JP2002516562A - Ｔリンパ球のインビトロ増殖のための改変された迅速な拡大方法（「改変ｒｅｍ」） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、細胞溶解性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球を含む、多数のＴリンパ球を迅速に生成するための、改変された迅速な拡大方法（「低-PBMC-REM」または「改変REM」と呼ばれる）を提供する。この方法は、高PBMC-REMの特徴である、大過剰の末梢血単核細胞（PBMC）またはEBVで形質転換されたリンパ芽球細胞（LCL）を使用しない。500倍より大きいクローンの拡大が、約８〜14日の単回の刺激サイクル中に達成され得る。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｔリンパ球のインビトロ増殖のための 改変された迅速な拡大方法（「改変REM」） 発明の分野 本発明は、ヒト抗原に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ 球を含む、Ｔリンパ球を培養するための改善された方法に関する。本発明の方法 は、例えば、細胞性免疫療法に有用である、Ｔ細胞の非常に迅速でかつ効率的な 拡大をもたらす。 背景 Ｔリンパ球は、骨髄で形成され、胸腺へ移動し、そしてそこで成熟し、次いで 、末梢血およびリンパ循環中に入る。Ｔリンパ球は、表現型的に、いくつかの異 なるタイプの細胞に細分され得る：この細胞は、ヘルパーＴ細胞、サプレッサー Ｔ細胞、および細胞障害性Ｔ細胞を含む。Ｔリンパ球は、Ｂリンパ球と異なり、 抗体分子を産生しないが、標的細胞の表面上で発現される主要組織適合遺伝子複 合体（ＭＨＣ）のタンパク質に結合した抗原性タンパク質のペプチドフラグメン トを認識し得るヘテロダイマー細胞表面レセプターを発現する；例えば、Abbas ，A.K.、Lichtman，A.H.およびPober，J.S.、Cellular and Molecular Immunolo gy ，1991，特に15-16頁を参照のこと。 本発明により拡大され得るＴリンパ球は、細胞性「免疫療法」の状況で特に目 的とされる。本明細書中で使用されるように、細胞性免疫療法は、治療的利益を 達成するための免疫系の細胞（特に、Ｔリンパ球）の患者への導入を含む任意の 種々の技術をいう。このような技術は、実例として、「免疫回復」技術（例えば 、無防備な免疫系（compromised immune system）を有する患者へのＴ細胞の投 与を含む）；「免疫増強」技術（例えば、患者の免疫系がガンまたは病原体（例 えば、ウイルスまたは細菌性病原体）を回避するかまたはそれと闘う能力を増強 するための患者へのＴ細胞の投与を含む）；および「免疫調節」技術（例えば、 自 己免疫状態に冒された患者におけるような患者の免疫系の他の細胞の活性を調節 するための患者へのＴ細胞の投与を含む）を含み得る。 細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）は、代表的には、CD3+、CD4-、CD8+表現型であ り、そしてクラスI MHC分子と結合した外来抗原のフラグメントをそれらの細胞 表面上で提示する細胞を溶解する。CD3+、CD4+、CD8-であるCTLはまた、同定さ れている。CTL認識の標的細胞は、ウイルスまたは他の病原体による感染後に抗 原を発現している正常な細胞；および形質転換を受け、そして変異タンパク質を 発現しているかまたは正常なタンパク質を過剰発現している腫瘍細胞を含む。 大部分の「ヘルパー」Ｔ細胞は、CD3+、CD4+、CD8-である。ヘルパーＴ細胞は 、クラスII MHC分子と結合して提示される抗原のフラグメントを認識し、そして 抗原特異的なＴおよびＢ細胞の応答を増幅し、単球またはマクロファージのよう な補助免疫細胞を活性化するサイトカインを産生するように最初に機能する。例 えば、Abbas，A.K.ら、前出を参照のこと。ヘルパーＴ細胞はまた、細胞溶解活 性に関与するおよび／またはそれを増大させる。 従来のヘルパーＴ細胞および細胞溶解性つまり「キラー」Ｔ細胞に加えて、他 のＴ細胞集団を迅速に拡大し得ることもまた有用である。例えば、γ／δＴ細胞 レセプターを発現するＴ細胞は、ヒトＴ細胞集団の比較的小さな部分を表すが、 ウイルスおよび細菌性病原体ならびに腫瘍細胞に対する反応性において役割を果 たすと推測される（例えば、W．Haasら、1993．Annu．Rev．Immunol．11:637を 参照のこと）。潜在的な臨床的重要性を有する別のＴ細胞集団は、CD1制限Ｔ細 胞の集団である。CD1は限定された多型を示すMHC様分子であり、そして抗原性ペ プチドを「提示する」古典的なMHC分子とは異なり、CD分子はリポグリカンを結 合し、そして微生物抗原の認識において重要であるようである（例えば、P.A．S ielingら、1995．Science 269:227;およびE.M．Beckmanら、1994．Nature 372:6 91を参照のこと）。 従って、Ｔリンパ球は、ウイルス、細菌性病原体、および腫瘍に対する宿主免 疫応答の重要な成分である。適切に機能するＴ細胞の重要性は、先天性、後天性 または医原性のＴ細胞免疫不全状態（例えば、SCID、BMT、AIDSなど）を有する 個体により極めて明確にされている。これらの状態は、生命を脅かす広範な種々 の感染または悪性疾患の発達をもたらし得る。従って、免疫担当Ｔリンパ球の欠 損に関連する疾患を有するヒト、またはさらなるＴリンパ球を投与することによ り改善され得る状態を有するヒトは、上記のように、細胞性免疫療法により利益 を受け得る。このような治療に使用するためのＴ細胞は、免疫不全宿主または別 の供給源（好ましくは、適合性ドナー）由来であり得る。後者の供給源は、もち ろん、免疫不全宿主が不十分な数のＴ細胞を有するかまたは十分に有効でないＴ 細胞を有する状況において特に重要である。いずれの場合でも、有効な投与のた めに十分な数のＴ細胞を得ることは難しい；そしてそれゆえ、標的Ｔ細胞は、宿 主への投与前に大きな数になるまでインビトロで最初に増殖されなければならな い。 このような細胞性免疫療法を受けた後、先に示された宿主（例えば、病原体ま たは腫瘍により発現される抗原に対して不十分に応答するかまたは応答しない） は十分な免疫応答を表して、病原体または腫瘍に対して耐性になり得るかまたは 免疫性になり得る。 免疫を確立するための抗原特異的Ｔ細胞養予の移入は、動物モデルにおけるウ イルス感染および腫瘍の有効な治療であることが示されている（Greenberg，P.D .，Advances in Immunology(1992)中に概説される）。養子免疫療法が有効であ るためには、抗原特異的Ｔ細胞は、通常、単離され、そしてインビトロ培養によ り数が拡大されることが必要であり、養子移入の後にこのような培養されたＴ細 胞はインビボで維持および機能していなければならない。いくつかのヒト疾患の 処置に対して、単一の細胞の子孫を示すクローン化された抗原特異的Ｔ細胞の免 疫療法における使用は重大な利点を提示する。なぜなら、これらの細胞の特異性 および機能は厳密に規定され得、そして正確な用量応答効果は容易に評価され得 るからである。Riddellらは、最初にヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを養子的に 移入して、ヒトにおいて欠損した免疫を回復した。Riddell，S.R.ら、「Restora tion of Viral Immunity in Immunodeficient Humans by the Adoptive Trans f er of T Cell Clones」，Science 257:238-240(1992)。その研究において、Ridd ellらは、養子免疫療法を使用して、同種骨髄移植レシピエントにおけるサイト メガロウイルスに対する欠損した免疫を回復した。サイトメガロウイルス特異 的CD8+細胞障害性Ｔ細胞クローンが３つのCMVセロポジティブ骨髄ドナーから単 離され、エフェクターＴ細胞の数的な拡大を達成するために５〜12週間インビト ロで増殖され、次いでそれぞれの骨髄移植(BMT)レシピエントに静脈内投与され た。BMTレシピエントは、移植前化学放射線療法による宿主Ｔ細胞応答の除去、 および同種骨髄移植後に通常観察されるドナー免疫の回復の遅れによりCMV特異 的免疫を欠損していた（Reusserら、Blood，78:1373-1380，1991）。Riddellら は、毒性が見られないこと、および移入されたＴ細胞クローンがこれらの免疫不 全宿主にCD8+サイトメガロウイルス特異的CTL応答の迅速かつ持続的な再構成を 提供することを見出した。 Riddellら（J ．Immunology，146:2795-2804，1991）は、CD8+ CMV特異的Ｔ細 胞クローンを単離および培養するために以下の手順を使用した：骨髄ドナー由来 の末梢血単核細胞（PBMC）を最初に自己サイトメガロウイルス感染線維芽細胞と ともに培養してCMV特異的CTL前駆体を活性化した。次いで、培養したＴ細胞を、 CMV感染線維芽細胞およびγ線照射したPBMCを補充した培養物で再刺激した。適 切な培養培地中の２〜５U/mlのインターロイキン-２（IL-2）を再刺激後２およ び４日目に添加してCD8+ CTLの拡大を促進した（Riddellら，J ．Immunol.，146: 2795-2804，1991）。Ｔ細胞クローンを単離するために、ポリクローナルCD8+ CM V特異的Ｔ細胞を、限界希釈（0.3〜0.6細胞/ウェル）で、96-ウェル丸底ウェル 中に、抗原提示細胞としてのCMV感染線維芽細胞（Riddell，J ．Immunol.，146:2 795-2804，1991）；または抗原提示細胞により提供される刺激を模倣するための 抗CD3モノクローナル抗体（Riddell，J ．Imm．Methods，128:189-201，1990）の いずれかとともにプレートした。次いで、γ線照射した末梢血単核細胞（PBMC） およびEBV形質転換リンパ芽球細胞（LCL）をフィーダー細胞としてマイクロウェ ルに添加した。クローン性Ｔ細胞増殖が陽性のウェルは10〜14日で明らかとなっ た。次いで、クローンに由来する細胞を最初に48-または24-ウェルプレートで、 続いて12-ウェルプレートまたは75-cm²組織培養フラスコで、大きな数まで増殖 させた。Ｔ細胞増殖を、自己CMV感染線維芽細胞ならびにPBMCおよびLCLからなる γ線照射したフィーダー細胞での７〜10日毎の再刺激、ならびに再刺激の２およ び４日後の25〜50U/mlのIL-2の添加により促進した。 上記の研究および一般にＴ細胞の培養の先行技術に存在する主な問題は、大量 のヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを時宜を得た様式で増殖することができないこ とである。培養におけるＴ細胞の遅い増殖がヒトリンパ球の細胞周期時間または 使用した培養条件の固有の特性を表すかどうかは知られていない。例えば、上記 のCMV養子免疫療法研究で使用される培養方法を用いると、最も高い細胞用量（ １×10⁹細胞/cm²であった）を研究下で達成するようにＴ細胞を増殖させるため には３ケ月が必要であった。これは、ヒトウイルス性疾患およびガンについての 養子免疫療法の適用を大いに制限する。なぜなら、疾患プロセスは、治療に使用 されるべき特異的Ｔ細胞を単離しそして増殖するために必要とされる長い間隔の 間に進行し得るからである。動物モデル研究による外挿法（Greenberg，P.D.，A dvances in Immunology，1992中に概説される）に基づけば、ヒトにおいて、10⁹ 〜10¹⁰の細胞の範囲の抗原特異的Ｔ細胞の用量が、治療的利益のための免疫応答 を増大するために必要とされ得ることが予想される。 しかし、このような高細胞数を達成するための培養において迅速に拡大する抗 原特異的ヒトＴ細胞は、重大な障害であることが証明されている。従って、Ridd ellら、前出による研究（ここでは、有意な数の細胞を増殖させるために数ヶ月 かかった）を除いて、抗原特異的Ｔ細胞クローンを使用する養子免疫療法の研究 は行われていなかった。養子免疫療法のために多数の細胞を産生することの問題 は、米国特許第5,057,423号で確認された。この特許は、純粋な大型顆粒リンパ 球を単離するための方法、およびこれらの大型顆粒リンパ球をリンホカイン活性 化キラー（LAK）細胞へ拡大および変換するための方法が記載される。これらの 方法は、高レベル（すなわち、３〜４日の培養において100倍まで）の拡大を提 供するように記載されている。LAK細胞はいくつかのタイプの腫瘍細胞を溶解す るが、それらは規定された抗原を認識する特性をMHC制限Ｔ細胞と共有せず、そ してそれらは免疫記憶を提供しない。さらに、LAK細胞を拡大するために使用さ れる方法（これは高濃度のIL-2に優先的に依存する）は、抗原特異的ヒトＴ細胞 を効率的に拡大せず（Riddellら、未発表）；そしてそれらの方法は、IL-2の除 去またはＴ細胞レセプターを介した続く刺激に際し、Ｔ細胞にプログラムされた 細胞死（すなわち、アポトーシス）を受けさせ得る（LenardoらおよびBoehmeら 、 後出による論文の議論を参照のこと）。コンカナバリンＡまたはフィトヘマグル チニンのようなレクチンの使用に依存した初期の方法（例えば、Van de Griend ら、Transplantation 38:401-406(1984)、およびVan de Griendら、J ．Immunol ．Methods 66:285-298(1984)を参照のこと）はいっそう満足できない。なぜなら 、このような非特異的な刺激性レクチンの使用は、刺激された細胞において多く の表現型変化を誘導する傾向があるからである。この変化は、それらを、CD3レ セプターを介して刺激されたＴ細胞とは極めて異なるようにする。 抗原特異的Ｔ細胞クローンを多数に培養できないことは、一部分、ガン（Rose nberg，New Engl ．J．Med.，316:1310-1321，1986；Rosenberg，New Engl ．J．M ed. ，319:1676-1680，1988）およびHIV感染（HoM.ら、Blood 81:2093-2101，199 3）のようなヒト疾患についての養子免疫療法研究を、抗原特異性がほとんど規 定されていない、活性化したポリクローナルリンパ球集団の評価に制限すること の原因であった。このような研究において、リンパ球のポリクローナル集団は、 血液または腫瘍ろ過物のいずれかから単離され、そして高濃度のＴ細胞増殖因子 IL-2中で培養される。一般に、存在したとしても、これらの細胞は、病原体また は腫瘍に対するMHC制限特異性をほとんど示さず、そして治療的利益を受けた少 数の患者において、関与するエフェクターメカニズムを識別することは困難であ った。代表的には、非特異的エフェクターリンパ球での養子免疫療法研究は、約 ２×10¹⁰〜２×10¹¹の細胞を患者に投与した（例えば、米国特許第5,057,423号 、第１欄、40-43行を参照のこと）。 Ｔリンパ球を迅速に増殖させるための効率的な細胞培養法の開発は、診断的お よび治療的適用の両方において有用である。治療的適用において、患者由来のＴ 細胞を迅速に拡大する能力が、例えば、患者のＴリンパ球の特異性、活性、また は他の属性をモニターする試験において使用するための十分な数の細胞を早く生 じさせるために使用され得る。さらに、10⁹〜10¹⁰の細胞の細胞用量を迅速に達 成する能力は、ヒト疾患の処置のための特異的な養子免疫療法の適用可能性を大 いに助長する。 Ｔ細胞クローンを単離および拡大するための方法を含む、可能な治療的用途の ための細胞を培養することについて既に記載されたいくつかの確立された方法が 存在する。足場依存性細胞（すなわち、細胞増殖のために基材への付着を必要と する細胞）のための代表的な細胞培養方法は、使用される培養容器（すなわち、 マルチウェルプレート、ペトリディッシュ、および培養フラスコ）において利用 可能な表面積の量により制限される。足場依存性細胞について、増殖される細胞 の数を増加するための唯一の方法は、一般に、増加した表面積を有するより大き な容器を使用するおよび／またはより多くの容器を使用することである。しかし 、Ｔリンパ球のような造血細胞は足場非依存性である。それらは、基材に結合す ることなく、懸濁培養物中の適切な増殖因子に応答して生存および増殖し得る。 懸濁培養物中で抗原特異的リンパ球を増殖する能力を用いても、今日までに報告 された方法は、Ｔ細胞クローンの迅速な数的拡大を一貫してもたらすわけではな かった。例えば、GillisおよびWatsonにより行われたＴ細胞の研究において、低 密度（すなわち、Ｔ細胞増殖因子IL-2の存在下で５×10³〜１×10⁴細胞/ml）で 培養されたＴ細胞は、７日間に渡って迅速に増殖し、そして最終的に３〜５×10⁵ 細胞/mlの飽和密度に達したことが見出された。Gillis，S.およびWatson，J.