JP4001912B2 - Ｔリンパ球のインビトロ増殖の急速拡大方法（「ｒｅｍ」） - Google Patents
Ｔリンパ球のインビトロ増殖の急速拡大方法（「ｒｅｍ」） Download PDFInfo
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本発明は、部分的に、国立衛生研究所の助成第CA-18029号に資金援助されたものである。米国政府は本発明に特定の権利を有し得る。
発明の分野
本発明は、ヒト抗原特異的細胞溶解性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球を含むＴリンパ球を培養するための改善された方法に関する。本発明の方法は、例えば養子免疫療法に有用な、Ｔ細胞の非常に急速かつ効率的な拡大（expansion）を生じる。
背景
Ｔリンパ球は骨髄において形成され、胸腺に移動してそこで成熟し、次いで末梢血およびリンパ循環に入る。Ｔリンパ球は、３種類の別個のタイプの細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞、にさらに分けられる。Ｔリンパ球は、Ｂリンパ球とは異なり抗体分子を産生しないが、主要組織適合性複合体（MHC）のタンパク質に付着して標的細胞の表面上で発現する抗原性タンパク質のペプチドフラグメントを認識するヘテロダイマー細胞表面レセプターを発現する；例えば、Abbas,A.K.,Lichtman,A.H.およびPober,J.S.,Cellular and Molecular Immunology,1991,特に15〜16頁を参照のこと。
細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）は、典型的にはCD3＋、CD8＋、CD4−表現型のものであり、そしてそれらの細胞表面上のクラス2I MHC分子に会合する外来性抗原のフラグメントを示す細胞を溶解する。CTL認識の標的細胞には、ウイルスもしくは他の病原体による感染の後に抗原を発現する正常細胞；および形質転換され、かつ変異タンパク質を発現するか、または正常タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞が含まれる。
ヘルパーＴ細胞は、同様にCD3＋ではあるが、CD4を発現し、かつCD8膜タンパク質が存在しないことにより細胞傷害性Ｔ細胞と区別することができる。CD4＋ヘルパーＴ細胞は、クラスIIのMHC分子と会合して存在する抗原のフラグメントを認識し、そして主に、抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答を増幅し、かつ単球もしくはマクロファージのような補助免疫細胞を活性化するサイトカインを産生するために機能する。例えば、Abbas,A.K.ら、前出を参照のこと。
CD4＋ヘルパーおよびCD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、ウイルス、細菌性病原体および腫瘍に対する宿主の免疫応答の重要な成分である。その結果、先天性、後天性または医原性Ｔ細胞免疫不全疾患を患う個体は、生命を脅かす感染または悪性腫瘍（例えば、SCID、BMT、AIDS等）を発症する可能性がある。免疫学的に有用な（competent）Ｔリンパ球の欠損に関連する疾患を患うヒトは、養子移入と呼ばれることもある養子免疫療法によって回復される特定の免疫性を潜在的に有し得る。養子免疫療法において、所望の抗原特異性を有するＴ細胞を移入することにより１以上の特定の免疫性を個体に付与することが可能である。目的の細胞を免疫不全宿主から、または特異的に免疫された適合する宿主から誘導することができる。後者の供給源は、免疫不全宿主が十分な数のＴ細胞を有さないか、あるいは有効性が十分ではないＴ細胞しか有さない状況においてはもちろん特に重要である。
そのような免疫不全宿主においてＴ細胞応答を増大させるか、または再構成するために、抗原特異的Ｔ細胞をインビトロで大量に増殖させ、次いで免疫不全宿主に静脈内投与しなければならない。養子免疫療法を施した後、以前は病原体または腫瘍によって発現される抗原に対して不適切な応答を有したか、または応答しなかった宿主が、その病原体または腫瘍に対して抵抗性または免疫性になるのに十分な免疫応答を発現することができる。
免疫性を確立するための抗原特異的Ｔ細胞の養子移入は、ウィルス感染および腫瘍に対する有効な治療であることが動物モデルで示されている（Greenberg,P.D.,Advances in Immunology（1992）で検討されている）。養子免疫療法が効果的であるためには、通常、抗原特異的Ｔ細胞を単離してインビトロ培養により数を拡大する必要があり、そして養子移入後、このような培養されたＴ細胞がインビボで維持し、機能しなければならない。ヒト疾患の処置のために、１つの細胞の子孫を代表するクローン化抗原特異的Ｔ細胞を免疫療法において使用することにより重大な利益が得られる。なぜなら、これらの細胞の特異性および機能を厳密に規定し得、そして正確な用量：応答効果を見積もり得るからである。ヒトにおいて不完全な免疫性を回復するためにヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを最初に養子移入したのは、Riddellらであった。Riddell,S.R.ら、「Restoration of Viral Immunity in Immunodeficient Humans by the Adoptive Transfer of T Cell Clones」,Science 257：238-240（1992）。この研究で、Riddenllらは、同種異系の骨髄移植レシピエントにおけるサイトメガロウイルスに対する不完全な免疫性の回復のために養子免疫療法を用いた。サイトメガロウイルス特異的CD8＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、３つのCMV血清ポジティブ骨髄ドナーから単離され、インビトロで５〜12週間増殖させてエフェクターＴ細胞の数的な拡大を達成し、次いでそれぞれの骨髄移植（BMT）レシピエントに静脈内投与された。これらのBMTレシピエントは、移植前の化学放射線療法による宿主Ｔ細胞応答の除去および同種異系骨髄移植後に一般的に観察されるドナー免疫性の回復の遅れ（Reusserら、Blood,78：1373-1380,1991）により、CMV特異的免疫性が不完全であった。Riddellらは、毒性を示さない、および移入されたＴ細胞クローンがこれらの免疫不全宿主に急速かつ持続的なCD8＋サイトメガロウイルス特異的CTL応答の再構成を提供することを見出した。
Riddellら（J.Immunology,146：2795-2804,1991）は、CD8＋ CMV特異的Ｔ細胞クローンの単離および培養に以下の手順を用いた。まず、骨髄ドナーに由来する末梢血単核細胞（PBMC）を、自己サイトメガロウイルス感染線維芽細胞と共に培養して、CMV特異的CTL前駆体を活性化した。次に、培養したＴ細胞をCMV感染線維芽細胞で再度刺激し、その培養物にγ線照射PBMCを補充した。適切な培養培地中のインターロイキン２（IL-2）２〜５U/mlを、再刺激の２および４日後に添加してCD8＋ CTLの拡大を促進した（Riddellら、J.Immunol.,146：2795-2804,1991）。Ｔ細胞クローンを単離するため、ポリクローナルCD8＋ CMV特異的Ｔ細胞を、抗原提示細胞としてのCMV感染線維芽細胞（Riddell、J.Immunol.,146：2795-2804,1991）または抗原提示細胞によって提供される刺激を模倣するαCD3モノクローナル抗体（Riddell,J.Imm.Methods,128：189-201,1990）のいずれかと共に、96ウェル丸底ウェル内に限界希釈（0.3〜0.6細胞／ウェル）でプレートした。次いで、これらのマイクロウェルにγ線照射末梢血単核細胞（PBMC）およびEBV形質転換リンパ芽球様細胞株（LCL）をフィーダ細胞として添加した。10〜14日でクローン性Ｔ細胞の増殖についてポジティブなウェルが明らかになった。その後、これらのクローンに由来する細胞を、最初は48もしくは24インチのプレートで、次いで12ウェルプレートもしくは75cm2組織培養フラスコで大量に増殖させた。７〜10日ごとに自己CMV感染線維芽細胞、ならびにPBMCおよびLCLからなるγ線照射フィーダ細胞で再度刺激し、そして再刺激の２および４日後に25〜50U/mlのIL-2を添加することにより、Ｔ細胞の増殖を促進した。
上述の研究および一般的にＴ細胞培養の先行技術において存在する主要な問題は、時に適った様式で大量のヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを増殖させることができないことである。培養におけるＴ細胞のゆっくりした増殖が、ヒトリンパ球の細胞周期時間の本来の特性を表すのか、あるいは用いられる培養条件を表すのかは知られていない。例えば、上述のCMV養子免疫療法の研究において用いられる培養法では、Ｔ細胞を増殖させて研究下での最高細胞用量である１×109Ｔ細胞/cm2を達成するのに３ヶ月を要した。このことは、ヒトのウイルス性疾患およびガンへの養子免疫療法の適用を大きく制限する。なぜならば、治療で用いられる特定のＴ細胞の単離および増殖に要する長い間隔の間にこれらの疾患のプロセスが進行し得るからである。動物モデルでの研究（Greenberg,P.D.,Advances in Immunology,1992で検討されている）からの推測に基づくと、ヒトにおいて、治療上の利益のために免疫応答を増大させるには、109〜1010細胞の範囲の抗原特異的Ｔ細胞の用量が必要であり得ると予想される。しかし、抗原特異的ヒトＴ細胞を培養においてこれらの細胞数まで急速に拡大することは、重大な障害であることが立証されている。したがって、前述のRiddellらによる研究を除いて、抗原特異的Ｔ細胞クローンを用いる養子免疫療法の研究は実施されていない。養子免疫療法のために大量の細胞を産生するという問題は、米国特許第5,057,423号で確認された。この特許には、純粋な大型顆粒リンパ球を単離する方法およびこれらの大型顆粒リンパ球を拡大し、そしてリンホカイン活性化キラー（LAK）細胞に変換する方法が記載されている。この方法は、高レベルの拡大、すなわち、３〜４日の培養で100倍までの拡大を提供すると記載されている。LAK細胞はあるタイプの腫瘍細胞を溶解するが、規定された抗原を認識する特性をMHC制限Ｔ細胞と共有することはなく、そして免疫学的な記憶を提供することはない。さらに、LAK細胞の拡大に用いられる方法（これは高濃度のIL-2に顕著に依存する）は、抗原特異的ヒトＴ細胞を効率的に拡大しない（Riddellら、未公開）。加えて、これらの方法は、IL-2を取り除いたとき、または続くＴ細胞レセプターを介する刺激の際に、Ｔ細胞をプログラムされた細胞死（すなわち、アポトーシス）にさらし得る（後述のLenardoら、およびBoehmeらによる論文の考察を参照のこと）。
抗原特異的Ｔ細胞クローンを大量に培養することができないことが、部分的には、ガン（Rosenberg,New Engl.J.Med.,316:1310-1321,1986;Rosenberg,New Engl.J.Med.,319:1676-1680,1988）およびHIV感染（Ho M.ら、Blood 81:2093-2101,1993）のようなヒトの疾患のための養子免疫療法の研究を、不十分に規定された抗原特異性を有する活性化ポリクローナルなリンパ球集団の評価に制限する要因となっている。このような研究においては、リンパ球のポリクローナルな集団は血液または腫瘍濾過物のいずれかから単離され、そして高濃度のＴ細胞増殖因子IL-2中で培養される。一般には、これらの細胞は、病原体または腫瘍に対するMHC制限特異性をあったとしても僅かしか示さず、治療上の利益を経験した少数の患者において、関与するエフェクタの機構を認識することは困難である。典型的には、非特異的エフェクタリンパ球を用いる養子免疫療法の研究では、患者に約２×1010〜２×1011細胞を投与している（例えば、米国特許第5,057,423号、第１欄、第40〜43行を参照のこと）。
Ｔリンパ球を急速に増殖させる効率的な細胞培養方法の開発は、診断および治療用途の両者において有用である。診断用途において、患者由来のＴ細胞を急速に拡大する能力は、例えば、患者のＴリンパ球の特異性、活性、または他の属性をモニターする試験で使用するのに十分な数の細胞を急速に産生するために用いることができる。さらに、109〜1010細胞の細胞用量を急速に達成する能力は、ヒトの疾患の処置への特定の養子免疫療法の適用性を非常に容易にする。
Ｔ細胞クローンを単離および拡大する方法を含む、可能性のある治療的使用のための細胞を培養する、既に記載されている確立された方法がいくつか存在する。足場依存性細胞（すなわち、細胞増殖のために基質への付着を必要とする細胞）の典型的な細胞培養方法は、用いられる培養容器（すなわち、マルチウェルプレート、ペトリ皿、および培養フラスコ）の利用可能な表面積の量によって制限される。足場依存性細胞については、表面積が増大したより大きな容器を用い、および／またはより多くの容器を用いることが増殖する細胞の数を増加させる唯一の方法である。しかし、Ｔリンパ球のような造血性由来細胞は足場非依存性である。それらは、基質に付着することなく、懸濁培養において、適切な増殖因子に応答して生存し、増殖することが可能である。懸濁培養において抗原特異的リンパ球を増殖させる能力をもってしても、現在までに報告されている方法はＴ細胞クローンの急速な数的拡大を一貫して生じてはいない。例えば、GillisおよびWatsonによって実施されたＴ細胞の研究においては、Ｔ細胞増殖因子IL-2の存在下で低密度、すなわち５×103〜１×104細胞/mlで培養されたＴ細胞は７日間にわたって急速に増殖し、そして最終的に３〜５×105細胞/mlの飽和密度に到達したことが見出された。Gillis,S.およびWatson,J.「Interleukin-2 Dependent Culture of Cytolytic T Cell Lines」,Immunological Rev.,54:81-109（1981）。さらに、GillisおよびWatsonは、ひとたび細胞がこの飽和濃度に到達すると、これらの細胞は常に死んでしまうことも見出した。前述のGillisら。
他の研究では、長期培養でマウスＴリンパ球を確立する３種類の異なる方法が報告されている。Paulらは、最も広範に用いられる方法が、免疫されたドナー由来のＴリンパ球を、必須のＴ細胞レセプターシグナルおよび同時刺激シグナル（costimulatory signal）を提供するための抗原および抗原提示細胞の存在下において、それらのクローン化を試みる前に外来性増殖因子を添加することで数週間以上増殖させることであると報告している。Paul,W.E.,ら、「Long-term growth and cloning of non-trasformed lymphocytes」,Nature,294:697-699,（1981）。その後、タンパク質抗原に特異的なＴ細胞を、抗原および抗原提示細胞（APC）の供給源としての照射脾臓細胞を用いて、限界希釈によりクローン化する。第２の方法は、免疫されたドナーからＴ細胞を採取した後、できるだけ早くその細胞を軟寒天中でコロニーとして増殖させる工程を包含する。Ｔ細胞は、最初の懸濁培養において、抗原およびAPCの供給源（通常は照射脾臓細胞）で刺激される。この第２のアプローチにおいて、３日後に、これらの細胞が２層軟寒天培養系の上層に分布することが見出されている。これらのコロニーを４日目〜８日目に取り出し、次いで長期培養で拡大することができる。第３のアプローチは、細胞をそれらの抗原特異性よりむしろそれらの機能特性について選択する工程、次いでそれらを一連の異なる照射フィーダ細胞および増殖因子含有上清を用いて増殖させる工程を包含する。Paul,W.E.ら、「Long-term growth and cloning of non-transformed lymphocytes」,Nature,294:697-699,（1981）。これらの方法の各々では、１つの細胞からの個々のＴ細胞クローンを時に適った方法で109〜1010細胞まで拡大することは不可能であることが明らかである。従って、抗原特異的Ｔ細胞をクローン化する能力および受容される動物モデルにおけるＴ細胞クローンの治療上の効力の納得できる証拠にもかかわらず、ヒトＴ細胞の大量培養における技術的な困難性が、特定の養子免疫療法の臨床評価を妨げている。
培養されたＴ細胞に対するさらに別の関心は、養子免疫療法において有用であるためにそれらがインビボで機能し得るままでなければならないことである。特に、高濃度のIL-2が存在する培養で長期間増殖した抗原特異性Ｔ細胞が細胞周期の異常を生じ、そしてIL-2が除かれたときに休止期に戻る能力を失い得ることが観察されている。対照的に、正常な細胞周期は、連続する４つの期、有糸分裂（もしくは「Ｍ」期）および「間期」段階を作り上げる３つの期からなる。Ｍ期の間、細胞は核分裂および細胞質の分裂である細胞質分裂を受ける。間期段階は、有糸分裂の後、生合成活性が高率で再開するＧ1期；DNA合成が始まり、それが核のDNA含量が２倍になり染色体が複製されるまで続くＳ期；および有糸分裂が開始するまで続くＧ2期からなる。Ｇ1期の間、幾つかの細胞はその分裂周期での進行を止めたように見え、「Ｇ0」状態と呼ばれる「静止」または休止状態にあるといわれる。特定の環境因子（例えば、血清における増殖因子の欠如または細胞培養物の集密度）が細胞を休止状態に入らせることがある。その因子が回復されれば、その細胞は周期での正常な進行を再開するはずである。しかし、培養で増殖する細胞は、増殖因子が取り除かれた場合、休止期に入ることができなくなることがあり、これはこれらの細胞の死を招く。この増殖因子依存性は、培養されたＴ細胞に特に関係する。細胞増殖を促進するために高濃度のIL-2に曝されるＴリンパ球は、IL-2が除去された場合、またはこれらが続いてＴ細胞レセプターを介して刺激された場合、すなわち、それらが特異抗原に遭遇した場合、しばしばアポトーシスと呼ばれるプロセスによって死ぬ。（Lenardo M.J.,Nature,353:858-861,1991;Boehme S.A.およびLenardo M.J.,Eur.J.Immunol.,23：1552-1560,1992）。したがって、LAK細胞もしくはTIL細胞の増殖に用いられる培養方法およびインビトロでの拡大を促進するための高濃度のIL-2に顕著に依存する従来のＴ細胞培養方法は、多くの細胞をアポトーシスに対して感受性にし、そのため養子移入に対するそれらの有用性を制限し、または排除する可能性がある。
養子免疫療法の研究において、Ｔ細胞に外来性DNAを挿入して遺伝子マーカーを付与するのに遺伝子移入法を用いることにも利点がある。この遺伝子マーカーは、インビボでの移動および移入された細胞の生存の評価、または移入されたＴ細胞の安全性および効力を改良し得る機能を付与することを容易にする。哺乳動物細胞への安定な遺伝子移入の確立された方法は、両栄養性レトロウイルスベクターの使用である（Miller AD,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:1-24,1992）。レトロウイルスベクターを用いる標的細胞への遺伝子の安定な組込みは、その細胞が活発に周期活動を行い、具体的には、これらの細胞が細胞周期のＭ期を通過（transit）することを必要とする。従来の研究では、高用量のIL-2で増殖を誘導された少量のポリクローンＴ細胞にマーカー遺伝子を投入し、これらの細胞は腫瘍治療としてヒトに再注入され、移入された細胞のインビボでの生存を追求する手段を提供した。（Rosenbergら、New Engl.J.Med.,323:570-578,1990）。しかし、ヒトＴ細胞（その周期は、標準技法で増殖する場合には遅い）については、安定な遺伝子移入の効率はＴ細胞の0.1〜１％の範囲で非常に低い。（Springett CMら、J.Virology,63:3865-69,1989）。標的Ｔ細胞をより効率的に細胞周期のＳおよびＧ2−Ｍ期に入れる（recruit）培養方法は、レトロウイルス媒介遺伝子移入を用いる遺伝子改変の効率を高め（Roe T.ら、EMBO J,2:2099-2108,1993）、それにより養子免疫療法における遺伝的に改変されたＴ細胞の使用または遺伝的欠損疾患における欠陥遺伝子の送達のためのＴ細胞の使用の見込みを改善する。
発明の要旨
本発明は、Ｔ細胞の初期集団から単離された、ヒト抗原特異的細胞溶解性およびヘルパーＴ細胞を含む大量のＴ細胞を急速に産生する方法を提供する。本発明の方法はＴ細胞の急速な拡大に適用可能であるが、一般には、この急速拡大方法は、個々のＴ細胞クローンを拡大してＴリンパ球の大集団を提供しなければならない状況において特に利点がある。したがって、本発明は、Fred Hutchinsonガン研究センターでのヒト骨髄移植レシピエントを含む研究（下記）において例示されているように、ヒト養子免疫療法に関連して特に重要な道具を提供する。また、本発明は、以下に例示されるように、Ｔリンパ球への安定な遺伝子移入の効率を改善する方法も提供する。
したがって、本発明の目的の１つは、インビトロでＴリンパ球を急速に、大量に拡大することにある。このような急速に拡大したＴ細胞集団は、とりわけ、本明細書に例示されるように、特定の免疫応答を付与する目的で個体に注入するために用いることができる。Ｔ細胞はCD8＋細胞傷害性Ｔ細胞であっても、CD4＋ヘルパーＴ細胞であってもよく、それらは様々な細菌感染細胞または腫瘍細胞の任意のものにコードされる抗原と反応することができる。
本発明の別の目的は、養子免疫療法において用いられるＴ細胞の機能の変更または宿主中の欠陥遺伝子の置換に用いることができる外来性遺伝物質の安定な投入を容易にする様式でＴ細胞を増殖させる方法を用いることにある。
本発明の好ましい態様の多くを以下の一覧に記載する。
１． インビトロで培養培地中において初期Ｔリンパ球集団を急速に拡大する方法であって：
初期Ｔリンパ球集団をインビトロで培養培地に添加する工程；
不釣り合いに大量の非分裂末梢血単核細胞（PBMC）を、フィーダ細胞として、得られる細胞の集団が拡大しようとする初期集団のＴリンパ球の各々について少なくとも約40PBMCフィーダ細胞を含むように上記培養培地に添加する工程；および
上記培養物をインキュベートする工程；
を包含する方法。
この培養物を、Ｔリンパ球の増殖に適切な温度等の条件下でインキュベートする。ヒトＴリンパ球の増殖に対しては、例えば、温度は一般に少なくとも約25℃、好ましくは少なくとも約30℃、より好ましくは約37℃である。適切な培地および他の培養条件の説明は当該技術分野において周知であり、本明細書にも例示されている。
２． 前記初期Ｔリンパ球集団が少なくとも１種のヒトCD8＋抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）を含む、第１項の急速拡大法。本発明の好ましい態様においては、このCTLはヒトの腫瘍または病原体上に存在する抗原に特異的である。
３． 前記初期Ｔリンパ球集団が少なくとも１種のヒトCD4＋抗原特異的ヘルパーＴリンパ球を含む、第１項の急速拡大法。
４． 前記非分裂フィーダ細胞がγ線照射PBMCフィーダ細胞を含む、第１項の急速拡大法。好ましくは、PBMCは約3000〜3600radの範囲、より好ましくは約3300radのγ線を照射されている。
５． PBMCフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が少なくとも約200：１である、第１項の急速拡大法。
６． PBMCフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が約400：１と800：１との間である、第５項の急速拡大法。代表的には、約500：１の比が使用される。
７． 非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダ細胞として添加する工程をさらに包含する、第１項の急速拡大法。好ましくは、LCLは約6000〜10,000radの範囲、より好ましくは約8000radのγ線を照射されている。
８． LCLフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が少なくとも約10：１である、第７項の急速拡大法。
９． LCLフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が約50：１と200：１との間である、第８項の急速拡大法。典型的には、約100：１の比が用いられる。
１０． 前記培養培地に抗CD3モノクローナル抗体を添加する工程をさらに包含する、第１項の急速拡大法。
１１． 抗CD3モノクローナル抗体の濃度が少なくとも約0.5ng/mlである、第１０項の急速拡大法。
１２． 抗CD3モノクローナル抗体の濃度が少なくとも約1.0ng/mlである、項目１１の急速拡大方法。以下に示されるように、典型的には、約30ng/mlの濃度が用いられるが、よりずっと低レベルで用いることも可能である。
１３． 前記培養培地にIL-2を添加する工程をさらに包含する、第１項の急速拡大法。
１４． IL-2の濃度が少なくとも約10単位/mlである、第１３項の急速拡大法。典型的には、約30単位/mlの濃度が用いられる。
１５． 前記インキュベーションを少なくとも約９日間続け、かつ前記培養培地にIL-2を添加する工程をそれぞれ３〜５日の間隔をおいて繰り返す、第１４項の急速拡大法。典型的には、１日目、次に５日目または６日目、次いで８日目または９日目にIL-2を添加する。
１６． ヒトＴ細胞を遺伝的に形質導入する方法であって：初期Ｔリンパ球集団をインビトロで培養培地に添加する工程；不釣り合いに大量の非分裂末梢血単核細胞（PBMC）を、フィーダ細胞として、得られる細胞の集団が拡大しようとする初期集団のＴリンパ球の各々について少なくとも約40PBMCフィーダ細胞を含むように上記培養培地に添加する工程；上記培養物をインキュベートする工程；および上記培養培地にベクターを添加する工程、を包含する方法。ベクターは、標的細胞に投入することが可能な形態のDNAまたはRNAの単位を指す。形質導入は、一般に、そのような外来性DNAまたはRNAを標的細胞に投入することを指すのに用いられ、例えばウイルス感染およびエレクトロポレーションにより、異種DNAまたはRNA配列を標的細胞に投入することを包含する。Ｔリンパ球を形質導入する現時点で好ましい方法は、本明細書に例示されるように、レトロウイルスベクターを用いることである。
