JPH02502424A

JPH02502424A - 抗原特異的ｔセルラインの調製法並びに治療のためのその使用

Info

Publication number: JPH02502424A
Application number: JP63502143A
Authority: JP
Inventors: リウ，ヤン‐ナン; ゲルツ，リチャード・シィー
Original assignee: ザ・チルドレンズ・ホスピタル，インコーポレイテッド
Priority date: 1987-03-11
Filing date: 1988-02-09
Publication date: 1990-08-09
Also published as: WO1988007077A1; KR890700659A; AU1363088A; EP0348413A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】抗原特異的Ｔセルラインの調製法並びに治療のためのその使用関連出願この出願は、１９８６年１１月２４日に出願された米国出願番号９３３．７８９号の一部継続出願である。

発明の背景ここに記載の発明は、ナショナル・インスティチニート・オブ・ヘルスの認可番号１−Ｐｏｌ−ＨＤ１９９３７−０１ＡＩの補助を哺乳動物の免疫応答反応に関係している物質およびその反応機序は完全に理解されている訳ではないが、免疫応答を取り扱う技術は、治療上、大きい可能性を持っている。このことは、正常な免疫応答の抑制に至る様な病態であって、従来の薬物療法による治療では容易に治癒しない病態の治療に於いて特に明らかである。この様な病態には、ある種のウィルス感染、および抗癌剤、自己免疫疾患の治療薬、および臓器移植後の拒絶反応を阻止するために用いられる薬物などの投与によって惹起される免疫抑制が含まれる。

免疫刺激に応答する能力は、基本的にはリンパ系の細胞にある。

胚の時期に幹細胞が発達し、それがい（つかの異なった道筋に沿って分化する。

例えば、幹細胞はリンパ系幹細胞となり、それが分化して少なくとも２種の別々のリンパ細胞群を形成する。１つの群は１９２８球と呼ばれ、細胞−仲介性の免疫におけるエフェクター物質であり、他方（３９７８球）は抗体−コントロール型の免疫、即ち、体液性免疫の１次エフェクターである。Ｂ細胞が抗体産生を行うための刺激は、抗原（Ａｇ）がＢ細胞の表面にある免疫グロブリンに付着することである。従って、Ｂ細胞の数は、宿主に於ける特異抗体（Ａｂ）の生産量に太き（影響している。時には、そしてまた抗原によっては、Ｂ細胞の有効な抗体産生にはＴ細胞の共働作用が必要である。

１９２８球群の中で、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、細菌、ウィルス、真菌およびその他の抗原に対する１次免疫認識および宿主の防御反応に関与する抗原−特異的細胞である。細胞毒性Ｔ細胞（Ｔｃ）は、病原体に感染した標的細胞を死滅させることができる抗原−特異的エフェクター細胞である。

ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は抗原特異的であるが、遊離の抗原を認識することはできない。この認識、およびそれに続＜Ｔｈ細胞の活性化と増殖が起こるためには、抗原が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラス■産物、または“白血球抗原”と共に、Ｔｈ細胞上のレセプターまたはレセプター複合体に提示されなければならない。即ち、一定の数のＴｈ細胞がオートロガス（自己由来）であるか、または宿主のＭＨＣによって発現される１またはそれ以上の制限的白血球抗原（ＬＡ）に対する特異性を共有するものでなければならないという意味で、Ｔｈ細胞の病原性抗原認識はＭＨＣクラスＤ“制限”である。

同様に、Ｔｃ細胞は、クラスＩ　　ＭＨＣＬＡとの協同作用により抗原を認識する。

Ｔｈ細胞の場合、この機能は制限された数の“抗原−提示細胞（抗原提供細胞） ”（ＡＰＣ）と呼ばれる特殊な細胞によって行われる。今日では、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）が、マクロファージの表面で発現されたクラスＩ［ＭＨＣＬＡと連結した、処理された可溶性抗原を認識することについては十分に確立されている。

最近、他の細胞型、例えば静止細胞および活性化Ｂ細胞、樹枝細胞、表皮のランゲルハンス細胞、およびヒト皮膚フィブロプラスト（ヒト皮膚線維芽細胞）などもＴ細胞に抗原を提示することが知られている。ヒトリンパ芽球様Ｂ細胞（ＬＣＬ）を形質転換したエプスタイン−バーウィルスは、異的Ｔ細胞に提示することがわかっている。もし、あるＴｈ細胞がＭＨＣ−クラスｎ　　ＬＡ−抗原複合体の認識を可能ならしめるレセプターまたはレセプター複合体を持っていたら、それは活性化され、増殖し、インターロイキン２（Ｉ　Ｌ−２）の様なリンホカインを産生ずる。リンホカインは、抗微生物作用および腫瘍死滅作用を発揮し得るＴｃ細胞やマクロファージを含む幾種類かの“キラー細胞”の増殖をうながす。

刺激がなくなった後、増加したＴｈ細胞の生き残りは記憶細胞として体内にとどまり、同じ抗原が提示された時には急速に増殖することができる。急性ウィルス感染からの回復に於けるＴ細胞の重要性は、ある種のウィルス、特Ｊこミクロウィルス（インフルエンザ）、ポックスウィルス（奇肢症およびワタシェア症）、アレナウイルス（リンパ球性脈絡髄膜炎ウィルス）について、よく解明されている。

宿主の安寧にとって免疫系の防御機構が重要であることはよく知られているにもかかられず、これらの物質の治療学的可能性は認識されていない。予備的な研究で、ローゼンバークらＥＳ　、　Ａ　、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｊ、Ｍｅｄ、＋３　１　３．１　４８５＋（１９８５）コは、あらかじめＩＬ−２と一緒にインキュベートしておいたオートロガス末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を、さらに追加のＩ　Ｌ−２と共に進行かんの患者に全身投与すると、治療された２５人の患者すべてにがんの退行が認められたことを報告している。ローゼンバーグらはインキユベートしたＰＢＬを“ リンホカイン−活性化キラー（ＬＡＫ）細胞”と名付け、それらは天然のキラー細胞や細胞毒性Ｔ細胞とは別個の細胞溶解系に属すると報告した。しかし、この治療法を用いたその後の研究では、この初期に得られた結果への見込みを確認できなかった。

この“獲得免疫療法”の試みが長期的にどのような結果に終わったとしても、ローゼンバーグらは、“この方法をヒトがんの治療に適用する場合における最大の困難は、全身治療に使用する上で充分な数の、抗腫瘍活性を有するオートロガスヒト細胞を産生ずることができないという点にある”と述べている。このことは感染症、がん、臓器移植または抗新生物薬等によって免疫が抑制されている患者において特に問題である。

同様に、ホモジーニアス（均質）なＴｃまたはＴｈ細胞群を単離して維持し、それらを抗原特異性およびＭＨＣ制限に関して特性化する試みが多くなされた。これらの試みには、通常、血清反応陽性のヒトまたは不ズミ宿主から得た単核細胞を、細菌またはウィルス製剤と非増殖性のＡＰＣ類、たとえば放射線処理したオートロガス単核細胞（ＭＮＣ）との混合物で刺激することが含まれる。ポリクローナル（多クローン性）のＴｈ細胞またＴｃ細胞群を限界希釈法でクローンしてホモジーニアス集団を得、さらに増殖させて様々な方法で特性化する。ローゼンバーグらの記載によると、クローン化ＬＡＫ細胞の場合、Ｔリンパ細胞のクローン化における主な障害の１つは、オートロガスまたはアロジェネイック（同種性（ａｌ　Ｉｏｇｅｎｅｉｃ））なＭＨＣＬＡ−適合ＭＮＣの入手、特に臨床対象由来のものの入手に制限があるという点である。