「 Interleukin-2 Dependent Culture of Cytolytic T Cell Lines」，Immunologic al Rev. ，54:81-109(1981)。さらに、GillisおよびWatsonはまた、一旦細胞がこ の飽和濃度に達すると、細胞は常に死ぬことを見出した。Gillisら、同書。 別の研究は、長期培養においてマウスＴリンパ球を確立するための３つの異な る方法を報告した。Paulらは、最も広範に使用される方法は、免疫されたドナー 由来のＴリンパ球を、必要なＴ細胞レセプターシグナルおよび同時刺激シグナル を提供するために抗原および抗原提示細胞（APC）の存在下で、そしてそれらを クローン化することを試みる前に外来増殖因子を添加して、数週間以上増殖する ことであることを報告した。Paul，W.E.ら、「Long-term growth and cloning o f non-transformed lymphocytes」，Nature，294:697-699(1981)。次いで、タン パク質抗原に特異的なＴ細胞は、抗原およびAPCの供給源としての照射した脾臓 細胞を用いた限界希釈によりクローン化される。第２の方法は、免疫したドナー からの細胞を取得した後、できるだけ早くに、軟寒天中でコロニーとしてＴ細胞 を増殖することを含んだ。Ｔ細胞を、最初の懸濁培養物において、抗原およびAP Cの供給源（通常、照射した脾臓細胞）で刺激した。この第２のアプローチに おいて、３日後、細胞は２層軟寒天培養システムの上層に分配されたことが見出 された。コロニーを４〜８日目で拾い、次いで長期培養で拡大した。第３のアプ ローチは、細胞をそれらの抗原特異性よりもむしろそれらの機能的特性について 選択し、次いでそれらを一連の異なる照射したフィーダー細胞および増殖因子を 含んでいる上清とともに増殖することを含んだ。Paul，W.E.ら、「Long-term gr owth and cloning of non-transformed lymphocytes」，Nature，294:697-699(1 981)。これらの方法のいずれによっても、単一の細胞由来の個々のＴ細胞クロー ンを10⁹〜10¹⁰の細胞まで時宜を得た様式で拡大することは不可能であることは 明らかである。従って、抗原特異的Ｔ細胞をクローン化する能力および受け入れ られた動物モデルにおけるＴ細胞クローンの治療的効力の説得力のある証拠にも かかわらず、ヒトＴ細胞を多数に培養することの技術的困難は、細胞性免疫療法 手順の臨床的な評価および適用を妨害した。 培養されたＴ細胞のなお別の関心は、免疫療法手順において有用であるために それらがインビボで機能し得るままでなければならないことである。特に、高濃 度のIL-2中での長期の培養により増殖した抗原特異的Ｔ細胞は、細胞周期異常を 発生し、そしてIL-2が除去された場合に静止期に戻る能力を失い得ることが観察 されている。対照的に、正常な細胞周期は、４つの連続する期からなる：有糸分 裂（つまり「Ｍ」期）および「間期」段階を形成する３つの期。Ｍ期の間、細胞 は核分裂および細胞質分裂を受ける。間期段階は、GI期（ここでは、生合成活性 が、有糸分裂後速い速度で再開される）；Ｓ期（ここでは、DNA合成が生じる） およびG2期（これは有糸分裂の開始まで続く）からなる。G1期の間、いくつかの 細胞は分裂周期に前進するのを停止するようであり；そしてそれらは「休止」ま たは静止状態にあるといわれる（「G0」状態として示される）。特定の環境因子 （例えば、血清中の増殖因子の欠如または細胞培養物のコンフルエンス）は、細 胞が静止状態に入ることを引き起こし得る。一旦因子が元に戻されると、細胞は 周期へのその正常な前進を再開するはずである。しかし、培養で増殖した細胞は 、増殖因子が除去された場合に静止期に入り得ないかもしれず、このことはこれ らの細胞の死をもたらす。この増殖因子依存性は、特に培養されたＴ細胞に関連 する。細胞増殖を促進するために長期にわたって高濃度のIL-2に曝したＴリンパ 球 は、IL-2が除去されるか、またはそれらが続いてＴ細胞レセプターを介して刺激 される、すなわちそれらが特異的な抗原に遭遇する場合、しばしばアポトーシス と呼ばれるプロセスにより死ぬ（例えば、Lenardo M.J.，Nature，353:858-861 ，1991；Boehme S.A.およびLenardo M.J.,Eur ．J．Immunol.，23:1552-1560，19 92を参照のこと）。それゆえ、LAK細胞またはTIL細胞を増殖するために使用され る培養方法、およびインビトロでの拡大を促進するための長期高濃度IL-2に優先 的に依存するＴ細胞を培養するための先の方法は、多くの細胞をアポトーシスを 受けやすくし得、従って、細胞性免疫療法についてのそれらの有用性を制限また は排除する。 遺伝子マーカーを提供するため、移入された細胞のインビボでの移動および生 存の評価を容易にするため、または移入されたＴ細胞の安全性および効力を改善 し得る機能を付与するために、外来DNAをＴ細胞中に挿入する遺伝子移入方法を 用いることはまた、細胞性免疫療法研究において有利であり得る。哺乳動物細胞 中への安定な遺伝子移入のために確立された方法は、両種指向性レトロウイルス ベクターの使用である（例えば、Miller AD，Current Topics in Microbiology and Immunology ，158:1-24，1992を参照のこと）。レトロウイルスベクターを用 いた遺伝子の標的細胞への安定な組込みは、細胞が活発にサイクルしていること 、具体的にはこれらの細胞が細胞周期のＭ期を通過することを必要とする。先の 研究は、高用量のIL-2により増殖が駆動されたポリクローナルＴ細胞の少数にマ ーカー遺伝子を導入し、そしてこれらの細胞を腫瘍療法としてヒトに再注入し、 そして移入された細胞のインビボ生存後の手段を提供した（RosenbergらNew Eng l ．J．Med. ，323:570-578，1990）。しかし、ヒトＴ細胞（標準的な技術で増殖 した場合、ゆっくりとサイクルする）については、安定な遺伝子移入の効率は非 常に低く、0.1〜１％のＴ細胞の範囲である（Springett CMらJ ．Virology，63:3 865-69，1989）。より効率的に標的Ｔ細胞を細胞周期のＳおよびG2-M期に入れる 培養方法は、レトロウイルス媒介性遺伝子移入を使用する遺伝子改変の効率を増 大し得る（RoeT.ら，EMBO J，2:2099-2108，1993）。従って、細胞性免疫療法に おける遺伝子改変されたＴ細胞の使用、または遺伝子欠損疾患における欠損遺伝 子の送達のためのＴ細胞の使用の見込みを改善する。 S．Riddellら（1996年３月７日に公開されたPCT公開公報WO96/06929）により 記載される迅速拡大方法（本明細書中以降、「高PBMC REM」または「hp-REM」と 称する）は、臨床的な養子免疫療法プロトコルにおいて使用するための、機能的 な、抗原特異的Ｔ細胞クローンを提供するために開発された。hp-REMプロトコル は、Ｔ細胞の機能および特異性を損失することなく、制限された時間量で最大の Ｔ細胞拡大を提供するために設計された。一般に、hp-REMプロトコルは、最初の Ｔリンパ球集団を培養培地へインビトロで添加する工程；フィーダー細胞として の不均衡に多数の分裂していない末梢血単核細胞（「PBMC」）を、培養培地へ、 得られる細胞の集団が、拡大されるべき最初の集団中のそれぞれのＴリンパ球に 対して少なくとも約40PBMCフィーダー細胞（好ましくは少なくとも約200、より 好ましくは少なくとも約400）を含むように添加する工程、；および培養物をイ ンキュベートする工程を含む。hp-REMプロトコルの好ましい実施態様において、 拡大されるべきＴ細胞はまた、不均衡に多数のEBV形質転換リンパ芽球細胞（「L CL」）、抗CD3モノクローナル抗体（例えば、OKT3）（Ｔ細胞抗原レセプターを 介してＴ細胞を活性化するため）、およびＴ細胞増殖因子インターロイキン-２ （IL-2）に曝される。 hp-REMプロトコルにおいて、Ｔ細胞は、一般に、末梢血単核細胞（PBMC）およ びまた可能なEBV形質転換リンパ芽球細胞（EBV-LCL）からなる、大過剰のフィー ダー細胞を使用して拡大される。拡大されるべきＴ細胞は、代表的には、hp-REM 培養方法において、約0.2％未満の細胞を表す。上記のように、Ｔ細胞は、抗CD3 モノクローナル抗体（例えば、OKT3）を使用してＴ細胞抗原レセプターを介して 活性化され得、そしてＴ細胞増殖はIL-2を使用して誘導され得る。このようなhp -REM培養条件は、他で報告されたレベルよりも100〜200倍高いＴ細胞拡大のレベ ルをもたらすことを報告した。 しかし、大部分の使用では、臨床的使用が予定されているＴ細胞の調製におい ての大過剰のフィーダー細胞（すなわち、PBMCおよびEBV-LCL）の使用を避ける ことが好ましい。例えば、PBMCはヒトの血液に由来し、そして外来因子（例えば 、１型および２型のヒト免疫不全症ウイルス；１型および２型のヒトＴ細胞白血 病ウイルスI；およびＢ、ＣおよびＧ型肝炎のような肝炎ウイルス）の潜在的な 供 給源を示し得、そしてEBV-LCLは、エプスタイン-バーウイルスの潜在的な供給源 を示し得た。さらに、hp-REMプロトコルの大規模適用は、十分な数のフィーダー 細胞を提供するために多量のヒト末梢血の供給を必要とする。 それゆえ、必要とされるこのようなフィーダー細胞の数を減少するか、または それらを完全に置き換えることは特に有利である。これらの関心を考慮して、本 発明の方法（本明細書中以降、「低PBMC-REM」または「改変REM」と称する）は 、hp-REMプロトコルの重要な特徴である、大過剰のPBMCおよび／またはEBV-LCL フィーダー細胞を使用することなく、Ｔ細胞の迅速なインビトロ拡大を達成する ように設計される。発明の要旨 本発明は、hp-REMプロトコルの主要な特徴である、大過剰のPBMCおよび／また はEBV-LCLフィーダー細胞を使用することなく、Ｔ細胞の最初の集団から単離さ れる、ヒト抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞を含む多数のＴ細 胞を迅速に産生するための方法を提供する。本発明の方法は、Ｔリンパ球の迅速 な拡大に適用可能であるが、一般に、迅速な拡大方法は、個々のＴ細胞クローン がＴリンパ球の大きな集団を提供するために拡大されなければならない状況にお いて特に有利である。従って、本発明は、Fred Hutchinson Cancer Research Ce nterでのヒト骨髄移植レシピエントを含む本研究において例示されるような（hp -REMを使用する、以下に記載される）ヒトの養子免疫療法の状況において特に重 要な道具を提供する。本発明はまた、以下に例示するような、Ｔリンパ球への安 定な遺伝子の送達の効率を改善するための方法を提供する。 従って、本発明の１つの目的は、hp-REMプロトコルの主要な特徴である大過剰 のPBMCおよび／またはEBV-LCLフィーダー細胞を使用することなく、インビトロ でＴリンパ球を迅速に拡大させて多数にすることである。このような迅速に拡大 されたＴ細胞の集団は、とりわけ、本明細書中に例示されるような、特定の免疫 応答を与える目的のために個体に注入するために使用され得る。本発明を使用し て拡大され得るＴ細胞は、本明細書中に記載される任意の種々のＴリンパ球集団 を含む（例えば、CTL、ヘルパーＴ細胞、および他のＴリンパ球についての上記 の考察、ならびに免疫療法技術におけるこのような細胞の可能性のある用途を参 照のこと）。 本発明の別の目的は、上記のような、細胞性免疫療法において使用されるべき Ｔ細胞の機能を変化させるために使用され得る外来遺伝物質の安定な導入を容易 にする様式での、Ｔ細胞を増殖させるための方法の使用、またはさもなければ、 宿主中での欠損遺伝子もしくは不適切な遺伝子を克服することである。 本発明の多くの好ましい実施態様が、以下の一覧に記載される： １．インビトロで培養培地中の最初のＴリンパ球集団を迅速に拡大するための 方法（本明細書中で、「低-PBMC-REM」または「改変REM」と呼ばれる）。この方 法は、以下の工程を包含する：インビトロで培養培地に最初のＴリンパ球集団を 添加する工程；少なくとも１つのＴ細胞刺激成分を発現する、分裂していない哺 乳動物細胞株を培養培地に添加する工程であって、ここで、上記の細胞株はEBV で形質転換されたリンパ芽球（lymphoblastoid）細胞株（LCL）でない、工程； および上記培養物をインキュベートする工程。REM培養物は、一般に、Ｔリンパ 球の増殖に適切な温度などの条件下でインキュベートされる。ヒトＴリンパ球の 増殖について、例えば、温度は、一般に少なくとも約25℃であり、好ましくは、 約30℃であり、さらに好ましくは約37℃である。適切な培地および他の培養条件 の記載は当該分野で周知であり、そして本明細書中に例示されている。 ２．上記の項目に従う迅速な拡大方法。ここで、上記のＴ細胞刺激成分は、Fc -γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、およびサイトカインからなる群か ら選択される。 ３．上記の項目１または２のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の Ｔ細胞刺激成分は、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、およびサイ トカインからなる群から選択され、そして上記の最初のＴリンパ球集団は、約２ 週間未満の期間のインキュベーション後に少なくとも200倍拡大される。 ４．上記の項目１〜３のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記のＴ細 胞刺激成分は、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、およびサイトカ インからなる群から選択され、そして上記の最初のＴリンパ球集団は、約２週間 未満の期間のインキュベーション後に少なくとも500倍拡大される。 ５．上記の項目１〜４のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記のＴ細 胞刺激成分は、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、およびサイトカ インからなる群から選択され、そして上記の最初のＴリンパ球集団は、約２週間 未満の期間のインキュベーション後に少なくとも1000倍拡大される。 ６．上記の項目１〜５のいずれかに従う迅速な拡大方法。この方法はさらに、 培養培地に抗CD3モノクローナル抗体を添加する工程を包含し、ここで、抗CD3モ ノクローナル抗体の濃度は、少なくとも約1.0ng/mlである。代表的には、約10ng /mlの濃度が使用されるが、以下に示すように、さらに低いレベルが使用され得 る。 ７．上記の項目１〜６のいずれかに従う迅速な拡大方法。この方法はさらに、 培養培地にIL-2を添加する工程を包含し、ここで、IL-2の濃度は、少なくとも約 10ユニット/mlである。代表的には、約25ユニット/mlの濃度が使用される。好ま しくは、インキュベーションは少なくとも約９日間継続され、そしてここで、培 養培地にIL-2を添加する工程がそれぞれ３〜５日の間隔の後に繰り返される。代 表的には、IL-2は、０日目に添加され、５または６日目に再度、そして８または ９日目にまた添加される。 ８．上記の項目１〜７のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の哺乳 動物細胞株は、ヒト末梢血単核細胞（ヒトPBMC）に見出される少なくとも２倍の 頻度で；好ましくはヒトPBMC中に一般に見出される少なくとも３倍、少なくとも 10倍、または少なくとも50倍の頻度で存在する少なくとも１つの細胞型を含む。 ９．上記の項目１〜８のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記のＴ細 胞刺激成分は、Fc-γレセプターおよび細胞接着アクセサリー分子からなる群か ら選択される。 １０．上記の項目１〜９のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記のＴ 細胞刺激成分は、細胞接着アクセサリー分子およびサイトカインからなる群から 選択される。 １１．上記の項目１〜１０のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の Ｔ細胞刺激成分は、Fc-γレセプターおよびサイトカインからなる群から選択さ れる。 １２．上記の項目１〜１１のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の 哺乳動物細胞株は、細胞接着アクセサリー分子を発現する。 １３．上記の項目１〜１２のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の 細胞接着アクセサリー分子は、クラスII MHC、クラスＩ MHC、ICAM1、ICAM2、IC AM3、CD58、CD72、フィブロネクチン、CD27に対するリガンド、CD80、CD86、お よびヒアルロン酸塩からなる群から選択される。 １４．上記の項目１〜１３のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の 哺乳動物細胞株は、サイトカインを発現する。好ましくは、このサイトカインは インターロイキンである。 １５．上記の項目１〜１４のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の Ｔ細胞刺激成分はCD21に結合する分子である。 １６．上記の項目１〜１５のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の サイトカインは、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、およびIL-15からなる 群から選択される。 １７．上記の項目１〜１６のいずれかに従う迅速な拡大方法。この方法はさら に、可溶性のＴ細胞刺激因子を培養培地に添加する工程を包含する。 １８．上記の項目１〜１７のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の 可溶性のＴ細胞刺激因子は、サイトカイン、Ｔ細胞表面成分に特異的な抗体、お よびＴ細胞表面成分に結合し得る成分に特異的な抗体からなる群から選択される 。 １９．上記の項目１〜１８のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の 可溶性のＴ細胞刺激因子は、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、およびIL- 15からなる群から選択されるサイトカインである。 ２０．上記の項目１〜１９のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の 可溶性のＴ細胞刺激因子は、Ｔ細胞表面成分に特異的な抗体であり、そしてこの Ｔ細胞表面成分は、CD4、CD8、CD11a、CD2、CD5、CD49d、CD27、CD28、およびCD 44からなる群から選択される。 ２１．上記の項目１〜２０のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の 可溶性のＴ細胞刺激因子は、Ｔ細胞表面成分に結合し得る成分に特異的な抗体で あり、そしてこのＴ細胞表面成分は、CD4、CD8、CD11a、CD2、CD5、CD49d、CD27 、 CD28、およびCD44からなる群から選択される。 ２２．上記の項目１〜２１のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の 可溶性Ｔ細胞刺激因子は、CD21に結合する分子である。 ２３．上記の項目１〜２２のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、上記の CD21に結合する分子は、抗CD21抗体である。 ２４．上記の項目１〜２３のいずれかに従う迅速な拡大方法。この方法はさら に、非常に多数の末梢血単核細胞（PBMC）を培養物に添加する工程を包含する。 好ましくは、PBMCは、約3000〜3600radの範囲で、より好ましくは約3300radでγ 線照射される。 ２５．上記の項目１〜２４のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、拡大さ れるべき最初のＴ細胞に対するPBMCの比は、約40：1未満である。 ２６．上記の項目１〜２５のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、拡大さ れるべき最初のＴ細胞に対するPBMCの比は、約10：1未満である。 ２７．上記の項目１〜２６のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、拡大さ れるべき最初のＴ細胞に対するPBMCの比は、約3：1未満である。 ２８．上記の項目１〜２７のいずれかに従う迅速な拡大方法。この方法はさら に、EBVで形質転換された非常に多数のリンパ芽球細胞（LCL）を培養物に添加す る工程を包含する。好ましくは、PBMCは、約6000〜10,000radの範囲で、より好 ましくは約8000radでγ線照射される。 ２９．上記の項目１〜２８のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、拡大さ れる最初のＴ細胞に対するLCLの比は、約10：1未満である。 ３０．上記の項目１〜２９のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、最初の Ｔリンパ球集団は、少なくとも１つのヒトCD8+抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球 （CTL）を含む。本発明の好ましい実施態様において、CTLは、ヒト腫瘍上に存在 する抗原、またはウイルスもしくは細菌のような病原体によってコードされる抗 原に特異的である。 ３１．上記の項目１〜３０のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、最初の Ｔリンパ球集団は、少なくとも１つのヒトCD4＋抗原特異的ヘルパーＴリンパ球 を含む。 ３２．ヒトＴ細胞を遺伝子的に形質導入する方法。この方法は、以下の工程を 包含する：インビトロで培養培地に最初のＴリンパ球集団を添加する工程；Ｔ細 胞刺激成分を発現する、EBVで形質転換していない哺乳動物細胞株を培養培地に 添加する工程；およびその培養物をインキュベートする工程；および培養培地に ベクターを添加する工程。ベクターは、標的細胞に導入され得る形態のDNAまた はRNAの単位をいう。形質導入は、一般に、標的細胞へのそのような外因性DNAま たはRNAの導入をいうために使用され、例えば、ウイルス感染およびエレクトロ ポレーションによる、標的細胞中への異種DNAまたはRNA配列の導入を含む。Ｔリ ンパ球を形質導入するための現在好ましい方法は、本明細書中で例示されるよう なレトロウイルスベクターの使用である。 ３３．上記の項目３２に従う遺伝子形質導入法。ここで、上記のベクターは、 Ｔリンパ球を阻害する阻害化合物に対する耐性を提供する選択マーカーを含むレ トロウイルスベクターであり、そして、この方法はさらに、以下の工程を包含す る：レトロウイルスベクターの添加後少なくとも１日間、培養物のインキュベー ションを継続する工程；およびこの継続されたインキュベーション工程後に培養 培地に上記の阻害化合物を添加する工程。好ましくは、レトロウイルスベクター は、ポジティブおよびネガティブの両方の選択マーカーを含む。好ましいポジテ ィブな選択マーカーは、hph、neo、およびgptからなる群から選択される遺伝子 由来であり、そして好ましいネガティブな選択マーカーは、シトシンデアミナー ゼ、HSV-1 TK、VZV TK、HPRT、APRT、およびgptからなる群から選択される遺伝 子由来である。特に好ましいマーカーは、二官能性の選択可能な融合遺伝子であ り、ここで、ポジティブな選択マーカーは、hphまたはneo由来であり、そしてネ ガティブな選択マーカーは、シトシンデアミナーゼまたはTK遺伝子由来である。 ３４．上記の項目３２〜３３のいずれかに従う遺伝子形質導入法。この方法は さらに、非常に多数のヒトPBMCを添加する工程を包含する。 ３５．上記の項目３２〜３４のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、最初 のＴ細胞に対するPBMCの比は、約40：1未満である。 ３６．上記の項目３２〜３５のいずれかに従う遺伝子形質導入法。この方法は さらに、分類していないEBVで形質転換したリンパ芽球細胞（LCL）を添加する工 程を包含する。 ３７．上記の項目３２〜３６のいずれかに従う迅速な拡大方法。ここで、最初 のＴ細胞に対するLCLの比は、約10：1未満である。 ３８．インビトロで最初のＴリンパ球集団の迅速な拡大を促進し得るREM細胞 株を生成する方法。この方法は、以下の工程を包含する：細胞型涸渇PBMC集団を 産生するためにヒトPBMC集団から１つ以上の細胞型を涸渇させる工程、涸渇して いないPBMCによって提供される活性に対する涸渇した細胞型の寄与を決定するた めのhp-REMプロトコルにおいて、涸渇していないPBMCの代わりに細胞型涸渇PBMC 集団を使用する工程、この涸渇した細胞型によって提供されるＴ細胞刺激活性を 同定する工程、およびこのＴ細胞刺激活性の発現を可能にする遺伝子で哺乳動物 細胞株を形質転換する工程。 ３９．上記の項目３８に従うREM細胞株を生成する方法。ここで、上記のＴ細 胞刺激成分は、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、およびサイトカ インからなる群から選択される。 ４０．インビトロで最初のＴリンパ球集団の迅速な拡大を刺激し得るREM細胞 株。この細胞株は、上記の項目３８または項目３９に従う方法によって生成され た哺乳動物細胞株を含む。 ４１．上記の項目４０に従うREM細胞株。ここで、上記の細胞株は、細胞接着 アクセサリー分子を発現する。 ４２．上記の項目４０〜４１のいずれかに従うREM細胞株。ここで、上記の細 胞接着アクセサリー分子は、クラスII MHC、クラスI MHC、ICAM1、ICAM2、ICAM3 、CD58、CD72、フィブロネクチン、CD27に対するリガンド、CD80、CD86、および ヒアルロン酸塩からなる群から選択される。 ４３．上記の項目４０〜４２のいずれかに従うREM細胞株。ここで、上記の細 胞株は、Fc-γレセプターを発現する。 ４４．上記の項目４０〜４３のいずれかに従うREM細胞株。ここで、上記の細 胞株は、少なくとも１つのＴ細胞刺激サイトカインを発現する。 ４５．上記の項目４０〜４４のいずれかに従うREM細胞株。ここで、上記のＴ 細胞刺激サイトカインは、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、およびIL-15からな る群から選択される。 ４６．上記の項目４０〜４４のいずれかに従うREM細胞株。ここで、上記の細 胞株は、CD21に結合する分子を発現する。本明細書中で使用されるCD21に結合す る分子は、CD21細胞表面決定基に結合することが既知であるかまたは決定された 、天然または合成の分子であり得る。CD21に結合することが既知である分子は、 抗CD21抗体、ならびにC3d、C3dg、iC3b、およびEBV gp350/220ならびにその誘導 体を含む。 ４７．インビトロで最初のＴリンパ球集団を迅速に拡大し得る培養培地。この 培地は、上記の項目４０〜４６のいずれかに従うREM細胞株を含む。 ４８．上記の項目４７に従う培養培地。この培地はさらに、外因性サイトカイ ンを含む。 ４９．上記の項目４７〜４８のいずれかに従う培養培地。この培地はさらに、 非常に多数の外因性サイトカインを含み、ここで、上記の非常に多数の外因性サ イトカインは、少なくとも１つのインターロイキンを含む。 ５０．上記の項目４７〜４９のいずれかに従う培養培地。ここで、上記のイン ターロイキンは、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、およびIL-15からなる群から 選択される。 ５１．上記の項目４７〜５０のいずれかに従う培養培地。この培地はさらに、 CD21に結合する分子を含む。本明細書中で使用されるCD21に結合する分子は、CD 21細胞表面決定基に結合することが既知であるかまたは決定された、天然または 合成の分子であり得る。CD21に結合することが既知である分子は、抗CD21抗体、 ならびにC3d、C3dg、iC3b、およびEBV gp350/220ならびにCD21に結合するその誘 導体を含む。 ５２．上記の項目５１に従う培養培地。ここで、上記のCD21に結合する分子は 、抗CD21抗体である。 ５３．上記の項目４９〜５２のいずれかに従う培養培地。この培地はさらに、 抗CD3モノクローナル抗体を含む。 好ましい実施態様および本発明の適用の詳細な説明 本明細書中に記載する発明は、ヒト細胞障害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリ ンパ球（これらは、ヒトの疾患の細胞性免疫療法において特に有用であり得る） を含むＴリンパ球の数を、大過剰のPBMCおよび/またはEBV-LCLフィーダー細胞（ これらは、hp-REMプロトコルの主要な特徴である）を用いずに、迅速に拡大する ための方法を提供する。 Ｔ細胞を、「標的Ｔ細胞」として呼ぶ。一般に、標的Ｔ細胞は、本明細書中で 記載されるように、インビトロでの迅速な拡大を刺激する成分を補充された標準 的増殖培地を含む培養容器へ少数添加される(REM)。好ましくは、ヒト組換えIL- 2または別の適切なIL-2調製物が３〜５日の間隔で（代表的には「０日目」（す なわち培養の開始時）または「１日目」（開始の翌日）、再び５または６日目、 そして再び８または９日目に）低濃度で添加される。REMプロトコルは、Ｔ細胞 の迅速な拡大、代表的には500〜3000倍の範囲の拡大を８〜14日以内に生じる。 従って、このような方法は、以前に記載されたヒトＴ細胞を培養する方法より各 刺激サイクルについて約100〜1000倍効率的な拡大速度を達成し得る。 さらに、REMプロトコルは、ヘルパーＴ細胞および細胞障害性Ｔ細胞を含む任 意のＴ細胞サブ集団の迅速な拡大に；および多くの異なる抗原性特異性のＴ細胞 クローンに（例えば、CMV、HIV、または他のウイルス性、細菌性、もしくは腫瘍 由来抗原に特異的な細胞障害性またはヘルパーＴ細胞）適用可能である。さらに 、REMプロトコルは、選択される培養容器のサイズに依存して；小スケール増殖 （例えば、Ｔ細胞を10⁴個〜10⁷個の細胞へ迅速に拡大するために）；または大ス ケール拡大（例えば、Ｔ細胞を10⁶個〜10¹⁰個を超える細胞へ迅速に拡大するた めに）の両方のために用いられ得る。 従って、REMプロトコルは、ヒトの免疫を回復、増強、または調節するために 必要とされる細胞の数を増大させるために必要とされる時間を劇的に短縮するこ とによって養子免疫療法における使用のためにＴ細胞クローンを効率的に拡大す ることを可能にする。Riddellら（Science，257:238-240，1992）による研究に おいて、一旦Ｔ細胞クローンが単離されると、クローンを12週間培養し、そして １×10⁹CD8+CMV特異的Ｔ細胞/m²体表面積の最も高い投与細胞用量を達成するた めに複数のクローンをプールする必要があった。REMプロトコルを用いれば、 個々のＴ細胞クローンの10⁹個を超える細胞への拡大は、３週間未満で達成され 得る。 迅速な拡大方法（すなわち、「REM」技術）に関して、以下の略語が、本明細 書中で言及される種々のREMプロトコルを区別するために用いられる。基本的なR iddellプロトコル（上記および引用されるRiddell特許出願に記載されるような ）は、不釣り合いに多数のPBMCフィーダー細胞（および好ましくはEBV-LCLフィ ーダー細胞も）を用い、「高PBMCREM」または単に「hp-REM」として言及される 。反対に、本発明の方法は、このような大過剰のPBMCフィーダー細胞を利用せず （そして好ましくは、EBV-LCLフィーダー細胞を用いない）、「低PBMC REM」ま たは「改変REM」として言及される。このような方法は、以下に詳細に記載され る。 本発明の実施は、特に示されない限り、分子生物学、微生物学、細胞生物学、 組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用し、これらは当該分野の技術範囲 内にある。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook 、Fritsch、およびManiatis，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版 (1989);Animal Cell Culture(R.I.Freshney、編、1987);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M．MillerおよびM.P．Calos編1987);Handbook of Expe rimental Immunology ，(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell、編);Current Protocols in Molecular Biology（F.M．Ausubel，R．Brent，R.E．Kingston，D.D.Moore ，J.G．Siedman，J.A．Smith、およびK．StruhL編、1987);Current Protocols i n Immunology（J.E．Coligan，A.M．Krulsbeek，D.H．