１７． 非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をさらなるフィーダ細胞として添加する工程をさらに包含する、第１６項の遺伝的形質導入方法。
１８． 前記ベクターが、Ｔリンパ球を阻害する阻害化合物に対する耐性を提供する選択マーカーを含むレトロウイルスベクターであり、かつ上記レトロウイルスベクターを添加した後に少なくとも１日間、前記培養物のインキュベーションを継続する工程；および上記継続インキュベーション工程の後に前記培養培地に上記阻害化合物を添加する工程をさらに包含する、第１７項の遺伝的形質導入方法。
１９． 前記レトロウイルスベクターがポジティブおよびネガティブ選択マーカーの両者を含む、第１８項の遺伝的形質導入方法。好ましいポジティブ選択マーカーは、hph、neo、およびgptからなる群より選択される遺伝子に由来し、好ましいネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRTおよびgptからなる群より選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、ポジティブ選択マーカーがhphまたはneoに由来し、かつネガティブ選択マーカーがシトシンデアミナーゼまたはTK遺伝子に由来する、二機能性選択可能融合遺伝子である。
２０． 前記レトロウイルスベクターが、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を融合遺伝子としてコードする、第１９項の遺伝的形質導入方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１において説明される、４人のヒトドナーからのヒト抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球クローンおよび抗原特異的ヘルパーＴリンパ球クローンの急速拡大を説明する図である。
図２は、実施例２において説明される、養子免疫療法で用いるための６人のヒトドナーからの抗原特異的Ｔ細胞クローンの大規模拡大を説明する図である。
図３は、実施例３において説明される、急速拡大法におけるＴ細胞に対するPBMCフィーダ細胞の比の効果を説明する図である。
図４は、実施例４において説明される、急速拡大法におけるLCLフィーダ細胞の使用の効果を説明する図である。
図５は、実施例５において説明される、急速拡大法とＴ細胞の増殖に用いられる他の方法との比較を説明する図である。
図６は、実施例６において説明される、急速拡大培養物への抗CD3モノクローナル抗体の添加の効果を説明する図である。
図７は、実施例７において説明される、急速拡大培養物へのIL-2の添加の効果を説明する図である。
図８は、実施例８において説明される、急速拡大の後にHIV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球が抗原特異的溶解機能を保持することを示すデータを説明する図である。
図９は、実施例９において説明される、急速拡大の後にCMV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球が抗原特異的溶解機能を保持することを示すデータを説明する図である。
図10は、実施例10において説明される、インビトロでの急速拡大の後にCMV特異的CD4＋ヘルパーＴリンパ球が抗原特異的増殖機能を保持することを示すデータを説明する図である。
図11は、実施例11において説明される、急速に拡大されたＴ細胞がサイトカインを除かれた際に静止段階に入る能力を保持し、それらが抗原もIL-2もなしでインビトロで生存可能のままであり、かつそれらがＴ細胞レセプター活性化の際にIL-2に対する応答性を再び獲得することを示すデータを説明する図である。
図12は、実施例12において説明される、急速に拡大されＴ細胞がインビトロでの静止の後に細胞周期のＧ0／Ｇ1段階に入り、かつIL-2Rα鎖を発現しないことを示すデータを説明する図である。
図13は、実施例13において説明される、Ｔ細胞レセプター活性の後に静止Ｔ細胞が細胞増殖のＳおよびＧ2／Ｍ期に誘導されることを示すデータを説明する図である。
図14Aおよび14Bは、実施例16において説明される、REMによって増殖されたＴ細胞クローンを用いるヒト患者での養子免疫療法を示すデータを説明する図である。
図15は、実施例19において説明される、遺伝的に形質導入された抗原特異的CTLを用いる養子免疫療法を示すデータを説明する図である。
発明の詳細な説明
本明細書中に記載される発明は、ヒトの疾患の養子免疫療法において特に有用であり得る、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球を含むＴリンパ球の集団を急速に拡大させる方法を提供する。
このＴ細胞は「標的Ｔ細胞」と呼ばれる。一般には、標的Ｔ細胞は、少数が培養容器および以下のものが補充されている標準的な増殖培地に添加される：（i）Ｔ細胞レセプターシグナルを供与するためのＴ細胞レセプター複合体のCD3成分を指向する適切量の抗体、および（ii）共刺激シグナルを供与する、大過剰量のフィーダ細胞、好ましくは以下に記載されるγ照射PBMC。好ましくは、ヒト組換えIL-2または他の適切なIL-2調製物が低濃度で３〜５日間隔（典型的には、１日目、５日目もしくは６日目、および８日目もしくは９日目）で添加される。本発明の方法は、Ｔ細胞の急速な拡大、典型的には８〜14日間で500〜3000倍の範囲の拡大を生じる。従って、本方法は、各刺激周期について、現在記載されているヒトＴ細胞の培養方法より約100〜1000倍効率的である。
さらに、これらの方法は、ヘルパーＴ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞の集団の両者の急速拡大、ならびに多くの異なる抗原特異性のＴ細胞クローン（例えば、CMV、HIV、または他のウイルス抗原もしくは腫瘍由来の抗原に特異的な細胞溶解性もしくはヘルパーＴ細胞）に適用可能である。さらに、本発明の方法は、選択される培養容器のサイズに応じて、小規模の増殖（例えば、104〜107細胞のＴ細胞の急速拡大）、または大規模拡大（例えば、106〜1010細胞より多いＴ細胞の急速拡大）の両者に用いられ得る。
このように、本発明は、ヒトの免疫の調節に必要な細胞数を増殖させるのに要する時間を劇的に短縮することにより、養子免疫療法に用いるためのＴ細胞クローンを効率的に拡大させることを可能にする。例えば、Riddellらによる研究（Science,257:238-240,1992）においては、ひとたびＴ細胞クローンを単離したら、そのクローンを12週間培養し、そして、１×109のCD8＋ CMV特異的Ｔ細胞／ｍ2体表面積の最高投与細胞用量を達成するために、複数のクローンをプールする必要があった。本発明の方法を用いると、個々のＴ細胞クローンの109細胞を超える拡大は３週間未満で達成し得る。
本発明の実施では、他に示さない限り、当該技術分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、細胞生物学、組換えDNA、および免疫学の通常の技術が使用される。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch,およびManiatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版（1989）,Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編,1984）,Animal Cell Culture（R.I.Freshney編,1987）,一連のMethods in Enzymology（Academic Press,Inc.）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987）,Handbook of Experimental Immunology,（D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編）,Current Protocols in Molecular Biology（F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Siedman, J.A.SmithおよびK.Struhl編、1987）、およびCurrent Protocols in Immunology（J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.ShevachおよびW.Strober編,1991）を参照のこと。本明細書中で言及される、前述および後述の両方の全ての特許、特許出願、および刊行物は、参考により本明細書中で援用される。
本発明の理解の助けとして、以下は、明細書中で一般的に用いられるいくつかの略語の一覧である：
CTL 細胞傷害性Ｔリンパ球
APC 抗原提示細胞
CMV サイトメガロウイルス
HIV ヒト免疫不全ウイルス
EBV エプスタイン・バールウイルス
hIL-2 ヒトインターロイキン−２
MHC 主要組織適合性複合体
PBMC 末梢血単核細胞
LCL EBV形質転換リンパ芽球様細胞株
PBS リン酸緩衝化溶液
培養において増殖させようとするＴ細胞（すなわち、標的Ｔ細胞）は、処置される被験体から得られ得る。あるいは、レシピエントおよび移入される細胞が免疫学的に適合するという条件の下で、処置される被験体以外のヒトからＴ細胞を得ることができる。典型的には、この細胞は、組織、骨髄、胎児組織、または末梢血に由来する。好ましくは、細胞は末梢血に由来する。Ｔ細胞が組織に由来する場合、適切な培地または希釈液を用いて単一細胞の懸濁液を調製するべきである。Ｔ細胞のポリクローナル集団の生成を以下の実施例において説明する。詳しくは、実施例12を参照のこと。
当該技術分野において任意の周知の方法に従い、不均一集団からＴリンパ球を含む単核細胞を単離する。説明的な例として、Ficoll-Hypaque勾配遠心分離、蛍光活性化細胞選別（FACs）、モノクローナル抗体被覆プレートでの選択（panning）、および／または磁気分離技術を（別々にまたは組み合わせて）用いて、本発明による拡大のための精製された細胞集団が得られ得る。抗原特異的Ｔ細胞クローンを、当該技術分野において公知の標準的培養技術により単離する。この標準的技術には、抗原提示細胞で刺激することによる抗原特異的Ｔ細胞前駆体の初期活性化、および、それに続く、当該技術分野における公知の技術（例えば、RiddellおよびGreenberg（J.Immunol.Meth.,128:189-201,1990）；およびRiddellら（J.Immunol.,146:2795-2804,1991）に記載される技術）を用いる限界希釈培養によるクローン化が含まれる。以下の実施例も参照のこと。
限界希釈培養においてマイクロウェル中に単離されたＴ細胞クローンは、典型的には、14日後に１つの細胞から２×104〜５×105細胞に拡大される。この時点で、個々のクローンを、共刺激機能を提供する大過剰量のフィーダ細胞、および好ましくは、Ｔ細胞レセプターの刺激を提供するための抗CD3モノクローナル抗体と共に、プラスチック培養容器において適切な培養培地内に入れる。クローンがマイクロウェルから移されるときのこの急速拡大の初期相は、一般には、培養容器内で行われる。この培養容器の大きさは、標的細胞の数に依存し、そして、それは典型的には、25cm2フラスコであり得る。Ｔ細胞拡大のその後の周期に用いられる培養容器の大きさは、開始時のＴ細胞数および（通常は治療用途に）必要とされる細胞数に依存する。異なる大きさの培養容器に対する典型的な開始細胞数は次の通りである：５×104〜２×105−約25cm2フラスコ；２×105〜５×105−約75cm2フラスコ；５×105〜１×106−約225cm2フラスコ；および１×106〜２×106−ローラーボトル。各フラスコで用いられる培地の初期容量は、おおよそ、25cm2−20〜30ml；75cm2−60〜90ml；225cm2−100〜200ml；ローラーボトル−500mlである。
以下に説明されるように、最初に４人の異なるヒトドナーに由来した、異なる抗原特異性の10個の異なるＴ細胞クローンを用いる研究は、本発明の急速拡大方法を用いて、クローンＴ細胞数の500〜3000倍（平均で1200倍）の拡大を10〜13日の１回の増殖周期内で容易に達成し得ることを示している（実施例１を参照のこと）。
実施例２で説明されるように、この急速拡大方法は、養子免疫療法で使用するための抗原特異的Ｔ細胞を大量に（109細胞を超えて）生成するように容易にスケールアップし得る。この例において、最初に６人の異なるヒトドナーに由来する10個のクローンから大量のCMV特異的およびHIV特異的Ｔ細胞が生成した。
本明細書で使用される「フィーダ細胞」は、Ｔ細胞レセプターの活性化（これは、Ｔ細胞レセプター複合体の抗CD3モノクローナル抗体との結合により達成され得る）と同時に共刺激機能を提供する補助的な細胞（例えば、好ましくは、γ照射PBMCおよびLCL細胞）である。ヒトＴ細胞の従来の培養方法と劇的に異なる本発明の方法の一つの局面は、標的Ｔ細胞の数に対して、使用されるフィーダ細胞数の大過剰な比である。以下に実施例３で説明されるように、Ｔ細胞の最適な増殖のためには、Ｔ細胞：PBMCの比は、少なくとも約１：40（すなわち、少なくとも約40倍過剰のPBMC）であるべきであり、好ましくはＴ細胞：PBMC比は少なくとも約１：200であり、より好ましくは約１：400〜１：800の間である。典型的には、本発明者らは、約１：500の比を用いている。
以下に実施例４で説明されるように、好ましくは少なくとも約１：10、より好ましくは少なくとも約１：20、さらにより好ましくは約１：50〜１：200の間、最も好ましくは約１：100のＴ細胞：LCL比でLCLフィーダ細胞を含めることにより、この拡大はさらに高まり得る。
過去には、典型的には、抗CD3 mAbをプレート上にコートし、そしてＴ細胞を増殖させる培養においてフィーダ細胞を使用しないか、または、フィーダ細胞を使用する場合には、Ｔ細胞に対して非常に少ない割合（例えば、１：１〜10：１）のフィーダ細胞を用いることが普通であった。例えば、Garbrecht F.C.ら、J.Immunol.Methods 107:137-142,1980;Riddell,J.Immunol.Meth. 128:189-201,1990；およびLondei M.ら、Scand J.Immunol. 27:35-46,1988を参照のこと。以下に、実施例５で説明されるように、本発明の方法に従う拡大したＴ細胞の直接比較は、そのような従来の方法と比較して、各刺激周期で100倍〜1000倍のＴ細胞増殖の効率の改善を示す。
必要とされる大量のPBMCフィーダ細胞は、当該技術分野における公知の技術、例えば、リスクが最小の標準的な医用手順である白血球搬出法（leukaphoresis）（例えば、Weaverら、Blood 82:198-1984,1993を参照）により容易に入手し得る。そして、これらのフィーダ細胞は、使用時まで液体窒素中に凍結保存することにより保存し得る。LCLは、標準的な方法を用いて、EBV（例えば、EBVのB95-8株）による形質転換により（例えば、Crosslandら、J.Immunol. 146:4414-20,1991参照）、またはシクロスポリンＡの存在下における自発的外殖（outgrowth）により、末梢血Ｂ細胞から生成され得る。このようなLCL細胞は、本発明の急速拡大方法で用いるための培養において、急速に、かつ無限に増殖する。
フィーダ細胞を培養容器に添加する前に、これらのフィーダ細胞が有糸分裂するのを妨げるべきである。有糸分裂を妨げる技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、照射が含まれる。例えば、フィーダ細胞のPBMC成分は、約3000〜3600radの範囲のγ線が照射され得（好ましくは、PBMCは約3300radで照射される）、そしてLCLには約6000〜10,000radの範囲のγ線が照射され得る（好ましくは、LCLは約8000radで照射される）。
Ｔ細胞クローンの抗原特異性は培養系でそのクローンを拡大させる前に決定されるので、Ｔ細胞増殖を助けるために、自己または同種異系のいずれかのフィーダ細胞が用いられ得る。同種異系のフィーダ細胞を用いるＴ細胞の急速拡大は以下のいくつかの実施例で説明される。例えば、実施例１におけるドナー「ER」からのクローンの拡大；実施例２におけるドナー「PRM」および「JTE」からのクローンの拡大；ならびに実施例５におけるドナー「ER」からのクローンの拡大を参照のこと。同種異系のフィーダ細胞の使用し得ることは、患者が、PBMC中に存在するウイルス（例えばHIV）（従って、これはＴ細胞培養物を汚染し得る）に感染している状況において重要である。この環境において、スクリーニングされ、そしてアメリカ赤十字の基準によって適切な血液ドナーであると思われる個人に由来する同種異系のフィーダ細胞は、この培養方法で用いられ得る。
非常に都合のよいことに、Ｔ細胞レセプター活性化シグナル（通常、抗原および抗原提示細胞によって提供される）は、抗CD3モノクローナル抗体を培養系に添加することにより達成され得る。最も広く用いられる抗CD3モノクローナル抗体は、Ortho Pharmaceuticalsから臨床用途に適する処方で市販されているOKT3である。Ｔ細胞レセプターを結合手段として抗原ではなくαCD3 mAbを用いることにより、抗原提示細胞の供給源を持つ必要性が回避される。この抗原提示細胞の供給源を持つことは、ウイルス特異的Ｔ細胞に対して、大量の適切な自己細胞を維持し、そしてこれらの細胞にインビトロで高力価のウイルスを感染させることが必要である。以下の実施例６で説明されるように、少なくとも約0.5ng/ml、好ましくは少なくとも約1ng/ml、より好ましくは少なくとも約2ng/mlの濃度の抗CD3モノクローナル抗体は、本発明の方法を用いて500〜3000倍の拡大が約10〜13日以内の増殖で達成され得るように、Ｔ細胞の急速な拡大を促進する。典型的には、本発明者らは、抗CD3モノクローナル抗体を約30ng/mlの濃度で用いるが、実施例５に示されるように、より少ない濃度もまた使用可能である。
もちろん、抗CD3モノクローナル抗体の代用として、Riddellら、J.Immunol. 146:2795-2904、1991に記載されるように、抗原提示細胞を添加することによりＴ細胞レセプターを活性化し得、そして細胞を刺激し得る。適切な抗原提示細胞には、例えば、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、および関連するペプチド抗原でパルス標識された細胞が含まれる。
本発明の方法において用いられる培養培地は、市販の培地のいかなるものでもよく、好ましくは、RPMI、25mM HEPES、25μM ２−メルカプトエタノール、4mM Ｌ−グルタミン、および11％ヒトＡＢ血清を含むものである。仔ウシ胎児血清をヒトＡＢ血清の代わりに置き換え得る。好ましくは、照射されたフィーダ細胞を添加した後、抗CD3モノクローナル抗体および培養培地を標的CTLまたはヘルパーＴ細胞に添加し、この混合物を、当該技術分野において周知の標準的な細胞培養条件下において５％CO2加湿大気中で37℃でインキュベートする。典型的には、このような条件には、排気、および必要であれば、CO2の添加（例えば、加湿インキュベータ中で５％CO2）が含まれ得る。
好ましくは、培地はまた、インターロイキン−２（IL-2）を補充される。典型的には組換えヒトIL-2が用いられるが、その機能的等価物もまた用いられ得る。好ましくは、IL-2を１日目に添加し、そして３〜５日の間隔で再添加する。従って、本発明者らは、一般的には、１日目、５日目もしくは６日目、および８日目もしくは９日目にIL-2を添加する。以下の実施例７で説明されるように、少なくとも約5U/ml、より好ましくは少なくとも約10U/mlのIL-2濃度を用いることにより、拡大を改善し得る。一般には、本発明者らは、約30U/mlの濃度を用いる。
重要なことには、本発明の方法を用いて拡大された抗原特異的Ｔ細胞は、それらの抗原特異性機能を保持する。例えば、以下に実施例８で説明されるように、４個の異なるHIV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、関連抗原（すなわち、HIV）を発現するウイルス感染細胞を殺す能力を保持し、そして無関係のウイルス感染細胞または形質転換された標的細胞に対する非特異的細胞傷害活性を獲得しなかった。同様に、以下に実施例９で説明されるように、４個の異なるCMV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、CMV感染細胞を殺す能力を保持し、そして無関係のウイルス感染細胞または形質転換された標的細胞に対する非特異的細胞溶解活性は獲得しなかった。
これらの特性はまた、CD4＋ヘルパーＴ細胞に適用可能であった。従って、以下に実施例10で説明されるように、本発明の急速拡大方法を用いて増殖させた抗原特異的CD4＋Ｔ細胞は、適切なウイルス抗原および適切な抗原提示細胞（APC）に応答して増殖する能力を保持した。
さらに、本発明の方法によって培養された抗原特異的Ｔ細胞はまた、細胞周期の休止非分裂期に入ることが可能であり、インビトロで少なくとも４週間生存し得る。従って、刺激周期の最後（一般に12日目〜14日目）に培養物からＴ細胞のアリコートを取り除き、そしておおよそ同数の照射PBMCと共に（抗CD3 mAb、抗原またはIL-2なしで）培養容器に置かれ得る。
照射PBMCをフィーダ細胞として添加することにより、休止期に入り、かつ生存したままでいるＴ細胞の能力が改善される。好ましくは、Ｔ細胞を休止させるためのPBMCフィーダ細胞の比は少なくとも約２：１である。PBMCフィーダ細胞の添加なしでは、一般にＴ細胞の生存能力は（典型的には約10％以下のレベルに）大きく低下する。
以下に記載されるように、Ｔ細胞は小さな円形の形態であり、培養の28日後でさえトリパンブルー色素排除により60〜95％が生存している。本発明の方法によって増殖されたＴ細胞はまた、IL-2を取り除いたときに休止期に入り得る；そして抗原特異的Ｔ細胞レセプターを介して再刺激されたときにプログラムされた細胞死（すなわち、アポトーシス）を受けない。（例えば、抗CD3 mABまたは抗原での）再刺激の際、Ｔ細胞はIL-2に対する応答性を再度獲得し、そして細胞周期のＳ期およびＧ2期に入り細胞数を増加し得る。このような特性は、細胞のインビボでの生存および養子免疫療法の効率に重要であるものと考えられる。対照的に、Ｔ細胞増殖のための以前に記載された特定の方法は、サイトカインの除去またはＴ細胞レセプターの再刺激の後に一部の細胞でアポトーシス的な細胞死が生じることを報告している（例えば、Boehme SAおよびLenardo MJ,Eur.J.Immunol.,23:1552-1560,1992を参照のこと）。
免疫療法で用いられ得るＴ細胞に機能的遺伝子を導入することが望ましい多くの異なる環境が存在する。例えば、導入された遺伝子（gene or genes）は、移入されたＴ細胞の生存能力および／または機能を促進することにより治療効率を改善し得る；あるいはインビボでの生存または移動の選択および／または評価を可能にする遺伝的マーカーを提供し得る；あるいは、Lupton S.D.ら、Mol.and Cell Biol.,11：6（1991）；およびRiddellら、Human Gene Therapy 3:319-338（1992）に記載されるように、例えばその細胞をインビボでのネガティブ選択に対して感受性にすることにより、免疫療法の安全性を改善する機能を組込み得る；優勢ポジティブ選択マーカーをネガティブ選択マーカーと融合させることにより誘導される二機能性選択融合遺伝子の使用を記載する、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公開公報も参照のこと。
遺伝子の送達に組換え感染性ウイルス粒子を利用する様々な感染技術が開発されている。これは、本発明のＴリンパ球の形質導入に対する現時点での好ましいアプローチを表す。このように用いられているウイルスベクターには、シミアンウイルス40（SV40；Karlssonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 82:158,1985）、アデノウイルス（Karlssonら、EMBO J.5:2377,1986）、アデノ関連ウイルス（AAV）（B.J.Carter, Current Opinion in Biotechnology 1992,3:533-539）、およびレトロウイルス（Coffin,1985,17-71頁,Weissら（編）,RNA Tumor Viruses,第２版,第２巻,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）に由来するウイルスベクターが含まれる。このように、遺伝子移入法および発現法は多いが、本質的には遺伝物質を哺乳動物細胞に導入して発現するように機能する。上記技術のいくつかは造血性またはリンパ様細胞の形質導入に用いられている。これらの技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション（Bermanら、前出、1984）、プロトプラスト融合（Deansら、前出、1984）、エレクトロポレーション（Cannら、Oncogene 3:123,1988）、ならびに組換えアデノウイルス（Karlssonら、前出；Reutherら、Mol.Cell.Biol.6:123,1986）、アデノ関連ウイルス（LaFaceら、前出）およびレトロウイルスベクター（Overell et al.,Oncogene 4:1425,1989）での感染を含む。初代Ｔリンパ球は、エレクトロポレーション（Cannら、前出、1988）およびレトロウイルス感染（Nishiharaら、Cancer Res.48:4730,1988;Kasidら、前出、1990；およびRiddell,S.ら、Human Gene Therapy 3:319-338,1992）により成功裏に形質導入されている。
レトロウイルスベクターは、真核生物細胞への遺伝子移入の非常に効率的な方法を提供する。さらに、レトロウイルス組込みは、制御された様式で行われ、そして細胞当たり１もしくは数コピーの新しい遺伝情報の安定な組込みを生じる。