この問題を解決するために、オートロガスＭＮＣ以外のＡＰＣ類がＡＰＣとして用いられてきた。例えば、イセクツら［Ｔ、Ｉ　５ｓｅｋｕｔｚ、　　Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、、　　１λ９，１４４６（１９８２）］は］オートロガスエプスタインーバーウィルスＥＢＶ）−形質転換ＬＣＬセルライン（ライン）が、破傷風毒素反応性のポリクローナルＴ細胞またはＴ細胞クローンに破傷風毒素関連抗原を提示し得ることを初めて開示した。

カブラン博士ら［Ｄ、Ｒ，Ｋａｐｌａｎ、　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　８８＋１９３（１９８４）ＥはＡ型インフルエンザ免疫ドナー（供給体）から得た末梢血ＭＮＣの増殖による３種のＴｃｔｉｍｌ１ｍクローンの生産について報告している。それらクローンの１つは照射した、ウィルス感染オートロガスＭＮＣの存在下または照射した、感染エプスタイン−バーウィルス導入（形質転換した）アロジェネイックリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）の存在下で増殖した。

エルフェリンクらｌ：Ｂ、Ｇ、Ｅｌｆｅｒｉｎｋ、　　５ｃａｎｄ　Ｊ、　Ｉｔｒｍｕｎｏｌ、、　　２２．５８５（１９８５）］はオートロガスな、および同種性のエプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）−形質転換ＬＣＬセルラインがＭ。

化Ｔセルラインに提供し得ることを示した。その後、彼等は、Ｍ。

レプレ抗原のみを認識し得るＴ細胞クローンの単離についても報告した。このクローン化ではＡＰＣ類としてオートロガスＥＢＶ−４５質転換ＬＣＬを用いている。ＥＢＶ−形質転換ＬＣＬ使用の利点は、それが連続的かつ非制限的にＡＰＣの供給源になり得る点にある［ハーネンら（Ｊ、Ｂ、Ａ、Ｇ、Ｈａａｎｅｎ、　　５ｃａｎｄ、Ｊ、Ｔｍｍｕｎｏｌ、＋　　２：ｌ　　１０１（１９８６））コ。

ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）は大きい、種−特異的ヘルペスウィルス（ＤＮＡ　１．　５ｘ　１０”Ｄａ）であって、このグループの他のものと共通の潜在性および再活性化に関する性質を有する。ＨＣＭＶの基本的な潜在部位およびその再活性化に関連した分子的事象は不確実である。ＨｃＭｖｇ染および再活性化は無症状であるかもしれないが、免疫抑制患者の場合にはかなりの罹病率および死亡率を伴う。例えば、ＣＭＶは骨髄移植患者での日和見感染の最大の病因である。このような人々の８０％以上が現在の治療法によってもＨＣＭＶ肺炎により死亡している。

モノクローナル抗体療法は予防治療として役立つかもしれないが重篤なＨＣＭＶ感染症にかかった免疫抑制患者の生存はＨＣＭ　Ｖ特異的−細胞毒性Ｔ細胞の存在にかかっていることが示唆された。キナンら［Ｑｕｉｎｎａｎ、　　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｄ、、　　３０ユ、　　７（１９ｇ２ルは、これらの患者でのＨＣＭＶ特異的−細胞毒性Ｔ細胞応答には臨床上の回復とウィルス排出の停止が伴うが、細胞毒性応答のない活性な感染患者は一様に死亡することを示唆した。

ゲルッら［ＲｌＣ，Ｇｅｈｒｚ、Ｌａｎｃｅｔ、２，８４４（１９７７）コは先天性のＨＣＭＶ感染幼児は、ヘルパーＴ細胞の増殖における抗原−特異的欠損を有し、ＨＣＭＶ特異抗体の存在先；もかかわらず数箇月から数年間続く反復性（レプリケーティング）のウィルス感染症を伴うことを報告した。ＨＣＭＶ−特異的リンパ球増殖性応答を獲得するとウィルス排出が減少するようである。このように、ＨＣＭＶ　−特異的ヘルパーＴ細胞は、免疫受容性の宿主での該ウィルスに対する免疫欠損に対し、重要な役割を果たすと思われる。

再活性化ＨＣＭＶ感染症患者ではＨＣＭ　Ｖ抗原に対する抗体は防御的でなく、またはそれは適当なＴ細胞応答と連結してのみ有用である。末梢血中リンパ細胞（Ｐ　Ｂ　Ｌ）も、たとえそれが充分な量得られたとしても、治療剤としては有用でないようである。特定の抗原と反応性のヘルパーＴ細胞または細胞毒性Ｔ細胞の数は極めて少なく、従って、治療目的に十分な数を得るためには抗原−特異的Ｔ細胞のインビトロにおける選択的な拡張（増加）が必要である。

しかも、同種性ＰＢＬを治療的に投与するとＴ細胞の“外来”白血球抗原認識を活性化し、混合白血球培養反応を引き起こす可能性がある。この混合白血球培養反応は望ましくない非特異的免疫応答の活性化、または所望の抗原−特異的免疫応答を阻害し得るサプレッサー細胞の誘導をもたらし得る。

オートロガスまたは同種性抗原−特異的Ｔセルラインは混合白血球培養反応に関連する付随的な副作用なしに所望の治療活性を発現すると思われる。ポリシービッツ［Ｌ、　Ｋ、Ｂｏｒｙｓｉｅｔｉｃｚ、　　Ｅｕｒ、　Ｊ　。

Ｉ　ｍ＋ｎｕｎｏｌｏｇｙ、上３．８０４（１９８３）１らは血清陽性、巴者から得たＭＮＣをＩ　Ｌ−２の存在下で拡張増加（エキスパンション）させることによる短期間のポリクローナルＴｈセルラインの生成について報告している。ＭＮＣをオートロガスＨＣＭＶ−感染フイブロブラスト（線維芽細胞）上でコカルチャーするとポリクローナルＴｃ細胞が生成し、それはＨＣＭＶ−感染細胞を溶解した。

しかしながら、ＨＣＭＶ等のウィルスや他の病原体と関連した抗原に特異的なＴｈ細胞およびＴｃ細胞を多数、生成させて維持するための改良法が要求されている。さらに、生物学的活性が既知である抗原−特異的Ｔリンパ細胞を哺乳類対象に投与することからなる免疫療法もまた求められている。

本発明はＨＣＭＶ抗原のようなウィルス性抗原に特異的なホモージニアスヘルパーＴ細胞群（Ｔｈ）の効果的な製造を目的とするものである。本発明方法によれば最少量の抗原およびリンホカイン支持体を用い、該クローンの抗原特異性および機能的活性の両者を維持しながら、クローン化Ｔｈ細胞を生産する有効な方法の基礎が提供されると考えられる。このような観点から、本発明を最も広範囲にみた場合、本発明方法は（ａ）哺乳類ドナー（供与体）の血液から単核細胞（ＭＮＣ）群を単離し、ここに、ＭＮＣ群はウィルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞と、オートロガスで非増殖性の抗原−提示細胞を含有する、（ｂ）単離した該ＭＮＣ群と、その抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに十分な量のウィルス性抗原とを混合し、（Ｃ）該ヘルパーＴ細胞を、非増殖性のＭＮＣが生存性を消失するのに充分な期間、増殖させ、そして（ｄ）抗原−特異的ヘルパーＴ細胞を（ｉ）オートロガスＭＮＣ、アロジェネイックＭＭＣまたはその混合物；および（ｉｉ）オートロガスリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）、アロジェネイノクＬＣＬまたはその混合物、の混合物からなる非増殖性の抗原提供（提示）細胞の一定量；およびクローン化抗原−特異的ヘルパーＴ細胞を増殖させてホモジーニアスな集団を得るのに有効な量の該ウィルス性抗原の存在下、ただし、該ＬＣＬはＭＮＣによるヘルパーＴ細胞の増殖速度増大を越える増大を引き起こすのに有効な量存在するものとする、においてクローン増加させることからなる。