Margulies，E.M．Shevach およびW．Strober、編、1991);Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編、1984) ;およびシリーズMethods in Enzymology（Academic Press，Inc.)を参照のこと 。 本明細書中で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物（前出および後 出の両方）は、本明細書中に参考として援用される。 本発明を理解する補助として、以下は本明細書中でよく用いられるいくつかの 略語のリストである： CTL 細胞障害性Ｔリンパ球 APC 抗原提示細胞 CMV サイトメガロウイルス HIV ヒト免疫不全ウイルス EBV エプスタインバーウイルス hIL-2 ヒトインターロイキン２ MHC 主要組織適合性複合体 PBMC 末梢血単核細胞 EBV-LCL EBV形質転換リンパ芽球腫細胞株（ときどき単に「LCL」と略され る） PBS リン酸緩衝化溶液 REM 迅速な拡大方法 hp-REM 高PBMC REM 1p-REM 低PBMCまたは「改変」REM 本明細書中で用いられる「サイトカイン」は、種々の細胞内シグナリング分子 （これらのうち最も良く知られているものは、哺乳動物体細胞の調節に関与して いる）の任意のものをいう。サイトカインの多数のファミリーは、その効果にお いて増殖促進および増殖阻害の両方ものが、特徴付けされている。それらは例え ば、以下を含む：インターロイキン(例えば、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL- 4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9(P40)、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14 、およびIL-15);CSF型サイトカイン(例えば、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LIF、EPO 、TPO（「トロンボポエチン」）、TNF-α、およびTNF-β);インターフェロン(例 えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ)；TGF-βファミリーのサイトカイン（例えば、T GF-β1、TGF-β2、TGF-β3、インヒビンＡ、インヒビンＢ、アクチビンＡ、アク チビンＢ）；増殖因子（例えば、EGF、VEGF、SCF(「幹細胞因子」または「スチ ール因子」)、TGF-α、aFGF、bFGF、KGF、PDGF-A、PDGF-B、PD-ECGF、INS、IGF- 1、IGF-II、NGF-β）；α型間分泌サイトカイン（例えば、IL-8、GR0/MGSA、PF- 4、PBP/CTAP/βTG、IP-10、MIP-2、KC、9E3）；およびβ型間分泌サイトカイン （例えば、MCAF、ACT-2/PAT 744/G26、LD-78/PAT 464、RANTES、G26、1309、J E、TCA3、MIP-1α,B、CRG-2）；および走化性因子(例えば、NAP-1、MCP-1、MIP- 1α、MIP-1β、MIP-2、SISβ、SISδ、SISε、PF-4、PBP、γIP-10、MGSA)。多 数の他のサイトカインがまた当業者に公知である。これらのサイトカインの供給 源、特徴、標的、およびエフェクター活性は、記載されており、そしてサイトカ インの多くについて、その分子をコードするDNA配列もまた公知である；例えば 、R．CallardおよびA．Gearing，The Cytokine Facts Book(Academic Press，19 94)、およびそこに総説および/または引用されている特定の刊行物（これらは、 本明細書中でその全体が参考として援用される）を参照のこと。The Cytokine F acts Book のようなカタログに参照されるように、このようなサイトカインをコ ードする多くのDNAおよび/またはタンパク質配列はまた、GENBANK(DNA);および/ またはSWISSPROT（タンパク質）のような配列データベースから一般に入手可能 である。代表的には、このようなサイトカインをコードするクローン化されたDN Aは、プラスミドとしてすでに入手可能であるが、公開された配列情報に基づい てサイトカインをコードするポリヌクレオチドを合成することはまた可能である 。サイトカインをコードするポリヌクレオチドはまた、当該分野で記載されるポ リメラーゼ連鎖反応（PCR）方法論を用いて入手することが可能である。例えば 、MullisおよびFaloona，Met ．Enzymology，155:355(1987)を参照のこと。サイ トカインの検出、精製、および特徴付け（所与の細胞型に対して効果的な新たな サイトカインを同定するためのアッセイを含む）もまた、多数の刊行物および本 明細書中で援用される参考文献に記載されている。例えば、Lymphokines and In terferons ，1987;およびDeMaeyer,E.ら、「Interferons and Other Regulatory Cytokines」(John Wiley & Sons 1988)を参照のこと。 本明細書中で用いられる哺乳動物「細胞株」は、ヒトのような個体から得た「 初代細胞」と区別されるように、インビトロで反復的な増殖を行った哺乳動物細 胞（好ましくはヒト細胞）の集団をいう。一般に、哺乳動物細胞株は、少なくと も約10世代、より代表的には少なくとも約40世代、最も代表的には少なくとも約 100世代の間インビトロで増殖される。最も好ましくは、哺乳動物細胞株は、長 期間（すなわち、インビトロで少なくとも数カ月間、好ましくは少なくとも１年 間）増殖しそして維持され得る。このような細胞株は、「クローン」株（ここ で、集団の全ての細胞が単一の祖先細胞由来である）を含むがこれらに限定され ない。反対に、混合された末梢血集団（例えばPBMC）は、哺乳動物細胞株を構成 しない。しかし、本発明の使用のための哺乳動物細胞株は、末梢血において見出 される細胞型を含むが、この場合、この細胞型は一般に、ヒト末梢血単核細胞に おいて通常見出されるよりもずっと高い頻度（ヒト末梢血単核細胞において一般 に見出される頻度の少なくとも２倍の頻度；好ましくは、ヒト末梢血単核細胞に おいて一般に見出される頻度の少なくとも５倍、少なくとも10倍、少なくとも20 倍、または少なくとも50倍）で存在する。特定の「細胞型」は、例えば、末梢血 において代表的に見出される細胞型（例えば、Ｂリンパ球、単球、細胞障害性Ｔ リンパ球、ヘルパーＴリンパ球、顆粒球、好酸球、またはNK細胞）；または末梢 血において通常見出されない細胞型（例えば、線維芽細胞、内皮細胞など）；ま たはこのような細胞型のより特異的なサブ集団（例えば、抗原特異性または特定 のレセプターの発現に関して比較的均一なサブ集団）の１つであり得る。従って 、細胞株は、抗原特異性のような性質または細胞表面レセプター/リガンドに関 して、以下により詳細に議論するように、比較的均一であり得る。例示のために 、レセプター特異的単球株は、大部分の細胞が特定の細胞表面レセプター（細胞 株が、例えば単球の集団を特定のレセプターを発現する遺伝子で形質転換するこ とによって得られている）を有する単球であるインビトロでの細胞の集団をいう 。再び、例示のために、抗原特異的CTL細胞株は、大部分の細胞がウイルス性、 細菌性、または腫瘍性抗原のような特定の抗原（細胞株が、例えばＴ細胞の集団 を特定の抗原での反復的な刺激に曝露し、そして引き続いて抗原特異的CTLにつ いて富化することによって得られている）に特異的な細胞障害性Ｔリンパ球であ るインビトロでの細胞の集団をいう。 好ましくは、本発明で使用するためのこのような細胞株は、改変REM培養中で の使用の前に非分裂性にされる（例えば、照射によって）。しかし、あるいは（ または、さらに）（好ましくは拡大しているＴ細胞と同様のまたはそれより遅い 速度で）分裂しているが、後にネガティブ選択マーカー（例えば、その遺伝子を 有する細胞を阻害または死滅させるために用いられ得る自殺遺伝子、またはマー カーを有する細胞を単離および/または排除するために用いられ得る細胞表面 マーカー）を有するために排除され得る細胞株を利用し得る。後者の場合、細胞 株は、ネガティブ選択される前にREM培養物中である程度まで拡大することが可 能にされ得る。 好ましくは、本発明とともに用いられる哺乳動物細胞株は、比較的均一な株で ある（すなわち、細胞の少なくとも50％が特定の細胞型であり、より好ましくは 細胞の少なくとも70％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99 ％が特定の細胞型である）。しかし、このような細胞株に曝露することによって 拡大されるＴ細胞はまた、さらなる細胞株に（同時にまたは連続して）曝露され 得る。従って、例示のために、改変REM培養物（拡大されるＴリンパ球集団を含 む）は、１つの哺乳動物細胞株かまたはいくつかのこのような株に曝露され得る 。改変REMについて、拡大されるＴ細胞は、少なくとも１つのこのような哺乳動 物細胞株および/または因子の非細胞性混合物（例えば、サイトカイン、抗体、 可溶性リガンドなどを含む）に、本明細書中で議論されるように、曝露される。 培養物中で増殖させられるＴ細胞（すなわち「標的」Ｔ細胞）は、処置される 被験体から得られ得る。あるいは、Ｔ細胞は、処置される被験体以外の供給源か ら得られ得、この場合、レシピエントおよび移送される細胞は、好ましくは免疫 学的に適合性である（か、またはさもなくばレシピエントは移送される細胞に対 して免疫耐性にされる）。代表的には、標的Ｔ細胞は、組織、骨髄、胎児組織、 または末梢血由来である。好ましくは、細胞は末梢血由来である。Ｔ細胞が組織 由来の場合、単細胞懸濁液は、適切な培地または希釈液を用いて調製され得る。 Ｔリンパ球を含む単核細胞は、当該分野で周知の方法のいずれかにより、不均 一な集団から単離され得る。例示的な例として、Ficoll-Hypaque勾配遠心分離、 蛍光励起細胞ソーティング（FACs）、モノクローナル抗体コートプレート上での 選抜、および/または磁気分離技術が、本発明による拡大のために細胞の精製さ れた集団を得るために（別々にまたは組み合わせて）用いられ得る。抗原特異的 Ｔ細胞は、抗原提示細胞による刺激によって抗原特異的Ｔ細胞前駆体をまず活性 化することを含む当該分野で公知の標準的な培養技術によって、そしてクローン 集団については、希釈培養物を当該分野で公知の技術（例えば、RiddellおよびG reenberg(J ．Immunol．Meth.，128:189-201，1990);ならびにRiddellら(J ．Immu nol. ，146:2795-2804，1991に記載される技術)を用いて制限することによって単 離され得る。以下の実施例もまた参照のこと。制限的希釈培養物中でマイクロウ ェル中で単離されたＴ細胞クローンは、代表的に14日後に単細胞から２×10⁴〜 ５×10⁵個の細胞まで拡大した。 拡大のために、Ｔ細胞は、本明細書中に記載されるようにＴ細胞刺激性成分を 含むプラスチックの培養容器中の適切な培養培地中に置かれ得る。迅速な拡大の 初期の相は、一般に培養容器（そのサイズは、標的細胞の数に依存し、そしてそ れは代表的には25cm²フラスコであり得る）中で行われる。Ｔ細胞拡大のその後 のサイクルに用いられる培養容器のサイズは、開始のＴ細胞の数および必要な細 胞の数に依存する。異なるサイズの培養容器についての代表的な開始細胞数は、 以下の通りである：５×10⁴〜２×10⁵（約25cm²のフラスコ）；２×10⁵〜５×10⁵ （約75cm²のフラスコ）；５×10⁵〜１×10⁶（約225cm²のフラスコ）；および１ ×10⁶〜２×10⁶（ローラーボトル）。各フラスコとともに用いられる培地のおよ その初期容積は、25cm²（20〜30ml）；75cm²（60〜90ml）；225cm²（100〜200ml ）；ローラーボトル（500ml）である。 さらに大きいスケールの拡大については、種々の培養手段が用いられ得、これ らには例えば、スピナーフラスコ、細胞培養バッグ、およびバイオリアクター（ 例えば、中空線維バイオリアクター）が含まれる。 本明細書中で用いられる「フィーダー細胞」は、Ｔ細胞レセプター活性化（こ れは、Ｔ細胞レセプター複合体の抗CD3モノクローナル抗体との連結によって達 成され得る）とともに共刺激機能を提供するアクセサリー細胞である。REMにお ける使用のためのPBMCフィーダー細胞は、当該分野で公知の技術、例えば、白血 球除去血輸血（これは、最小の危険を伴う標準的な医学的手順である(例えば、W eaverら、Blood 82:1981-1984，1993を参照のこと)）によって得られ；そして、 これらのフィーダー細胞は、使用するまで液体窒素中に凍結保存によって保存さ れ得る。LCLは、標準的方法（例えば、Crosslandら、J ．Immunol. 146:4414-20 ，1991）を用いるEBV（例えば、EBVのB95-8株）での形質転換によって、または シクロスポリンＡの存在下での自発的増殖によって末梢血Ｂ細胞から生成され得 る。このようなLCL細胞は、迅速にそして無限に増殖する。 任意のフィーダー細胞を培養容器に添加する前に（PBMCまたは本明細書中に記 載の細胞株由来の細胞であろうとなかろうと）、このようなフィーダー細胞は好 ましくは有糸分裂を行うことを妨げられている。有糸分裂を防止する技術は当該 分野で周知であり、そして例えば照射を含む。例えば、任意のPBMCは、γ線で約 3000〜40O0radの範囲で照射され得る（好ましくはPBMCは、約3600radで照射され る）；任意のLCLはガンマ線で約6000〜12,000radの範囲で照射され得る（好まし くは、LCLは約10,000radで照射される）；そして、他の細胞株由来の任意の細胞 がまた、ガンマ線で約6000〜12.000radの範囲で照射され得る。先に議論された ように、ネガティブに選択可能なフィーダー細胞がまた用いられ得る。 Ｔ細胞クローンの抗原特異性が、培養系で細胞を拡大する前に一般に規定され るので、自己または同種フィーダー細胞のいずれかがＴ細胞増殖を支持するため に用いられ得る。同種フィーダー細胞を用いる能力は、患者がPBMCに存在するウ イルス（例えば、HIV）（従って、これはＴ細胞培養物を汚染し得る）によって 感染された状況において重要である。このような状況において、米国赤十字基準 によってスクリーニングされ、適切な血液ドナーであると推定された個体から得 られる同種フィーダー細胞の使用が、培養方法において用いられ得る。 Ｔ細胞レセプター活性化シグナル（通常抗原および抗原提示細胞によって提供 される）は、抗CD3モノクローナル抗体の培養系への添加によって達成され得る 。最も一般に用いられる抗CD3モノクローナル抗体は、「OKT3」であり、これはO rtho Pharmaceuticalsから臨床での使用に適した処方物として市販されている。 抗原ではなく抗CD3（「αCD3」）mAbのＴ細胞レセプターを連結するための手段 としての使用は、抗原提示細胞の供給源を有する必要性を回避する。抗原提示細 胞は、ウイルス特異的Ｔ細胞について、多数の適切な自己細胞を維持し、そして これらの細胞をインビトロで高力価のウイルスで感染することを必要とする。少 なくとも約0.5ng/ml、好ましくは少なくとも約１ng/ml、より好ましくは少なく とも約２ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体の濃度は、500〜3000倍の拡大が増殖 の約10〜13日以内に達成されるように、Ｔ細胞の迅速な拡大を促進した。代表的 には、約10ng/mlの抗CD3モノクローナル抗体の濃度が用いられた。 もちろん、抗CD3モノクローナル抗体の代替物として、Ridellら、J ．Immunol. 146:2795-2904，1991に記載されるように、Ｔ細胞レセプターが活性化され、そ して細胞が抗原提示細胞の添加によって刺激され得る。適切な抗原提示細胞は、 例えば、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、および関連のペプチド抗原でパルスされ た細胞を含む。 本発明の方法における使用のための培養培地は、任意の市販の培地であり得、 好ましくは以下を含むものであり得る：RPMI，25mMHEPES，25μM 2-メルカプト エタノール、４mM L-グルタミン、および11％ヒトAB血清。ウシ胎児血清は、ヒ トAB血清の代わりに用いられ得る。好ましくは、任意のフィーダー細胞の添加の 後に、抗CD3モノクローナル抗体、および培養培地が標的Ｔ細胞に添加され、そ してその混合物は、37℃で５％CO₂湿潤雰囲気中で、当該分野で周知の標準的な 細胞培養条件下でインキュベートされる。代表的には、このような条件は、必要 ならば、CO₂の排気および添加（例えば、５％CO₂を湿潤インキュベーター中で） を含む。 