レトロウイルスは、ウイルスのRNAゲノム複製にウイルスがコードするRNA指向DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素を用いて複製し、鳥類または哺乳動物宿主細胞の染色体DNAに組込まれる二本鎖DNA中間体を生じるクラスのウイルスである。ほとんどのレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。しかしながら、本発明による使用に適合し得るレトロウイルスは、あらゆる鳥類または哺乳動物細胞の供給源に由来し得る。これらのレトロウイルスは好ましくは両栄養性であり、これはヒトを含む数種の宿主細胞に感染し得ることを意味する。レトロウイルスゲノム（および本明細書中で記載されるように用いられるレトロウイルスベクター）の特徴は、レトロウイルスの長い末端反復（すなわち、LTR）である。これは、レトロウイルスゲノムの５’および３’末端に僅かに変化した形態で見出される約600塩基対の非翻訳領域である。プロウイルスとしてDNAに組込まれた場合、このレトロウイルスLTRは短いダイレクト反復配列を各末端に含み、RNAポリメラーゼIIによる転写および３’開裂およびRNA転写体のポリアデニル化のための開始シグナルである。このLTRには、ウイルス複製に必要な他の全てのシス作用配列が含まれる。
「プロウイルス」は、適切な宿主細胞内の染色体DNAに安定に組込まれるレトロウイルスのDNA逆転写体、もしくはそれらのクローン化コピー、または組込まれていない中間形態のレトロウイルスDNAのクローン化コピーをいう。適切なヘルパーウイルスの存在下において、または汚染ヘルパーウイルスを同時に生成することなくキャプシド化し得る適切な配列を含む細胞株において、プロウイルスの正転写および感染性ウイルスへの組立てが起こる。Mannら（Cell 33:153,1983）は、ヘルパーを含まない組換えレトロウイルスのストックの生成に使用し得る細胞株（例えば、Ψ２）の開発を記載している。これらの細胞株は、組込まれたレトロウイルスゲノムを含む。この組込まれたレトロウイルスゲノムは、キャプシド化にシスで必要な配列を欠いているが、完全なビリオンを生成するために必要な遺伝子産物の全てをトランスで提供する。この組込まれた変異プロウイルスから転写されたRNAは、それ自身ではパッケージ化され得ないが、これらの細胞は、その同一細胞に導入された組換えレトロウイルスから転写されたRNAをキャプシド化される得る。得られるウイルス粒子は感染性ではあるが、複製できない。これは、それらを、キャプシド化し得る相補的遺伝情報を欠く細胞への導入の後の感染性ウイルスを生成し得ない有用なベクターにする。環境栄養性（ecotropic）ウイルスのエンベロープ（例えば、Ψ２）をコードするトランス作用要素を有する細胞株におけるキャプシド化により、環境栄養性（制限された宿主範囲）子孫ウイルスが得られる。あるいは、両栄養性パッケージング遺伝子を有する細胞株（例えば、PA317,ATCC CRL9078；MillerおよびButtimore,Mol.Cell.Biol.6:2895,1986）内での組立てにより、両栄養性（広宿主範囲）子孫ウイルスが得られる。このようなパッケージング細胞株は、必須のレトロウイルスgag、polおよびenvタンパク質をトランスで提供する。この戦略は、哺乳動物細胞に対して感染性が高いものの、それらが標的細胞のゲノムに組込まれた後さらに複製することができないレトロウイルス粒子の生成を生じる。env遺伝子の産物は、標的細胞表面上のウイルスレセプターへのレトロウイルスの結合に与り、従って、そのレトロウイルスの宿主範囲を決定する。PA317細胞は、ヒトおよび他の種を起源とする細胞を形質導入し得る両栄養性エンベロープタンパク質を有するレトロウイルス粒子を生成する。他のパッケージング細胞株は、マウスおよびラット細胞のみを形質導入し得る環境栄養性エンベロープタンパク質を有する粒子を生成する。
多くのレトロウイルスベクター構築体が、多くの外来遺伝子の発現に成功裏に用いられている（例えば、Coffin,Weissら（編）,RNA Tumor Viruses,第２版,第２巻（Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1985,17-71頁を参照のこと）。挿入配列を有するレトロウイルスベクターは一般に機能的であり、そして一貫してレトロウイルスの感染を阻害する配列は、ほとんど同定されていない。機能的なポリアデニル化モチーフは、レトロウイルスRNAの合成をブロックすることによりレトロウイルスの複製を阻害し、そしてレトロウイルス粒子にパッケージされ得る配列には、約11kbのサイズ上限が存在する（Coffin、前出、1985）；しかしながら、最初は問題であると思われた（Coffin、前出、1985）複数の内部プロモーターの存在が、いくつかのレトロウイルス構築体において十分に許容されていることが見出された（Overellら、Mol.Cell.Biol. 8:1803,1983）。
レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを用いてインビトロで形質導入され、レシピエントマウスに移植されているマウス造血幹細胞の発達を追跡するために、いくつかのグループにより遺伝タグとして用いられている（Williamsら、Nature 310:476,1984;Dickら、Cell 42:71,1985；Kellerら、Nature 318:149,1985）。これらの研究は、この感染造血細胞がレシピエント動物の造血組織およびリンパ様組織を再構築し、そしてこれらの細胞がインビボで正常な発達潜在的能力を示すことを示している。これらの標識細胞は、レトロウイルスベクター配列の存在を示し得る多くの分子生物学的技術のいずれか、最も注目すべきはサザン分析およびPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて可視化し得る。レトロウイルスベクターを用いて細胞を遺伝的に標識し得ることは、この手法を自己細胞の移植片の追跡に使用し得る臨床環境においても有用である。このアプローチは、Rosenbergら（N.Engl.J.Med.323:570,1990）により、末期ガン処置のためのTIL（腫瘍浸潤リンパ球）療法が施されている患者におけるTILの追跡に既に用いられている。これらの細胞のマーカー遺伝子での形質導入は、インビトロで細胞機能障害に関連しなかった（Kasidら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:473,1990）。
レトロウイルスベクターにおいて多くの遺伝子産物が発現している。これは、そのレトロウイルスのLTR内に組込まれているプロモーターの転写制御下に発現させようとする配列を置くか、あるいはそれらをLTRの間に挿入されている異種プロモーターの制御下に置くことにより達成し得る。後者の戦略は、そのベクター内の優勢選択マーカー遺伝子を共発現させる方法を提供し、それにより特定のベクター配列を発現する細胞の選択を可能にする。
刺激因子（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現は、処置された個体に対して有害であり得ると考えられる。従って、本発明のＴ細胞をインビボでのネガティブ選択に対して感受性にする遺伝子セグメントを含むことは本発明の範囲内にある。「ネガティブ選択」は、注入された細胞が個体のインビボ条件での変化の結果として排除され得ることを意味する。ネガティブ選択表現型は、投与された作用物質（例えば化合物）に対する感受性を付与する遺伝子の挿入の結果として生じ得る。ネガティブ選択遺伝子は当該技術分野において公知であり、これにはとりわけ次のものが含まれる：ガンシクロビル感受性を付与するＩ型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-I TK）遺伝子（Wiglerら、Cell 11:223,1977）；細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子、細胞のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）遺伝子、細菌性シトシンデアミナーゼ（Mullenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33（1992））。
加えて、インビボでネガティブ選択表現型の細胞を選択し得るポジティブマーカーをＴ細胞に含めることが有用である。このポジティブ選択マーカーは、宿主細胞に導入されることにより、その遺伝子を有する細胞のポジティブな選択を可能にする優勢表現型を発現する遺伝子である。このタイプの遺伝子は当該技術分野において公知であり、そしてこれには、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質G418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ADA）、および多剤耐性（MDR）遺伝子が含まれる。
好ましくは、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択要素とは、ネガティブ選択要素の喪失はまた、必然的にポジティブ選択マーカーの喪失をともなうように結合される。さらにより好ましくは、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーは、一方の喪失が必ず他方の喪失を招くように融合される。上記の所望のポジティブおよびネガティブ選択の特徴の両者を付与するポリペプチドを発現産物として生成する融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（HyTK）である。この遺伝子の発現により、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性を付与し、かつインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドが生成される。Lupton S.D.ら、Mol. and Cell. Biology 11:3374-3378,1991を参照のこと。加えて、好ましい実施態様において、この融合遺伝子を有するレトロウイルスベクター、特に、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性およびインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を付与するもの（例えば、Lupton,S.D.ら（1991）前出に記載されているHyTKレトロウイルスベクター）内に、キメラレセプターをコードする本発明のポリヌクレオチドが存在する。S.D.LuptonによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601公開公報も参照のこと。これらは、優勢ポジティブ選択マーカーをネガティブ選択マーカーとの融合に由来する二機能性選択融合遺伝子の使用を記載する。
好ましいポジティブ選択マーカーは、hph、neo、およびgptからなる群より選択される遺伝子に由来し、そして好ましいネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、HIV-I TK、VZV TK、HPRT、APRTおよびgptからなる群より選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、ポジティブ選択マーカーがhphまたはneoに由来し、そしてネガティブ選択マーカーがシトシンデアミナーゼまたはTK遺伝子に由来する二機能性選択融合遺伝子である。
当該技術分野において周知のように、様々な方法がＴリンパ球の形質導入に使用され得る。典型的には、本発明者らは、次のようにレトロウイルスによる形質導入を行う：本明細書中に記載されるREMを用いる刺激後の１日目に、20〜30単位／mlのIL-2を細胞に加え；３日目に、培地の1/2を標準的な方法に従って調製したレトロウイルス上清に置き換え、そして次いでその培養物に５μg/mlポリブレンおよび20〜30単位/ml IL-2を補充し；４日目に細胞を洗浄し、そして20〜30単位/ml IL-2を補充した新鮮な培養培地中に入れ；５日目にレトロウイルスへの暴露を繰り返し；６日目に30単位/ml IL-2を補充した選択培地（例えば、そのレトロウイルスベクターに与えられた抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を含む）中に細胞を入れ；13日目に、Ficoll-Hypaque密度勾配分離を用いて生存細胞を死細胞から分離し、そして次いで本発明の急速拡大方法を用いてその生存細胞をサブクローン化する。
本発明のリンパ球は、個体に免疫性を付与するために使用し得る。「免疫性」は、リンパ球の応答が指向する、病原体による感染または腫瘍に対する応答に関連する１つ以上の身体的症状の軽減を意味する。投与される細胞量は、通常、病原体に対する免疫性を有する正常な個体に存在する範囲内である。従って、CD8+ CD4-細胞は、通常、各々の注入が少なくとも106〜1010細胞／ｍ2、好ましくは少なくとも107〜109細胞／ｍ2の範囲内の注入により投与される。これらのクローンは１回の注入で投与され得るか、またはある期間の範囲にわたって複数回注入され得る。しかしながら、異なる個体では応答性が変動することが予想されるため、注入細胞のタイプおよび量ならびに注入の回数および複数回の注入が行われる期間範囲は担当医によって決定され、かつ日常的な検査によって決定され得る。本明細書中に例示されるように、本発明の急速拡大方法を用いることにより、十分なレベルのＴリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を含む）の生成を容易に達成し得る。
本発明に従ってREMを用いて拡大されたＴ細胞が、リンパ球を用いる養子免疫療法および遺伝子療法に関連して多用されるレトロウイルスベクターのようなベクターを用いる非常に高いレベルの形質導入を示すことも観察されている。急速拡大されたＴ細胞の遺伝的形質導入は実施例18に説明されており；そしてそのような遺伝的に形質導入された抗原特異的CTLのヒト患者における養子免疫療法への使用は実施例19に説明されている。
以下に提示される実施例は、当業者の実施者に対するさらなる案内として提供されるものであり、そしていかなる意味においても本発明を制限するものと解釈されない。
実施例１
４人のヒトドナーに由来するヒト抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球クローンおよび抗原特異的ヘルパーＴリンパ球の急速拡大
CD3＋、CD8＋、CD4− CMV特異的またはHIV特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローン、およびCD3＋、CD4＋、CD8− CMV特異的ヘルパーＴ細胞クローンを、CMVおよび／またはHIVセロポジティブである４人のヒトドナーから（「ER」、「DRG」、「DPN」および「DH」と呼ばれる）単離した。上述の標準的な方法を用いて、10個の異なる抗原特異的Ｔ細胞クローンを単離した（例えば、Riddellら、Science 257:238-240（1992）、Riddellら、（J.Immunology,146:2795-2804,1991）を参照のこと）。
小規模拡大のため、細胞を５〜６×104Ｔ細胞／フラスコの投入細胞濃度で、25cm2組織培養フラスコにおいて培養した。
４個のクローン（ER3C、ER12C、ER4G、およびER11G）に、γ線照射同種異系PBMCおよびLCLをフィーダ細胞として添加した。簡単に述べると、同種異系PBMCを、標準的な方法（例えば、前出のWeaverらを参照のこと）を用いて血液銀行がスクリーニングしたボランティアドナーから白血球搬出により得た。同種異系LCLを、上述のように、EBVのB95-8株で形質転換することによりこのPBMCのアリコートから生成した。PBMCは3300radで、そしてLCLは8000radでγ線照射に供した。
残りのクローンには、自己γ線照射PBMCおよびLCLをフィーダ細胞として添加した。自己PBMCおよびLCLを、同種異系フィーダ細胞について記載したのと同じ方法で単離および照射した。
25mlの最終培養容積で、各フラスコに添加されたPBMCフィーダ細胞の数は約25×106であり、そしてLCLフィーダ細胞の数は約５×106であった。Ｔ細胞レセプターの刺激シグナルを与えるために、培養開始時に最終濃度30ng/mlで抗CD3モノクローナル抗体を添加し、そして活性化Ｔ細胞の拡大をさらに促進するため、培養開始後１日目に、40U/mlの濃度でヒト組換えIL-2を添加した。培養開始後５日目および８日目に、培地の1/2を、IL-2を20U/mlの濃度で含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106／培地mlを超えたとき、培養物を分割した。培養開始後11〜13日目に、フラスコ当たりで得られたＴ細胞の総数を評価した。
図１に示したように、その結果は、Ｔ細胞の全てが急速かつ劇的な拡大を受けたことを示す。特に、本発明の方法を用いて、１刺激周期で、細胞は866倍〜1500倍の範囲の拡大（1100倍を超える平均拡大）を示した。
実施例２
養子免疫療法に用いるための、６人のヒトドナーに由来する抗原特異的Ｔ細胞クローンの大規模拡大
上述のように、６人の個々の患者（「DRG」、「MRL」、「DRD」、「LAH」、「RM」および「JTE」と呼ばれる）からCMVまたはHIV特異的Ｔ細胞クローンを単離した。クローンを、マイクロウェルから移した後少なくとも１刺激周期培養した。
この大規模拡大のために、各クローンのアリコートを、1.5×105〜５×105の投入細胞数で、フィーダ細胞としての自己（DRG、MRL、DRD、LAH）または同種異系（RM、JTE）のいずれかのγ線照射PBMCおよびLCLと共に75cm2フラスコにおいて培養した。各フラスコに添加したフィーダ細胞の数は、75〜90×106PBMCおよび15×106LCLであった。抗CD3モノクローナル抗体を、最終濃度30ng/mlで培養培地の総容積75mlにて添加した。培養開始後１日目にヒト組換えIL-2を最終濃度30U/mlで添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合には、培養物を分割し、そして再補給した。総細胞収量は、培養開始後10〜14日目にフラスコから回収された細胞数を表し、そして少数の出発細胞数からの１周期での拡大を反映する。
図２に示すように、その結果は、急速な大規模拡大が全てのクローンについて達成されたことを示す。特に、これらのクローンは、１刺激周期で抗原特異的Ｔ細胞の大集団（6.2×108〜9×109細胞の範囲）を生じる約250倍〜2200倍の範囲の拡大（約1130倍の平均拡大）を示した。
刺激の反復周期もまた、急速拡大の促進に効果がある。したがって、この技術を用いて、1015を超えるクローン由来のエフェクターＴ細胞を生成することが可能である。実際問題としては、（超大規模培養に必要な培地およびインキュベータの空間により）109〜５×1010の細胞用量がより適しており、これは一般に養子免疫療法での使用に十分である。
実施例３
急速拡大方法におけるPBMCフィーダ細胞のＴ細胞に対する比の効果
（実施例２のように）クローンDRG28D3由来の５×104個の細胞数のＴ細胞を投入して個々の25cm2フラスコを確立した。様々な数のγ線照射PBMCを添加して、Ｔ細胞のPBMCに対する１：３〜１：800の範囲の比を達成した。抗CD3 mAB（30ng/ml）および５×106LCLを各フラスコに添加して、各フラスコの最終容積を25mlとした。１日目に組換えIL-2を40U/mlの濃度で添加し、そして５日目および８日目に1/2の培地をIL-2を20U/mlの濃度で含有する新鮮な培地に置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合には、培養物を分割した。各々のＴ細胞：PBMC比で確立された培養物におけるＴ細胞の増殖を、13日目に生存Ｔ細胞を数えることにより評価した。
図３に示されるように、その結果は、Ｔ細胞：PBMC比を少なくとも１：40（すなわち、少なくとも40倍過剰のPBMC）、好ましくは少なくとも１：200、より好ましくは約１：400と１：800の間で用いることにより、Ｔ細胞の増殖を顕著に増強し得ることを示す。典型的には、発明者らは約１：500の比を用いる。
実施例４
急速拡大方法におけるLCLフィーダ細胞の使用の効果
（実施例２の）クローンDRG28D3由来の５×104個の細胞数のＴ細胞を投入して個々の25cm2フラスコを確立した。様々な数のγ線照射LCLを添加して、Ｔ細胞のLCLに対する１：０〜１：300の範囲の比を達成した。抗CD3 mAB（30ng/ml）および25×106PBMCを各フラスコに添加し、各フラスコの最終容積を25mlとした。１日目に組換えIL-2を40U/mlの濃度で添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2を20U/mlの濃度で含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合には、培養物を分割した。各々のＴ細胞：LCL比で確立された培養物におけるＴ細胞の増殖を、13日目に生存Ｔ細胞を数えることにより評価した。
図４に示されるように、その結果は、培養物にLCLフィーダ細胞を添加することにより、REMの下での拡大速度をさらに高め得ることを示す。このようなさらなる増強は、Ｔ細胞：LCL比を少なくとも１：lO（すなわち、少なくとも10倍過剰のPBMC）、好ましくは少なくとも１：20、さらにより好ましくは約１：50と１：200の間で用いることにより達成し得る。典型的には、発明者らは約１：100の比を用いる。
実施例５
Ｔ細胞の増殖に用いられる他の方法とのこの急速拡大方法の比較
６個の異なるＴ細胞クローンのアリコートを、以下に記載される条件下で刺激した。
（a）REMの使用：
本発明の急速拡大方法に従って、５×104個のＴ細胞を25cm2フラスコにおいて、１：500のＴ細胞：PBMC比のγ線照射PBMC、および１：100のＴ細胞：LCL比のγ線照射LCLと共に、40ng/mlのαCD3 mABを含有する25mlの培地中で培養した。１日目に組換えIL-2（30U/ml）を添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地と置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合に培養物を分割した。培養開始後11日目に得られた生存Ｔ細胞の総数を出発細胞数で除することにより、細胞数の拡大倍数を決定した。
（b）標準的なαCD3刺激の使用：
本質的にRiddellらによって記載された方法（J.Immun.Methods,1990,前出）に従って、５×105個のＴ細胞を、24ウェルプレートの個別のウェルにおいて、２×106個のγ線照射PBMCおよび２×105個のγ線照射LCLと共に、40ng/ml αCD3 mABを含有する２mlの培地中で培養した。１日目に組換えIL-2（30U/ml）を添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合に培養物を分割した。培養開始後11日目に得られた生存Ｔ細胞の総数を出発細胞数で除することにより、細胞数の拡大倍数を決定した。
（c）標準的な抗原刺激の使用
本質的にRiddellらによって記載された方法（J.Immunol.,1991,前出）に従って、５×105個のＴ細胞を、24ウェルプレートの個別のウェルにおいて、５×104個の自己CMV感染線維芽細胞からなる特異抗原、ならびに２×106個のγ線照射PBMCおよび２×105個のγ線照射LCLからなるフィーダ細胞と共に２mlの培地中で培養した。２日目に組換えIL-2（30U/ml）を添加し、そして４日目および６日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合に培養物を分割した。抗原で刺激された培養においては、培養開始後７日目と９日目の間に最大細胞収量が得られた。したがって、培養開始後７〜９日目に得られた生存Ｔ細胞の総数を出発細胞数で除することにより、細胞数の拡大倍数を決定した。
図５に示される比較の結果は、従来のＴ細胞増殖方法と比較して、本発明の急速拡大方法（REM）を用いることで１刺激周期で劇的に拡大することを示す。特に、REMを用いての平均拡大は、標準的な抗CD3法を用いて観察されるものよりもほぼ100倍高く、そして標準的な抗原刺激法を用いて観察されるものよりもほぼ500倍高かった。
実施例６
急速拡大培養物への抗CD3モノクローナル抗体の添加の効果
培養系への抗CD3モノクローナル抗体の添加の効果を評価するため、５×104個のＴ細胞（実施例２のようにクローンDRG 28D3から得られた）を、25cm2フラスコにおいて、１：500のＴ細胞：PBMC比のγ線照射PBMCおよび１：100のＴ細胞：LCL比のγ線照射LCLと共に、０〜40ng/mlの濃度範囲の様々な濃度の抗CD3 mABを含有する25ml培地中で培養した。１日目に組換えIL-2（30U/ml）を添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地に置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合に培養物を分割した。培養開始後11日日に得られた生存細胞の数を数えることにより、Ｔ細胞の増殖を評価した。
図６に示されるように、その結果は、培養物に抗CD3モノクローナル抗体を添加することにより、REMの下での拡大速度をさらに高めることができることを示す。このようなさらなる増強は、少なくとも約0.5ng/ml、好ましくは少なくとも約１ng/ml、より好ましくは少なくとも約２ng/mlの抗CD3濃度を用いて達成され得る。典型的には、発明者らは約30ng/mlの濃度を用いる。
実施例７
急速拡大培養物へのIL-2の添加の効果