１−２週間を要するであろう選択的増殖工程（ｅ）の期間中に、工程（ｄ）の前に、さらにヘルパーＴ細胞を増殖させ、生存可能なウィルス抗原−特異的Ｔｈ細胞群の生産を促進するために追加量の該ウィルス抗原とオートロガスな非増殖性ＡＰＣを加えると有効であろう。工程（ｄ）においては、抗原特異的モノクローナルＴｈ細胞を限界希釈法、または顕微操作またはフローサイトメトリーによる単−細胞単離法によって導くことができる。

本発明には抗原−特異的Ｔｈ細胞の増殖が包含されており、従って、本発明はまた、ウィルス抗原に特異的なホモジーニアスヘルパーＴ細胞群を増殖させる方法であって、該同質ヘルパーＴ細胞群と、ヘルパーＴ細胞群の増殖に有効な量の抗原および非−増殖性抗原提示細胞（ＡＰＣ）混合物とを混合することかみなる方法を提供するものである。ここに該ＡＰＣ混合物は（ｉ）オートロガスまたはアロジェネイックリンバ芽球様細胞（ＬＣＬ）と（ｉｉ）オートロガスまたはアロ　　・ジェネイソク単核細胞（ＭＮＣ）からなり、ここに、ＬＣＬはＭＮＣによるヘルパーＴ細胞の増殖速度促進以上に促進するのに有効な量、存在するものとする。好ましくは、ＬＣＬはウィルスによる形質転換、ハイブリドーマ形成法等によって生産され得る連続的なリンパ芽球様セルラインから導く。ＡＰＣはＸ線照射、マイトマイシンＣ等の化学物質処理などの当業者既知の方法で非−増殖性にする。

非−増殖性のＭＮＣおよびＬＣＬはいずれも、それがＴｈ細胞と同じ宿主から導かれているか、１またはそれ以上のクラス■制限抗原（略語：“ＭＨＣＬＡ−適合″）を共有する同種のＭＮＣまたはＬＣしてある場合には、Ｔｈ細胞の増殖を引き起こすことが分かった。

驚くべきことには、ＬＣＬとＭＮＣとの混合物は共働的に抗原をＴｂ細胞に提供し、このようにして得られる増殖速度は、いずれかの型のＡＰＣを等量、単独使用した場合にもたらされる増殖速度より大きいことが分かった。

例えば、この効果はＡＰＣとして、ＥＢＶ−形質転換オートロガスＬＣＬおよびオートロガスＭＮＣの混合物を少なくとも１：１０の比率で用いた場合に、ＨＣＭＶ抗原のようなウィルス性抗原の例で観察された。Ｔｈ細胞と加えられるＬＣＬとの比率は約１：１−３であって、Ｔｈ細胞のＭＮＣに対する割合は約１：３ −１０であることが好ましい。

しかも、実質的なＴｂクローン拡張の増大を得るには限られた密度のＬＣＬが必要であるにすぎない。本発明方法のこの特徴は、限られた数のＭＮＣを用いて、比較的短期間にヒト抗原特異的Ｔｈクローンを多量に増加し得るので、実用性という観点から重要である。

例えば、本発明方法によれば、ＡＰＣとして１−２Ｘ１０’ＭＮＣおよび１ｘｌＱ＠ＬＣＬを用い、ＨＣＭＶ−特異的Ｔｈクローンを２週間で１−２Ｘ１０＠細胞から１０’細胞にまで拡張することができる。

Ｆ”）の存在下で本発明方法の増殖工程（ｃ）および／または（ｄ）を行うことが極めて好ましいことが分かった。

さらに本発明は初期増殖段階（上記工程ａ−ｃ）またはその後の拡張（増加）段階（上記の工程（ｄ））を該ウィルス抗原に特異的な一定量のモノクローナル抗体の存在下で行うことにより、ウィルス抗原−特異的Ｔｈ細胞の増殖速度を増大することに関する。本発明のこの側面に関する１つの実施態様では、ＨＣＭＶ血清−陽性哺乳類ドナー（供給体）の血液から単離したＭＮＣと、構造タンパク質等のＨＣＭＶ遺伝子産物上に存在する抗原に特異的なモノクローナル抗体とを混合することにより、ＨＣＭＶウィルス抗原に特異的なＴｈ細胞の増殖速度を増大した。モノクローナル抗体を、（ａ）増殖刺激有効量の該抗原と、（ｂＸｉ　）非増殖性ＭＮＣ１（ｉｉ）連続的なＬＣＬから誘導された非増殖性ＬＣＬ、および（ｉｉｉ　）それらの混合物、例えば、協同的相互作用によりＴｈ細胞の増殖速度をさらに増大し得る混合物、からなる群から選択されるオートロガス（自己由来）ＡＰＣの一定量と一緒に用いる。オートロガスな非増殖性抗原提供細胞はＸ−照射オートロガスＭＮＣ，Ｘ−照射エプスタインーバーウイルス（ＥＢＶ） −形質転換リンパ芽球様セルライン（ＬＣＬ）およびその混合物からなる群から選択されることが好ましい。これらは本発明方法の工程（ｂ）において、モノクローナル抗体および／またはＩ　Ｌ−２を用いて増殖速度を増大するか否かにかかわらず、ＡＰＣとして用いるのに好ましい。

本発明方法はまた、ＨＣＭＶ抗原に特異的なホモジーニアスな細胞毒性細胞群（Ｔｅ）を得る方法を提供するものである。この側面に関する本発明の態様は、（ａ’）哺乳類ドナー、好ましくはヒトの血液から単核細胞（ＭＮＣ）群を単離し、ここに、ＭＮＣ群は該ウィルス抗原に特異的なＴｃ細胞を含有する、（ｂｌ）単離した該ＭＮＣ群を、それぞれ該抗原に特異的なＴｃ細胞を増殖させるのに有効な量の、（ｉ）オートロガスで非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば放射されたＭＮＣ，（ｉｉ）該ＨＣＭＶ抗原、および（ｉｉｉ）インターロイキン−２（Ｉ　Ｌ−２）と混合し、（ｃｌ）該Ｔｃ細胞を非増殖性のＭＮＣが生存性を消失するのに有効な期間、増殖させ、そして（ｄｌ）該抗原−特異的Ｔｃ細胞を、それぞれ該クローン化Ｔｃ細胞の増殖に有効な量の（ｉ）非増殖性のオートロガスな抗原提示細胞、非増殖性のアロジェネイック抗原提示細胞またはその混合物、（ｉｉ）ＩＬ−２、および（ｉｉｉ）該ＨＣＭＶ抗原の存在下、クローン増殖（拡張）させて該ホモジーニアス細胞群を得ることからなる工程を含む。