好ましくは、培地はまたインターロイキン２（IL-2）を補充される。代表的に は、組換えヒトIL-2が用いられるが、その機能的等価物もまた用いられ得る。好 ましくは、IL-2が１日目に添加され、そして３〜５日の間隔で再び添加される。 従って、IL-2は一般に１日目、５または６日目に添加され、そして再び８または ９日目に添加された。拡大は、少なくとも約５U/ml、より好ましくは少なくとも 約10U/mlのIL-2濃度を用いて改善され得る。一般に、約25U/mlの濃度が用いられ 得る。 Riddellら（前出）に記載されるように、REMを用いて拡大された抗原特異的Ｔ 細胞は、その抗原特異的機能を保持した。例えば、４つの異なるHIV特異的CD8+ 細胞障害性Ｔ細胞クローンは、関連の抗原（すなわち、HIV）を発現するウイル ス感染細胞を死滅させる能力を保持し、そして非関連のウイルス感染または形質 転換標的細胞に対する非特異的細胞溶解性活性を獲得しなかった。同様に、４つ の異なるCMV特異的CD8+細胞障害性Ｔ細胞クローンは、CMV感染細胞を死滅させる 能力を保持し、そして非関連のウイルス感染または形質転換標的細胞に対する非 特異的細胞溶解性活性を獲得しなかった。これらの特徴はまた、CD4+ヘルパーＴ 細胞に適用可能であった。従って、REMを用いて増殖した抗原特異的CD4+Ｔ細胞 は、適切なウイルス抗原および適切な抗原提示細胞(APC)に応答して増殖する能 力を保持した。さらに、REM下で培養された抗原特異的Ｔ細胞はまた、細胞周期 の静止状態の、非分裂相に入り得た；およびインビボで少なくとも４週間生存し 続け得た。従って、Ｔ細胞のアリコートは刺激周期（一般に12〜14日）の終わり で培養から除去され得、そしておよそ同数の照射PBMCを含む（抗CD3mAb、抗原、 またはIL-2を含まない）培養容器に置かれ得る。 拡大された集団の保存の間のフィーダー細胞としての照射PBMCの添加によって 、休止相に入りそして生存し続けるＴ細胞の能力が改善される。好ましくは、保 存の間のPBMCフィーダー細胞の休止Ｔ細胞に対する比は、少なくとも約２：１で ある。PBMCフィーダー細胞の添加無しでは、Ｔ細胞の生存度は、一般に有意に（ 代表的には、約10％以下のレベルに）低下する。 Riddellら（前出）に記載されるように、REMによって拡大されるＴ細胞は、小 さな丸い形態をとり、そして60〜95％はトリパンブルー色素排除によって培養28 目以降でさえ生存し続ける。hp-REMによって増殖されるＴ細胞はまた、IL-2の除 去により休止相に入り；そしてそれらは、抗原特異的Ｔ細胞レセプターによる再 刺激に際してプログラムされた細胞死（すなわち、アポトーシス）を行わなかっ た。再刺激（例えば、抗CD3 mAbまたは抗原での）に際し、Ｔ細胞は、IL-2に対 して再び応答性を獲得し、そして細胞周期のＳおよびG2相に入り得、そして細胞 数を増加させた。このような特徴は、細胞のインビボ生存および細胞性免疫療法 の効果にとって重要であると考えられている。対照的に、Ｔ細胞の増殖について の特定の以前に記載された方法は、サイトカイン除去またはＴ細胞レセプター再 刺激後のある割合の細胞において、アポトーシス性細胞死を引き起こすことが報 告されている(例えば、BoehmeSAおよびLenardo MJ，Eur ．J．Immunol.，23:1552 -1560，1992)。 機能性遺伝子の免疫療法において使用されるＴ細胞への導入が所望され得る多 くの異なる状況がある。例えば、導入された遺伝子は、移送されたＴ細胞の生存 度および/または機能を促進することによって治療の効果を改善し得る；または これらは、インビボ生存または移入の選択および/または評価を可能にする遺伝 子マーカーを提供し得る；またはこれらは、例えば、Lupton S.D.らMol ．and Ce ll Biol. ，11:6(1991)；およびRidellら、Human Gene Therapy 3:319-338(1992) によって記載されるように、細胞をインビボでネガティブ選択に対して感受性に することによって、免疫療法の安全性を改善する機能を取り込み得る；Luptonら による公開公報WO/92 08796およびWO/94 28143（優性のポジティブ選択可能マー カーをネガティブ選択可能マーカーと融合することによって誘導される二機能性 選択可能融合遺伝子の使用を記載する）もまた参照のこと。 組換え感染ウイルス粒子を遺伝子送達のために利用する種々の感染技術が開発 されている。これは、本発明のＴリンパ球の形質導入に対する現在好ましいアプ ローチを代表する。このようにして用いられているウイルスベクターには、サル ウイルス40（SV40）(例えば、Karlssonら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84 82: 158，1985を参照のこと)；アデノ随伴ウイルス（AAV）(例えば、B.J．Carter，C urrent Opinion in Biotechnology 1992，3:533-539)；およびレトロウイルス（ 例えば、Coffin，1985，17-71頁Weissら（編）、RNA Tumor Viruses、第２版、 第２巻、Cold Spring Harbor Laboratory，New York）由来のウイルスベクター が含まれる。従って、遺伝子移入および発現方法は数多くあるが、遺伝子物質を 哺乳動物細胞中に導入しそして発現するために本質的には機能する。上記の技術 の多くは、造血性またはリンパ球細胞を導入するために用いられており、これら には、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えば、Bermanら、前出、1984 ）；プロトプラスト融合（例えば、Deansら、前出、1984）；エレクトロポレー ション（例えば、Cannら、Oncogene 3:123，1988）；ならびに組換えアデノウイ ルス(例えば、Karlssonら、前出；Rentherら、Mol．Cell Biol．6:123，1986)； アデノ随伴ウイルス（例えば、LaFaceら、前出）；およびレトロウイルスベクタ ー（例えば、Overellら、Oncogene 4:1425，1989）での感染が含まれる。一次Ｔ リンパ球は、エレクトロポレーション（例えば、Cannら、前出、1988）およびレ トロウイルス感染（例えば、Nishiharaら、Cancer Res．48:4730，1988;Kasidら 、前出、1990；およびRiddell，S.ら、Human Gene Therapy 3:319-338，1992） によって首尾良く形質導入されている。 レトロウイルスベクターは、真核生物細胞への遺伝子移入のための高度に効率 的な方法を提供する。さらに、レトロウイルス組込みは、制御された様式で起こ り、そして１つの細胞あたりの新たな遺伝情報の１つまたはいくつかのコピーの 安定な組込みを生じる。 レトロウイルスは、ウイルスでコードされ、RNAで指向されるDNAポリメラーゼ を用いて、またはウイルスRNAゲノムを複製して鳥類または哺乳動物宿主細胞の 染色体DNA中に組み込まれる二本鎖DNA中間体を提供するために逆転写酵素を用い て複製するウイルスの１つの綱である。ほとんどのレトロウイルスベクターは、 マウスレトロウイルス由来である。しかし、本発明による使用に適用可能なレト ロウイルスは、任意の鳥類または哺乳動物細胞供給源由来であり得る。これらの レトロウイルスは、好ましくは広宿主性であり、これはこれらがいくつかの種（ ヒトを含む）の宿主細胞を感染し得ることを意味する。レトロウイルスゲノムの （および本明細書中で記載されるように用いられるレトロウイルスベクター）特 徴は、レトロウイルス長末端反復（すなわちLTR）であり、これはレトロウイル スゲノムの5'および3'末端でわずかに改変された形態で見出される約600塩基対 の非翻訳領域である。DNAにプロウイルスとして組み込まれた場合に、レトロウ イルスLTRは、各末端で短い直接反復配列を含み、そしてRNAポリメラーゼIIによ る転写の開始ならびにRNA転写物の3'切断およびポリアデニル化のためのシグナ ルを送る。LTRは、ウイルス複製に必要な全ての他のシス作用配列を含む。 「プロウイルス」は、レトロウイルスのDNA逆転写物で、適切な宿主細胞にお いて染色体DNAに安定に組み込まれるもの、またはそのクローン化されたコピー 、もしくはレトロウイルスDNAの組み込まれていない中間体の形態のクローン化 されたコピーをいう。適切なヘルパーウイルスの存在下、または汚染ヘルパーウ イルスの同時産生を伴わないでキャプシド産生を可能にする適切な配列を含む細 胞株において、プロウイルスの順向きの転写および感染性ウイルスへのアセンブ リが起こる。Mannら（Cell 33:153,1983）は、組換えレトロウイルスのヘルパー のないストックを作製するのに使用され得る細胞株（例えば、Ψ2）の開発を記 載する。これらの細胞株は、組み込まれたレトロウイルスゲノムを含み、これは シス位にキャプシド形成のために必要とされる配列を欠いているが、トランスに インタクトなビリオンを産生するために必要な全ての遺伝子産物を提供する。組 み込まれた変異のプロウイルスから転写されたRNAは、それ自身ではパッケージ 化 され得ないが、これらの細胞は、同じ細胞に導入された組換えレトロウイルスか ら転写されたRNAをキャプシド形成し得る。得られたウイルス粒子は、感染性で はあるが、複製能を欠く。これは、ウイルス粒子をキャプシド形成を可能にする 相補的な遺伝子情報を欠く細胞への導入後、感染性ウイルスを産生し得ない有用 なベクターにする。同種指向性のウイルスエンベロープをコードするトランス作 用エレメントを有する細胞株（例えば、Ψ2）におけるキャプシド形成は、同種 指向性の（制限された宿主範囲の）子孫ウイルスを提供する。あるいは、両種種 向性のパッケージング遺伝子を含む細胞株（例えば、PA317、ATCC CRL 9078；Mi llerおよびButtimore，Mol．Cell．Biol．6:2895、1986）におけるアセンブリは 、両種指向性の（広範な宿主範囲の）子孫ウイルスを提供する。このようなパッ ケージング細胞株は、必要なレトロウイルスのgag、polおよびenvタンパク質を トランスに提供する。この戦略は、哺乳動物細胞に対して非常に感染性である一 方、標的細胞のゲノムに組み込まれた後、さらなる複製は不可能であるレトロウ イルス粒子の産生を生じる。env遺伝子産物は、標的細胞の表面上のウイルスレ セプターへのレトロウイルスの結合の原因であり、従って、レトロウイルスの宿 主範囲を決定する。PA317細胞は、両種指向性エンベロープタンパク質を有する レトロウイルス粒子を産生する。このレトロウイルス粒子は、ヒトおよび他の種 の起源の細胞を形質導入し得る。他のパッケージング細胞株は、同種指向性エン ベロープタンパク質を有する粒子を産生する。この粒子は、マウスおよびラット の細胞のみを形質導入する。 多数のレトロウイルスベクター構築物が、多数の外来性遺伝子を発現するため に首尾良く使用されている（例えば、（Weissら（編）RNA Tumor Viruses、第２ 版、第２巻（Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1985、17〜71頁）に おけるCoffinを参照のこと）。挿入配列を有するレトロウイルスベクターは、一 般に機能的であり、そして常にレトロウイルス感染について阻害性である配列は ほとんど同定されていない。機能的ポリアデニル化モチーフは、レトロウイルス のRNA合成をブロックすることによりレトロウイルス複製を阻害し、そしてレト ロウイルス粒子中にパッケージ化され得る約11kbの配列のサイズの上限が存在す る（Coffin、前出、1985）。しかし、当初は問題と考えられた複数の内在性プロ モーターの存在（Coffln、前出、1985）は、いくつかのレトロウイルス構築物に おいて良好に耐性であることが見い出された（Overellら、Mol．Cell．Biol．8: 1803,1983）。 レトロウイルスベクターは、インビトロでレトロウイルスベクターで形質導入 され、そしてレシピエントマウスに移植されたマウス造血幹細胞の発生を追跡す るための遺伝子標識としていくつかのグループにより使用されている（Williams ら、Nature 310:476、1984；Dickら、Cell 42:71、1985；Kellerら、Nature 318 ：149、1985）。これらの研究により、感染した造血細胞がレシピエント動物の 造血組織およびリンパ組織を再構成し、そして細胞がインビボで通常の発生能を 示すことが実証された。標識した細胞は、レトロウイルスベクター配列の存在を 示し得る多数の分子生物学技法（最も有名なものはサザン分析およびPCR（ポリ メラーゼ連鎖反応））のいずれかを用いて可視化され得る。レトロウイルスベク ターを用いて遺伝学的に標識する能力はまた、これらの技法が自己の細胞の移植 片を追跡するために使用され得る臨床的な設定条件において有用である。このア プローチはすでに、Rosenbergら（N．Engl．J．Med.323:570,1990）による末期 ガン処置のためにTIL（腫瘍浸潤性リンパ球）治療を受けた患者におけるTILを追 跡するために使用されている。これらの細胞のマーカー遺伝子を用いた形質導入 は、インビトロでの細胞機能不全には関連していなかった（Kasidら、Proc.Natl .Acad.Sci.USA 87:473,1990）。 多くの遺伝子産物がレトロウイルスベクターで発現されている。これは、レト ロウイルスLTR中に含まれるプロモーターの転写制御下に発現されるべき配列を 配置することによるか、またはLTR間に挿入された異種プロモーターの制御下に それらを配置することのいずれかにより達成され得る。後者の戦略は、ベクター において優性選択可能なマーカー遺伝子を同時発現し、したがって特定のベクタ ー配列を発現する細胞の選択を可能にする方法を提供する。 刺激因子の過剰発現（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）が処置され る個体にとって毒性であり得ることが予期される。従って、インビボでネガティ ブ選択に感受性である本発明のＴ細胞を生じる遺伝子セグメントを含むことは本 発明の範囲内である。「ネガティブ選択」により、融合細胞が個体のインビボ状 態における変化の結果として排除され得ることが意味される。ネガティブ選択表 現型は、投与される因子（例えば、化合物）に対して感受性である遺伝子の挿入 から生じ得る。ネガティブ選択可能な遺伝子は、当該分野で公知であり、そして 、とりわけ以下が挙げられる：単純ヘルペス１型チミジンキナーゼ（HSV-I TK） 遺伝子（Wiglerら、Cell 11:223,1977）（これは、ガンシクロビル感受性を与え る）；細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（phosphribosy ltransferase）（HPRT）、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ APRT）遺伝子、細菌性シトシンデアミナーゼ（Mullenら、Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 89:33(1992)）。 さらに、Ｔ細胞において、インビトロでのネガティブ選択可能な表現型の細胞 選択を可能にするポジティブ標識を含むことは有用である。ポジティブ選択可能 なマーカーは、宿主細胞に導入されることにより遺伝子を有する細胞のポジティ ブ選択を可能にする優性発現型を発現する遺伝子であり得る。この型の遺伝子は 、当該分野で公知であり、とりわけハイグロマイシンＢに抵抗性を与えるハイグ ロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質G418に対する 耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子 （neoまたはaph）、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子、アデノシンデアミナ ーゼ遺伝子（ADA）、および多剤耐性（MDR）遺伝子が挙げられる。 好ましくは、ネガティブ選択可能なエレメントの欠損がまた、ポジティブ選択 可能なマーカーの欠損により必然的に伴うようにポジティブ選択可能なマーカー およびネガティブ選択可能なエレメントは連結される。さらにより好ましくは、 ポジティブ選択可能なマーカーおよびネガティブ選択可能なマーカーは融合され て、その結果一方の欠損が必然的に他方の欠損を導く。発現産物として上記の所 望のポジティブ選択特性およびネガティブ選択特性の両方を付与するポリペプチ ドを得る融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラ ーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（HyTK）である。