培養系への抗CD3モノクローナル抗体の添加の効果を評価するために、（実施例２のようにクローンDRG 28D3から得られた）５×104個のＴ細胞を、25cm2フラスコにおいて、１：500のＴ細胞：PBMC比のγ線照射PBMCおよび１：100のＴ細胞：LCL比のγ線照射LCLと共に、30ng/mlの抗CD3 mABを含有する25ml培地中で培養した。１日目に組換えIL-2を様々な濃度（０〜50U/mlの範囲）で各フラスコに添加し、次いで５日目および８日目に培地の1/2をIL-2を同じ濃度で含有する新鮮な培地に置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えたときに培養物を分割した。培養開始後11日日に得られた生存細胞数を数えることにより、Ｔ細胞の増殖を評価した。
図６に示されるように、その結果は、培養物にIL-2を添加することにより、REMの下での拡大速度をさらに高めることができることを示す。このようなさらなる増強は、少なくとも約５U/ml、好ましくは少なくとも約10U/mlのIL-2濃度を用いることにより達成し得た。典型的には、発明者らは約30U/mlの濃度を用いる。
実施例８
HIV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、急速拡大の後に抗原特異的溶解機能を保持する
クローンRM56G6/7、RM56G6/2、JTE10A5/5およびJTE10A5/13は、Riddellら、J.Immunol.,1991に記載されるように生成されたCD3＋、CD8＋、CD4−、HIV（gag）特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンである（実施例２を参照のこと）。個々のクローンを、本発明の急速拡大培養方法を用いて少なくとも２刺激周期培養した。刺激後10〜12日目に、Ｔ細胞クローンを、Riddell,S.ら、J.Immunol.,1991,前出に記載されるように５時間のCr51放出アッセイにおいて、MHCが制限されたAg特異的細胞傷害機能の保持についてアッセイした。
標的細胞は自己およびHLA不適合EBV形質転換LCLからなっており、そしてこれらを擬似感染（「mock」）させるか、あるいはワクシニア−HIV（gag）組換えウイルス（「Vac／gag」）またはコントロールのワクシニアウイルス（「Vac」）で16時間感染させた。
図８に示されるように、その結果は、REMを用いて拡大させたHIV（gag）特異的CTLクローンが、HIV（gag）発現標的細胞をMHCが制限された様式で溶解する能力を保持することを示す。
実施例９
CMV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、急速拡大の後に抗原特異的溶解機能を保持する
クローンLAH4F8、LAH7E4、MRL10E6およびMRL10B5は、実施例２に記載されるように生成させたCD3＋、CD8＋、CD4−、CMV特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンである。個々のクローンを、本発明の急速拡大培養方法を用いて少なくとも２刺激周期培養した。刺激後10〜12日目に、Ｔ細胞クローンを、上述のように５時間Cr51放出アッセイにおいて、MHCが制限されたAg特異的細胞溶解機能の保持についてアッセイした。
標的細胞は自己およびHLA不適合線維芽細胞からなっており、そしてこれらを擬似感染（「mock」）させるか、またはCMVのAD169株（「CMV」）で24時間感染させた。
図９に示されるように、その結果は、REMを用いて拡大させたCMV特異的CTLクローンが、CMV発現標的細胞をMHCが制限された様式で溶解する能力を保持することを示す。
実施例10
CMV特異的CD4＋ヘルパーＴリンパ球は、インビトロでの急速拡大の後に、抗原特異的増殖機能を保持する
Ｔ細胞クローンDHTh-2およびDHTh-10（実施例１を参照のこと）は、上述のようにPBLをCMV抗原で刺激し、そして限界希釈でクローン化することによりCMVセロポジティブドナーから生成された、CD3＋、CD4＋、CD8− CMV特異的クラスII MHCに制限されたクローンである。
これらのクローンのアリコートを、本発明の急速拡大方法で、30ng/mlの抗CD3 mABならびにＴ細胞のPBMCに対する１：500の比およびＴ細胞のLCLに対する１：100の比を用いて、２刺激周期拡大させた。
周期２の14日後、Ｔ細胞を洗浄し、そして96ウェル丸底プレート中の３連の培養物において、５×104細胞／ウェルでプレートした。ドナーDHまたはクラスII MHC不適合同種異系ドナーから得られた照射PBMCを、抗原提示細胞として５×105個添加した。幾つかの３連では、グリシン抽出により調製されたCMV抗原を１／500の濃度で添加した。96時間のインキュベーションの最後の18時間、3Ｈチミジンでウェルをパルス標識し、そしてβシンチレーション計数のために細胞を回収した。
図10に示されるそのデータにより、クローンDHTh-2およびDHTh-10が、REMを用いる急速インビトロ拡大の後でも、MHCが制限されたCMV特異的増殖応答を示し続けることが確認される。
実施例11
急速に拡大したＴ細胞はサイトカインが使用中止された際に休止段階に入る能力を保持し、これらは、抗原またはIL-2なしでもインビトロで生存可能のままであり、そしてこれらは、Ｔ細胞レセプター活性化の際にIL-2に対する応答性を回復する
本発明の方法によって培養された抗原特異的Ｔ細胞は、細胞周期の静止非分裂期に入ることも可能であり；かつインビトロで少なくとも4週間生存し続けることができる。したがって、Ｔ細胞のアリコートを刺激周期の終わり（一般的には、12〜14日目）に培養物から取り出し、ほぼ同数の照射PBMCと共に（抗CD3 mAB、抗原、またはIL-2なしで）培養容器に入れることができる。照射PBMCをフィーダ細胞として添加することにより、休止期に入り、かつ生存可能のままでいるＴ細胞の能力を改善した。さらに、Ｔ細胞は小さな円い形態をとることが観察され、そして培養28日後であっても細胞の60〜95％が生存可能のままであった（トリパンブルー色素排除により測定した場合）。
クローンER11G（実施例１を参照のこと）が、急速拡大方法で２周期増殖させた代表的なCD3＋、CD8＋、CD4− HIV（gag）特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンである。増殖の第２周期の後、Ｔ細胞をインビトロで休止させた。簡単に述べると、細胞を洗浄し、１×106/mlの細胞濃度で新鮮な培地に再懸濁し、次いで１mlを24ウェルプレートの個別のウェルにプレートした。２×106個のγ線照射同種異系PBMCを、各ウェルに最終容積２mlで添加した。７日ごとに、1/2容積の新鮮な培地を添加した。
21日後、Ficoll hypaqueで細胞を分離し、そして生存休止Ｔ細胞を洗浄して96ウェル丸底プレートの３連の培養物に１×105／ウェルでプレートした。０、2.5、５、10または20単位/mlのIL-2を、IL-2に対する休止細胞の応答性を評価するために添加した。Ｔ細胞のアリコートを抗CD3 mABで48時間活性化し、次いで上述の通り96ウェル丸底プレートにプレートした。増殖を評価するため、72時間のインキュベーションの最後の16時間、全てのウェルを3Ｈチミジンでパルス標識した。
図11に示されるそのデータにより、本発明に従ってREMにより生成させたＴ細胞は、静止段階の間、外因性IL-2に応答して増殖することがなく；そしてこれらは、Ｔ細胞レセプターの活性化に際してIL-2応答性を回復することが確認された。
実施例12
急速に拡大したＴ細胞はインビトロでの休止の後に細胞周期のＧ０／Ｇ１段階に入り、そしてIL-2Rα鎖を発現しない
Ｔ細胞クローンDRG28D3（実施例２を参照のこと）は、急速拡大方法で２周期増殖させた代表的なCD3＋、CD8＋、CD4− CMV特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンである。拡大の２周期の後、細胞を実施例11に記載されるようにインビトロで休止させた。インビトロでの休止の14日後、生存Ｔ細胞をFicoll hypaqueで分離しそして洗浄した。
次に、DNA含量を評価するために、細胞をヨウ化プロピジウムで染色することにより細胞周期分析を行った。図12に示されるように、そのデータは、約95％の細胞が細胞周期のＧ０／Ｇ１期に入っていることを示した。
IL-2レセプターα鎖の発現を、抗CD3モノクローナル抗体、抗IL2レセプターα鎖モノクローナル抗体、または第２工程のモノクローナル抗体のみを用いる間接免疫蛍光法で細胞を染色することによりモニターした。データは、休止細胞は抗CD3抗体で染色されるが、しかしごくわずかのIL-2レセプターα鎖しか発現しないことを示した。ポジティブコントロールとして、48時間活性化されているＴ細胞も染色した。データは、休止Ｔ細胞上での低レベルのIL2Rαの発現が、活性化によりアップレギュレートされることを示した。
実施例13
Ｔ細胞レセプター活性化の後に、休止Ｔ細胞は細胞増殖のＳおよびＧ２／Ｍ期に誘導される
上述のように14日間休止しているDRG28D3細胞のアリコートを、急速拡大方法を用いて再刺激した。簡単に述べると、１×105個のＴ細胞を、25cm2フラスコにおいて、フィーダ細胞としての25×106個のγ線照射PBMCおよび5×106個のγ線照射LCL、ならびに30ng/mlの抗CD3 mABと共に培養した。１日目に30U/mlのIL-2を添加した。５日目に培養物を回収し、そして細胞をFicoll hypaqueを用いて遠心分離し残留フィーダ細胞をＴ細胞から分離した。次いで、残った細胞を洗浄し、そしてDNA含量を評価（access）するためヨウ化プロピジウムで染色した。
図13に示される結果は、活性化に続くこの時期に、Ｔ細胞の約40％が細胞周期のＳまたはＧ2／Ｍ期に、残りの細胞がＧ１に入っていることを示す。
上のデータをまとめると、本発明の方法で増殖させたＴ細胞は、IL-2の使用中止の際に休止期に入ることが可能であり、そして、これらは抗原特異的Ｔ細胞レセプターによる再刺激の際にプログラム細胞死（すなわち、アポトーシス）を受けない。（例えば、抗CD3 mABまたは抗原での）再刺激の際、Ｔ細胞はIL-2に対する応答性を再獲得し、そして細胞周期のＳおよびＧ2期に入ることが可能であり、かつ細胞数が拡大し得る。このような特性は、細胞のインビボでの生存および養子免疫療法の効力に重要であると考えられる。
実施例14
ポリクローナル抗原特異的Ｔ細胞の単離およびCMV特異的CTLクローンの生成
本明細書中に記載される方法は、養子免疫療法において用いるためのヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを含むＴ細胞を迅速に増強させるために特に有用である。決められた抗原特異性のＴ細胞クローンが治療に用いられる環境においては、まず、これらのクローンを以下に説明される標準的な方法を用いてポリクローナルＴ細胞から単離しなければならない。次いで、本発明の急速拡大方法を用いて、抗原特異的Ｔ細胞クローンの数を迅速に拡大させることができる。この培養方法をどのように用いるのかを示す次の実施例において、標準的な方法を用いるＴ細胞クローンの生成が簡潔に説明される。
CMVセロポジティブによって以前にサイトメガロウイルス（CMV）に感染していることが既知である、「MRL」と呼ばれる人物から末梢血（PB）を採取した。Ficoll hypaque密度勾配分離を用いてMRL由来の末梢血を精製し、末梢血単核細胞（PBMC）の集団を得た。
線維芽細胞株は、ドナーMRLから得た皮膚生検物に由来した。自己線維芽細胞（５×105）をAD169株サイトメガロウイルス（CMV）で６時間感染させ、次いで１：20の比で自己PBMC（１×107）に添加した。培養７日後に、この集団からCD4＋Ｔ細胞を枯渇させ、そして96ウェル丸底ウェルにおいて２×103個のAD169 CMV感染線維芽細胞；５×104個のγ線照射PBMC；1×104個のγ線照射LCL；および50単位/mlの組換えヒトIL-2と共に、0.2mlの培養培地の固定容積で0.3〜0.7のＴ細胞／ウェルをプレートすることによりCD8＋Ｔ細胞をクローン化した。プレーティングの13日後に増殖についてポジティブなウェル中のＴ細胞のアリコートを、Riddellら、J.Immunol.,前出に記載される通りにウイルス特異的細胞溶解活性について試験し、次いで細胞溶解活性を示すものを再刺激のためにはマイクロウェルに、または急速拡大のためには25cm2フラスコに、移した。
実施例15
自己フィーダ細胞系を用いるCD8＋ CMV特異的Ｔ細胞クローンの急速拡大
（実施例14からの）MRL CD8＋ CMV特異的Ｔ細胞クローンを数え、そして組織培養フラスコに入れた。自己PBMCをドナーの白血球搬出により得、そしてそれにγ線照射した後、フィーダ細胞として添加した。PBMCにはγ線を3,300radで照射した。照射PBMCの標的Ｔ細胞の量に対する比は400：１〜700：１の範囲であり、一般的には約500：１であった。
これらの培養で用いられた培地は、25mM HEPES、11％ヒトCMVセロネガティブAB血清、4mM Ｌ−グルタミン、および25μM ２−メルカプトエタノールが補充されたRPMIであった。急速拡大培養の開始時に、培養混合物に抗CD3モノクローナル抗体（30ng/ml）を添加した。次いで、培養物に、開始後１日目、さらに５日目、そしてさらに８日目にIL-2を30単位/mlで補給した。また、５日目および８日目に標的Ｔ細胞を数え、そしてＴ細胞の濃度が１×106/mlを超える場合には、培養物を分割してＴ細胞の濃度を培養培地のml当たり約2.5×105〜５×105個に減らした。10日目後、養子免疫療法で用いる前に標的Ｔ細胞に品質制御試験を行うか、またはさらなる拡大について上に概説される工程を繰り返すことによって再刺激し、その後免疫療法で用いた。
MRLクローンを用いて、約2000倍の拡大が10〜13日の期間内に得られた。一般には、500倍〜3000倍の拡大が10〜13日の培養期間内で達成することができる。したがって、２×104〜５×105個のＴ細胞から出発したとしても、この急速拡大培養方法は１刺激周期の後に各クローンについて５×108個までのＴ細胞を得ることができる。したがって、REMを用いて、２回の10〜13日増殖周期の後に５×109個を超えるＴ細胞のクローン性集団を達成することが日常的に可能である。
実施例16
REMによって増殖させたＴ細胞クローンを用いるヒト患者における養子免疫療法
現在、10人の異なる個人由来の100を超える異なるクローンに急速拡大方法が適用されている。REMによって増殖させたＴ細胞クローンを用いる養子免疫療法の効力が、University of Washington School of Medicineと共同でFred Hutchinson Cancer Research Centerで行われた研究において評価されている。この研究は、REM生成Ｔ細胞クローンの養子移入が骨髄移植片（「BMT」）レシピエントにおいて抗原特異的応答を回復し得るかどうかを決定するために設計された。
説明のために、そのような研究の１つにおいて、CMV特異的CD8＋Ｔ細胞クローンをドナー「MRL」から得て、本明細書中に記載されるようにREMを用いて急速に拡大させ、次いでドナーMRL由来の同種異系骨髄移植を受けるHLAが同一の兄弟に投与した。Ｔ細胞投与は骨髄移植後35日目に開始し、そして４週間連続で毎週用量を与えた。最初の２回の用量については、実施例１に記載される通りに抗原特異的Ｔ細胞を拡大させた。３回目および４回目の用量については、実施例２に記載される通りにＴ細胞を拡大させた。
Ｔ細胞クローンは、3.3×107細胞/mlの細胞用量で始めて、そして各注入ごとに以下のように上昇させて４回の静脈内注入により投与した：注入#2−1.0×108Ｔ細胞／ｍ2；注入#3−3.3×108細胞／ｍ2；および注入#4−１×109Ｔ細胞／ｍ2。
CD8＋ CMV特異的Ｔ細胞クローンの各々の養子移入の前後に、PBMCをレシピエントから得て、インビトロでHLA適合CMV感染線維芽細胞で刺激し、そして（実施例８〜９に記載されるように）CD8＋ CMV特異的CTL活性の存在について試験するるか、またはCD4＋ CMV特異的ヘルパーＴ細胞活性について試験するために、実施例10に記載される方法を用いてインビトロでCMV抗原で刺激した。
図14Aに示されるように、患者のCD8＋ CMV特異的CTL応答はＴ細胞の注入を開始する前は本質的にネガティブであったが、しかし急速に拡大させたCTLを投与した後はCMV特異的細胞溶解性活性の大きな増大が観察された（予想されるように、CD4＋ CMV特異的ヘルパーＴ細胞応答は影響されなかった、図14B）。
ヒトレシピエントにおける養子免疫療法でのREM拡大抗原特異的Ｔ細胞クローンの使用のこれらの証明は、現在、University of Washington School of Medicineと共同でFred Hutchinson Cancer Research Centerでの多数の同様の研究において繰り返されている。
実施例17
急速拡大系における同種異系フィーダ細胞の使用
フィーダ細胞がHIVを有し得、そのためそのウイルスを培養物に伝染させ得るHIV感染者の場合のような幾つかの状況においては、フィーダ細胞としての自己PBMCおよびLCLの使用は禁忌であり得る。そのような状況においては、同種異系照射PBMCおよびLCLを自己PBMCおよびLCLの代わりに培養系に用いることが可能である。
同種異系フィーダ細胞系の使用の説明例として、冷凍保存された同種異系PBMCをドナー「RRM」（アメリカ赤十字の献血基準を満たす）から得た。このPBMCにγ線照射し、そしてγ線照射同種異系LCL（上述のように標準的な方法により同じドナーから得た）と共にフィーダ細胞として添加した。発明者らは、自己系についてとほぼ同じ、すなわち、PBMCについて400〜700：１、およびLCLについて20〜120：１の同種異系PBMCおよびLCLの標的Ｔ細胞に対する比を用いた。
拡大の標的となる細胞は、HIVセロポジティブドナーから得たCD8＋ HIV特異的CTLであった。特に、HIVセロポジティブな個体「ER」から得られたPBMCのサンプルから、まず細胞をそれらのプラスチックへの付着に基づいて分離し、次いでその付着単層をワクシニア/gag組換えウイルスで16時間感染させることにより、CD8＋ HIV（gag）特異的CTLを生成させた。次いで、vac／gag感染付着細胞にＵＶ光を照射してワクシニアウイルスを不活性化し、そして応答するＴ細胞を含有する非付着細胞を添加した。７日後にこの刺激を繰り返し、そして再刺激後２および４日目に２〜５U/mlのIL-2を添加した。さらに７日後、残留CD4＋ Ｔ細胞を培養物から枯渇させ、そしてαCD3 mAB（30ng/ml）、照射同種異系PBMC（５×104／ウェル）、照射同種異系LCL（１×104／ウェル）、IL-2（50単位/ml）および0.2mlの培養培地を含有する96ウェル丸底プレートにCD8＋ Ｔ細胞を0.3〜0.5細胞／ウェルでプレートした。14日後、増殖しているクローンを自己HIV-gag発現標的細胞に対する細胞溶解活性についてスクリーニングし、そしてポジティブクローンを上述の急速拡大のために25cm2フラスコに移した。
CD8＋ HIV（gag）特異的Ｔ細胞クローンの１刺激周期にわたる拡大の範囲は、実施例15に例示される自己フィーダ細胞系において観察されるものと同様であった。すなわち、500〜1500倍の拡大があり、そしてクローンはHIV（gag）特異的細胞溶解反応性を保持した。
実施例18
養子免疫療法において使用するためのヒトＴ細胞クローンの遺伝子形質導入および急速拡大
本発明の急速拡大方法は、レトロウイルスベクター中にコードされる遺伝子のヒトＴ細胞への安定な移入を促進するために用いることができる。
実例となる実施例として、ドナー「RRM」に由来するHIV（gag）特異的Ｔ細胞クローンを上述の培養条件下で刺激し、そして刺激後１日目にIL-2を補給した。
刺激後３日目に、培地の1/2を、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を融合遺伝子としてコードするレトロウイルス粒子（前出のLuptonらによって記載されるように）を含む、「HyTK」と呼ばれるレトロウイルス上清で置き換えた。次いで、培養物に５μg/mlのポリブレンおよび20U/mlのIL-2を補充した。次の日（４日目）に、細胞を洗浄し、そして20U/mlのIL-2を有するCTL培地に入れた。５日目に、上述の通りにレトロウイルス上清への暴露を繰り返し、そして６日目に細胞をハイグロマイシンを250μg/mlの濃度で、かつIL-2を30U/mlで含有する培地に入れた。刺激後13日目に、生存培養Ｔ細胞を、Ficoll Hypaque密度勾配分離によって死んだ細胞から分離し、次いで96ウェル丸底プレートにおいて、フィーダ細胞としての照射PBMCおよびLCL、抗CD3モノクローナル抗体（30ng/ml）およびIL-2（50U/ml）と共に１細胞／ウェルでサブクローン化した。Ｔ細胞をサブクローン化する利点は、得られた遺伝子改変Ｔ細胞が単一の組込み部位を有し、そして増殖および／または機能に影響を及ぼし得る変異事象について個別に評価できることである。（あるいは、形質導入されたクローンをサブクローン化する必要はないが、しかしハイグロマイシン選択のさらなる周期の条件下で再刺激して形質導入されたＴ細胞がネガティブに選択されることを確実にすることができる。）
プレート後７日目に、ハイグロマイシンＢをウェルに250μg/mlで添加してHyTKを発現するサブクローンを選択した。次いで、これらの遺伝子改変サブクローンを、上述の急速拡大方法を用いて25cm2以上のフラスコにおいて急速に拡大させた。
これらの実験により、本明細書中に記載される方法に従って急速に拡大させた細胞を形質導入することにより、非常に効率的な形質導入を達成できることが明らかとなった。REMによって拡大させたＴ細胞クローンの細胞周期のＳ期に効率的に前進する能力が、Ｔ細胞クローン株がレトロウイルスベクターのようなベクターで形質導入される効率を大いに増強すると考えられる。
得られる遺伝子形質導入されたHIV（gag）特異的CTLを、以下の実施例に記載されるように、ヒトの養子免疫療法に用いた。
実施例19
遺伝子形質導入された抗原特異的CTLを用いる養子免疫療法
実施例18のように調製された遺伝子形質導入された抗原特異的CTLを、患者「RRM」において行われた養子移入実験で用いた。特に、クローンRRM56G6に由来する個々のHyTK形質導入HIV（gag）特異的サブクローンは、本明細書中に記載の培養方法で拡大され、そして２週間隔で行われる４回の注入で静脈内注入された。Ｔ細胞を、以下のように２週間隔の４つの用量で投与した：投与#1−１×108細胞／ｍ2；投与#2−3.3×108細胞／ｍ2；投与#3−１×109細胞／ｍ2；投与#4−3.3×109細胞／ｍ2。注入の前後の様々な時期に、実施例８に記載されるようにクロム放出アッセイを用いて末梢血のサンプルをハイグロマイシン耐性HIV（gag）で特異的CTLの存在について試験した。
特に、養子免疫療法の前（#1の前）、最初のＴ細胞注入の14日後（#1の14日後）、および２回目のＴ細胞注入の１日後（#2の１日後）に得られたPBLを、インビトロでUV不活性化vac/gag感染単球で刺激した。培養物を、６〜８日後に再刺激し、次いで２つのアリコートに分割し、そして低濃度のIL-2（２〜５U/ml）を含有する培地を補給した。培養物のアリコートの一方にはまた、300μg/mlの濃度のハイグロマイシンを入れた。インビトロでの拡大の後、これらの培養物由来のＴ細胞を数え、そして擬似感染、vac/gag感染、またはCMV gBを発現するコントロールvac組換え体感染のいずれかの自己およびMHC不適合標的細胞に対する細胞溶解活性についてアッセイした。MHC不適合標的に対する溶解活性は常に10％未満であった。これは示していない。データが示されるエフェクター対標的比は、10：１のＥ／Ｔを達成するには少なすぎる生存細胞しか数えられなかった#1の前＋Hygro培養物を除いて、10：１である。このエフェクターについて、培養物全体をアッセイした。
図15に示されるデータは、最初の注入の14日後および２回目の注入の1日後に得られたPBLから始められた培養物においてハイグロマイシン耐性gag特異的CTL活性が存続するのに対して、ハイグロマイシンＢの添加により妨げられる、#1の前の培養物における内在性gag特異的細胞溶解活性の存在を示す。移入された細胞の保持もまた、末梢血単核細胞から抽出されたDNAのPCRによって確認された。
これらの結果は、遺伝子改変され、次いで本発明の方法を用いて急速に拡大された抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の好結果の養子移入を示す。
発明の分野
本発明は、ヒト抗原特異的細胞溶解性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球を含むＴリンパ球を培養するための改善された方法に関する。本発明の方法は、例えば養子免疫療法に有用な、Ｔ細胞の非常に急速かつ効率的な拡大（expansion）を生じる。
背景
Ｔリンパ球は骨髄において形成され、胸腺に移動してそこで成熟し、次いで末梢血およびリンパ循環に入る。Ｔリンパ球は、３種類の別個のタイプの細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および細胞傷害性Ｔ細胞、にさらに分けられる。Ｔリンパ球は、Ｂリンパ球とは異なり抗体分子を産生しないが、主要組織適合性複合体（MHC）のタンパク質に付着して標的細胞の表面上で発現する抗原性タンパク質のペプチドフラグメントを認識するヘテロダイマー細胞表面レセプターを発現する；例えば、Abbas,A.K.,Lichtman,A.H.およびPober,J.S.,Cellular and Molecular Immunology,1991,特に15〜16頁を参照のこと。
細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）は、典型的にはCD3＋、CD8＋、CD4−表現型のものであり、そしてそれらの細胞表面上のクラス2I MHC分子に会合する外来性抗原のフラグメントを示す細胞を溶解する。CTL認識の標的細胞には、ウイルスもしくは他の病原体による感染の後に抗原を発現する正常細胞；および形質転換され、かつ変異タンパク質を発現するか、または正常タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞が含まれる。