工程（ｂ’）、（ｃｌ）または（ｄつは該Ｔｃ細胞の増殖速度を増加するよう作用するＨＣＭＶ抗原に特異的なモノクローナル抗体の存在下で行うことが好ましい。

抗原−特異的Ｔヘルパーセルラインに関して述べたように、特定のウィルス抗原に反応性のポリクローナルＴｃラインは所望の抗原を発現している標的細胞に対して細胞毒性を示すＴｃ芽細胞を連続的に刺激することによって増殖され得る。

単一の子孫Ｔ細胞から導かれたウィルス−特異的Ｔｃクローンのホモジーニアスな集団は工程（ｄｌ）の後、限界希釈法または顕微操作あるいはフローサイトメトリーによる単一細胞単離によって得ることができる。

このＴｃ細胞増殖法の他の好ましい態様には、（１）細胞−関連ウィルス抗原として全ＨＣＭＶウィルス抗原を使用するか、またはＨＣＭＶ感染オートロガスまたはアロジエネイックフイブロブラスト、例えばＨＣＭＶ即時型初期タンパ声質を使用する、（２）工程（Ｃ１）の間に該Ｔｃ細胞の増殖をもたらすためにウィルス抗原、■Ｌ−２およびオートロガスで非−増殖性ＡＰＣを追加する、そして（３）工程（ｂｌ）または（ｄｌ）の間にさらに連続的なオートロガスＭＮＣラインから導かれた非−増殖性ＭＮＣをも含有する抗原提供細胞を、オートロガスな単核抗原−提示細胞によるＴｃ細胞増殖速度の増大以上に増大させるに有効な量、用いることを含む。この連続的でオートロガスなＭＮＣラインはウィルスで形質転換されたＬＣＬ即ちＥＢＶで形質転換されたＬＣＬを含むことが好ましい。

本発明はまた、ウィルス抗原、例えばＨＣＭＶ抗原などの抗原に特異的なホモジーニアスＴｃ細胞群を増殖させる方法に関するものである。本発明方法は、該ホモジージアス細胞毒性Ｔ細胞群を、それぞれ該Ｔｃ細胞群を増殖させるのに有効な量の該抗原、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）混合物と混合することを含む。ここに、該ＡＰＣ混合物はアロジェネイックウイルスー形質転換リンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）およびアロジェネイック単核細胞（ＭＮＣ）を含有する。本発明方法はまた、該Ｔｃ細胞群と該細胞群の増殖速度を増大するよう作用する、該抗原のモノクローナル抗体の一定量とを混合することをも含む。

本明細書において、ウィルスまたは感染細胞など、病理学的標的に関して、“抗原”という語句はポリペプチド、ポリペプチド複合体、グリコプロティン、核酸等、免疫応答を惹起する物質を指す。病理学的標的抗原はウィルスのエンベロープグリフプロティンのような病理学的標的そのものの一部であってもよく、または新生物組織またはウィルス感染細胞等の病んだ組織が発現する抗原であってもよい。“抗原−特異的”Ｔリンパ細胞は抗原提供（提示）細胞（ＡＰＣ）により、−個の抗原が、抗原提供細胞が産生ずる白血球抗原（Ｌ　Ａ）と−緒に提供されると、該抗原の存在下で活性化される。抗原−特異的Ｔｈ細胞は、それが特異性を有する抗原が、Ｔｈ細胞が特異性を有する白血球抗原を産生ずるＡＰＣによってＴｈ細胞に提供されると、その抗原の存在下、適当な培地中で増殖するであろう。上記したように、ヒトヘルパーＴ細胞の場合、特異的な白血球抗原はヒトＭＨＣクラス■抗原であり、ヒト細胞毒性Ｔ細胞はＭＨＣクラスＩ抗原に特異的である。

Ｃ，ＨＣＭＶ抗原−特異的Ｔセルライン本発明の好ましい態様は、ホモジーニアスＴｃおよびＴ　ｈ細胞Ｒ１およびその製造方法に関する。ここに、ある細胞群はＨＣＭＶ抗原に特異的である。

Ｔ細胞またはＴ細胞クローンが抗原−特異的であるという場合、抗原を含有する組成物は特定されるかもしれないが、抗原性組成物のエピトープ、または特定の抗原性部位は必ずしも明らかでない。

例えば、３個の異なるホモジーニアスなＴヘルパーリンパ細胞群が一個の特定のＨＣＭＶ構造タンパク質またはグリコプロティンに特異的であることもある。これらはいずれも同一の抗原に応答し、従って同じ抗原特異性を有するが、分子下（サブモレキニラー）レベルで　・は別々の抗原領域またはエピトープと反応するという意味で異なる特異性を有するかもしれない。この文脈から、異なるＨＣＭＶ−特異的Ｔリンパ細胞は、それらが同じＨＣＭＶ関連抗原の同じエピトープを認識する限り、同一の分子下−特異性を有するものである。

しかしながら、抗原が、ＡＰＣが様々な場合に提示されるように複数のエピトープを有するとすれば、それらは、同一の抗原に特異的であり得る。

例えば、ＨＣＭＶのＤＮＡゲノムは後の初期遺伝子の発現に必要な調節タンパク質をコードする即時−初期遺伝子の制限的転写で開始される、一連の順番で転写される。主な即時−初期遺伝子（Ｉ−Ｅｌ）は感染細胞の細胞表面で、感染後６ −２４時間後に発現される６８＋Ｉ）の調節タンパク質をコードしている。ＨＣＭＶ−特異的細胞毒性Ｔ細胞はその免疫監視における役割の一つとして、潜在的ＨＣＭＶの再活性化を防ぐために、この即時−初期タンパク質を優先的に認識すると考えられている。

ＤＮＡ合成の開始に先立って初期遺伝子が転写される。初期遺伝子の産物にはＤＮＡの転写に必要なウィルス−特異的ポリメラーゼおよびキナーゼが含まれる。

これらの酵素は免疫応答には重要な役割を演じていないと思われる。

しかしながら、後期ＨＣＭＶ遺伝子は様々な免疫原性構造タンパク質およびグリコプロティンをコードしている。これらには、ウィルスの核カプシドと外部エンベロープとを結合する、ジスルフィド−架橋エンベロープグリコベブチド複合体、非グリコシリル化エンベロープタンパク質、外被グリコプロティン：およびウィルスの内部カプシド構造を形成するマトリクスタンパク質が含まれる。

米国特許第９３３，７８９号（１９８６年１１月２４日出願）には多くの免疫原性構造グリコペプチド複合体およびＨＣＭＶエンベロープフラクションから還元されたグリコペプチドの精製および特性化が、それに特異的なモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）と共に、完全に開示されている。この特許出願に記載されている主なグリコペプチドおよびグリコペプチド複合体、並びにＭｏＡｂを以下の表１に示す。

第１表ＭｏＡｂによって免疫沈澱されたＨＣＭＶ表面グリコペプチド複合体およびグリコペプチド＊これらの物質を精製全ウィルス製品（″全ＨＣＭＶ抗原”と命名、以下の実施例１参照）から得るために用いた洗浄剤抽出、ＨＰＬＣ１還元、免疫沈降および電気泳動からなる方法はすべてカリらによって報告されたものである［Ｂ、Ｋａｒｉ、　　Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ＋　　６０゜３４５（１９８６）コ。