この遺伝子の発現により、イ ンビトロでポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性を、そしてインビボ でのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドを得 る。Lupton S.D.ら、Mol．and Cell．Biology 11:3374-3378,1991を参照のこと 。 さらに、好ましい実施態様において、キメラレセプターをコードする本発明のポ リヌクレオチドは、融合遺伝子を含むレトロウイルスベクター、特にインビトロ でポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでのネガテ ィブ選択のためのガンシクロビル感受性を付与するレトロベクター（例えば、Lu pton,S.D.ら（1991））前出に記載のHyTKレトロウイルスベクター中にある。S.D ．LuptonによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の刊行物もまた参照のこと 。これらは、優先ポジティブ選択可能なマーカーとネガティブ選択可能なマーカ ーとの融合に由来する２機能の選択可能な融合遺伝子の使用を記載している。 好ましいポジティブ選択可能なマーカーは、hph、neoおよびgptからなる群か ら選択される遺伝子に由来し、そして好ましいネガティブ選択可能なマーカーは 、シトシンデアミナーゼ、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRTおよびgptからなる群 から選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは２機能の選択可能な 融合遺伝子であり、ここでポジティブ選択可能なマーカーはhphまたはneoに由来 し、そしてネガティブ選択可能なマーカーはシトシンデアミナーゼまたはTK遺伝 子に由来する。 種々の方法が、当該分野で周知なようにＴリンパ球を形質導入するために使用 され得る。代表的に、レトロウイルス形質導入が以下のように実施され得る：本 明細書中に記載のREMを用いて刺激後１日目に、20〜30単位/ml IL-2を有する細 胞を提供し得る；１、２または３日目に、培地の半量を、標準方法に従って調製 したレトロウイルス上清で置換し、そして培養物に5μg/mlポリブレンおよび20- 30単位/ml IL-2を補充し得る；４日目に、細胞を洗浄し、20〜30単位/ml IL-2を を補充した新鮮な培養培地中に配置する。５日目に、レトロウイルスへの曝露は 繰り返され得、６日目に、細胞を30単位/ml IL-2を補充した選択培地（例えば、 レトロウイルスベクターにおいて提供される抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生 物質を含む）に配置し得；13日目に、生存細胞を死細胞から、Ficoll Hypaque密 度勾配分離法を用いて分離し得、次いで生存細胞をREMを用いてサブクローン化 し得る。 細胞をREM開始後１、２、または３日目にベクターに曝露する場合、抗原特異 的なCTL（55E1、EBV特異的なCD8+クローン株）およびレトロウイルス（LAPSN、C lowesら、1994、J．Clin．Invest.93:644（フローサイトメトリによるアルカリ ホスファターゼ発現のモニターを可能にした））を用いて、高度の形質導入頻度 が達成され得る。 上記のように、本発明にしたがって調製したＴ細胞は、レシピエント個体にお いて免疫を回復、増強、および／または調節するために使用され得る。「免疫」 は、リンパ球応答が指向される、病原体による感染または腫瘍に対する応答に関 連する１つ以上の身体的症状を軽減する事を意味する。投与される細胞の量は、 通常は病原体に対する免疫を有する正常な個体において存在する範囲にある。従 って、CD8+CD4-細胞は、通常、各注入液が少なくとも10⁶〜10¹⁰細胞/m²の範囲で あって、好ましくは少なくとも10⁷〜10⁹細胞/m²である注入液により投与される 。このクローンは、単回注入またはある範囲の時間にわたる複数注入により投与 され得る。しかし、異なる個体が、応答性において異なることが予想されるため 、注入される細胞の型および量ならびに注入回数および複数注入が行われる場合 の時間の範囲は、看護する内科医により決定され、そして日常の試験により決定 され得る。Ｔリンパ球（細胞障害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ 球）の十分なレベルの産生は、本発明の迅速な拡大方法を、本明細書中に例示さ れるように用いることにより容易に達成可能である。 REMを使用して拡大されたＴ細胞が、ベクター（例えば、リンパ球を用いる細 胞性免疫療法および遺伝子治療という状況における主な用途であるレトロウイル スベクター）を用いて非常に高いレベルの形質導入を示したことも観察されてい る。 Riddelら、前出における実施例は、基本的なREMプロトコル（すなわち、hpREM ）を例示し、そしてまた、拡大されたＴ細胞集団の調製および使用へのREM技術 の一般的な適用を例示することに役立ち、そして、その意味において、改変REM の状況に適用され得る技術および原理を例示する。 以下の実施例は、hpREMプロトコルの特徴であるPBMCおよび／またはEBV-LCLフ ィーダー細胞の低減または除去を可能にする本発明の従った例示的なREM技術の 改変（すなわち、改変REM）を示す。 以下に示した全ての実施例は、当業者にとり、さらなる指針として提供され、 そして本発明を制限するものとしては決して解釈されない。 実施例 実施例１ 迅速な拡大における単球Fc-γレセプターの寄与 大過剰量においてhp-REMを駆動するために使用されるPBMCフィーダー細胞は、 Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、および顆粒球、およびナチュ ラルキラー（「NK」）細胞を含む細胞の異種集団である。 hp-REMプロトコルにおいてPBMCにより供給されると考えられている活性の一つ は、IgG抗体分子のFc部分に結合し得るFc-γレセプターの供給である。特に、hp -REMプロトコルにおけるＴ細胞活性化は、PBMC集団内での単球上のFc-γレセプ ター（「FcγR」）の抗CD3抗体（例えば、OKT3）のFc部分との結合により媒介さ れ得、従ってこの抗体は、拡大されるべき集団内でＴ細胞に対して単球により提 示され得ると考えられている。このような活性化後、Ｔ細胞は、「自己分泌性」 増殖刺激サイクルを開始し得ると考えられる。このサイクルにおいて、活性化Ｔ 細胞は、増殖刺激サイトカインを分泌、そしてまたこのようなサイトカインに対 する細胞表面レセプターの発現の増大の両方を行う。従って、Fc-γレセプター 、あるいはそうでなければ効果的に抗CD3抗体を提示するレセプターを供給する ことは、Ｔ細胞拡大の開始および促進において機能すると考えられている。 hp-REMプロトコルにおいて単球Fc-γレセプターの寄与を検証および定量化す ることは、PBMCフィーダー細胞から単球を涸渇させることにより達成され得る。 末梢血液単核細胞は、上記のように、種々の供給源のいずれかから得られ得る 。以下の例について、バフィーコート層（健常なヒトドナーに由来する）を赤十 字血液銀行から得た。PBMCを、上記で参考にしたように標準技術を用いて、Fico ll勾配を用いて単離し、洗浄し、そして細胞培養培地（摂氏４度で）に保存した 。 種々の技術が、PBMCのような混合集団から種々の細胞型を分離するために使用 され得る。例示のために、単球／マクロファージ集団の涸渇をsephadex G-10ク ロマトグラフィーを用いて実施した（例えば、「Current Protocols in Immunol ogy」（Wiley Interscience，1992）の第3.6章を参照のこと）。単球の涸渇は、 FITC結合抗CD14モノクローナル抗体（例えば、PharmaGenから入手可能）での染 色に続くフローサイトメトリーによりモニターされた。涸渇前のCD14発現は、全 体の細胞の約7,4％であった。涸渇の後では、約1.5％であった。 PBMCの迅速な拡大を促進する能力に対する単球を涸渇させることの影響を評価 するために、標準hp-REMプロトコルを使用して、そして単球を涸渇させたPBMCを 涸渇させていないPBMCと比較した。 例示の目的のために、CTL株（「27EB」と命名する）を上記に類似した手順で 調製した。簡潔に述べると、PBMCは、一人の個体の血液試料から得、そして同じ 個体由来のEBV-LCLと培養した。２週間後、CD8+CTLを、抗CD8抗体でコートした フラスコ（例えば、Applied Immune SciencesのAIS-CD8+「CELLectorフラスコ」 ）を用いて「パンニング（panning）」ことにより単離した。 これら全ての例示的な実施例について、PBMCは、3600rad（Cs-137供給源を使 用して）でγ照射し、そしてEBV-LCLを10000radで照射した。 培養は、一般に、hp-REMについては10％ウシ胎児血清をヒト血清の代わりに使 用したことを除いて上記のように維持した。そしてIL-2を25単位/mlで使用し、 そして一般に「０日目」に最初に添加した（培養開始後１日に反するように）、 次いで３〜５日間の間隔で（通常、５日目、そしてついで再び８日目に）、さも なければ、hp-REMプロトコルについて上記のように添加した。OKT3は、一般に約 10ng/mlで使用した。細胞は代表的に、培養14日後に採集しそして定量化した。 この例について、培養物を5×10⁴CTL(「27EB」、上記のように)、5×10⁶照射E BV-LCL（すなわち、CTLの100:1過剰量）（上記のように調製し、そして照射した ）、10ng/ml OKT3、25U/ml IL-2および2.5×10⁷照射PBMC（すなわち、CTLの500: 1過剰量）（単球涸渇または涸渇していないかのいずれか、上記のように調製し 、そして照射した）で確立した。代表的なコントロール培養物は、例えば、なに も添加していないCTLの培養物を含む。培養14日後、細胞を採集し、そして定量 化した。 涸渇していないPBMCを用いた標準的なhp-REMプロトコルの場合において、約4. 86×10⁷Ｔ細胞を回収すると、約882倍の拡大を示した。 表１に示すように、単球を涸渇させたPBMCを代わりに使用した場合、約2.7×1 0⁷Ｔ細胞のみが回収された。これは、コントロール比の約55％にまで拡大率が低 下したことを示す。 上記の結果は、PBMC集団内の単球が明らかに、Ｔ細胞の迅速な拡大をもたらす PBMCの能力に有意に寄与するというさらなる徴候を提供する。以下の例において 、REMの大過剰のPBMCフィーダー細胞に対する依存性を低減させる手段としてPBM C以外の供給源からFcγR活性またはその同等物を提供する能力。実施例２ 改変REMにおける単球Fc-γレセプター活性の置換 上記のように、単球上に見い出されるFc-γレセプターは、抗体（例えば、抗C D3抗体（例えば、OKT3））の存在下でPBMCによって供給される刺激活性の重要な 部分を担っていると考えられている。 異種PBMC集団によって供給された刺激成分を同定した後、別の供給源からその 活性（またはその同等物）を提供することにより、PBMC自身に対する依存性を低 減させることが可能である。好ましくは、上記の改変REMにおける使用について 、同定された刺激活性は、哺乳動物細胞株により、またはREM培養物への非細胞 性添加物として供給される。例示的な両方の実施例を以下に提供する。a. 改変REMにおける哺乳動物細胞株の使用 PBMC（またはLCL）により供給された、同定されたＴ細胞刺激活性のうちの１ つを発現する細胞株を、効果的に使用して、このようなPBMC（またはLCL）フィ ーダー細胞におけるREMの依存性を低減させ得る。このような細胞株をこのプロ トコルに組み込む場合、上記のように、細胞株は、ウイルスのような外来因子の 潜在的な供給源ではないことが好ましい。従って、使用する補助的細胞株は、好 ましくは、EBV形質転換細胞株（例えば、EBV-LCL）ではない。さらに、ヒトＴ細 胞の迅速な拡大のために、より高等な哺乳動物（特に、霊長類、最も好ましくは ヒト）に由来する細胞株を使用することが一般に好ましい。 Fc-γレセプターを発現する哺乳動物細胞株は、文献に記載されており、そし て種々の供給源から得られ得る。例えば、多くのヒト腫瘍株がFc-γレセプター を発現することが実証されてきている（例えば、R.J．Looneyら、J．Immunol．1 36:1641(1986)（K562、赤白血病細胞株を記載する）；S.J．Collinsら、1977．N ature 270:347(1977)（HL60、前骨芽球性細胞株を記載する）；C.LozzioおよびB ．Lozzio,Blood 45:321(1975)(U937、組織性リンパ腫細胞株を記載する)；およ びG.R．Crabtreeら、Cancer Res．38:4268(1979)を参照のこと）。 Fc-γセプターを発現する細胞はまた、標準的な分子生物学技術を用いて容易 に調製し得る。例示のために、FcγR陽性細胞株を、哺乳動物細胞を形質転換す るための種々の周知の技術のいずれかを用いてFc-γレセプターをすでに発現す る不死化した細胞により得られ得る。あるいは、存在する細胞株（例えば、ヒト 細胞株）を、細胞にFc-γレセプターをコードする遺伝子を導入することにより 遺伝学的に改変して、Fc-γレセプターを発現させ得る。従って、選択すべき細 胞株（例えば、刺激成分（例えば、サイトカインまたは細胞接着補助分子（両者 とも以下に考察される））をすでに発現するヒト細胞株）は、さらにFcγRをコ ードする遺伝子の導入により改変され得る。 例示のために、ヒト単球は、IgG抗体結合についての親和性において異なる２ つの異なるFc-γレセプター型（「FcγRI」および「FcγRII」）を明らかに発現 する（例えば、RavetchおよびKinet Annu．Review of Immunol．9:457-492,1991 を参照のこと）。特に、FcγRIは、一般に高親和性レセプター（Ka=10⁸-10⁹）で ある一方、FcγRIIは一般に低親和性レセプター（Ka=10⁷）である。FcγRIおよ びFcγRIIの両方の遺伝子は、同定され、そしてクローン化されている。先の研 究は、遺伝子移入の後のFcγRIIレセプターを発現する線維芽細胞は、効果的に 単球涸渇Ｔリンパ球培養物の抗CD3依存的増殖を回復し得ることを実証している （例えば、Peltzら、J．Immunol．141;1891(1988)を参照のこと）。従って、Fc γRを発現するように遺伝子的に改変した細胞株は、hp-REMプロトコルにおけるP BMCにより供給される刺激活性の重要な部分を供給し得るはずである。従って、 このような細胞株の使用は、潜在的に他の成分（例えば、以下に記載のようなサ イトカインまたは接着補助分子）と組み合わせて、迅速な拡大に要求されるPBMC の数における低減をそれによって可能にする。b. 改変REMのための非細胞性添加物の使用 上記のような細胞株を介してＴ細胞刺激成分を提供することに加えて、多数の 成分（または、それらの機能的等価物）を、改変REM培養培地に対する非細胞性 添加物として、提供することが可能である。従って、明らかにPBMC単球が寄与す るFcγR活性に対する異なる代替物として、FcγR活性の代替物または構造的同等 物を提供することが可能である。例えば、抗体（例えば、抗CD3抗体）のＴ細胞 への「提示」を達成するための代替手段は、このような抗体をビーズ（例えば、 sephadexビーズまたは磁気ビーズ）に結合させることである。 可溶性抗体（FcγRを介しておそらく提示される）の代替物に対するこのよう なビーズ結合抗体の能力を評価するために、本発明者らは、実験を実施し、抗CD 3結合磁気ビーズが効果的にREMプロトコルにおいて可溶性抗CD3モノクローナル 抗体を置換し得るか否かを決定した。 抗CD3結合磁気ビーズ（「BioMag抗CD3」）は、Perceptive Diagnosticsから入 手した。使用した粒子は、約１μmの大きさで、そして約20μg抗体/1×10⁷ビー ズでロードされた抗CD3モノクローナル抗体を共有結合している。ビーズの範囲 は、hp-REMにおいて使用されるPBMC集団内に提示されると予測される抗原提示細 胞（「APC」）の数に近似するように選択した。 hp-REMにおける実際の影響を定量化するために、本質的に実施例１に記載のよ うに、5×10⁴CTL、5×10⁶照射EBV-LCL、2.5×10⁷照射同種PBMCおよび25U/ml IL- 2を含むＴ細胞拡大培養物を確立した。10ng/mlの可溶性抗CD3抗体（OKT3）また は 種々の量の抗CD3結合ビーズのいずれかを、Ｔ細胞活性剤として添加した。本質 的に実施例１に記載のように、細胞培養物を拡大して、そしてＴ細胞の数を数え た。 結果を表２に示す。