ヘルパーＴ細胞は、同様にCD3＋ではあるが、CD4を発現し、かつCD8膜タンパク質が存在しないことにより細胞傷害性Ｔ細胞と区別することができる。CD4＋ヘルパーＴ細胞は、クラスIIのMHC分子と会合して存在する抗原のフラグメントを認識し、そして主に、抗原特異的ＴおよびＢ細胞応答を増幅し、かつ単球もしくはマクロファージのような補助免疫細胞を活性化するサイトカインを産生するために機能する。例えば、Abbas,A.K.ら、前出を参照のこと。
CD4＋ヘルパーおよびCD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、ウイルス、細菌性病原体および腫瘍に対する宿主の免疫応答の重要な成分である。その結果、先天性、後天性または医原性Ｔ細胞免疫不全疾患を患う個体は、生命を脅かす感染または悪性腫瘍（例えば、SCID、BMT、AIDS等）を発症する可能性がある。免疫学的に有用な（competent）Ｔリンパ球の欠損に関連する疾患を患うヒトは、養子移入と呼ばれることもある養子免疫療法によって回復される特定の免疫性を潜在的に有し得る。養子免疫療法において、所望の抗原特異性を有するＴ細胞を移入することにより１以上の特定の免疫性を個体に付与することが可能である。目的の細胞を免疫不全宿主から、または特異的に免疫された適合する宿主から誘導することができる。後者の供給源は、免疫不全宿主が十分な数のＴ細胞を有さないか、あるいは有効性が十分ではないＴ細胞しか有さない状況においてはもちろん特に重要である。
そのような免疫不全宿主においてＴ細胞応答を増大させるか、または再構成するために、抗原特異的Ｔ細胞をインビトロで大量に増殖させ、次いで免疫不全宿主に静脈内投与しなければならない。養子免疫療法を施した後、以前は病原体または腫瘍によって発現される抗原に対して不適切な応答を有したか、または応答しなかった宿主が、その病原体または腫瘍に対して抵抗性または免疫性になるのに十分な免疫応答を発現することができる。
免疫性を確立するための抗原特異的Ｔ細胞の養子移入は、ウィルス感染および腫瘍に対する有効な治療であることが動物モデルで示されている（Greenberg,P.D.,Advances in Immunology（1992）で検討されている）。養子免疫療法が効果的であるためには、通常、抗原特異的Ｔ細胞を単離してインビトロ培養により数を拡大する必要があり、そして養子移入後、このような培養されたＴ細胞がインビボで維持し、機能しなければならない。ヒト疾患の処置のために、１つの細胞の子孫を代表するクローン化抗原特異的Ｔ細胞を免疫療法において使用することにより重大な利益が得られる。なぜなら、これらの細胞の特異性および機能を厳密に規定し得、そして正確な用量：応答効果を見積もり得るからである。ヒトにおいて不完全な免疫性を回復するためにヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを最初に養子移入したのは、Riddellらであった。Riddell,S.R.ら、「Restoration of Viral Immunity in Immunodeficient Humans by the Adoptive Transfer of T Cell Clones」,Science 257：238-240（1992）。この研究で、Riddenllらは、同種異系の骨髄移植レシピエントにおけるサイトメガロウイルスに対する不完全な免疫性の回復のために養子免疫療法を用いた。サイトメガロウイルス特異的CD8＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、３つのCMV血清ポジティブ骨髄ドナーから単離され、インビトロで５〜12週間増殖させてエフェクターＴ細胞の数的な拡大を達成し、次いでそれぞれの骨髄移植（BMT）レシピエントに静脈内投与された。これらのBMTレシピエントは、移植前の化学放射線療法による宿主Ｔ細胞応答の除去および同種異系骨髄移植後に一般的に観察されるドナー免疫性の回復の遅れ（Reusserら、Blood,78：1373-1380,1991）により、CMV特異的免疫性が不完全であった。Riddellらは、毒性を示さない、および移入されたＴ細胞クローンがこれらの免疫不全宿主に急速かつ持続的なCD8＋サイトメガロウイルス特異的CTL応答の再構成を提供することを見出した。
Riddellら（J.Immunology,146：2795-2804,1991）は、CD8＋ CMV特異的Ｔ細胞クローンの単離および培養に以下の手順を用いた。まず、骨髄ドナーに由来する末梢血単核細胞（PBMC）を、自己サイトメガロウイルス感染線維芽細胞と共に培養して、CMV特異的CTL前駆体を活性化した。次に、培養したＴ細胞をCMV感染線維芽細胞で再度刺激し、その培養物にγ線照射PBMCを補充した。適切な培養培地中のインターロイキン２（IL-2）２〜５U/mlを、再刺激の２および４日後に添加してCD8＋ CTLの拡大を促進した（Riddellら、J.Immunol.,146：2795-2804,1991）。Ｔ細胞クローンを単離するため、ポリクローナルCD8＋ CMV特異的Ｔ細胞を、抗原提示細胞としてのCMV感染線維芽細胞（Riddell、J.Immunol.,146：2795-2804,1991）または抗原提示細胞によって提供される刺激を模倣するαCD3モノクローナル抗体（Riddell,J.Imm.Methods,128：189-201,1990）のいずれかと共に、96ウェル丸底ウェル内に限界希釈（0.3〜0.6細胞／ウェル）でプレートした。次いで、これらのマイクロウェルにγ線照射末梢血単核細胞（PBMC）およびEBV形質転換リンパ芽球様細胞株（LCL）をフィーダ細胞として添加した。10〜14日でクローン性Ｔ細胞の増殖についてポジティブなウェルが明らかになった。その後、これらのクローンに由来する細胞を、最初は48もしくは24インチのプレートで、次いで12ウェルプレートもしくは75cm2組織培養フラスコで大量に増殖させた。７〜10日ごとに自己CMV感染線維芽細胞、ならびにPBMCおよびLCLからなるγ線照射フィーダ細胞で再度刺激し、そして再刺激の２および４日後に25〜50U/mlのIL-2を添加することにより、Ｔ細胞の増殖を促進した。
上述の研究および一般的にＴ細胞培養の先行技術において存在する主要な問題は、時に適った様式で大量のヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを増殖させることができないことである。培養におけるＴ細胞のゆっくりした増殖が、ヒトリンパ球の細胞周期時間の本来の特性を表すのか、あるいは用いられる培養条件を表すのかは知られていない。例えば、上述のCMV養子免疫療法の研究において用いられる培養法では、Ｔ細胞を増殖させて研究下での最高細胞用量である１×109Ｔ細胞/cm2を達成するのに３ヶ月を要した。このことは、ヒトのウイルス性疾患およびガンへの養子免疫療法の適用を大きく制限する。なぜならば、治療で用いられる特定のＴ細胞の単離および増殖に要する長い間隔の間にこれらの疾患のプロセスが進行し得るからである。動物モデルでの研究（Greenberg,P.D.,Advances in Immunology,1992で検討されている）からの推測に基づくと、ヒトにおいて、治療上の利益のために免疫応答を増大させるには、109〜1010細胞の範囲の抗原特異的Ｔ細胞の用量が必要であり得ると予想される。しかし、抗原特異的ヒトＴ細胞を培養においてこれらの細胞数まで急速に拡大することは、重大な障害であることが立証されている。したがって、前述のRiddellらによる研究を除いて、抗原特異的Ｔ細胞クローンを用いる養子免疫療法の研究は実施されていない。養子免疫療法のために大量の細胞を産生するという問題は、米国特許第5,057,423号で確認された。この特許には、純粋な大型顆粒リンパ球を単離する方法およびこれらの大型顆粒リンパ球を拡大し、そしてリンホカイン活性化キラー（LAK）細胞に変換する方法が記載されている。この方法は、高レベルの拡大、すなわち、３〜４日の培養で100倍までの拡大を提供すると記載されている。LAK細胞はあるタイプの腫瘍細胞を溶解するが、規定された抗原を認識する特性をMHC制限Ｔ細胞と共有することはなく、そして免疫学的な記憶を提供することはない。さらに、LAK細胞の拡大に用いられる方法（これは高濃度のIL-2に顕著に依存する）は、抗原特異的ヒトＴ細胞を効率的に拡大しない（Riddellら、未公開）。加えて、これらの方法は、IL-2を取り除いたとき、または続くＴ細胞レセプターを介する刺激の際に、Ｔ細胞をプログラムされた細胞死（すなわち、アポトーシス）にさらし得る（後述のLenardoら、およびBoehmeらによる論文の考察を参照のこと）。
抗原特異的Ｔ細胞クローンを大量に培養することができないことが、部分的には、ガン（Rosenberg,New Engl.J.Med.,316:1310-1321,1986;Rosenberg,New Engl.J.Med.,319:1676-1680,1988）およびHIV感染（Ho M.ら、Blood 81:2093-2101,1993）のようなヒトの疾患のための養子免疫療法の研究を、不十分に規定された抗原特異性を有する活性化ポリクローナルなリンパ球集団の評価に制限する要因となっている。このような研究においては、リンパ球のポリクローナルな集団は血液または腫瘍濾過物のいずれかから単離され、そして高濃度のＴ細胞増殖因子IL-2中で培養される。一般には、これらの細胞は、病原体または腫瘍に対するMHC制限特異性をあったとしても僅かしか示さず、治療上の利益を経験した少数の患者において、関与するエフェクタの機構を認識することは困難である。典型的には、非特異的エフェクタリンパ球を用いる養子免疫療法の研究では、患者に約２×1010〜２×1011細胞を投与している（例えば、米国特許第5,057,423号、第１欄、第40〜43行を参照のこと）。
Ｔリンパ球を急速に増殖させる効率的な細胞培養方法の開発は、診断および治療用途の両者において有用である。診断用途において、患者由来のＴ細胞を急速に拡大する能力は、例えば、患者のＴリンパ球の特異性、活性、または他の属性をモニターする試験で使用するのに十分な数の細胞を急速に産生するために用いることができる。さらに、109〜1010細胞の細胞用量を急速に達成する能力は、ヒトの疾患の処置への特定の養子免疫療法の適用性を非常に容易にする。
Ｔ細胞クローンを単離および拡大する方法を含む、可能性のある治療的使用のための細胞を培養する、既に記載されている確立された方法がいくつか存在する。足場依存性細胞（すなわち、細胞増殖のために基質への付着を必要とする細胞）の典型的な細胞培養方法は、用いられる培養容器（すなわち、マルチウェルプレート、ペトリ皿、および培養フラスコ）の利用可能な表面積の量によって制限される。足場依存性細胞については、表面積が増大したより大きな容器を用い、および／またはより多くの容器を用いることが増殖する細胞の数を増加させる唯一の方法である。しかし、Ｔリンパ球のような造血性由来細胞は足場非依存性である。それらは、基質に付着することなく、懸濁培養において、適切な増殖因子に応答して生存し、増殖することが可能である。懸濁培養において抗原特異的リンパ球を増殖させる能力をもってしても、現在までに報告されている方法はＴ細胞クローンの急速な数的拡大を一貫して生じてはいない。例えば、GillisおよびWatsonによって実施されたＴ細胞の研究においては、Ｔ細胞増殖因子IL-2の存在下で低密度、すなわち５×103〜１×104細胞/mlで培養されたＴ細胞は７日間にわたって急速に増殖し、そして最終的に３〜５×105細胞/mlの飽和密度に到達したことが見出された。Gillis,S.およびWatson,J.「Interleukin-2 Dependent Culture of Cytolytic T Cell Lines」,Immunological Rev.,54:81-109（1981）。さらに、GillisおよびWatsonは、ひとたび細胞がこの飽和濃度に到達すると、これらの細胞は常に死んでしまうことも見出した。前述のGillisら。
他の研究では、長期培養でマウスＴリンパ球を確立する３種類の異なる方法が報告されている。Paulらは、最も広範に用いられる方法が、免疫されたドナー由来のＴリンパ球を、必須のＴ細胞レセプターシグナルおよび同時刺激シグナル（costimulatory signal）を提供するための抗原および抗原提示細胞の存在下において、それらのクローン化を試みる前に外来性増殖因子を添加することで数週間以上増殖させることであると報告している。Paul,W.E.,ら、「Long-term growth and cloning of non-trasformed lymphocytes」,Nature,294:697-699,（1981）。その後、タンパク質抗原に特異的なＴ細胞を、抗原および抗原提示細胞（APC）の供給源としての照射脾臓細胞を用いて、限界希釈によりクローン化する。第２の方法は、免疫されたドナーからＴ細胞を採取した後、できるだけ早くその細胞を軟寒天中でコロニーとして増殖させる工程を包含する。Ｔ細胞は、最初の懸濁培養において、抗原およびAPCの供給源（通常は照射脾臓細胞）で刺激される。この第２のアプローチにおいて、３日後に、これらの細胞が２層軟寒天培養系の上層に分布することが見出されている。これらのコロニーを４日目〜８日目に取り出し、次いで長期培養で拡大することができる。第３のアプローチは、細胞をそれらの抗原特異性よりむしろそれらの機能特性について選択する工程、次いでそれらを一連の異なる照射フィーダ細胞および増殖因子含有上清を用いて増殖させる工程を包含する。Paul,W.E.ら、「Long-term growth and cloning of non-transformed lymphocytes」,Nature,294:697-699,（1981）。これらの方法の各々では、１つの細胞からの個々のＴ細胞クローンを時に適った方法で109〜1010細胞まで拡大することは不可能であることが明らかである。従って、抗原特異的Ｔ細胞をクローン化する能力および受容される動物モデルにおけるＴ細胞クローンの治療上の効力の納得できる証拠にもかかわらず、ヒトＴ細胞の大量培養における技術的な困難性が、特定の養子免疫療法の臨床評価を妨げている。
培養されたＴ細胞に対するさらに別の関心は、養子免疫療法において有用であるためにそれらがインビボで機能し得るままでなければならないことである。特に、高濃度のIL-2が存在する培養で長期間増殖した抗原特異性Ｔ細胞が細胞周期の異常を生じ、そしてIL-2が除かれたときに休止期に戻る能力を失い得ることが観察されている。対照的に、正常な細胞周期は、連続する４つの期、有糸分裂（もしくは「Ｍ」期）および「間期」段階を作り上げる３つの期からなる。Ｍ期の間、細胞は核分裂および細胞質の分裂である細胞質分裂を受ける。間期段階は、有糸分裂の後、生合成活性が高率で再開するＧ1期；DNA合成が始まり、それが核のDNA含量が２倍になり染色体が複製されるまで続くＳ期；および有糸分裂が開始するまで続くＧ2期からなる。Ｇ1期の間、幾つかの細胞はその分裂周期での進行を止めたように見え、「Ｇ0」状態と呼ばれる「静止」または休止状態にあるといわれる。特定の環境因子（例えば、血清における増殖因子の欠如または細胞培養物の集密度）が細胞を休止状態に入らせることがある。その因子が回復されれば、その細胞は周期での正常な進行を再開するはずである。しかし、培養で増殖する細胞は、増殖因子が取り除かれた場合、休止期に入ることができなくなることがあり、これはこれらの細胞の死を招く。この増殖因子依存性は、培養されたＴ細胞に特に関係する。細胞増殖を促進するために高濃度のIL-2に曝されるＴリンパ球は、IL-2が除去された場合、またはこれらが続いてＴ細胞レセプターを介して刺激された場合、すなわち、それらが特異抗原に遭遇した場合、しばしばアポトーシスと呼ばれるプロセスによって死ぬ。（Lenardo M.J.,Nature,353:858-861,1991;Boehme S.A.およびLenardo M.J.,Eur.J.Immunol.,23：1552-1560,1992）。したがって、LAK細胞もしくはTIL細胞の増殖に用いられる培養方法およびインビトロでの拡大を促進するための高濃度のIL-2に顕著に依存する従来のＴ細胞培養方法は、多くの細胞をアポトーシスに対して感受性にし、そのため養子移入に対するそれらの有用性を制限し、または排除する可能性がある。
養子免疫療法の研究において、Ｔ細胞に外来性DNAを挿入して遺伝子マーカーを付与するのに遺伝子移入法を用いることにも利点がある。この遺伝子マーカーは、インビボでの移動および移入された細胞の生存の評価、または移入されたＴ細胞の安全性および効力を改良し得る機能を付与することを容易にする。哺乳動物細胞への安定な遺伝子移入の確立された方法は、両栄養性レトロウイルスベクターの使用である（Miller AD,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:1-24,1992）。レトロウイルスベクターを用いる標的細胞への遺伝子の安定な組込みは、その細胞が活発に周期活動を行い、具体的には、これらの細胞が細胞周期のＭ期を通過（transit）することを必要とする。従来の研究では、高用量のIL-2で増殖を誘導された少量のポリクローンＴ細胞にマーカー遺伝子を投入し、これらの細胞は腫瘍治療としてヒトに再注入され、移入された細胞のインビボでの生存を追求する手段を提供した。（Rosenbergら、New Engl.J.Med.,323:570-578,1990）。しかし、ヒトＴ細胞（その周期は、標準技法で増殖する場合には遅い）については、安定な遺伝子移入の効率はＴ細胞の0.1〜１％の範囲で非常に低い。（Springett CMら、J.Virology,63:3865-69,1989）。標的Ｔ細胞をより効率的に細胞周期のＳおよびＧ2−Ｍ期に入れる（recruit）培養方法は、レトロウイルス媒介遺伝子移入を用いる遺伝子改変の効率を高め（Roe T.ら、EMBO J,2:2099-2108,1993）、それにより養子免疫療法における遺伝的に改変されたＴ細胞の使用または遺伝的欠損疾患における欠陥遺伝子の送達のためのＴ細胞の使用の見込みを改善する。
発明の要旨
本発明は、Ｔ細胞の初期集団から単離された、ヒト抗原特異的細胞溶解性およびヘルパーＴ細胞を含む大量のＴ細胞を急速に産生する方法を提供する。本発明の方法はＴ細胞の急速な拡大に適用可能であるが、一般には、この急速拡大方法は、個々のＴ細胞クローンを拡大してＴリンパ球の大集団を提供しなければならない状況において特に利点がある。したがって、本発明は、Fred Hutchinsonガン研究センターでのヒト骨髄移植レシピエントを含む研究（下記）において例示されているように、ヒト養子免疫療法に関連して特に重要な道具を提供する。また、本発明は、以下に例示されるように、Ｔリンパ球への安定な遺伝子移入の効率を改善する方法も提供する。
したがって、本発明の目的の１つは、インビトロでＴリンパ球を急速に、大量に拡大することにある。このような急速に拡大したＴ細胞集団は、とりわけ、本明細書に例示されるように、特定の免疫応答を付与する目的で個体に注入するために用いることができる。Ｔ細胞はCD8＋細胞傷害性Ｔ細胞であっても、CD4＋ヘルパーＴ細胞であってもよく、それらは様々な細菌感染細胞または腫瘍細胞の任意のものにコードされる抗原と反応することができる。
本発明の別の目的は、養子免疫療法において用いられるＴ細胞の機能の変更または宿主中の欠陥遺伝子の置換に用いることができる外来性遺伝物質の安定な投入を容易にする様式でＴ細胞を増殖させる方法を用いることにある。
本発明の好ましい態様の多くを以下の一覧に記載する。
１． インビトロで培養培地中において初期Ｔリンパ球集団を急速に拡大する方法であって：
初期Ｔリンパ球集団をインビトロで培養培地に添加する工程；
不釣り合いに大量の非分裂末梢血単核細胞（PBMC）を、フィーダ細胞として、得られる細胞の集団が拡大しようとする初期集団のＴリンパ球の各々について少なくとも約40PBMCフィーダ細胞を含むように上記培養培地に添加する工程；および
上記培養物をインキュベートする工程；
を包含する方法。
この培養物を、Ｔリンパ球の増殖に適切な温度等の条件下でインキュベートする。ヒトＴリンパ球の増殖に対しては、例えば、温度は一般に少なくとも約25℃、好ましくは少なくとも約30℃、より好ましくは約37℃である。適切な培地および他の培養条件の説明は当該技術分野において周知であり、本明細書にも例示されている。
２． 前記初期Ｔリンパ球集団が少なくとも１種のヒトCD8＋抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）を含む、第１項の急速拡大法。本発明の好ましい態様においては、このCTLはヒトの腫瘍または病原体上に存在する抗原に特異的である。
３． 前記初期Ｔリンパ球集団が少なくとも１種のヒトCD4＋抗原特異的ヘルパーＴリンパ球を含む、第１項の急速拡大法。
４． 前記非分裂フィーダ細胞がγ線照射PBMCフィーダ細胞を含む、第１項の急速拡大法。好ましくは、PBMCは約3000〜3600radの範囲、より好ましくは約3300radのγ線を照射されている。
５． PBMCフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が少なくとも約200：１である、第１項の急速拡大法。
６． PBMCフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が約400：１と800：１との間である、第５項の急速拡大法。代表的には、約500：１の比が使用される。
７． 非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダ細胞として添加する工程をさらに包含する、第１項の急速拡大法。好ましくは、LCLは約6000〜10,000radの範囲、より好ましくは約8000radのγ線を照射されている。
８． LCLフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が少なくとも約10：１である、第７項の急速拡大法。
９． LCLフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が約50：１と200：１との間である、第８項の急速拡大法。典型的には、約100：１の比が用いられる。
１０． 前記培養培地に抗CD3モノクローナル抗体を添加する工程をさらに包含する、第１項の急速拡大法。
１１． 抗CD3モノクローナル抗体の濃度が少なくとも約0.5ng/mlである、第１０項の急速拡大法。
１２． 抗CD3モノクローナル抗体の濃度が少なくとも約1.0ng/mlである、項目１１の急速拡大方法。以下に示されるように、典型的には、約30ng/mlの濃度が用いられるが、よりずっと低レベルで用いることも可能である。
１３． 前記培養培地にIL-2を添加する工程をさらに包含する、第１項の急速拡大法。
１４． IL-2の濃度が少なくとも約10単位/mlである、第１３項の急速拡大法。典型的には、約30単位/mlの濃度が用いられる。
１５． 前記インキュベーションを少なくとも約９日間続け、かつ前記培養培地にIL-2を添加する工程をそれぞれ３〜５日の間隔をおいて繰り返す、第１４項の急速拡大法。典型的には、１日目、次に５日目または６日目、次いで８日目または９日目にIL-2を添加する。
１６． ヒトＴ細胞を遺伝的に形質導入する方法であって：初期Ｔリンパ球集団をインビトロで培養培地に添加する工程；不釣り合いに大量の非分裂末梢血単核細胞（PBMC）を、フィーダ細胞として、得られる細胞の集団が拡大しようとする初期集団のＴリンパ球の各々について少なくとも約40PBMCフィーダ細胞を含むように上記培養培地に添加する工程；上記培養物をインキュベートする工程；および上記培養培地にベクターを添加する工程、を包含する方法。ベクターは、標的細胞に投入することが可能な形態のDNAまたはRNAの単位を指す。形質導入は、一般に、そのような外来性DNAまたはRNAを標的細胞に投入することを指すのに用いられ、例えばウイルス感染およびエレクトロポレーションにより、異種DNAまたはRNA配列を標的細胞に投入することを包含する。Ｔリンパ球を形質導入する現時点で好ましい方法は、本明細書に例示されるように、レトロウイルスベクターを用いることである。
１７． 非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をさらなるフィーダ細胞として添加する工程をさらに包含する、第１６項の遺伝的形質導入方法。
１８． 前記ベクターが、Ｔリンパ球を阻害する阻害化合物に対する耐性を提供する選択マーカーを含むレトロウイルスベクターであり、かつ上記レトロウイルスベクターを添加した後に少なくとも１日間、前記培養物のインキュベーションを継続する工程；および上記継続インキュベーション工程の後に前記培養培地に上記阻害化合物を添加する工程をさらに包含する、第１７項の遺伝的形質導入方法。
１９． 前記レトロウイルスベクターがポジティブおよびネガティブ選択マーカーの両者を含む、第１８項の遺伝的形質導入方法。好ましいポジティブ選択マーカーは、hph、neo、およびgptからなる群より選択される遺伝子に由来し、好ましいネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRTおよびgptからなる群より選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、ポジティブ選択マーカーがhphまたはneoに由来し、かつネガティブ選択マーカーがシトシンデアミナーゼまたはTK遺伝子に由来する、二機能性選択可能融合遺伝子である。
２０． 前記レトロウイルスベクターが、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を融合遺伝子としてコードする、第１９項の遺伝的形質導入方法。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１において説明される、４人のヒトドナーからのヒト抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球クローンおよび抗原特異的ヘルパーＴリンパ球クローンの急速拡大を説明する図である。
図２は、実施例２において説明される、養子免疫療法で用いるための６人のヒトドナーからの抗原特異的Ｔ細胞クローンの大規模拡大を説明する図である。
図３は、実施例３において説明される、急速拡大法におけるＴ細胞に対するPBMCフィーダ細胞の比の効果を説明する図である。