＋これらのＭｏＡｂを産生ずるハイブリドーマはインビトロ・インターナショナル、Ｌｉｎｔｈｉｃｕ＋ｍ　　ＭＤに、下記アクセスコードの下で寄託されている：Ｈｂ２−２９−９８７（”９Ｂ７”）＝ＩＶＩ−１０１１７；Ｈｂ２−１５ −９Ｅ１０（“９Ｅ１０”）＝ＩＶＩ−１０１１８；Ｈｂｌ−４８−４１Ｃ２（ “４１Ｃ２）＝ＩＶＩ−１０１１９゜ ÷＋ｇｐＡ、＊＊ｇｐＢ、＊＊＊ｇｐＣ表１記載の免疫原性グリコペプチド複表体記載びグリコペプチドはＨＣＭＶ血清陽性ドナーから得た血液から導かれたＴｂ細胞の増殖を選択的に刺激するのに有用である。同様に、既知の結合特異性を有するモノクローナル抗体、例えば９Ｅ１０．４１Ｃ２および９Ｂ７等はウィルス抗原の精製に有用である。これらのモノクローナル抗体を用いてＴｈ細胞クローンの抗原認識を増大し、そのことによって限られたウィルス抗原の存在下での増加を促進することができる。

Ｉｌ、　Ｔセルラインによる免疫治療Ｔ細胞の種々のＨＣＭＶタンパク質に対する認識はＴセルラインを用いる適当な免疫治療コースの計画に重要である。本明細書に例示したＴｈ細胞は主としてＨＣＭ　Ｖの構造タンパク質を認識する。

従って、それらは、細胞不含ウィルス（即ち、急性ウィルス血症の場合）の認識に重要と思われる。マウスおよびヒトでのデータは、ある種の細胞毒性Ｔ細胞が感染細胞の表面で発現される即時−初期タンパク質を認識することを示している。これらのタンパク質はウィルス遺伝子が宿主細胞によって発現された後にのみ、産生されるので、そのようなＴｃ細胞は潜在性ＨＣＭＶの再活性化の阻止に重要であり、予防および特異的ＨＣＭＶ治療の両方法での投与が示唆好ましいＴセルラインはヒトＬＡ産物と一緒になってウィルス抗原を認識する。従って、治療用Ｔ細胞はオートロガスであるか患者によって発現される制限的特異性の１またはそれ以上が共通するものでなければならない。治療のために単離したＴ細胞を個体に移すという関係から、アロジェ不イソク細胞は受容体と同じ種のドナー個体から得られた細胞であって、受容体が発現する抗原の適当なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスに適合する主要組織適合複合体である（略語、“ＬＡ−適合ＭＨＣ”。従って、慢性ＨＣＭＶ疾患のような病理学的感染症患者を治療する際には、後にＴ細胞を再投与して治療するためにオートロガス抗原−特異的Ｔセルラインをインビトロで増殖させることができる。または生命にかかわる急性感染症の治療のためにＴ細胞クローン製剤を迅速に得ることが重要である場合には増殖させた既知のウィルス抗原−特異的および／またはＨＬＡ型の治療用アロジェネイックＴ細胞を予備−増殖させ、複数回投与することができる。この方法は免疫抑制下の患者の治療において特に重要である。

従って、本発明はまた、１９２８球（Ｔ細胞）を用いてＨＣＭＶ感染症など、ウィルス感染症に罹患しているヒト患者等、哺乳類を治療する方法を提供するものである。本発明方法は、該感染症哺乳類を、ウィルス感染に対する増大した免疫反応を引き出すのに有効な量のホモジーニアスな、クローン増殖したウィルス抗原−特異的Ｔ細胞群で治療することからなる。ここに、該Ｔ細胞群は（ａ）少なくとも一個の該哺乳類の抗原提供細胞（ＡＰＣ）の細胞表面に存在する白血球抗原（Ｌ　Ａ）、および（ｂ）該ウィルス抗原に特異的である。

好ましくは、該クローン増殖したＴ細胞群は基本的にＴｈ細胞とＴｃ細胞からなる。上記のごとく、（ａ）種々の感染段階で発現される抗原を認識する免疫系を促進し、かつ／または（ｂ）有効な数の全Ｔ細胞群が受容体にとってＭＨＣ−適合することを保証するために、ホモジーニアスな、クローン−増殖したウィルス抗原−特異的Ｔ細胞群を複数（または“バンク″）投与することがしばしば好ましい。

従って、本発明のＴ細胞免疫療法は、Ｔ細胞群を複数投与することからなり、ここに、Ｔ細胞群は（ａ）該ウィルスの種々の複数抗原、および（ｂ）該哺乳類のＡＰＣの表面に存在する少なくとも一個のＬＡに特異性を有する。さらに、本発明方法は、Ｔ細胞群を複数投与することを含んでいてもよく、各投与は（ａ）該ウィルスの少なくとも一個の抗原、および（ｂ）該哺乳類の単一種の様々なアロタイプのＡＰＣ表面に存在する複数の異なるＬＡ、ここに少な（とも−個のＬＡは該哺乳数とＬＡ−制限−適合である、に特異性を有するＴ細胞を含むものである。

Ｔ細胞クローンと同様、ポリクローナルラインは有意な治療可能性を有するかもしれない。抗原−特異的ポリクローナルＴセルラインはＴ細胞供与体によって発現される全ての制限ＭＨＣＬＡ全全部一緒に標的ウィルス抗原を認識することができるＴｈおよび／またはＴｅ細胞を含有するという点で特に有利である。単一のプロジェンターＴ細胞から導かれたウィルス−特異的ＴｈおよびＴｃクローンの利点は、それらが既知の抗原−特異性、機能活性、およびＭＨＣＬＡ−制限特異性を有するホモジーニアスな細胞群であるという点にある。従って、一群の細胞すべてが同じ機能活性を表すので、それらは最大の治療効果を発揮すると思われる。実際的な観点からは、モノクローナルＴ細胞を用いるなるば、独立したＴ細胞群から導かれた、より大きい“バンク”が必要である。

本発明方法によれば治療有効量のＴｈ細胞および／またはＴｃ細胞を投与することができるので、罹患している吐乳類を同時に異種のリンホカイン類、例えばＩＬ−２（ＴＣＧＦ）で治療することができ′る（必ずしも必要ではないが）。Ｉ　Ｌ−２の大量投与は患者によっては副作用を伴うので、Ｉ　Ｌ−２を用いずに免疫応答を促進し得ることはＴ細胞療法の効果の実質的な進歩をもたらすものである。

本発明方法によって生産され、上記のＴ細胞“バンク”の製造に用い得る代表的な集団である抗原−特異的Ｔセルラインの例を以下の表２に示す。

ｂ）ポリクローナルＣ）即時−初期タンパク質（６８ｋＤ）、ｄ）　Ｄｒａｆｔ　Ｐａｔｅｎｔ　ａｎｄ　Ｔｒａｄｅｍａｒｋ　０ｆｆｉｃｅ　Ｄｅｐｏｓｉｔ　Ｐｏ１ｉｃｙｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、　ＢＮＡ　ＰＣＴＪ、　３２．　９０（１９８６）に基づいて、Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　　Ｌｉｔｈｉｃｕ＋ｎ。

ＭＤに寄託本発明は、主に、ウィルス抗原に対して特異的であるＴｈおよびＴｃ細胞の製造、およびこれらＴ細胞の均質（ホモジニアス）な個体群によるウィルス感染症の治療について説明している。しかし、種々の病理学的標的（病理的標本）における抗原に対して特異的であるＴｈおよびＴｃ細胞のホモジニアスな個体群は本発明方法を用いて製造することができ、これらの個体群は種々の病原体または病理的標的に対する免疫応答を増大または刺激するのに効果的であると思われる。