抗CD3結合ビーズを用いたＴ細胞拡大が、可溶性OKT3より もいくらか少なかった場合（約80％の範囲で）、結果は、抗体コートビーズが、 改変REMプロトコルにおいてＴ細胞活性化/増殖の実質的なレベルを誘導し得るこ とを示唆する。PBMC集団内の、APCにより潜在的に提供される他の活性と比較し て抗CD3提示の相対的な役割のさらに詳細な定量化は、種々のサイトカインまた は他の可溶性刺激因子（以下にさらに詳細に記載される）の存在下または非存在 下のいずれかで、APC涸渇培養物を用いて抗CD3ビーズとともに得られ得る拡大率 を評価することにより容易に得られ得る。 本明細書中に記載のような種々のPBMC置換成分を提供する相対的効率の比較は 、種々の成分をPBMC制限REM培養物（すなわち、PBMCが至適下(sub-optimal)レベ ルで含まれる培養物）に種々の濃度で添加し戻す標準的な抗体価測定分析により 容易に達成され得る。例示のために、以下に記載の実験は、外因性サイトカイン の種々の組み合わせを、PBMC集団が至適出発レベルの２分の１から４分の１にま で減少した至適下hp-REM培養物に添加する影響を評価した。類似のアッセイが、 他の成分（例えば、FcγRを発現する細胞または接着補助成分、抗CD3結合ビーズ 、および／または他の可溶性刺激因子（例えば、Ｔ細胞表面成分に対して指向さ れたモノクローナル抗体）について、以下により詳細に記載するように容易に実 施 され得る。実施例３ 迅速拡大におけるＢ細胞の寄与 PBMCにより供給される刺激へのＢリンパ球の寄与を数量化するために、本発明 者らは、Ｂ細胞涸渇PBMC集団がREMを支持する相対的能力を試験した。 Ｂ細胞のような細胞（または本明細書中では他の細胞という）の単離は、涸渇 される細胞に存在することが知られる細胞表面マーカーに対して指向された抗体 を用いて好都合に達成され得る。種々のこのようなマーカーが周知であり、種々 の「CD」または「分化クラスター」マーカーを含む；そして多くのこのようなマ ーカーに対する抗体が容易に入手可能である。また、多くのこのようなマーカー について、抗体と結合したビーズは、容易に入手可能であり、大いに細胞分離を 容易にし得る。 例示のために、CD19はＢリンパ球に対して周知の細胞表面マーカーである。抗 CD19抗体と結合した磁気ビーズは、Dynalから得られ、製造者により記載された 標準的な手順に従ってＢ細胞のPBMC集団を涸渇させるために用いられ得た。 涸渇は、CD19染色後の蛍光活性化細胞分別（「FACS」）により評価した。PBMC集 団を、涸渇前に約12％のＢ細胞を含み、かつ涸渇後１％未満のＢ細胞を含むと概 算した。 hp-REMにおけるＢ細胞涸渇の影響を試験するために、５×10⁴ CTL、５×10⁶照 射EBV-LCL、2.5×10⁷照射異種PBMC（Ｂ細胞涸渇または非涸渇）、10ng/ml OKT3 および25U/ml IL-2を含むＴ細胞拡大培養物を樹立した：そして14日後、Ｔ細胞 を採取し、上記のように数量化した。表３に示す結果は、Ｂ細胞がまたPBMCによ り供給された刺激活性に寄与することを示唆した。 本実験および前述の実験におけるＴ細胞拡大のレベルの減少は、hp-REMプロト コルにおける単球およびＢ細胞の抗原提示細胞（「APC」）としての役割を示唆す る。（Ｔ細胞拡大を実施例１で観察されたレベル〜本実験において観察されたレ ベルにまで阻害できないことは、用いた種々の方法および／または用いたアッセ イにより検出されなかった少数のAPCの存在による細胞涸渇における差異の結果 であり得る。実施例１で測定された単球涸渇は約7.5％から約1.5％にまで単球集 団を減少させたのみであることもまた注目されるべきである。） PBMC集団から種々の細胞型を涸渇させるために用いられ得、従って本明細書中 に記載の結果のさらなる確証および数量化を提供するために用いられ得る多くの 他の周知の技術がある。従って、例えば、ナイロンウールは、PBMC集団から単球 およびＢ細胞の両方（ならびに任意の線維芽細胞）を除去するために用いられ得 る。改変REMにおける種々のAPC活性の置換を以下の実施例においてさらに記載す る。実施例４ 改変REMにおける種々のAPC活性の置換 上記のＢ細胞涸渇および単球涸渇実験において得られた結果は、PBMC集団にお ける推定APCがPBMCにより供給される刺激に寄与するようであることを示した。 実施例１〜２において記載したように、抗CD3抗体の提示におけるFcγR活性の役 割が推定APCにより提供された活性の幾分かを占めることが予期される。このよ うなFcγR活性は、別の（非PBMC）供給源、例えば、FcγRを発現する細胞株また は抗CD3結合ビーズ（これもまた上述された）によって供給され得る。 PBMC集団内のAPCはまた、活性化／増殖プロセスをさらに増強すると予期され る接着補助分子および刺激性サイトカインに寄与すると考えられる。（さらに、 以下に記載のように、PBMC集団内のＴリンパ球もまた、抗CD3抗体を介する活性 化の結果として刺激性サイトカインを生産することが予期される。）このような 接着補助分子およびサイトカインの役割を、以下の実施例により詳細に記載する 。実施例５ REM におけるサイトカインの寄与 抗CD3抗体（例えば、OKT3）がＴ細胞クローンのインビトロ拡大のための増幅 を活性化および誘導するために用いられるが、γ照射フィーダー細胞PBMC集団は また、抗CD3抗体により活性化可能であると考えられるＴリンパ球の実質的な集 団を含む。このような照射フィーダー細胞は分裂できない一方、抗CD3抗体によ るそれらの活性化は、さらなるリンパ増殖性シグナルを提供し得る多数のサイト カインの分泌を生じると考えられる。例えば、II-2に加えて、Ｔ細胞の抗CD3活 性化は、他の刺激性サイトカイン（IL-1αおよびβ、IL-6、IL-8、GM-CSF、IFN- αならびにTNFαおよびβを含む）の分泌を生じると考えられる。それらのサイ トカインの１つ以上の分泌が、hp-REMプロトコル内のPBMCにより提供された増殖 性刺激に実質的に寄与し得ると考えられる。特徴づけられた大多数の他のサイト カインのうち、これらの多くが、Ｔ細胞の増殖を刺激することが知られている。 これらサイトカインは、例えば、IL-7およびIL-15を含む。他は、本明細書中に 記載のように、Ｔ細胞増殖を増強するそれらの能力、および多数のPBMCへのREM の依存を減少させるそれらの相対的能力について容易にスクリーニングされ得る 。 例示のために、本発明者らは、REMの促進におけるこのようなサイトカインの 潜在的な役割を数量化するために、多数の外因的に供給されたサイトカインが、 PBMCフィーダー細胞の数が至適下レベルに減少したREM培養物におけるＴ細胞拡 大を再構成する能力を分析した。 上記のアッセイに本質的に類似の手順に従い、５×10⁴ CTL、５×10⁶ EBV-LCL 、10ng/ml OKT3および25U/ml IL-2を含む培養物を、2.5×10⁷照射PBMC（100％コ ントロール）、1.25×10⁷照射PBMC（50％）または6.12×10⁶照射PBMC（25％）の いずれかと共に樹立した。 多数のサイトカインがIL-2と相乗的に作用して、Ｔ細胞増殖を促進し得ると考 えられる。この例示の実験において、以下の外因性サイトカインを、記載のよう に単独または種々の組み合わせのいずれかで培養物に添加した：IL-1（40U/ml） 、 IL-4（200U/ml）、IL-6（500U/ml）およびIL-12（20U/ml）。 表４に示す結果は、このようなサイトカインが、PBMC集団が至適下レベルに減 少するときＴ細胞拡大を実質的に増強し得ることを確証する。拡大レベルが至適 数のPBMCフィーダー細胞で観察されたレベルに回復しなかったことは予期されな くはない。なぜなら、PBMC集団は、本明細書中に記載のさらなる刺激活性を供給 すると考えられるからである。データは、サイトカイン反応混液中のIL-4のIL-1 2との置換は、増幅をさらに増強し得ることを示唆する。多くのこのようなサイ トカインの特性、供給源、ならびにDNAおよびタンパク質配列は、サイトカイン 参照本（例えば「The Cytokine Facts Book」R．Callardらによる、前出）に記 載されている。例示の目的のために１つの例をとると、IL-12は、Ｔリンパ球に よるIFNγ産生を誘導し、そして末梢血リンパ球の増幅を共刺激する２つのペプ チド鎖（p35およびp40）を含むヘテロダイマーサイトカインであることが知られ ている。IL-12はまた、TH1 Ｔリンパ球の増幅および分化を刺激し、そしてＢ細 胞、単球／マクロファージ、およびＢリンパ芽球腫細胞により産生されることが 知られている。p35およびp40の両鎖の完全アミノ酸配列が公知であり、Genbank から入手可能である（Accession番号はCallardにおいて提供される）。IL-12レ セプターもまた特徴づけられている（同書）。 さらなるサイトカインおよびそれらの反応混液は、類似の様式で容易に試験さ れ得る；次いで、刺激性反応混液の比較が、ずっとより低いレベルのPBMCを用い て行われ得る。 フィーダー細胞上清の可溶性成分が低PBMC REMに対して有効な刺激を提供し得 るというさらなる証拠を、PBMC集団を至適下レベルに減少させ、REM上清を用い て可溶性刺激シグナルを提供することにより得た。 簡単に述べれば、標準的なhp-REMプロトコルを、抗原特異的CTLクローンを用 いて、PBMC（500:1）、EBV-LCL（100:1）、抗CD3抗体（10ng/ml）および組換え ヒトIL-2（25単位/ml）を用いて48時間REM拡大を実施することにより上記のよう にして実施した。48時間後、細胞を採取し、そして上清（「REM上清」）を、PBM Cが至適下レベル（すなわち、至適の１/2、1/4もしくは1/8または「SOP」）に減 少したREM拡大における可溶性刺激因子の供給源として試験した。 表５に示す結果は、このような可溶性因子が、低PBMC REMの背景において有効 な刺激シグナルを提供し得ることを確証する。特に、PBMCが減少するとき観察さ れた増幅倍レベルの減少の大部分は、標準培地の代わりにREM上清を用いること により克服され得る。さらに、PBMCが減少するほど（すなわち、至適の1/8まで ）、REM上清を用いることにより観察される効果がより大きくなる（REM培地を用 いない359倍に対してREM培地を用いる1022倍平均拡大）。従って、このような上 清および／またはそれらの成分（例えば、個々のサイトカインまたはそれらの 「反応混液」は、PBMCのような大過剰のフィーダー細胞を用いてREMを実施する 必要性を減少させるために用いられ得る。 実施例６ 改変REM中のサイトカイン活性の置換 上述のように、大多数のサイトカインが記載されており、広範に入手可能であ る。これらサイトカインは、Ｔリンパ球を刺激することが知られる多数のサイト カインを含む。当業者に明らかなように、このようなサイトカイン（それらがＴ 細胞を刺激することが既に知られているか否かに関わらず）は、上記の方法のよ うな方法を用いて、迅速拡大を増大する能力について容易に試験され得る。さら に、本明細書中に記載の迅速拡大技術のいずれかについて、得られた拡大Ｔ細胞 は、hp-REMについて上述した方法のような方法を用いて、種々の所望の特性の維 持についてモニターされ得る。 改変REMにおいて用いられるべきサイトカインは、本明細書中に記載されたい くつかの方法のいずれかにおいて標的Ｔ細胞に導入され得る。従って、例えば、 １つ以上のサイトカインが上述のように培地に添加され得る。あるいは、または さらに、サイトカインはまた、サイトカインをREM培地に分泌する細胞により供 給され得る。従って、例示のために、特定のサイトカインまたはサイトカインの 組み合わせを分泌することが知られる哺乳動物細胞株が用いられ得る。あるいは 、以前に特定のサイトカインを分泌しない（または至適下レベルで分泌する）哺 乳動物細胞株が、所望のサイトカインをコードする遺伝子を導入することにより 容易に改変され得る。周知であるように、遺伝子は、サイトカインの発現がその 有効性を最大化するように制御され得るように、（その元来のプロモーターの代 わりとしての）種々のプロモーターのいずれかの制御下に配置され得る。大多数 のサイトカインの完全配列が公知であり、そしてコードするDNAはしばしば入手 可能である。多くのこのような配列は、核酸および／またはタンパク質データベ ース（例えば、GenEMBL GENBANKまたはSwissprot）において公開されている；例 えば、Cytokine Facts Book，R.E．Callardら、Academic Press，1994を参照の こと。また、上述のように、このようなさらなる哺乳動物細胞株は、同時にいく つかのＴ細胞刺激活性を提供するように改変され得る。実施例７ 迅速拡大における補助接着分子の役割 上述のように、APC（例えば、単球およびＢ細胞）もまた、Ｔ細胞活性化／増 殖を増強するように働く他のＴ細胞共刺激シグナルを提供する。従って、Ｔ細胞 活性化は、APC（Ｔ細胞レセプター／CD3複合体と相互作用する）の表面上のMHC 結合抗原性ペプチドの特異的認識を含むが、APCとＴ細胞との間の多くの抗原非 特異的レセプター：リガンド相互作用は、さらにＴ細胞活性化／増殖を増強し得 る。特に、APCは、Ｔ細胞上の種々のレセプターに対するリガンドを発現し、そ してＴ細胞活性化／増殖は、Ｔ細胞レセプターおよび他のシグナル伝達分子によ り送達されたシグナルの組み合わせの結果であるようである。多くのこのような レセプター：リガンド相互作用が既に同定されており、多くのこのような相互作 用に対して、レセプター：リガンド相互作用の阻害がＴ細胞増殖およびサイトカ イン分泌を阻害することが報告されている。例示のために、Ｔ細胞活性化／増殖 において役割を果たすようであると考えられる多くのレセプター：リガンド対を 、 以下の表６に列挙する。 これらの分子の多くが、接着（細胞：細胞相互作用および／または細胞：基質 相互作用を増強する）において機能することが報告されているが、多くはまた、 Ｔ細胞共刺激シグナル（例えば、細胞内カルシウムならびにPIおよびPKCの活性 化を増強するような）を送達することが示されている（例えば、Geppertら、199 0．Immunol．Reviews 117:5-66を参照のこと）。 上記のようなこのような接着補助分子の相互作用は、休止Ｔリンパ球の活性化 をポジティブに増強することが示された。これらの補助分子に結合する抗体は、 特定の条件下では、Ｔ細胞活性化シグナルを提供することが示された（例えば、 以下に引用する参考文献を参照のこと）。また、精製補助分子リガンドICAM-1お よびLFA-3（それぞれ、CD11aおよびCD2に対するリガンド）の抗CD3モノクローナ ル抗体で刺激された精製Ｔ細胞への添加は、Ｔ細胞活性化および増殖のための共 刺激シグナルを提供することが示された（例えば、Semnaniら、1994、J．Exp．M ed.180:2125を参照のこと）。 従って、CD4およびCD8に対して指向された種々の抗体は、Ｔ細胞活性化を阻害 し得るか（例えば、I．BankおよびL．Chess 1985．J．Exp．Med．162:1194；G.A ．van Seventer．1986．Eur．J．Immunol．16:1363を参照のこと）または抗CD3 mAbと相乗作用してＴ細胞増殖を誘導し得るか（例えば、F．Emmrichら1986．PNA S 83:8298；T．Owensら1987．PNAS 84:9209；K．Saizawaら、1987，Nature 328: 260を参照のこと）のいずれかである。当業者に周知であるように、特定の抗原 に対して惹起された抗体のコレクションは、抗原上の種々の異なる部位に結合す る抗体を含むと予期される。 多くの研究は、他の接着補助分子に対する抗体がＴ細胞刺激／増殖を増大し得 ることを示している。例示のために、例えば、以下を参照のこと：J.A．Ledbett erら1985．J．Immunol．135:2331（CD5およびCD28に対して指向された抗体は、 抗CD3誘導Ｔ細胞増殖を増大する）；P.J．Martinら1986．J．Immunol．136:3282 （CD28に対する抗体は、抗CD3誘導Ｔ細胞増殖を増大する）；R．Galandriniら19 93．J．Immunol．150:4225およびY．Shimizu 1989．J．Immunol．143:2457（CD4 4に対して指向された抗体は、抗CD3誘導Ｔ細胞増殖を増大する）；S.C．Meurら1 984．Cell 36:897（CD2のT11.2およびT11.3エピトープに対して指向された抗体 は、Ｔ細胞増殖を刺激する）；R.van Lier．1987．J．Immunol．139:1589（CD27 に対して指向された抗体は、抗CD3誘導Ｔ細胞増殖を増大する）；Bossyら1995． Eur．J．Immunol．25:459（CD50（ICAM-3）に対する抗体は、抗CD3誘導Ｔ細胞増 殖を増大する）；M.C．Wacholtzら1989．J．Exp．Med．170:431（LFA-1に対して 指向された抗体は、２つの抗体がＴ細胞表面上で架橋するとき抗CD3誘導Ｔ細胞 増殖を増大する）；G.A．