図４は、実施例４において説明される、急速拡大法におけるLCLフィーダ細胞の使用の効果を説明する図である。
図５は、実施例５において説明される、急速拡大法とＴ細胞の増殖に用いられる他の方法との比較を説明する図である。
図６は、実施例６において説明される、急速拡大培養物への抗CD3モノクローナル抗体の添加の効果を説明する図である。
図７は、実施例７において説明される、急速拡大培養物へのIL-2の添加の効果を説明する図である。
図８は、実施例８において説明される、急速拡大の後にHIV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球が抗原特異的溶解機能を保持することを示すデータを説明する図である。
図９は、実施例９において説明される、急速拡大の後にCMV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球が抗原特異的溶解機能を保持することを示すデータを説明する図である。
図10は、実施例10において説明される、インビトロでの急速拡大の後にCMV特異的CD4＋ヘルパーＴリンパ球が抗原特異的増殖機能を保持することを示すデータを説明する図である。
図11は、実施例11において説明される、急速に拡大されたＴ細胞がサイトカインを除かれた際に静止段階に入る能力を保持し、それらが抗原もIL-2もなしでインビトロで生存可能のままであり、かつそれらがＴ細胞レセプター活性化の際にIL-2に対する応答性を再び獲得することを示すデータを説明する図である。
図12は、実施例12において説明される、急速に拡大されＴ細胞がインビトロでの静止の後に細胞周期のＧ0／Ｇ1段階に入り、かつIL-2Rα鎖を発現しないことを示すデータを説明する図である。
図13は、実施例13において説明される、Ｔ細胞レセプター活性の後に静止Ｔ細胞が細胞増殖のＳおよびＧ2／Ｍ期に誘導されることを示すデータを説明する図である。
図14Aおよび14Bは、実施例16において説明される、REMによって増殖されたＴ細胞クローンを用いるヒト患者での養子免疫療法を示すデータを説明する図である。
図15は、実施例19において説明される、遺伝的に形質導入された抗原特異的CTLを用いる養子免疫療法を示すデータを説明する図である。
発明の詳細な説明
本明細書中に記載される発明は、ヒトの疾患の養子免疫療法において特に有用であり得る、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球を含むＴリンパ球の集団を急速に拡大させる方法を提供する。
このＴ細胞は「標的Ｔ細胞」と呼ばれる。一般には、標的Ｔ細胞は、少数が培養容器および以下のものが補充されている標準的な増殖培地に添加される：（i）Ｔ細胞レセプターシグナルを供与するためのＴ細胞レセプター複合体のCD3成分を指向する適切量の抗体、および（ii）共刺激シグナルを供与する、大過剰量のフィーダ細胞、好ましくは以下に記載されるγ照射PBMC。好ましくは、ヒト組換えIL-2または他の適切なIL-2調製物が低濃度で３〜５日間隔（典型的には、１日目、５日目もしくは６日目、および８日目もしくは９日目）で添加される。本発明の方法は、Ｔ細胞の急速な拡大、典型的には８〜14日間で500〜3000倍の範囲の拡大を生じる。従って、本方法は、各刺激周期について、現在記載されているヒトＴ細胞の培養方法より約100〜1000倍効率的である。
さらに、これらの方法は、ヘルパーＴ細胞および細胞溶解性Ｔ細胞の集団の両者の急速拡大、ならびに多くの異なる抗原特異性のＴ細胞クローン（例えば、CMV、HIV、または他のウイルス抗原もしくは腫瘍由来の抗原に特異的な細胞溶解性もしくはヘルパーＴ細胞）に適用可能である。さらに、本発明の方法は、選択される培養容器のサイズに応じて、小規模の増殖（例えば、104〜107細胞のＴ細胞の急速拡大）、または大規模拡大（例えば、106〜1010細胞より多いＴ細胞の急速拡大）の両者に用いられ得る。
このように、本発明は、ヒトの免疫の調節に必要な細胞数を増殖させるのに要する時間を劇的に短縮することにより、養子免疫療法に用いるためのＴ細胞クローンを効率的に拡大させることを可能にする。例えば、Riddellらによる研究（Science,257:238-240,1992）においては、ひとたびＴ細胞クローンを単離したら、そのクローンを12週間培養し、そして、１×109のCD8＋ CMV特異的Ｔ細胞／ｍ2体表面積の最高投与細胞用量を達成するために、複数のクローンをプールする必要があった。本発明の方法を用いると、個々のＴ細胞クローンの109細胞を超える拡大は３週間未満で達成し得る。
本発明の実施では、他に示さない限り、当該技術分野の技術の範囲内である、分子生物学、微生物学、細胞生物学、組換えDNA、および免疫学の通常の技術が使用される。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Sambrook,Fritsch,およびManiatis, Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第２版（1989）,Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編,1984）,Animal Cell Culture（R.I.Freshney編,1987）,一連のMethods in Enzymology（Academic Press,Inc.）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987）,Handbook of Experimental Immunology,（D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編）,Current Protocols in Molecular Biology（F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Siedman, J.A.SmithおよびK.Struhl編、1987）、およびCurrent Protocols in Immunology（J.E.Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H.Margulies, E.M.ShevachおよびW.Strober編,1991）を参照のこと。本明細書中で言及される、前述および後述の両方の全ての特許、特許出願、および刊行物は、参考により本明細書中で援用される。
本発明の理解の助けとして、以下は、明細書中で一般的に用いられるいくつかの略語の一覧である：
CTL 細胞傷害性Ｔリンパ球
APC 抗原提示細胞
CMV サイトメガロウイルス
HIV ヒト免疫不全ウイルス
EBV エプスタイン・バールウイルス
hIL-2 ヒトインターロイキン−２
MHC 主要組織適合性複合体
PBMC 末梢血単核細胞
LCL EBV形質転換リンパ芽球様細胞株
PBS リン酸緩衝化溶液
培養において増殖させようとするＴ細胞（すなわち、標的Ｔ細胞）は、処置される被験体から得られ得る。あるいは、レシピエントおよび移入される細胞が免疫学的に適合するという条件の下で、処置される被験体以外のヒトからＴ細胞を得ることができる。典型的には、この細胞は、組織、骨髄、胎児組織、または末梢血に由来する。好ましくは、細胞は末梢血に由来する。Ｔ細胞が組織に由来する場合、適切な培地または希釈液を用いて単一細胞の懸濁液を調製するべきである。Ｔ細胞のポリクローナル集団の生成を以下の実施例において説明する。詳しくは、実施例12を参照のこと。
当該技術分野において任意の周知の方法に従い、不均一集団からＴリンパ球を含む単核細胞を単離する。説明的な例として、Ficoll-Hypaque勾配遠心分離、蛍光活性化細胞選別（FACs）、モノクローナル抗体被覆プレートでの選択（panning）、および／または磁気分離技術を（別々にまたは組み合わせて）用いて、本発明による拡大のための精製された細胞集団が得られ得る。抗原特異的Ｔ細胞クローンを、当該技術分野において公知の標準的培養技術により単離する。この標準的技術には、抗原提示細胞で刺激することによる抗原特異的Ｔ細胞前駆体の初期活性化、および、それに続く、当該技術分野における公知の技術（例えば、RiddellおよびGreenberg（J.Immunol.Meth.,128:189-201,1990）；およびRiddellら（J.Immunol.,146:2795-2804,1991）に記載される技術）を用いる限界希釈培養によるクローン化が含まれる。以下の実施例も参照のこと。
限界希釈培養においてマイクロウェル中に単離されたＴ細胞クローンは、典型的には、14日後に１つの細胞から２×104〜５×105細胞に拡大される。この時点で、個々のクローンを、共刺激機能を提供する大過剰量のフィーダ細胞、および好ましくは、Ｔ細胞レセプターの刺激を提供するための抗CD3モノクローナル抗体と共に、プラスチック培養容器において適切な培養培地内に入れる。クローンがマイクロウェルから移されるときのこの急速拡大の初期相は、一般には、培養容器内で行われる。この培養容器の大きさは、標的細胞の数に依存し、そして、それは典型的には、25cm2フラスコであり得る。Ｔ細胞拡大のその後の周期に用いられる培養容器の大きさは、開始時のＴ細胞数および（通常は治療用途に）必要とされる細胞数に依存する。異なる大きさの培養容器に対する典型的な開始細胞数は次の通りである：５×104〜２×105−約25cm2フラスコ；２×105〜５×105−約75cm2フラスコ；５×105〜１×106−約225cm2フラスコ；および１×106〜２×106−ローラーボトル。各フラスコで用いられる培地の初期容量は、おおよそ、25cm2−20〜30ml；75cm2−60〜90ml；225cm2−100〜200ml；ローラーボトル−500mlである。
以下に説明されるように、最初に４人の異なるヒトドナーに由来した、異なる抗原特異性の10個の異なるＴ細胞クローンを用いる研究は、本発明の急速拡大方法を用いて、クローンＴ細胞数の500〜3000倍（平均で1200倍）の拡大を10〜13日の１回の増殖周期内で容易に達成し得ることを示している（実施例１を参照のこと）。
実施例２で説明されるように、この急速拡大方法は、養子免疫療法で使用するための抗原特異的Ｔ細胞を大量に（109細胞を超えて）生成するように容易にスケールアップし得る。この例において、最初に６人の異なるヒトドナーに由来する10個のクローンから大量のCMV特異的およびHIV特異的Ｔ細胞が生成した。
本明細書で使用される「フィーダ細胞」は、Ｔ細胞レセプターの活性化（これは、Ｔ細胞レセプター複合体の抗CD3モノクローナル抗体との結合により達成され得る）と同時に共刺激機能を提供する補助的な細胞（例えば、好ましくは、γ照射PBMCおよびLCL細胞）である。ヒトＴ細胞の従来の培養方法と劇的に異なる本発明の方法の一つの局面は、標的Ｔ細胞の数に対して、使用されるフィーダ細胞数の大過剰な比である。以下に実施例３で説明されるように、Ｔ細胞の最適な増殖のためには、Ｔ細胞：PBMCの比は、少なくとも約１：40（すなわち、少なくとも約40倍過剰のPBMC）であるべきであり、好ましくはＴ細胞：PBMC比は少なくとも約１：200であり、より好ましくは約１：400〜１：800の間である。典型的には、本発明者らは、約１：500の比を用いている。
以下に実施例４で説明されるように、好ましくは少なくとも約１：10、より好ましくは少なくとも約１：20、さらにより好ましくは約１：50〜１：200の間、最も好ましくは約１：100のＴ細胞：LCL比でLCLフィーダ細胞を含めることにより、この拡大はさらに高まり得る。
過去には、典型的には、抗CD3 mAbをプレート上にコートし、そしてＴ細胞を増殖させる培養においてフィーダ細胞を使用しないか、または、フィーダ細胞を使用する場合には、Ｔ細胞に対して非常に少ない割合（例えば、１：１〜10：１）のフィーダ細胞を用いることが普通であった。例えば、Garbrecht F.C.ら、J.Immunol.Methods 107:137-142,1980;Riddell,J.Immunol.Meth. 128:189-201,1990；およびLondei M.ら、Scand J.Immunol. 27:35-46,1988を参照のこと。以下に、実施例５で説明されるように、本発明の方法に従う拡大したＴ細胞の直接比較は、そのような従来の方法と比較して、各刺激周期で100倍〜1000倍のＴ細胞増殖の効率の改善を示す。
必要とされる大量のPBMCフィーダ細胞は、当該技術分野における公知の技術、例えば、リスクが最小の標準的な医用手順である白血球搬出法（leukaphoresis）（例えば、Weaverら、Blood 82:198-1984,1993を参照）により容易に入手し得る。そして、これらのフィーダ細胞は、使用時まで液体窒素中に凍結保存することにより保存し得る。LCLは、標準的な方法を用いて、EBV（例えば、EBVのB95-8株）による形質転換により（例えば、Crosslandら、J.Immunol. 146:4414-20,1991参照）、またはシクロスポリンＡの存在下における自発的外殖（outgrowth）により、末梢血Ｂ細胞から生成され得る。このようなLCL細胞は、本発明の急速拡大方法で用いるための培養において、急速に、かつ無限に増殖する。
フィーダ細胞を培養容器に添加する前に、これらのフィーダ細胞が有糸分裂するのを妨げるべきである。有糸分裂を妨げる技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、照射が含まれる。例えば、フィーダ細胞のPBMC成分は、約3000〜3600radの範囲のγ線が照射され得（好ましくは、PBMCは約3300radで照射される）、そしてLCLには約6000〜10,000radの範囲のγ線が照射され得る（好ましくは、LCLは約8000radで照射される）。
Ｔ細胞クローンの抗原特異性は培養系でそのクローンを拡大させる前に決定されるので、Ｔ細胞増殖を助けるために、自己または同種異系のいずれかのフィーダ細胞が用いられ得る。同種異系のフィーダ細胞を用いるＴ細胞の急速拡大は以下のいくつかの実施例で説明される。例えば、実施例１におけるドナー「ER」からのクローンの拡大；実施例２におけるドナー「PRM」および「JTE」からのクローンの拡大；ならびに実施例５におけるドナー「ER」からのクローンの拡大を参照のこと。同種異系のフィーダ細胞の使用し得ることは、患者が、PBMC中に存在するウイルス（例えばHIV）（従って、これはＴ細胞培養物を汚染し得る）に感染している状況において重要である。この環境において、スクリーニングされ、そしてアメリカ赤十字の基準によって適切な血液ドナーであると思われる個人に由来する同種異系のフィーダ細胞は、この培養方法で用いられ得る。
非常に都合のよいことに、Ｔ細胞レセプター活性化シグナル（通常、抗原および抗原提示細胞によって提供される）は、抗CD3モノクローナル抗体を培養系に添加することにより達成され得る。最も広く用いられる抗CD3モノクローナル抗体は、Ortho Pharmaceuticalsから臨床用途に適する処方で市販されているOKT3である。Ｔ細胞レセプターを結合手段として抗原ではなくαCD3 mAbを用いることにより、抗原提示細胞の供給源を持つ必要性が回避される。この抗原提示細胞の供給源を持つことは、ウイルス特異的Ｔ細胞に対して、大量の適切な自己細胞を維持し、そしてこれらの細胞にインビトロで高力価のウイルスを感染させることが必要である。以下の実施例６で説明されるように、少なくとも約0.5ng/ml、好ましくは少なくとも約1ng/ml、より好ましくは少なくとも約2ng/mlの濃度の抗CD3モノクローナル抗体は、本発明の方法を用いて500〜3000倍の拡大が約10〜13日以内の増殖で達成され得るように、Ｔ細胞の急速な拡大を促進する。典型的には、本発明者らは、抗CD3モノクローナル抗体を約30ng/mlの濃度で用いるが、実施例５に示されるように、より少ない濃度もまた使用可能である。
もちろん、抗CD3モノクローナル抗体の代用として、Riddellら、J.Immunol. 146:2795-2904、1991に記載されるように、抗原提示細胞を添加することによりＴ細胞レセプターを活性化し得、そして細胞を刺激し得る。適切な抗原提示細胞には、例えば、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、および関連するペプチド抗原でパルス標識された細胞が含まれる。
本発明の方法において用いられる培養培地は、市販の培地のいかなるものでもよく、好ましくは、RPMI、25mM HEPES、25μM ２−メルカプトエタノール、4mM Ｌ−グルタミン、および11％ヒトＡＢ血清を含むものである。仔ウシ胎児血清をヒトＡＢ血清の代わりに置き換え得る。好ましくは、照射されたフィーダ細胞を添加した後、抗CD3モノクローナル抗体および培養培地を標的CTLまたはヘルパーＴ細胞に添加し、この混合物を、当該技術分野において周知の標準的な細胞培養条件下において５％CO2加湿大気中で37℃でインキュベートする。典型的には、このような条件には、排気、および必要であれば、CO2の添加（例えば、加湿インキュベータ中で５％CO2）が含まれ得る。
好ましくは、培地はまた、インターロイキン−２（IL-2）を補充される。典型的には組換えヒトIL-2が用いられるが、その機能的等価物もまた用いられ得る。好ましくは、IL-2を１日目に添加し、そして３〜５日の間隔で再添加する。従って、本発明者らは、一般的には、１日目、５日目もしくは６日目、および８日目もしくは９日目にIL-2を添加する。以下の実施例７で説明されるように、少なくとも約5U/ml、より好ましくは少なくとも約10U/mlのIL-2濃度を用いることにより、拡大を改善し得る。一般には、本発明者らは、約30U/mlの濃度を用いる。
重要なことには、本発明の方法を用いて拡大された抗原特異的Ｔ細胞は、それらの抗原特異性機能を保持する。例えば、以下に実施例８で説明されるように、４個の異なるHIV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、関連抗原（すなわち、HIV）を発現するウイルス感染細胞を殺す能力を保持し、そして無関係のウイルス感染細胞または形質転換された標的細胞に対する非特異的細胞傷害活性を獲得しなかった。同様に、以下に実施例９で説明されるように、４個の異なるCMV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔ細胞クローンは、CMV感染細胞を殺す能力を保持し、そして無関係のウイルス感染細胞または形質転換された標的細胞に対する非特異的細胞溶解活性は獲得しなかった。
これらの特性はまた、CD4＋ヘルパーＴ細胞に適用可能であった。従って、以下に実施例10で説明されるように、本発明の急速拡大方法を用いて増殖させた抗原特異的CD4＋Ｔ細胞は、適切なウイルス抗原および適切な抗原提示細胞（APC）に応答して増殖する能力を保持した。
さらに、本発明の方法によって培養された抗原特異的Ｔ細胞はまた、細胞周期の休止非分裂期に入ることが可能であり、インビトロで少なくとも４週間生存し得る。従って、刺激周期の最後（一般に12日目〜14日目）に培養物からＴ細胞のアリコートを取り除き、そしておおよそ同数の照射PBMCと共に（抗CD3 mAb、抗原またはIL-2なしで）培養容器に置かれ得る。
照射PBMCをフィーダ細胞として添加することにより、休止期に入り、かつ生存したままでいるＴ細胞の能力が改善される。好ましくは、Ｔ細胞を休止させるためのPBMCフィーダ細胞の比は少なくとも約２：１である。PBMCフィーダ細胞の添加なしでは、一般にＴ細胞の生存能力は（典型的には約10％以下のレベルに）大きく低下する。
以下に記載されるように、Ｔ細胞は小さな円形の形態であり、培養の28日後でさえトリパンブルー色素排除により60〜95％が生存している。本発明の方法によって増殖されたＴ細胞はまた、IL-2を取り除いたときに休止期に入り得る；そして抗原特異的Ｔ細胞レセプターを介して再刺激されたときにプログラムされた細胞死（すなわち、アポトーシス）を受けない。（例えば、抗CD3 mABまたは抗原での）再刺激の際、Ｔ細胞はIL-2に対する応答性を再度獲得し、そして細胞周期のＳ期およびＧ2期に入り細胞数を増加し得る。このような特性は、細胞のインビボでの生存および養子免疫療法の効率に重要であるものと考えられる。対照的に、Ｔ細胞増殖のための以前に記載された特定の方法は、サイトカインの除去またはＴ細胞レセプターの再刺激の後に一部の細胞でアポトーシス的な細胞死が生じることを報告している（例えば、Boehme SAおよびLenardo MJ,Eur.J.Immunol.,23:1552-1560,1992を参照のこと）。
免疫療法で用いられ得るＴ細胞に機能的遺伝子を導入することが望ましい多くの異なる環境が存在する。例えば、導入された遺伝子（gene or genes）は、移入されたＴ細胞の生存能力および／または機能を促進することにより治療効率を改善し得る；あるいはインビボでの生存または移動の選択および／または評価を可能にする遺伝的マーカーを提供し得る；あるいは、Lupton S.D.ら、Mol.and Cell Biol.,11：6（1991）；およびRiddellら、Human Gene Therapy 3:319-338（1992）に記載されるように、例えばその細胞をインビボでのネガティブ選択に対して感受性にすることにより、免疫療法の安全性を改善する機能を組込み得る；優勢ポジティブ選択マーカーをネガティブ選択マーカーと融合させることにより誘導される二機能性選択融合遺伝子の使用を記載する、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公開公報も参照のこと。
遺伝子の送達に組換え感染性ウイルス粒子を利用する様々な感染技術が開発されている。これは、本発明のＴリンパ球の形質導入に対する現時点での好ましいアプローチを表す。このように用いられているウイルスベクターには、シミアンウイルス40（SV40；Karlssonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84 82:158,1985）、アデノウイルス（Karlssonら、EMBO J.5:2377,1986）、アデノ関連ウイルス（AAV）（B.J.Carter, Current Opinion in Biotechnology 1992,3:533-539）、およびレトロウイルス（Coffin,1985,17-71頁,Weissら（編）,RNA Tumor Viruses,第２版,第２巻,Cold Spring Harbor Laboratory,New York）に由来するウイルスベクターが含まれる。このように、遺伝子移入法および発現法は多いが、本質的には遺伝物質を哺乳動物細胞に導入して発現するように機能する。上記技術のいくつかは造血性またはリンパ様細胞の形質導入に用いられている。これらの技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション（Bermanら、前出、1984）、プロトプラスト融合（Deansら、前出、1984）、エレクトロポレーション（Cannら、Oncogene 3:123,1988）、ならびに組換えアデノウイルス（Karlssonら、前出；Reutherら、Mol.Cell.Biol.6:123,1986）、アデノ関連ウイルス（LaFaceら、前出）およびレトロウイルスベクター（Overell et al.,Oncogene 4:1425,1989）での感染を含む。初代Ｔリンパ球は、エレクトロポレーション（Cannら、前出、1988）およびレトロウイルス感染（Nishiharaら、Cancer Res.48:4730,1988;Kasidら、前出、1990；およびRiddell,S.ら、Human Gene Therapy 3:319-338,1992）により成功裏に形質導入されている。
レトロウイルスベクターは、真核生物細胞への遺伝子移入の非常に効率的な方法を提供する。さらに、レトロウイルス組込みは、制御された様式で行われ、そして細胞当たり１もしくは数コピーの新しい遺伝情報の安定な組込みを生じる。
レトロウイルスは、ウイルスのRNAゲノム複製にウイルスがコードするRNA指向DNAポリメラーゼまたは逆転写酵素を用いて複製し、鳥類または哺乳動物宿主細胞の染色体DNAに組込まれる二本鎖DNA中間体を生じるクラスのウイルスである。ほとんどのレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。しかしながら、本発明による使用に適合し得るレトロウイルスは、あらゆる鳥類または哺乳動物細胞の供給源に由来し得る。これらのレトロウイルスは好ましくは両栄養性であり、これはヒトを含む数種の宿主細胞に感染し得ることを意味する。レトロウイルスゲノム（および本明細書中で記載されるように用いられるレトロウイルスベクター）の特徴は、レトロウイルスの長い末端反復（すなわち、LTR）である。これは、レトロウイルスゲノムの５’および３’末端に僅かに変化した形態で見出される約600塩基対の非翻訳領域である。プロウイルスとしてDNAに組込まれた場合、このレトロウイルスLTRは短いダイレクト反復配列を各末端に含み、RNAポリメラーゼIIによる転写および３’開裂およびRNA転写体のポリアデニル化のための開始シグナルである。このLTRには、ウイルス複製に必要な他の全てのシス作用配列が含まれる。