広く定義すると、病理的標的とは、哺乳動物宿主の健康と幸福をおびやかす疾病の原因または結果である、哺乳動物体内に存在するもの（独立体）である。この標的はウィルス、バクテリア、真菌のように宿主に対して外来性の独立体であってもよく、またはウィルス感染細胞、腫瘍細胞のような疾病または病理的症状の産物であってもよい。本発明の治療の詳細な具体例において、治療の病理的標的は、しばしば、２次感染であり、この２次感染は、第１の疾病が２次感染に対して免疫的に応答し得る受容体の能力を弱めるので、意図された受容体にとってさらに危険である。第１の疾病の多くの態様は、意図された受容体の２次感染に対する免疫応答を弱めるので、治療は受容体の免疫系の態様を抑制するように作用する。このような治療としては、放射線治療法、化学療法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

主に、本発明の治療法では、ＭＨＣＬＡ−適合性である同一種の個体から得たアロジェネイックな（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）　Ｔ細胞を用いることができる。これによって、医師および薬剤師は、患者を処置するためにアロジェネイックなＴ細胞の予め製剤化された投与形態（投与剤）を単に用いることができる。適合しないＴ細胞は単に患者を助ける効果がないだけであるので、投与は、適合して患者を助けるものもあれば、適合せずに患者を助けないものもある、多くの細胞を含んでいてよい。

このように、アロジェネイックな治療細胞によって発現した１またはそれ以上のＬＡを有する多くの患者を治療するために単一の投与剤を用いることができる。

さらに、投与剤は、異なるＭＨＣクラス制限を有するＴｃおよびＴｈの両細胞を含有することができる。明らかに、このような治療法は、−件一件に基づいて投与剤を調製する必要がない。このことは、スケールの効果を考慮してＴ細胞を大きい培養培地中で増殖させ得ることを意味している。さらに、細胞は、個別回収、白血球除去（１ｅｕｋａｐｈｅｒｅｓ　ｉｓ）および培養を必要とせずに、すぐに入手することができる。

しかしながら、前述の長所にもかかわらず、本発明の新規な免疫療法における最も有望な特徴は、各投与が抗原特異性Ｔ細胞を含有しているであろうという予想である。これは、細胞毒性細胞の非特異的増強のみをもたらすローゼンバーグ等（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、）（７）方法を越えた実質的な進歩性を意味する。本発明方法においては、投与形態は、個々の病原体の全てと関連する種々の抗原に対して特異的であるアロジェネイックなＴｈおよびＴｃ細胞を含有する投与剤を提供することができる。すなわち、単位投与剤は、個々に培養されて混合された多くのＴｈおよびＴｃ細胞クローンを含み得る。投与形態は予め選択された多くのＬＡ制限および予め選択された多くの抗原特異性を有するＴｈおよびＴｃ細胞を含有することができる。特定の病原体が、種々の抗原において１０または２０の既知のエビ）　−プを発現することが構造的にまたは他の点で知られている場合、投与剤は各々に対して特異性を有する適当なＴ細胞を含有することが中、治療上有効量のオートロガスなまたはアロジェ不イックなＴ細胞を非経口投与することを含んでいる。このようなプロトコルは、投薬あたり投与される細胞の数量外は、ローゼンバーグ等［Ｓ、　Ａ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１３．１４８５　（１９８５）］によって提供されるものであり、臨床医によって決定された因子、治療に基づく病理学、患者の体型および身体的な状態ならびに他の因子によって投与される投薬の量は幅広く変わるであろう。しかし、本発明の増強された増殖性効果によって、ローゼンバーグ等（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｔ　ａｌ、）の方法によって必要とされるものと比べて、実質的に患者からＭＮＣをあまり多く取り出さず、また実質的に患者にさらに多くのオートロガスな抗原特異性Ｔ細胞を戻すことができる。

発明の詳細な説明以下に詳細な実施例を挙げて、本発明をさらに説明する。

寒鬼ガニ１、ヱヱ土五込亙Ω里曙１０％ウシ胎児血清を加えたダルベツコ修飾イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｅｃｏ’ 　ｓ　ＭｏｄＨｉｅｄ　ｅａｇｌｅ’　ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ、　Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｎ　）において増殖されたヒト１次フィブロブラスト培養物を、１〜５の感染多重度（Ｍｏｌ）でタウン（Ｔｏ％ｎｅ）菌株ＨＣＭＶによって感染させた。以下に記載の実験のある種のものについては、感染後３〜４日目に、マーカーとして［３Ｈ］グルコサミン［５μＣｉ／好、２２Ｃｉ／ｉＭ、アマ−ジャム（Ａｉｅｒｓｈａｍ）、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｅｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ］または［３ＩＩＳコメチオニン［５μｃｉ／ｚＱ、１０９　Ｃｉ／ｘＭ、デュポン／　ＮＥＷ（ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮ）、ＢｏｓｔｏｎｓＭＡコを以後の精製中に加えた。

７５００ｘｇで２０分間低速遠心分離して、培地から細胞および細胞残骸（Ｃｅｌｌｕｒａ　ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。４８．２００ｘｙで１時間遠心分離して、上澄み液からウィルスを集めた。トリス（Ｔｒｉｓ）　ＮａＣｒｌｆｌ＆？１’ｔｉ＆　（５０ｘＭ　トリスヒドロキシメチルアミノ　メタン−ＨＣ１２゜ｐＨ７，４、および１５０　ｘＭ　Ｎ　ａＣ□中に、ウィルスノヘレットを再懸濁させ、同一の緩衝液で調製された２０〜６０％スクロース勾配液（シ１糖勾配液）で積層させた。１３１．３００Ｘ９で１時間、速度沈降を行った。勾配液を回収し、２８０ｎｍでの光学密度を監視した。４３％スクロースでバンドされた光学密度の主要ピークを集めた。これらの分画をＴｒｉｓ　ＮａＣＱ緩衝液で希釈し、１３１，３００×９で２時間遠心分離してウィルスを回収した。この精製された全ウィルス調製物を「全ＨＣＭＶ抗原（Ｗｈｏｌｅ　ＨＣＭＶ　Ａｎｔｉｇｅｎ）Ｊと命名した。

膜成分を可溶化するために、全ＨＣＭＶ抗原調製物を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　　１００（ＴＸ−１００）を含有するＴＮ緩衝液［Ｔ　ｒｉｓ−Ｎ　ａＣ（１緩衝液（５０ｘＭ　Ｔｒｉｓ塩酸塩、ｐＨ７，５、ｌＱｚＭ　ＮａＣｐ、２ｉＭフェニルメチルスルホニルフルオライド）１２〜４１（ｌに懸濁させた。

室温で６０分間インキュベートした後、この溶液を１２０，０００りで６０分間、速度帯状（ｒａｔｅ　ｚｏｎａｌ）遠心分離にかけて２０〜６０％スクロース勾配液で積層した。ＴＸ−１００可溶化物質は勾配液の頂上に残存し、一方、ＨＣＭＶヌクレオカプシドは速度沈降によってバンドされた。また、１．０％ノニデノト（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４０［Ｎ　Ｐ−４０１ジクｖ−ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）コを用いて、タウン菌株ＨＣＭＶの洗浄剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）抽出物を調製した。この方法で、１％ＮＰ−４０を含有するＴＮ緩衝液３〜５ｉｆｆに、精製した全ＨＣＭ　Ｖ抗原１０〜１５１９を懸濁した。洗浄剤−ウィルス懸濁液を室温で１時間撹拌した。１時間高速遠心分離にかけることによって、抽出したプロティンを不溶性プロティンと分離した。これらの方法のいずれかによって得られた抽出物をｒＨｃＭＶ洗浄剤抽出物」と命名した。