van Seventerら1990 J．Immunol．144:4579（抗CD3mAb を有するプラスチック上に固定化された精製ICAM-1は、LFA-1分子を介してＴ細 胞増殖を共刺激する）；Y．Shimizuら1990．J．Immunol．145:59（抗CD3mAbを有 するプラスチック上の精製フィブロネクチンは、Ｔ細胞増殖を共刺激し、そして VLA4およびVLA5に対する抗体は、共刺激Ｔ細胞レセプターとしてのVLA4およびVL A5の役割を示す活性を阻害した）；N.K．Damleら1992．J．Immunol．148:1985（ 可溶性ICAM-1、B7-1、LFA-3およびVCAMは、抗CD3誘導Ｔ細胞増殖を増大する）。 REMプロトコル内のこのような接着補助因子の相対的寄与の数量化は、種々の サイトカインの組み合わせについて上述したのと類似のPBMC制限hp-REMアッセイ において欠失技術および抗体価実験を用いて、容易に達成され得る。実施例８ 改変REMにおける接着補助分子活性の置換 上述の改変に類似の様式で、かつおそらくこのような改変の組み合わせで、RE Mプロトコルは、このように、高レベルのこれらのレセプターリガンドを発現す る特徴づけられた細胞株（例えば、選択した細胞株の遺伝子改変またはこのよう な分子を既に発現する樹立細胞株の同定により得られた）を含むように改変され 得る。シグナル伝達を誘導することが知られる補助分子に対して指向された抗体 を利用し、および／またはPBMCフィーダー細胞により提供される対応する活性の 代わりとなる手段として精製補助リガンド分子を使用し、それによりREMを駆動 するのに必要なPBMCの数を減少させることもまた可能である。実施例９ EBV-LCL により提供されたさらなる刺激活性の置換 EBV-LCLは最大Ｔ細胞拡大を達成するために充分ではないようであるが、それ らは、hp-REMプロトコルにおいて拡大を増強し得る。EBV-LCLの分析は、それら が接着分子（例えば、LFA-1、ICAM-1、およびLFA-3）ならびにFcγRを発現する ことを示した。さらに、EBV-LCLはIL-1（LiuらCell Immunol．108:64-75，1987 ）およびIL-12（Kobayashiら、1989．J．Exp．Med．170:827）を分泌し、これら は共にAPCによってもまた分泌される。 上述のように、このような成分は、他の供給源により容易に供給され得、それ によりhp-REMに特徴的な大多数のPBMCおよび／またはEBV-LCLフィーダー細胞の 必要性を減少させると考えられる。実施例１０ 改変REMにおける抗CD21抗体の使用 CD21は、成熟Ｂリンパ球上で、および低レベルでＴリンパ球において発現され る補助分子である。本発明者らは、CD21に結合し、改変REMの背景において刺激 シグナルを提供する分子の能力を試験した。 第１のセットの実験では、本発明者らは、EBV-LCLフィーダー細胞集団が完全 に除去された改変REMにおいて刺激シグナルを提供する能力を試験するためにプ レート結合抗CD21抗体を使用した。２つの異なる抗原特異的CTLクローン（「R7 」(これは同種抗原特異的である)および「11E2」(これはEBV特異的である)）を 、EBV-LCLが除去されているが他の成分は上述のように維持された（PBMC(500:1) 、IL-2(25単位/ml)）改変REM手順において試験した。抗CD21抗体は、市販により 入手可能である。本発明者らは、Pharmingenから入手可能な抗CD21抗体を用いた 。抗CD3抗体もまた用いて、抗CD21と同様にプレートに結合させた。培養物を、 本質的に上述のように、２週間の標準REMサイクルにわたって拡大させた。 表７に示したデータは、抗CD21抗体を含むことにより、EBV-LCLを使用せずに 得られ得る増殖倍が大きく増加した（R7および11E2について、それぞれコントロ ールの650％およびコントロールの408％）ことを明らかにした。 第２のセットの実験（可溶性抗CD21抗体を用いて実施した）は、さらなる確証 的なデータを提供した。特に、広範な抗CD21濃度を上述のようにREMにおいて用 いた。但し、抗CD21および抗Cd3の両方を可溶性抗体として供給した（抗CD21、 ０ng/ml〜1.75ng/ml；抗CD3、10ng/ml）。 表８に示すように、培養物由来の全EBV-LCLフィーダー細胞の除去は、平均増 殖倍の実質的な減少を生じた（R7および11E2について、それぞれコントロールの 10％およびコントロールの14％）。少量の抗CD21抗体の培養培地への添加でさえ も、増殖倍の大きな増加を生じた（R7および11E2について、それぞれコントロー ルの72％およびコントロールの57％）。 抗CD21抗体は刺激シグナルを増強するための好都合な方法を提供するが、他の 方法でCD21を刺激することもまた可能である。例えば、抗CD21抗体に加えて、CD 21に結合するために用いられ得る他の分子は、EBVのC3d、C3dg、iC3dおよびgp35 0/220を含む（例えば、W．Timensら、「Leucocyte Typing V，White Cell Diffe rentiation Antigens」、Schlossman，S.F.ら（編）、Oxford University Press ，Oxford，1995の516〜518頁を参照のこと）。また、上述のように、このような Ｔ細胞刺激成分が改変REM培地中に可溶性因子として提供され得るが、それらは また、培地中に含まれる細胞株（例えば、CD21に結合する分子を分泌するかまた は提示する細胞株）により提供され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 クラリー，キム ウィッティーズ アメリカ合衆国 ワシントン 98125，シ アトル，エヌ．イー．，サンドポイント ウェイ 12302

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．インビトロで培養培地中の最初のＴリンパ球集団を迅速に拡大するための方 法であって、以下の工程： インビトロで培養培地に最初のＴリンパ球集団を添加する工程； 少なくとも１つのＴ細胞刺激成分を発現する、分裂していない哺乳動物細胞株 を培養培地に添加する工程であって、ここで、該細胞株はEBVで形質転換された リンパ芽球細胞株（LCL）でない、工程；および 培養物をインキュベートする工程 を包含する、方法。 ２．前記Ｔ細胞刺激成分が、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、お よびサイトカインからなる群から選択される、請求項１に記載の迅速な拡大方法 。 ３．前記Ｔ細胞刺激成分が、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、お よびサイトカインからなる群から選択され、そして前記最初のＴリンパ球集団が 、約２週間未満の期間のインキュベーション後に少なくとも200倍拡大される、 請求項１に記載の迅速な拡大方法。 ４．前記Ｔ細胞刺激成分が、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、お よびサイトカインからなる群から選択され、そして前記最初のＴリンパ球集団が 、約２週間未満の期間のインキュベーション後に少なくとも500倍拡大される、 請求項１に記載の迅速な拡大方法。 ５．前記Ｔ細胞刺激成分が、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、お よびサイトカインからなる群から選択され、そして前記最初のＴリンパ球集団が 、約２週間未満の期間のインキュベーション後に少なくとも1000倍拡大される、 請求項１に記載の迅速な拡大方法。 ６．前記培養培地に抗CD3モノクローナル抗体を添加する工程をさらに包含し、 ここで、抗CD3モノクローナル抗体の濃度が、少なくとも約1.0ng/mlである、請 求項１に記載の迅速な拡大方法。 ７．前記培養培地にIL-2を添加する工程をさらに包含し、ここで、IL-2の濃度が 、少なくとも約10ユニット/mlである、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 ８．前記哺乳動物細胞株が、ヒト末梢血単核細胞（ヒトPBMC）に見出される少な くとも３倍の頻度で存在する少なくとも１つの細胞型を含む、請求項１に記載の 迅速な拡大方法。 ９．前記Ｔ細胞刺激成分が、Fc-γレセプターおよび細胞接着アクセサリー分子 からなる群から選択される、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 １０．前記Ｔ細胞刺激成分が、細胞接着アクセサリー分子およびサイトカインか らなる群から選択される、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 １１．前記Ｔ細胞刺激成分が、Fc-γレセプターおよびサイトカインからなる群 から選択される、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 １２．前記哺乳動物細胞株が、細胞接着アクセサリー分子を発現する、請求項１ に記載の迅速な拡大方法。 １３．前記細胞接着アクセサリー分子が、クラスII MHC、クラスＩ MHC、ICAM1 、ICAM2、ICAM3、CD58、CD72、フィブロネクチン、CD27に対するリガンド、CD80 、CD86、およびヒアルロン酸塩からなる群から選択される、請求項１２に記載の 迅速な拡大方法。 １４．前記哺乳動物細胞株が、サイトカインを発現する、請求項１に記載の迅速 な拡大方法。 １５．前記Ｔ細胞刺激成分が、CD21に結合する分子である、請求項１に記載の迅 速な拡大方法。 １６．前記サイトカインが、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12、およびIL- 15からなる群から選択される、請求項１４に記載の迅速な拡大方法。 １７．前記培養培地に可溶性のＴ細胞刺激因子を添加する工程をさらに包含する 、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 １８．前記可溶性のＴ細胞刺激因子が、サイトカイン、Ｔ細胞表面成分に特異的 な抗体、およびＴ細胞表面成分に結合し得る成分に特異的な抗体からなる群から 選択される、請求項１７に記載の迅速な拡大方法。 １９．前記可溶性のＴ細胞刺激因子が、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-12 、およびIL-15からなる群から選択されるサイトカインである、請求項１７に記 載の迅速な拡大方法。 ２０．前記可溶性のＴ細胞刺激因子が、Ｔ細胞表面成分に特異的な抗体であり、 そして該Ｔ細胞表面成分が、CD4、CD8、CD11a、CD2、CD5、CD49d、CD27、CD28、 およびCD44からなる群から選択される、請求項１７に記載の迅速な拡大方法。 ２１．前記可溶性のＴ細胞刺激因子が、Ｔ細胞表面成分に結合し得る成分に特異 的な抗体であり、そして該Ｔ細胞表面成分が、CD4、CD8、CD11a、CD2、CD5、CD4 9d、CD27、CD28、およびCD44からなる群から選択される、請求項１７に記載の迅 速な拡大方法。 ２２．前記可溶性のＴ細胞刺激因子が、CD21に結合する分子である、請求項１７ に記載の迅速な拡大方法。 ２３．前記CD21に結合する分子が、抗CD21抗体である、請求項２２に記載の迅速 な拡大方法。 ２４．非常に多数の末梢血単核細胞（PBMC）を培養物に添加する工程をさらに包 含する、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 ２５．拡大される最初のＴ細胞に対するPBMCの比が、約40：1未満である、請求 項２４に記載の迅速な拡大方法。 ２６．拡大される最初のＴ細胞に対するPBMCの比が、約10：1未満である、請求 項２４に記載の迅速な拡大方法。 ２７．拡大される最初のＴ細胞に対するPBMCの比が、約3：1未満である、請求項 ２４に記載の迅速な拡大方法。 ２８．EBVで形質転換された非常に多数のリンパ芽球細胞（LCL）を培養物に添加 する工程をさらに包含する、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 ２９．拡大される最初のＴ細胞に対するLCLの比が、約10：1未満である、請求項 ２８に記載の迅速な拡大方法。 ３０．前記最初のＴリンパ球集団が、少なくとも１つのヒトCD8+抗原特異的細胞 障害性Ｔリンパ球（CTL）を含む、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 ３１．前記最初のＴリンパ球集団が、少なくとも１つのヒトCD4+抗原特異的ヘル パーＴリンパ球を含む、請求項１に記載の迅速な拡大方法。 ３２．ヒトＴ細胞を遺伝子的に形質導入する方法であって、以下の工程： インビトロで培養培地に最初のＴリンパ球集団を添加する工程； Ｔ細胞刺激成分を発現する、EBVで形質転換していない哺乳動物細胞株を培養 培地に添加する工程；および 該培養物をインキュベートする工程；および 培養培地にベクターを添加する工程 を包含する、方法。 ３３．請求項３２に記載の遺伝子形質導入法であって、ここで、前記ベクターが 、Ｔリンパ球を阻害する阻害化合物に対する耐性を提供する選択マーカーを含む レトロウイルスベクターであり、そしてさらに、以下の工程： レトロウイルスベクターの添加後少なくとも１日間、培養物のインキュベーシ ョンを継続する工程；および 該継続されたインキュベーション工程後に該培養培地に該阻害化合物を添加す る工程 を包含する、方法。 ３４．非常に多数のヒトPBMCを添加する工程をさらに包含する、請求項３２に記 載の遺伝子形質導入法。 ３５．最初のＴ細胞に対するPBMCの比が、約40：1未満である、請求項３４に記 載の遺伝子形質導入法。 ３６．分裂していないEBVで形質転換したリンパ芽球細胞（LCL）を添加する工程 をさらに包含する、請求項３２に記載の遺伝子形質導入法。 ３７．最初のＴ細胞に対するLCLの比が、約10：1未満である、請求項３６に記載 の遺伝子形質導入法。 ３８．インビトロで最初のＴリンパ球集団の迅速な拡大を促進し得るREM細胞株 を生成する方法であって、以下の工程： 細胞型涸渇PBMC集団を産生するためにヒトPBMC集団から１つ以上の細胞型を涸 渇させる工程、 涸渇していないPBMCによって提供される活性に対する涸渇した細胞型の寄与を 決定するためのhp-REMプロトコルにおいて、涸渇していないPBMCの代わりに該細 胞型涸渇PBMC集団を使用する工程、 該涸渇細胞型によって提供されるＴ細胞刺激活性を同定する工程、および 該Ｔ細胞刺激活性の発現を可能にする遺伝子で哺乳動物細胞株を形質転換する 工程 を包含する、方法。 ３９．前記Ｔ細胞刺激成分が、Fc-γレセプター、細胞接着アクセサリー分子、 およびサイトカインからなる群から選択される、請求項３８に記載のREM細胞株 を生成する方法。 ４０．請求項３８に記載の方法によって生成される哺乳動物細胞株を含む、イン ビトロで最初のＴリンパ球集団の迅速な拡大を刺激し得るREM細胞株。 ４１．前記細胞株が、細胞接着アクセサリー分子を発現する、請求項４０に記載 のREM細胞株。 ４２．前記細胞接着アクセサリー分子が、クラスII MHC、クラスI MHC、ICAM1、 ICAM2、ICAM3、CD58、CD72、フィブロネクチン、CD27に対するリガンド、CD80、 CD86、およびヒアルロン酸塩からなる群から選択される、請求項４１に記載のRE M細胞株。 ４３．前記細胞株が、Fc-γレセプターを発現する、請求項４０に記載のREM細胞 株。 ４４．前記細胞株が、少なくとも１つのＴ細胞刺激サイトカインを発現する、請 求項４０に記載のREM細胞株。 ４５．前記Ｔ細胞刺激サイトカインが、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、およ びIL-15からなる群から選択される、請求項４４に記載のREM細胞株。 ４６．前記細胞株が、CD21に結合する分子を発現する、請求項４０に記載のREM 細胞株。 ４７．請求項４０に記載のREM細胞株を含む、インビトロで最初のＴリンパ球集 団を迅速に拡大し得る培養培地。 ４８．外因性サイトカインをさらに含む、請求項４７に記載の培養培地。 ４９．非常に多数の外因性サイトカインをさらに含み、ここで、該非常に多数の 外因性サイトカインが、少なくとも１つのインターロイキンを含む、請求項４７ に記載の培養培地。 ５０．前記インターロイキンが、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、およびIL-15 からなる群から選択される、請求項４９に記載の培養培地。 ５１．CD21に結合する分子をさらに含む、請求項４７に記載の培養培地。 ５２．前記CD21に結合する分子が、抗CD21抗体である、請求項５１に記載の培養 培地。 ５３．抗CD3モノクローナル抗体をさらに含む、請求項４９に記載の培養培地。