「プロウイルス」は、適切な宿主細胞内の染色体DNAに安定に組込まれるレトロウイルスのDNA逆転写体、もしくはそれらのクローン化コピー、または組込まれていない中間形態のレトロウイルスDNAのクローン化コピーをいう。適切なヘルパーウイルスの存在下において、または汚染ヘルパーウイルスを同時に生成することなくキャプシド化し得る適切な配列を含む細胞株において、プロウイルスの正転写および感染性ウイルスへの組立てが起こる。Mannら（Cell 33:153,1983）は、ヘルパーを含まない組換えレトロウイルスのストックの生成に使用し得る細胞株（例えば、Ψ２）の開発を記載している。これらの細胞株は、組込まれたレトロウイルスゲノムを含む。この組込まれたレトロウイルスゲノムは、キャプシド化にシスで必要な配列を欠いているが、完全なビリオンを生成するために必要な遺伝子産物の全てをトランスで提供する。この組込まれた変異プロウイルスから転写されたRNAは、それ自身ではパッケージ化され得ないが、これらの細胞は、その同一細胞に導入された組換えレトロウイルスから転写されたRNAをキャプシド化される得る。得られるウイルス粒子は感染性ではあるが、複製できない。これは、それらを、キャプシド化し得る相補的遺伝情報を欠く細胞への導入の後の感染性ウイルスを生成し得ない有用なベクターにする。環境栄養性（ecotropic）ウイルスのエンベロープ（例えば、Ψ２）をコードするトランス作用要素を有する細胞株におけるキャプシド化により、環境栄養性（制限された宿主範囲）子孫ウイルスが得られる。あるいは、両栄養性パッケージング遺伝子を有する細胞株（例えば、PA317,ATCC CRL9078；MillerおよびButtimore,Mol.Cell.Biol.6:2895,1986）内での組立てにより、両栄養性（広宿主範囲）子孫ウイルスが得られる。このようなパッケージング細胞株は、必須のレトロウイルスgag、polおよびenvタンパク質をトランスで提供する。この戦略は、哺乳動物細胞に対して感染性が高いものの、それらが標的細胞のゲノムに組込まれた後さらに複製することができないレトロウイルス粒子の生成を生じる。env遺伝子の産物は、標的細胞表面上のウイルスレセプターへのレトロウイルスの結合に与り、従って、そのレトロウイルスの宿主範囲を決定する。PA317細胞は、ヒトおよび他の種を起源とする細胞を形質導入し得る両栄養性エンベロープタンパク質を有するレトロウイルス粒子を生成する。他のパッケージング細胞株は、マウスおよびラット細胞のみを形質導入し得る環境栄養性エンベロープタンパク質を有する粒子を生成する。
多くのレトロウイルスベクター構築体が、多くの外来遺伝子の発現に成功裏に用いられている（例えば、Coffin,Weissら（編）,RNA Tumor Viruses,第２版,第２巻（Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1985,17-71頁を参照のこと）。挿入配列を有するレトロウイルスベクターは一般に機能的であり、そして一貫してレトロウイルスの感染を阻害する配列は、ほとんど同定されていない。機能的なポリアデニル化モチーフは、レトロウイルスRNAの合成をブロックすることによりレトロウイルスの複製を阻害し、そしてレトロウイルス粒子にパッケージされ得る配列には、約11kbのサイズ上限が存在する（Coffin、前出、1985）；しかしながら、最初は問題であると思われた（Coffin、前出、1985）複数の内部プロモーターの存在が、いくつかのレトロウイルス構築体において十分に許容されていることが見出された（Overellら、Mol.Cell.Biol. 8:1803,1983）。
レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを用いてインビトロで形質導入され、レシピエントマウスに移植されているマウス造血幹細胞の発達を追跡するために、いくつかのグループにより遺伝タグとして用いられている（Williamsら、Nature 310:476,1984;Dickら、Cell 42:71,1985；Kellerら、Nature 318:149,1985）。これらの研究は、この感染造血細胞がレシピエント動物の造血組織およびリンパ様組織を再構築し、そしてこれらの細胞がインビボで正常な発達潜在的能力を示すことを示している。これらの標識細胞は、レトロウイルスベクター配列の存在を示し得る多くの分子生物学的技術のいずれか、最も注目すべきはサザン分析およびPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて可視化し得る。レトロウイルスベクターを用いて細胞を遺伝的に標識し得ることは、この手法を自己細胞の移植片の追跡に使用し得る臨床環境においても有用である。このアプローチは、Rosenbergら（N.Engl.J.Med.323:570,1990）により、末期ガン処置のためのTIL（腫瘍浸潤リンパ球）療法が施されている患者におけるTILの追跡に既に用いられている。これらの細胞のマーカー遺伝子での形質導入は、インビトロで細胞機能障害に関連しなかった（Kasidら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:473,1990）。
レトロウイルスベクターにおいて多くの遺伝子産物が発現している。これは、そのレトロウイルスのLTR内に組込まれているプロモーターの転写制御下に発現させようとする配列を置くか、あるいはそれらをLTRの間に挿入されている異種プロモーターの制御下に置くことにより達成し得る。後者の戦略は、そのベクター内の優勢選択マーカー遺伝子を共発現させる方法を提供し、それにより特定のベクター配列を発現する細胞の選択を可能にする。
刺激因子（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現は、処置された個体に対して有害であり得ると考えられる。従って、本発明のＴ細胞をインビボでのネガティブ選択に対して感受性にする遺伝子セグメントを含むことは本発明の範囲内にある。「ネガティブ選択」は、注入された細胞が個体のインビボ条件での変化の結果として排除され得ることを意味する。ネガティブ選択表現型は、投与された作用物質（例えば化合物）に対する感受性を付与する遺伝子の挿入の結果として生じ得る。ネガティブ選択遺伝子は当該技術分野において公知であり、これにはとりわけ次のものが含まれる：ガンシクロビル感受性を付与するＩ型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-I TK）遺伝子（Wiglerら、Cell 11:223,1977）；細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子、細胞のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）遺伝子、細菌性シトシンデアミナーゼ（Mullenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33（1992））。
加えて、インビボでネガティブ選択表現型の細胞を選択し得るポジティブマーカーをＴ細胞に含めることが有用である。このポジティブ選択マーカーは、宿主細胞に導入されることにより、その遺伝子を有する細胞のポジティブな選択を可能にする優勢表現型を発現する遺伝子である。このタイプの遺伝子は当該技術分野において公知であり、そしてこれには、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質G418に対する耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ADA）、および多剤耐性（MDR）遺伝子が含まれる。
好ましくは、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択要素とは、ネガティブ選択要素の喪失はまた、必然的にポジティブ選択マーカーの喪失をともなうように結合される。さらにより好ましくは、ポジティブおよびネガティブ選択マーカーは、一方の喪失が必ず他方の喪失を招くように融合される。上記の所望のポジティブおよびネガティブ選択の特徴の両者を付与するポリペプチドを発現産物として生成する融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（HyTK）である。この遺伝子の発現により、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性を付与し、かつインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドが生成される。Lupton S.D.ら、Mol. and Cell. Biology 11:3374-3378,1991を参照のこと。加えて、好ましい実施態様において、この融合遺伝子を有するレトロウイルスベクター、特に、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性およびインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を付与するもの（例えば、Lupton,S.D.ら（1991）前出に記載されているHyTKレトロウイルスベクター）内に、キメラレセプターをコードする本発明のポリヌクレオチドが存在する。S.D.LuptonによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601公開公報も参照のこと。これらは、優勢ポジティブ選択マーカーをネガティブ選択マーカーとの融合に由来する二機能性選択融合遺伝子の使用を記載する。
好ましいポジティブ選択マーカーは、hph、neo、およびgptからなる群より選択される遺伝子に由来し、そして好ましいネガティブ選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、HIV-I TK、VZV TK、HPRT、APRTおよびgptからなる群より選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、ポジティブ選択マーカーがhphまたはneoに由来し、そしてネガティブ選択マーカーがシトシンデアミナーゼまたはTK遺伝子に由来する二機能性選択融合遺伝子である。
当該技術分野において周知のように、様々な方法がＴリンパ球の形質導入に使用され得る。典型的には、本発明者らは、次のようにレトロウイルスによる形質導入を行う：本明細書中に記載されるREMを用いる刺激後の１日目に、20〜30単位／mlのIL-2を細胞に加え；３日目に、培地の1/2を標準的な方法に従って調製したレトロウイルス上清に置き換え、そして次いでその培養物に５μg/mlポリブレンおよび20〜30単位/ml IL-2を補充し；４日目に細胞を洗浄し、そして20〜30単位/ml IL-2を補充した新鮮な培養培地中に入れ；５日目にレトロウイルスへの暴露を繰り返し；６日目に30単位/ml IL-2を補充した選択培地（例えば、そのレトロウイルスベクターに与えられた抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質を含む）中に細胞を入れ；13日目に、Ficoll-Hypaque密度勾配分離を用いて生存細胞を死細胞から分離し、そして次いで本発明の急速拡大方法を用いてその生存細胞をサブクローン化する。
本発明のリンパ球は、個体に免疫性を付与するために使用し得る。「免疫性」は、リンパ球の応答が指向する、病原体による感染または腫瘍に対する応答に関連する１つ以上の身体的症状の軽減を意味する。投与される細胞量は、通常、病原体に対する免疫性を有する正常な個体に存在する範囲内である。従って、CD8+ CD4-細胞は、通常、各々の注入が少なくとも106〜1010細胞／ｍ2、好ましくは少なくとも107〜109細胞／ｍ2の範囲内の注入により投与される。これらのクローンは１回の注入で投与され得るか、またはある期間の範囲にわたって複数回注入され得る。しかしながら、異なる個体では応答性が変動することが予想されるため、注入細胞のタイプおよび量ならびに注入の回数および複数回の注入が行われる期間範囲は担当医によって決定され、かつ日常的な検査によって決定され得る。本明細書中に例示されるように、本発明の急速拡大方法を用いることにより、十分なレベルのＴリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球および／またはヘルパーＴリンパ球を含む）の生成を容易に達成し得る。
本発明に従ってREMを用いて拡大されたＴ細胞が、リンパ球を用いる養子免疫療法および遺伝子療法に関連して多用されるレトロウイルスベクターのようなベクターを用いる非常に高いレベルの形質導入を示すことも観察されている。急速拡大されたＴ細胞の遺伝的形質導入は実施例18に説明されており；そしてそのような遺伝的に形質導入された抗原特異的CTLのヒト患者における養子免疫療法への使用は実施例19に説明されている。
以下に提示される実施例は、当業者の実施者に対するさらなる案内として提供されるものであり、そしていかなる意味においても本発明を制限するものと解釈されない。
実施例１
４人のヒトドナーに由来するヒト抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球クローンおよび抗原特異的ヘルパーＴリンパ球の急速拡大
CD3＋、CD8＋、CD4− CMV特異的またはHIV特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローン、およびCD3＋、CD4＋、CD8− CMV特異的ヘルパーＴ細胞クローンを、CMVおよび／またはHIVセロポジティブである４人のヒトドナーから（「ER」、「DRG」、「DPN」および「DH」と呼ばれる）単離した。上述の標準的な方法を用いて、10個の異なる抗原特異的Ｔ細胞クローンを単離した（例えば、Riddellら、Science 257:238-240（1992）、Riddellら、（J.Immunology,146:2795-2804,1991）を参照のこと）。
小規模拡大のため、細胞を５〜６×104Ｔ細胞／フラスコの投入細胞濃度で、25cm2組織培養フラスコにおいて培養した。
４個のクローン（ER3C、ER12C、ER4G、およびER11G）に、γ線照射同種異系PBMCおよびLCLをフィーダ細胞として添加した。簡単に述べると、同種異系PBMCを、標準的な方法（例えば、前出のWeaverらを参照のこと）を用いて血液銀行がスクリーニングしたボランティアドナーから白血球搬出により得た。同種異系LCLを、上述のように、EBVのB95-8株で形質転換することによりこのPBMCのアリコートから生成した。PBMCは3300radで、そしてLCLは8000radでγ線照射に供した。
残りのクローンには、自己γ線照射PBMCおよびLCLをフィーダ細胞として添加した。自己PBMCおよびLCLを、同種異系フィーダ細胞について記載したのと同じ方法で単離および照射した。
25mlの最終培養容積で、各フラスコに添加されたPBMCフィーダ細胞の数は約25×106であり、そしてLCLフィーダ細胞の数は約５×106であった。Ｔ細胞レセプターの刺激シグナルを与えるために、培養開始時に最終濃度30ng/mlで抗CD3モノクローナル抗体を添加し、そして活性化Ｔ細胞の拡大をさらに促進するため、培養開始後１日目に、40U/mlの濃度でヒト組換えIL-2を添加した。培養開始後５日目および８日目に、培地の1/2を、IL-2を20U/mlの濃度で含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106／培地mlを超えたとき、培養物を分割した。培養開始後11〜13日目に、フラスコ当たりで得られたＴ細胞の総数を評価した。
図１に示したように、その結果は、Ｔ細胞の全てが急速かつ劇的な拡大を受けたことを示す。特に、本発明の方法を用いて、１刺激周期で、細胞は866倍〜1500倍の範囲の拡大（1100倍を超える平均拡大）を示した。
実施例２
養子免疫療法に用いるための、６人のヒトドナーに由来する抗原特異的Ｔ細胞クローンの大規模拡大
上述のように、６人の個々の患者（「DRG」、「MRL」、「DRD」、「LAH」、「RM」および「JTE」と呼ばれる）からCMVまたはHIV特異的Ｔ細胞クローンを単離した。クローンを、マイクロウェルから移した後少なくとも１刺激周期培養した。
この大規模拡大のために、各クローンのアリコートを、1.5×105〜５×105の投入細胞数で、フィーダ細胞としての自己（DRG、MRL、DRD、LAH）または同種異系（RM、JTE）のいずれかのγ線照射PBMCおよびLCLと共に75cm2フラスコにおいて培養した。各フラスコに添加したフィーダ細胞の数は、75〜90×106PBMCおよび15×106LCLであった。抗CD3モノクローナル抗体を、最終濃度30ng/mlで培養培地の総容積75mlにて添加した。培養開始後１日目にヒト組換えIL-2を最終濃度30U/mlで添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合には、培養物を分割し、そして再補給した。総細胞収量は、培養開始後10〜14日目にフラスコから回収された細胞数を表し、そして少数の出発細胞数からの１周期での拡大を反映する。
図２に示すように、その結果は、急速な大規模拡大が全てのクローンについて達成されたことを示す。特に、これらのクローンは、１刺激周期で抗原特異的Ｔ細胞の大集団（6.2×108〜9×109細胞の範囲）を生じる約250倍〜2200倍の範囲の拡大（約1130倍の平均拡大）を示した。
刺激の反復周期もまた、急速拡大の促進に効果がある。したがって、この技術を用いて、1015を超えるクローン由来のエフェクターＴ細胞を生成することが可能である。実際問題としては、（超大規模培養に必要な培地およびインキュベータの空間により）109〜５×1010の細胞用量がより適しており、これは一般に養子免疫療法での使用に十分である。
実施例３
急速拡大方法におけるPBMCフィーダ細胞のＴ細胞に対する比の効果
（実施例２のように）クローンDRG28D3由来の５×104個の細胞数のＴ細胞を投入して個々の25cm2フラスコを確立した。様々な数のγ線照射PBMCを添加して、Ｔ細胞のPBMCに対する１：３〜１：800の範囲の比を達成した。抗CD3 mAB（30ng/ml）および５×106LCLを各フラスコに添加して、各フラスコの最終容積を25mlとした。１日目に組換えIL-2を40U/mlの濃度で添加し、そして５日目および８日目に1/2の培地をIL-2を20U/mlの濃度で含有する新鮮な培地に置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合には、培養物を分割した。各々のＴ細胞：PBMC比で確立された培養物におけるＴ細胞の増殖を、13日目に生存Ｔ細胞を数えることにより評価した。
図３に示されるように、その結果は、Ｔ細胞：PBMC比を少なくとも１：40（すなわち、少なくとも40倍過剰のPBMC）、好ましくは少なくとも１：200、より好ましくは約１：400と１：800の間で用いることにより、Ｔ細胞の増殖を顕著に増強し得ることを示す。典型的には、発明者らは約１：500の比を用いる。
実施例４
急速拡大方法におけるLCLフィーダ細胞の使用の効果
（実施例２の）クローンDRG28D3由来の５×104個の細胞数のＴ細胞を投入して個々の25cm2フラスコを確立した。様々な数のγ線照射LCLを添加して、Ｔ細胞のLCLに対する１：０〜１：300の範囲の比を達成した。抗CD3 mAB（30ng/ml）および25×106PBMCを各フラスコに添加し、各フラスコの最終容積を25mlとした。１日目に組換えIL-2を40U/mlの濃度で添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2を20U/mlの濃度で含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合には、培養物を分割した。各々のＴ細胞：LCL比で確立された培養物におけるＴ細胞の増殖を、13日目に生存Ｔ細胞を数えることにより評価した。
図４に示されるように、その結果は、培養物にLCLフィーダ細胞を添加することにより、REMの下での拡大速度をさらに高め得ることを示す。このようなさらなる増強は、Ｔ細胞：LCL比を少なくとも１：lO（すなわち、少なくとも10倍過剰のPBMC）、好ましくは少なくとも１：20、さらにより好ましくは約１：50と１：200の間で用いることにより達成し得る。典型的には、発明者らは約１：100の比を用いる。
実施例５
Ｔ細胞の増殖に用いられる他の方法とのこの急速拡大方法の比較
６個の異なるＴ細胞クローンのアリコートを、以下に記載される条件下で刺激した。
（a）REMの使用：
本発明の急速拡大方法に従って、５×104個のＴ細胞を25cm2フラスコにおいて、１：500のＴ細胞：PBMC比のγ線照射PBMC、および１：100のＴ細胞：LCL比のγ線照射LCLと共に、40ng/mlのαCD3 mABを含有する25mlの培地中で培養した。１日目に組換えIL-2（30U/ml）を添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地と置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合に培養物を分割した。培養開始後11日目に得られた生存Ｔ細胞の総数を出発細胞数で除することにより、細胞数の拡大倍数を決定した。
（b）標準的なαCD3刺激の使用：
本質的にRiddellらによって記載された方法（J.Immun.Methods,1990,前出）に従って、５×105個のＴ細胞を、24ウェルプレートの個別のウェルにおいて、２×106個のγ線照射PBMCおよび２×105個のγ線照射LCLと共に、40ng/ml αCD3 mABを含有する２mlの培地中で培養した。１日目に組換えIL-2（30U/ml）を添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合に培養物を分割した。培養開始後11日目に得られた生存Ｔ細胞の総数を出発細胞数で除することにより、細胞数の拡大倍数を決定した。
（c）標準的な抗原刺激の使用
本質的にRiddellらによって記載された方法（J.Immunol.,1991,前出）に従って、５×105個のＴ細胞を、24ウェルプレートの個別のウェルにおいて、５×104個の自己CMV感染線維芽細胞からなる特異抗原、ならびに２×106個のγ線照射PBMCおよび２×105個のγ線照射LCLからなるフィーダ細胞と共に２mlの培地中で培養した。２日目に組換えIL-2（30U/ml）を添加し、そして４日目および６日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地で置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合に培養物を分割した。抗原で刺激された培養においては、培養開始後７日目と９日目の間に最大細胞収量が得られた。したがって、培養開始後７〜９日目に得られた生存Ｔ細胞の総数を出発細胞数で除することにより、細胞数の拡大倍数を決定した。
図５に示される比較の結果は、従来のＴ細胞増殖方法と比較して、本発明の急速拡大方法（REM）を用いることで１刺激周期で劇的に拡大することを示す。特に、REMを用いての平均拡大は、標準的な抗CD3法を用いて観察されるものよりもほぼ100倍高く、そして標準的な抗原刺激法を用いて観察されるものよりもほぼ500倍高かった。
実施例６
急速拡大培養物への抗CD3モノクローナル抗体の添加の効果
培養系への抗CD3モノクローナル抗体の添加の効果を評価するため、５×104個のＴ細胞（実施例２のようにクローンDRG 28D3から得られた）を、25cm2フラスコにおいて、１：500のＴ細胞：PBMC比のγ線照射PBMCおよび１：100のＴ細胞：LCL比のγ線照射LCLと共に、０〜40ng/mlの濃度範囲の様々な濃度の抗CD3 mABを含有する25ml培地中で培養した。１日目に組換えIL-2（30U/ml）を添加し、そして５日目および８日目に培地の1/2をIL-2（20U/ml）を含有する新鮮な培地に置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えた場合に培養物を分割した。培養開始後11日日に得られた生存細胞の数を数えることにより、Ｔ細胞の増殖を評価した。
図６に示されるように、その結果は、培養物に抗CD3モノクローナル抗体を添加することにより、REMの下での拡大速度をさらに高めることができることを示す。このようなさらなる増強は、少なくとも約0.5ng/ml、好ましくは少なくとも約１ng/ml、より好ましくは少なくとも約２ng/mlの抗CD3濃度を用いて達成され得る。典型的には、発明者らは約30ng/mlの濃度を用いる。
実施例７
急速拡大培養物へのIL-2の添加の効果
培養系への抗CD3モノクローナル抗体の添加の効果を評価するために、（実施例２のようにクローンDRG 28D3から得られた）５×104個のＴ細胞を、25cm2フラスコにおいて、１：500のＴ細胞：PBMC比のγ線照射PBMCおよび１：100のＴ細胞：LCL比のγ線照射LCLと共に、30ng/mlの抗CD3 mABを含有する25ml培地中で培養した。１日目に組換えIL-2を様々な濃度（０〜50U/mlの範囲）で各フラスコに添加し、次いで５日目および８日目に培地の1/2をIL-2を同じ濃度で含有する新鮮な培地に置き換えた。Ｔ細胞の濃度が1.5×106/mlを超えたときに培養物を分割した。培養開始後11日日に得られた生存細胞数を数えることにより、Ｔ細胞の増殖を評価した。
図６に示されるように、その結果は、培養物にIL-2を添加することにより、REMの下での拡大速度をさらに高めることができることを示す。このようなさらなる増強は、少なくとも約５U/ml、好ましくは少なくとも約10U/mlのIL-2濃度を用いることにより達成し得た。典型的には、発明者らは約30U/mlの濃度を用いる。
実施例８
HIV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、急速拡大の後に抗原特異的溶解機能を保持する
クローンRM56G6/7、RM56G6/2、JTE10A5/5およびJTE10A5/13は、Riddellら、J.Immunol.,1991に記載されるように生成されたCD3＋、CD8＋、CD4−、HIV（gag）特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンである（実施例２を参照のこと）。個々のクローンを、本発明の急速拡大培養方法を用いて少なくとも２刺激周期培養した。刺激後10〜12日目に、Ｔ細胞クローンを、Riddell,S.ら、J.Immunol.,1991,前出に記載されるように５時間のCr51放出アッセイにおいて、MHCが制限されたAg特異的細胞傷害機能の保持についてアッセイした。
標的細胞は自己およびHLA不適合EBV形質転換LCLからなっており、そしてこれらを擬似感染（「mock」）させるか、あるいはワクシニア−HIV（gag）組換えウイルス（「Vac／gag」）またはコントロールのワクシニアウイルス（「Vac」）で16時間感染させた。
図８に示されるように、その結果は、REMを用いて拡大させたHIV（gag）特異的CTLクローンが、HIV（gag）発現標的細胞をMHCが制限された様式で溶解する能力を保持することを示す。
実施例９
CMV特異的CD8＋細胞傷害性Ｔリンパ球は、急速拡大の後に抗原特異的溶解機能を保持する