ＨＣＭＶ特異性ヘルパーＴ細胞は、全ＨＣＭ　Ｖ抗原調製物内に含有されるＨＣＭＶプロティンおよびグリコプロティンを認識すると思われるが、ＨＣＭＶＩ％異性細胞毒性Ｔ細胞は、主に、感染した細胞の表面に発現された、ＨＣＭＶをコードするプロティンを認識する。特に、感染から６〜２４時間以内に細胞膜上に発現する主要な即時−初期（１−Ｅ　］）プロティンは、ＨＣＭＶ特異性細胞毒性丁細胞の増殖において重要であると思われる。

したがって、Ｔ細胞ドナーによって認識されるｌまたはそれ以上のクラスＩ白血球抗原を有するオートロガスなフィブロブラストまたはアロジェネイックなフィブロブラストを、感染多重度５〜１０で３時間、タウン菌株ＨＣＭＶで感染させた。場合によっては、細胞をシクロへキサミド（５０μｇ／ｘ（１”）の存在下で感染させた。シクロへキサミドの除去後、アクチノマイシンＤ（５μ９／峠）を添加して、ＤＮＡ転写をさらに予防し、それによって、ＨＣＭＶのＩ−Ｅ遺伝子の選択的発現を許す。シクロへキサミドおよびアクチノマイシンＤで処理しなかった感染されたフィブロブラストは、ＨＣＭＶの！−Ｅおよび後期遺伝子産物の両者を発現した。これらの調製物を「細胞関連ウィルス抗原（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｖｉｒａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ）Ｊと命名した。　ゲールツ等［Ｒ，Ｃ，Ｇｅｈｒｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　２．８４４　（１９７７）ｌによる開示に従って、単純ヘルペスウィルスｌ型（ＨＳＶ−７）を部分的に精製し、５６°Ｃで１時間熱不活化させてｒＨ５Ｖ抗原」を得た。

ＨＳ）を補充したＲＰＭＩ　　１６４０培地中に懸濁させた熱不活化全ＨＣＭＶ抗原（５６℃、１時間）１０μｇで１×ｌＯ＠ＭＮＣ／Ｍ１２の濃度の単核細胞（ＭＮＣ）１０Ｘ　１０・を刺激することによりて２５ｃＨｅの直立細胞培養フラスコ中でＨＣＭＶ特異性Ｔ細胞ブラストを調製した。７〜１０日後に、５％ｃｏ、雰囲気下、３７℃でＨＣＭＶ特異性ブラストをざらにバルク培養中で増殖するか、または、供給細胞としてのＸ線照射（５，ＯＯＯＲ）されたオートロガスなＭＮＣ（ＭＮ　Ｃ１−１）、１　μｇ　／ｇｆｆ（Ｔ　ｈ細胞膜：対し　７）ノ濃１ｔ＋７）全ＨＣＭ　Ｖ抗原、または１：２０のフィブロブラスト：ＭＮＣ割合（Ｔｃ細胞に対して）の細胞関連抗原、および１０〜２０％インターロイキン−２（Ｉ　Ｌ−２）［ＴＣＧＦ、ビオテスト（Ｂｉｏｔｅｓｔ）、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、　Ｇｅｒｍａｎｙ］の存在下、０．３細胞／ウエルで、９６ウ工ルＵ字底組織培養プレートにおける限界希釈によってクローン化した。その後、３〜４日毎、新鮮なＩＬ−２含有培地で細胞を再培養した。７〜１４日毎、この培増殖細胞を増殖し、９６ウエル平底細胞培養プレートに移した。

次いで、さらに増殖させるために増殖細胞を２４ウエルプレートに移し、次に大規模に生産するために２５０１細胞培養フラスコに再度接種した。増殖したクローンは第２限界希釈によってサブクローン化し、確実にクローン化した。４つの異なるＨＣＭＶ血清反応陽性（ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）ドナーからクローンを増殖させ、１００以上の個々のＴセルラインを得た。

２、ＨＣＭＶ−ＴｈおよびＴｃセルラインおよびクローンの特性付は以下の実施例において用いるＴｈおよびＴｅラインおよびクローンの全てを、表現型、増殖性応答、ＩＬ−２産生および細胞毒性活性について以下のように特性付けた。

Ａ９塁勇里公訴モノクローナル抗体０ＫＴ３（全Ｔ細胞）、０ＫＴ４（ヘルパー／インデニーサーＴ細胞）、および０ＫＴ８（細胞毒性／サプレッサーＴ細胞）［オルソ・ファーマシューティヵルズ・インコーホレーテッド（Ｏｒｔｈｏ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、）、Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ３を用いて、間接免疫蛍光測定法によってＣＤ表現型決定因子の発現についてＴセルラインを分析した。

ザイス（Ｚｅｉｓｓ）蛍光顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡検査法またはＥＰＩＣ３５ｐｃｅｌｌ　５４１［コールタ−・コーポレイション（Ｃｏｕｎｔｅｒ　Ｃｏｒｐ、）、Ｈｉａｌｅａｈ、　ＦＬ３を用いた流量血球計算法（ｆｌＯｗｅｙｔｏｍｅｔｒｙ）によって蛍光を検出した。ポリクローナルＴｈラインは優先的にＣＤ３＋４÷８−であり、Ｔｈクローンの全てはＣＤ３−）−４−８−表現型を表した。Ｔｃラインは優先的にＣＤ３＋４−８−！−であり、ＴｃクローンはＣＤ３＋４−８＋であった。

Ｂ、リンパ球増殖性ＴＣＧＦの非存在下、−晩、Ｔセルラインおよびクローンを組織培養培地中に静置し、次いで全ＨＣＭＶ抗原またはＨＳＶ抗原のいずれかで７２時間再刺激してＴｈクローンの増殖性応答の特異性を決定した。Ｔｈラインおよびクローンの全てがＨＣＭＶに対して陽性の増殖性応答を示したが、ＨＳＶに対する応答は組織培養培地バックグランド対照と同じであった。すなわち、Ｔｈラインおよびクローンの全てはＨＣＭＶ特異性であった。Ｔｃ細胞クローンはＩＬ−２の非存在下でＨＣＭＶ抗原に対してあまり増殖しなかった。

Ｃ，インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生全ＨＣＭＶ抗原でＴｈクローンを刺激し、上澄み液を２４時時間和集め、ネズミのＣＴＬＬ−２０（Ｉ　Ｌ−２依存性）セルラインを用いてＩＬ−２活性について検査した。ＣＴＬＬ−２０の生存および増殖によって示されるように、Ｔｂクローンの全てがＴ　Ｌ−２を産生ずることがわかった。ＴｃクローンはＩＬ−２生産に関して試験しなかった。

Ｄ、細胞毒性活性ＮＫＩ的セルライン、Ｋ５６２、標的細胞としてのオートロガスな未感染のフィブロブラストならびにＣＭＶ−および）ｉｓｖ−ｇ染フィブロブラストに対する細胞毒性活性について、Ｔｈクローンの全てを試験した。ＮＫまたはウィルス特異性細胞毒性活性は、いかなるＴｈクローンを用いても観察されなかった。