クローンLAH4F8、LAH7E4、MRL10E6およびMRL10B5は、実施例２に記載されるように生成させたCD3＋、CD8＋、CD4−、CMV特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンである。個々のクローンを、本発明の急速拡大培養方法を用いて少なくとも２刺激周期培養した。刺激後10〜12日目に、Ｔ細胞クローンを、上述のように５時間Cr51放出アッセイにおいて、MHCが制限されたAg特異的細胞溶解機能の保持についてアッセイした。
標的細胞は自己およびHLA不適合線維芽細胞からなっており、そしてこれらを擬似感染（「mock」）させるか、またはCMVのAD169株（「CMV」）で24時間感染させた。
図９に示されるように、その結果は、REMを用いて拡大させたCMV特異的CTLクローンが、CMV発現標的細胞をMHCが制限された様式で溶解する能力を保持することを示す。
実施例10
CMV特異的CD4＋ヘルパーＴリンパ球は、インビトロでの急速拡大の後に、抗原特異的増殖機能を保持する
Ｔ細胞クローンDHTh-2およびDHTh-10（実施例１を参照のこと）は、上述のようにPBLをCMV抗原で刺激し、そして限界希釈でクローン化することによりCMVセロポジティブドナーから生成された、CD3＋、CD4＋、CD8− CMV特異的クラスII MHCに制限されたクローンである。
これらのクローンのアリコートを、本発明の急速拡大方法で、30ng/mlの抗CD3 mABならびにＴ細胞のPBMCに対する１：500の比およびＴ細胞のLCLに対する１：100の比を用いて、２刺激周期拡大させた。
周期２の14日後、Ｔ細胞を洗浄し、そして96ウェル丸底プレート中の３連の培養物において、５×104細胞／ウェルでプレートした。ドナーDHまたはクラスII MHC不適合同種異系ドナーから得られた照射PBMCを、抗原提示細胞として５×105個添加した。幾つかの３連では、グリシン抽出により調製されたCMV抗原を１／500の濃度で添加した。96時間のインキュベーションの最後の18時間、3Ｈチミジンでウェルをパルス標識し、そしてβシンチレーション計数のために細胞を回収した。
図10に示されるそのデータにより、クローンDHTh-2およびDHTh-10が、REMを用いる急速インビトロ拡大の後でも、MHCが制限されたCMV特異的増殖応答を示し続けることが確認される。
実施例11
急速に拡大したＴ細胞はサイトカインが使用中止された際に休止段階に入る能力を保持し、これらは、抗原またはIL-2なしでもインビトロで生存可能のままであり、そしてこれらは、Ｔ細胞レセプター活性化の際にIL-2に対する応答性を回復する
本発明の方法によって培養された抗原特異的Ｔ細胞は、細胞周期の静止非分裂期に入ることも可能であり；かつインビトロで少なくとも4週間生存し続けることができる。したがって、Ｔ細胞のアリコートを刺激周期の終わり（一般的には、12〜14日目）に培養物から取り出し、ほぼ同数の照射PBMCと共に（抗CD3 mAB、抗原、またはIL-2なしで）培養容器に入れることができる。照射PBMCをフィーダ細胞として添加することにより、休止期に入り、かつ生存可能のままでいるＴ細胞の能力を改善した。さらに、Ｔ細胞は小さな円い形態をとることが観察され、そして培養28日後であっても細胞の60〜95％が生存可能のままであった（トリパンブルー色素排除により測定した場合）。
クローンER11G（実施例１を参照のこと）が、急速拡大方法で２周期増殖させた代表的なCD3＋、CD8＋、CD4− HIV（gag）特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンである。増殖の第２周期の後、Ｔ細胞をインビトロで休止させた。簡単に述べると、細胞を洗浄し、１×106/mlの細胞濃度で新鮮な培地に再懸濁し、次いで１mlを24ウェルプレートの個別のウェルにプレートした。２×106個のγ線照射同種異系PBMCを、各ウェルに最終容積２mlで添加した。７日ごとに、1/2容積の新鮮な培地を添加した。
21日後、Ficoll hypaqueで細胞を分離し、そして生存休止Ｔ細胞を洗浄して96ウェル丸底プレートの３連の培養物に１×105／ウェルでプレートした。０、2.5、５、10または20単位/mlのIL-2を、IL-2に対する休止細胞の応答性を評価するために添加した。Ｔ細胞のアリコートを抗CD3 mABで48時間活性化し、次いで上述の通り96ウェル丸底プレートにプレートした。増殖を評価するため、72時間のインキュベーションの最後の16時間、全てのウェルを3Ｈチミジンでパルス標識した。
図11に示されるそのデータにより、本発明に従ってREMにより生成させたＴ細胞は、静止段階の間、外因性IL-2に応答して増殖することがなく；そしてこれらは、Ｔ細胞レセプターの活性化に際してIL-2応答性を回復することが確認された。
実施例12
急速に拡大したＴ細胞はインビトロでの休止の後に細胞周期のＧ０／Ｇ１段階に入り、そしてIL-2Rα鎖を発現しない
Ｔ細胞クローンDRG28D3（実施例２を参照のこと）は、急速拡大方法で２周期増殖させた代表的なCD3＋、CD8＋、CD4− CMV特異的細胞傷害性Ｔ細胞クローンである。拡大の２周期の後、細胞を実施例11に記載されるようにインビトロで休止させた。インビトロでの休止の14日後、生存Ｔ細胞をFicoll hypaqueで分離しそして洗浄した。
次に、DNA含量を評価するために、細胞をヨウ化プロピジウムで染色することにより細胞周期分析を行った。図12に示されるように、そのデータは、約95％の細胞が細胞周期のＧ０／Ｇ１期に入っていることを示した。
IL-2レセプターα鎖の発現を、抗CD3モノクローナル抗体、抗IL2レセプターα鎖モノクローナル抗体、または第２工程のモノクローナル抗体のみを用いる間接免疫蛍光法で細胞を染色することによりモニターした。データは、休止細胞は抗CD3抗体で染色されるが、しかしごくわずかのIL-2レセプターα鎖しか発現しないことを示した。ポジティブコントロールとして、48時間活性化されているＴ細胞も染色した。データは、休止Ｔ細胞上での低レベルのIL2Rαの発現が、活性化によりアップレギュレートされることを示した。
実施例13
Ｔ細胞レセプター活性化の後に、休止Ｔ細胞は細胞増殖のＳおよびＧ２／Ｍ期に誘導される
上述のように14日間休止しているDRG28D3細胞のアリコートを、急速拡大方法を用いて再刺激した。簡単に述べると、１×105個のＴ細胞を、25cm2フラスコにおいて、フィーダ細胞としての25×106個のγ線照射PBMCおよび5×106個のγ線照射LCL、ならびに30ng/mlの抗CD3 mABと共に培養した。１日目に30U/mlのIL-2を添加した。５日目に培養物を回収し、そして細胞をFicoll hypaqueを用いて遠心分離し残留フィーダ細胞をＴ細胞から分離した。次いで、残った細胞を洗浄し、そしてDNA含量を評価（access）するためヨウ化プロピジウムで染色した。
図13に示される結果は、活性化に続くこの時期に、Ｔ細胞の約40％が細胞周期のＳまたはＧ2／Ｍ期に、残りの細胞がＧ１に入っていることを示す。
上のデータをまとめると、本発明の方法で増殖させたＴ細胞は、IL-2の使用中止の際に休止期に入ることが可能であり、そして、これらは抗原特異的Ｔ細胞レセプターによる再刺激の際にプログラム細胞死（すなわち、アポトーシス）を受けない。（例えば、抗CD3 mABまたは抗原での）再刺激の際、Ｔ細胞はIL-2に対する応答性を再獲得し、そして細胞周期のＳおよびＧ2期に入ることが可能であり、かつ細胞数が拡大し得る。このような特性は、細胞のインビボでの生存および養子免疫療法の効力に重要であると考えられる。
実施例14
ポリクローナル抗原特異的Ｔ細胞の単離およびCMV特異的CTLクローンの生成
本明細書中に記載される方法は、養子免疫療法において用いるためのヒト抗原特異的Ｔ細胞クローンを含むＴ細胞を迅速に増強させるために特に有用である。決められた抗原特異性のＴ細胞クローンが治療に用いられる環境においては、まず、これらのクローンを以下に説明される標準的な方法を用いてポリクローナルＴ細胞から単離しなければならない。次いで、本発明の急速拡大方法を用いて、抗原特異的Ｔ細胞クローンの数を迅速に拡大させることができる。この培養方法をどのように用いるのかを示す次の実施例において、標準的な方法を用いるＴ細胞クローンの生成が簡潔に説明される。
CMVセロポジティブによって以前にサイトメガロウイルス（CMV）に感染していることが既知である、「MRL」と呼ばれる人物から末梢血（PB）を採取した。Ficoll hypaque密度勾配分離を用いてMRL由来の末梢血を精製し、末梢血単核細胞（PBMC）の集団を得た。
線維芽細胞株は、ドナーMRLから得た皮膚生検物に由来した。自己線維芽細胞（５×105）をAD169株サイトメガロウイルス（CMV）で６時間感染させ、次いで１：20の比で自己PBMC（１×107）に添加した。培養７日後に、この集団からCD4＋Ｔ細胞を枯渇させ、そして96ウェル丸底ウェルにおいて２×103個のAD169 CMV感染線維芽細胞；５×104個のγ線照射PBMC；1×104個のγ線照射LCL；および50単位/mlの組換えヒトIL-2と共に、0.2mlの培養培地の固定容積で0.3〜0.7のＴ細胞／ウェルをプレートすることによりCD8＋Ｔ細胞をクローン化した。プレーティングの13日後に増殖についてポジティブなウェル中のＴ細胞のアリコートを、Riddellら、J.Immunol.,前出に記載される通りにウイルス特異的細胞溶解活性について試験し、次いで細胞溶解活性を示すものを再刺激のためにはマイクロウェルに、または急速拡大のためには25cm2フラスコに、移した。
実施例15
自己フィーダ細胞系を用いるCD8＋ CMV特異的Ｔ細胞クローンの急速拡大
（実施例14からの）MRL CD8＋ CMV特異的Ｔ細胞クローンを数え、そして組織培養フラスコに入れた。自己PBMCをドナーの白血球搬出により得、そしてそれにγ線照射した後、フィーダ細胞として添加した。PBMCにはγ線を3,300radで照射した。照射PBMCの標的Ｔ細胞の量に対する比は400：１〜700：１の範囲であり、一般的には約500：１であった。
これらの培養で用いられた培地は、25mM HEPES、11％ヒトCMVセロネガティブAB血清、4mM Ｌ−グルタミン、および25μM ２−メルカプトエタノールが補充されたRPMIであった。急速拡大培養の開始時に、培養混合物に抗CD3モノクローナル抗体（30ng/ml）を添加した。次いで、培養物に、開始後１日目、さらに５日目、そしてさらに８日目にIL-2を30単位/mlで補給した。また、５日目および８日目に標的Ｔ細胞を数え、そしてＴ細胞の濃度が１×106/mlを超える場合には、培養物を分割してＴ細胞の濃度を培養培地のml当たり約2.5×105〜５×105個に減らした。10日目後、養子免疫療法で用いる前に標的Ｔ細胞に品質制御試験を行うか、またはさらなる拡大について上に概説される工程を繰り返すことによって再刺激し、その後免疫療法で用いた。
MRLクローンを用いて、約2000倍の拡大が10〜13日の期間内に得られた。一般には、500倍〜3000倍の拡大が10〜13日の培養期間内で達成することができる。したがって、２×104〜５×105個のＴ細胞から出発したとしても、この急速拡大培養方法は１刺激周期の後に各クローンについて５×108個までのＴ細胞を得ることができる。したがって、REMを用いて、２回の10〜13日増殖周期の後に５×109個を超えるＴ細胞のクローン性集団を達成することが日常的に可能である。
実施例16
REMによって増殖させたＴ細胞クローンを用いるヒト患者における養子免疫療法
現在、10人の異なる個人由来の100を超える異なるクローンに急速拡大方法が適用されている。REMによって増殖させたＴ細胞クローンを用いる養子免疫療法の効力が、University of Washington School of Medicineと共同でFred Hutchinson Cancer Research Centerで行われた研究において評価されている。この研究は、REM生成Ｔ細胞クローンの養子移入が骨髄移植片（「BMT」）レシピエントにおいて抗原特異的応答を回復し得るかどうかを決定するために設計された。
説明のために、そのような研究の１つにおいて、CMV特異的CD8＋Ｔ細胞クローンをドナー「MRL」から得て、本明細書中に記載されるようにREMを用いて急速に拡大させ、次いでドナーMRL由来の同種異系骨髄移植を受けるHLAが同一の兄弟に投与した。Ｔ細胞投与は骨髄移植後35日目に開始し、そして４週間連続で毎週用量を与えた。最初の２回の用量については、実施例１に記載される通りに抗原特異的Ｔ細胞を拡大させた。３回目および４回目の用量については、実施例２に記載される通りにＴ細胞を拡大させた。
Ｔ細胞クローンは、3.3×107細胞/mlの細胞用量で始めて、そして各注入ごとに以下のように上昇させて４回の静脈内注入により投与した：注入#2−1.0×108Ｔ細胞／ｍ2；注入#3−3.3×108細胞／ｍ2；および注入#4−１×109Ｔ細胞／ｍ2。
CD8＋ CMV特異的Ｔ細胞クローンの各々の養子移入の前後に、PBMCをレシピエントから得て、インビトロでHLA適合CMV感染線維芽細胞で刺激し、そして（実施例８〜９に記載されるように）CD8＋ CMV特異的CTL活性の存在について試験するるか、またはCD4＋ CMV特異的ヘルパーＴ細胞活性について試験するために、実施例10に記載される方法を用いてインビトロでCMV抗原で刺激した。
図14Aに示されるように、患者のCD8＋ CMV特異的CTL応答はＴ細胞の注入を開始する前は本質的にネガティブであったが、しかし急速に拡大させたCTLを投与した後はCMV特異的細胞溶解性活性の大きな増大が観察された（予想されるように、CD4＋ CMV特異的ヘルパーＴ細胞応答は影響されなかった、図14B）。
ヒトレシピエントにおける養子免疫療法でのREM拡大抗原特異的Ｔ細胞クローンの使用のこれらの証明は、現在、University of Washington School of Medicineと共同でFred Hutchinson Cancer Research Centerでの多数の同様の研究において繰り返されている。
実施例17
急速拡大系における同種異系フィーダ細胞の使用
フィーダ細胞がHIVを有し得、そのためそのウイルスを培養物に伝染させ得るHIV感染者の場合のような幾つかの状況においては、フィーダ細胞としての自己PBMCおよびLCLの使用は禁忌であり得る。そのような状況においては、同種異系照射PBMCおよびLCLを自己PBMCおよびLCLの代わりに培養系に用いることが可能である。
同種異系フィーダ細胞系の使用の説明例として、冷凍保存された同種異系PBMCをドナー「RRM」（アメリカ赤十字の献血基準を満たす）から得た。このPBMCにγ線照射し、そしてγ線照射同種異系LCL（上述のように標準的な方法により同じドナーから得た）と共にフィーダ細胞として添加した。発明者らは、自己系についてとほぼ同じ、すなわち、PBMCについて400〜700：１、およびLCLについて20〜120：１の同種異系PBMCおよびLCLの標的Ｔ細胞に対する比を用いた。
拡大の標的となる細胞は、HIVセロポジティブドナーから得たCD8＋ HIV特異的CTLであった。特に、HIVセロポジティブな個体「ER」から得られたPBMCのサンプルから、まず細胞をそれらのプラスチックへの付着に基づいて分離し、次いでその付着単層をワクシニア/gag組換えウイルスで16時間感染させることにより、CD8＋ HIV（gag）特異的CTLを生成させた。次いで、vac／gag感染付着細胞にＵＶ光を照射してワクシニアウイルスを不活性化し、そして応答するＴ細胞を含有する非付着細胞を添加した。７日後にこの刺激を繰り返し、そして再刺激後２および４日目に２〜５U/mlのIL-2を添加した。さらに７日後、残留CD4＋ Ｔ細胞を培養物から枯渇させ、そしてαCD3 mAB（30ng/ml）、照射同種異系PBMC（５×104／ウェル）、照射同種異系LCL（１×104／ウェル）、IL-2（50単位/ml）および0.2mlの培養培地を含有する96ウェル丸底プレートにCD8＋ Ｔ細胞を0.3〜0.5細胞／ウェルでプレートした。14日後、増殖しているクローンを自己HIV-gag発現標的細胞に対する細胞溶解活性についてスクリーニングし、そしてポジティブクローンを上述の急速拡大のために25cm2フラスコに移した。
CD8＋ HIV（gag）特異的Ｔ細胞クローンの１刺激周期にわたる拡大の範囲は、実施例15に例示される自己フィーダ細胞系において観察されるものと同様であった。すなわち、500〜1500倍の拡大があり、そしてクローンはHIV（gag）特異的細胞溶解反応性を保持した。
実施例18
養子免疫療法において使用するためのヒトＴ細胞クローンの遺伝子形質導入および急速拡大
本発明の急速拡大方法は、レトロウイルスベクター中にコードされる遺伝子のヒトＴ細胞への安定な移入を促進するために用いることができる。
実例となる実施例として、ドナー「RRM」に由来するHIV（gag）特異的Ｔ細胞クローンを上述の培養条件下で刺激し、そして刺激後１日目にIL-2を補給した。
刺激後３日目に、培地の1/2を、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子を融合遺伝子としてコードするレトロウイルス粒子（前出のLuptonらによって記載されるように）を含む、「HyTK」と呼ばれるレトロウイルス上清で置き換えた。次いで、培養物に５μg/mlのポリブレンおよび20U/mlのIL-2を補充した。次の日（４日目）に、細胞を洗浄し、そして20U/mlのIL-2を有するCTL培地に入れた。５日目に、上述の通りにレトロウイルス上清への暴露を繰り返し、そして６日目に細胞をハイグロマイシンを250μg/mlの濃度で、かつIL-2を30U/mlで含有する培地に入れた。刺激後13日目に、生存培養Ｔ細胞を、Ficoll Hypaque密度勾配分離によって死んだ細胞から分離し、次いで96ウェル丸底プレートにおいて、フィーダ細胞としての照射PBMCおよびLCL、抗CD3モノクローナル抗体（30ng/ml）およびIL-2（50U/ml）と共に１細胞／ウェルでサブクローン化した。Ｔ細胞をサブクローン化する利点は、得られた遺伝子改変Ｔ細胞が単一の組込み部位を有し、そして増殖および／または機能に影響を及ぼし得る変異事象について個別に評価できることである。（あるいは、形質導入されたクローンをサブクローン化する必要はないが、しかしハイグロマイシン選択のさらなる周期の条件下で再刺激して形質導入されたＴ細胞がネガティブに選択されることを確実にすることができる。）
プレート後７日目に、ハイグロマイシンＢをウェルに250μg/mlで添加してHyTKを発現するサブクローンを選択した。次いで、これらの遺伝子改変サブクローンを、上述の急速拡大方法を用いて25cm2以上のフラスコにおいて急速に拡大させた。
これらの実験により、本明細書中に記載される方法に従って急速に拡大させた細胞を形質導入することにより、非常に効率的な形質導入を達成できることが明らかとなった。REMによって拡大させたＴ細胞クローンの細胞周期のＳ期に効率的に前進する能力が、Ｔ細胞クローン株がレトロウイルスベクターのようなベクターで形質導入される効率を大いに増強すると考えられる。
得られる遺伝子形質導入されたHIV（gag）特異的CTLを、以下の実施例に記載されるように、ヒトの養子免疫療法に用いた。
実施例19
遺伝子形質導入された抗原特異的CTLを用いる養子免疫療法
実施例18のように調製された遺伝子形質導入された抗原特異的CTLを、患者「RRM」において行われた養子移入実験で用いた。特に、クローンRRM56G6に由来する個々のHyTK形質導入HIV（gag）特異的サブクローンは、本明細書中に記載の培養方法で拡大され、そして２週間隔で行われる４回の注入で静脈内注入された。Ｔ細胞を、以下のように２週間隔の４つの用量で投与した：投与#1−１×108細胞／ｍ2；投与#2−3.3×108細胞／ｍ2；投与#3−１×109細胞／ｍ2；投与#4−3.3×109細胞／ｍ2。注入の前後の様々な時期に、実施例８に記載されるようにクロム放出アッセイを用いて末梢血のサンプルをハイグロマイシン耐性HIV（gag）で特異的CTLの存在について試験した。
特に、養子免疫療法の前（#1の前）、最初のＴ細胞注入の14日後（#1の14日後）、および２回目のＴ細胞注入の１日後（#2の１日後）に得られたPBLを、インビトロでUV不活性化vac/gag感染単球で刺激した。培養物を、６〜８日後に再刺激し、次いで２つのアリコートに分割し、そして低濃度のIL-2（２〜５U/ml）を含有する培地を補給した。培養物のアリコートの一方にはまた、300μg/mlの濃度のハイグロマイシンを入れた。インビトロでの拡大の後、これらの培養物由来のＴ細胞を数え、そして擬似感染、vac/gag感染、またはCMV gBを発現するコントロールvac組換え体感染のいずれかの自己およびMHC不適合標的細胞に対する細胞溶解活性についてアッセイした。MHC不適合標的に対する溶解活性は常に10％未満であった。これは示していない。データが示されるエフェクター対標的比は、10：１のＥ／Ｔを達成するには少なすぎる生存細胞しか数えられなかった#1の前＋Hygro培養物を除いて、10：１である。このエフェクターについて、培養物全体をアッセイした。
図15に示されるデータは、最初の注入の14日後および２回目の注入の1日後に得られたPBLから始められた培養物においてハイグロマイシン耐性gag特異的CTL活性が存続するのに対して、ハイグロマイシンＢの添加により妨げられる、#1の前の培養物における内在性gag特異的細胞溶解活性の存在を示す。移入された細胞の保持もまた、末梢血単核細胞から抽出されたDNAのPCRによって確認された。
これらの結果は、遺伝子改変され、次いで本発明の方法を用いて急速に拡大された抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の好結果の養子移入を示す。
Claims (17)
- インビトロで培養培地中において初期Ｔリンパ球集団を急速に拡大させる方法であって、以下の工程：
少なくとも１０4細胞を含む初期Ｔリンパ球集団をインビトロで培養培地に添加する工程；
非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィーダ細胞として、始めのＰＢＭＣ対Ｔリンパ球比が少なくとも４０：１となるように、該培養培地に添加する工程；
非分裂ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）をフィーダ細胞として該培養培地に添加する工程；
抗ＣＤ３モノクローナル抗体を該培養培地に添加する工程；および
該培養物をインキュベートする工程
を含み、それにより、抗原特異的でＭＨＣ−制限性のＴリンパ球の拡大された集団を生産することを特徴とする方法。 - 前記初期Ｔリンパ球集団が、少なくとも１種のヒトＣＤ８＋抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球を含む、請求項１に記載の急速拡大方法。
- 前記初期Ｔリンパ球集団が、少なくとも１種のヒトＣＤ４＋抗原特異的ヘルパーＴリンパ球を含む、請求項１に記載の急速拡大方法。
- 前記非分裂ＰＢＭＣフィーダ細胞が、γ線照射ＰＢＭＣフィーダ細胞を含む、請求項１に記載の急速拡大方法。
- ＰＢＭＣフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が、少なくとも２００：１である、請求項１に記載の急速拡大方法。
- ＰＢＭＣフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が、４００：１と８００：１の間である、請求項５に記載の急速拡大方法。
- ＬＣＬフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が、少なくとも１０：１である、請求項１に記載の急速拡大方法。
- ＬＣＬフィーダ細胞の初期Ｔリンパ球に対する比が、５０：１と２００：１の間である、請求項７に記載の急速拡大方法。
- 抗ＣＤ３モノクローナル抗体の濃度が、少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌである、請求項１に記載の急速拡大方法。
- 抗ＣＤ３モノクローナル抗体の濃度が、少なくとも１．０ｎｇ／ｍｌである。請求項９に記載の急速拡大方法。
- 前記培養培地にＩＬ−２を添加する工程をさらに包含する、請求項１に記載の急速拡大方法。
- ＩＬ−２の濃度が、少なくとも１０単位／ｍｌである、請求項１１に記載の急速拡大方法。
- 前記インキュベーションを少なくとも９日間続け、かつ前記培養培地にＩＬ−２を添加する工程を３〜５日の間隔毎に繰り返す、請求項１２に記載の急速拡大方法。
- ヒトＴ細胞に遺伝子形質導入する方法であって、以下の工程：
少なくとも１０4細胞を含む初期Ｔリンパ球集団をインビトロで培養培地に添加する工程；
非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィーダ細胞として、始めのＰＢＭＣ対Ｔリンパ球比が少なくとも４０：１となるように、該培養培地に添加する工程；
非分裂ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）をフィーダ細胞として該培養培地に添加する工程；
抗ＣＤ３モノクローナル抗体を該培養培地に添加する工程；
該培養培地にベクターを添加する工程；および
該培養物をインキュベートする工程
を含み、それにより、外因性サイトカインの除去によって可逆的に休止期になり、かつ、抗原特異的でＭＨＣ−制限性の形質導入されたＴリンパ球集団を生産することを特徴とする方法。 - 前記ベクターが、Ｔリンパ球を阻害する阻害化合物に対する耐性を付与する選択マーカーを含むレトロウイルスベクターであり、かつ以下の工程：
該レトロウイルスベクターの添加後に少なくとも１日、前記培養物のインキュベーションを継続する工程；および
該継続されたインキュベーション工程の後に前記培養培地に該阻害化合物を添加する工程；
をさらに包含する、請求項１４に記載の遺伝子形質導入方法。 - 前記レトロウイルスベクターが、ポジティブ選択マーカーおよびネガティブ選択マーカーの両方を含む、請求項１５に記載の遺伝子形質導入方法。
- 前記レトロウイルスベクターが、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子を融合遺伝子としてコードする、請求項１６に記載の遺伝子形質導入方法。
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