ＮＫ標的セルライン、Ｋ５６２、標的細胞としてのオートロガスな未感染フィブロブラストおよび不適合または部分適合アロジェネイックな未感染フィブロブラストならびにＨＣＭＶ−１Ｈ５Ｖ−１およびインフルエンザ−感染フィブロブラストに対する細胞毒性活性について、Ｔｃクローンの全てを試験した。抗ＮＫ活性はいかなるＴｃクローンでも観察されなかった。ＨＣＭＶ特異性Ｔｃクローンの全てがオートロガスなおよびＭＨＣＬＡ−適合ＨＣＭＶ感染フィブロブラストに対して細胞毒性活性を示したが、アロジェネイックな不適合ＨＣＭＶ感染フ感染フィブロブラストては細胞毒性活性を示さなかった。ＨＳＶまたはインフルエンザウィルスで感染されたいかなる標的細胞についても、細胞毒性活性は観察されなかった。すなわち、本明細書に記載のＴｃクローンはＭＨＣクラスｌ抗原によつて制限されたＨＣＭＶ特異性細胞毒性活性を示し、したがって、ウィルス特異性細胞毒性Ｔ細胞の特性を示す。

実施例ｍＨＣＭＶ抗原に対するＨＣＭＶ特異性Ｔｈクローンの増殖性応答ドナーＷＲＣから得た１７のＨＣＭＶ−Ｔｈクローンを、表現型、増殖性応答、ＩＬ−２産生および細胞毒性活性について広範囲に特性付けた。クローン全てがＣＤ３÷４÷８ −であり、ＨＣＭＶに対して増殖性であるがＨＳＶに対して増殖性でなく（上記実施例■（２）に記載したとおり）、ＨＳＶではなくＨＣＭＶで刺激すると全てがＩ　Ｌ−２を産生じ、細胞毒性活性を示さなかった。全てのクローンも、抗クラスｎモノクローナル抗体でブロックすることによって決定されたクラスＩＩＭＨＣ制限特異性、およびＤＲ，ＤＱまたはＤＰと関連して発現した適切なり警制限決定因子を有する細胞を提供するオートロガスなまたはアロジエネイックな抗原によって提供された全ＨＣＭＶ抗原に対して活性を示した。

精製されたＨＣＭＶ抗原に対するＴ細胞反応性の研究に関して、３日目の再刺激培養に、抗原提供細胞供給源として、Ｘ線照射されたオートロガスな単核細胞を加えた。培養の最後の１６時間に、ウェルあたり１μＣｉのトリチウム標識チミジンを加えた。培養をガラス繊維フィルターで回収し、液体シンチレーション分光計で計数した。これらの検査の結果を下記第３表に示す。

第３表全ＨＣＭＶ抗原、ＨＣＭＶ洗浄剤抽出物（エンベロープグリコプロティン）、洗浄剤抽出物からの沈澱物（内部プロティン）、およびＨＰＬＣ精製したＨＣＭＶグリコグリコプロティンるＨＣＭＶ特異性Ｔｈクローンの反応性ＨＣＭＶ−Ｔｈクローンの増殖性応答［１分あたりの計数（ＣＰＭ）コクローン＋ＭＮＣ””　＋　ＣＭＶ抗原クトり　　　　　ＢＣＭＶ　　タウンクローン　　クローン　　十　全）ＩＣＭＶ　　洗浄剤カプシド　Ｉ’１ＰＬＣＩＩＰＬＣＨＰＬＣＷＲＣ−Ｔ２：６９　９８　　１１７　７３，２ｇ２　４，８５５　６．１８６　　１７８　　１４２　　１６１ＶＲＣ−Ｔ３：３　　６７　１．０１１　５５，０８０　９．３１１　３，３５５　１．１９４　１９，７０６　２５，３８７ＷＲＣ−Ｔ３：４　１１１　　４７５　５１．１８５　１５．６３２　１，５８０　　１６３　　３６５　　１５５ＩＲＣ−７３ｇ１６　８７　　１４２１２１，０３０　４．５５３　　１５４　　１４２　　３０８　　１５５Ｗｌ’ＩＣ−Ｌ６　　１１４　　１４２６３，８６７　５．６６９　４．４３３　　２１３　　１１８　　４２７ＶＲＣ−Ｌ７　　　　　２４１　　１．０フ９　　７０，４８４　　２９．１３１　　　７．４３９　　　２．３３ｇ　　　　　　５８５　@　　　５２０ＷＲＣ−Ｌ８　　１２４　　１５０３３，９７７１０，１２０　２．７４２　　８００　　１８９　　２０４ＷＩｌｔＣ−ＬＩＯ３２５９８１７０，７７３３２，５６９１０，３０７１０，３２１７４，９０２３１，０６３１１１Ｃ−Ｌｉ２　　２１７　　３１５　６８，５５ｇ　　３９，８０５　３，１５８　　３８９　１，０７３　　２７７ＷＲＣ−Ｌ２５　　３９９　　６４ｇ９．８４７３Ｂ、１４９　７．９９４　　６１４　　６７８　　３３０ＷＲＣ−Ｌ４３　　１ｇ１　　６７０１０２．７＋１１７　１６．７２２　１６．３ｇ９　　４０４　　４９６　１，４９５ＷＲＣ−Ｔｌ：８　　４Ｂ　　１，８３４　２０，２９７　３３，７３６　１５，６４１　　２２９　　１７２　　２９９Ｉｃ−Ｔ２＃４１　１０３　　４８０　６，２００　３．８＋３０　　　　　　２６２　１．３４６　４，２１５ＹＲＣ−Ｌ３１　　１２２　　２６ｇ３１．４９７４５．７６６２６，９２７　　２７６　　１１４　　２０６ＷＲＣ−Ｌ３４　　５２　　３１９１２，４７７１５．０７７　　ｇ、７６２　　１９６　　１８７　　２５３ＷＲＣ−Ｌ３５　　４９　　１３４　５．６５ｇ２２，９６５　２．６８２　　１４８　　１２０　　２１１１１ＲＣ−Ｌｉ２　　９４　　１３１　４，１０８　１．６３９　　　　　　　９８　　１６３　　１４０富第１表に示したＨＰＬＣビーク２（２ＵＲ）、３（３ｔＪＲ）および４（４ＵＲ）から誘導された、精製され、還元されていないグリコペプチド複合物。ＨＰＬＣ−２ＵＲ，４ＵＲは主としてｇｐＢ３を含有しており、ＭｏＡｂ　９　Ｅ　１０と反応性であり、２ＵＲは免疫学的に異なるｇｐｃを含有し、ｇｐＡまたはｇｐＢと反応性であるＭｏＡｂ’ｓと非反応性である。ＨＰＬＣ−３ＵＲは主としてＭｏＡｂ　４１　Ｃ２と反応性であるｇｐＡを含有している。

第３表に示したデーターは、１７のクローン全てが全タウンＨＣＭＶ抗原に対して反応性があることを示しており、４１０８個／分〜１２１．０３０個／分を示している。これらの結果、これらのＨＣＭＶ−Ｔｈクローンによって認識された免疫優性決定因子がヴイリオンから得られた構造プロティンおよび／またはグリコプロティンによって発現されるということを示している。

クローンの全てがタウンＨＣＭＶのトリトンＸ−１００抽出物に対して非常に反応するが、全タウンウィルス性粒子に対するよりも狭い範囲である。すなわち、Ｔｈクローンの大多数は、主に、ウィルスのエンベロープ内に含まれるプロティンもしくはグリコプロティン、または洗浄剤抽出物において見いだされるべきウィルスエンベロープと充分に結合しているプロティンを認識すると思われる。

全タウン抗原と比較して低い応答は残渣洗浄剤の抑制効果をもたらすか、または抽出工程から得られた構造的変化によって免疫原性の損失をもたらす。

重要なこととして、Ｔｈクローンの全てが、洗浄剤抽出後、ウィルス抗原の沈澱物に対して低いが重要な増殖性応答を示した。いくつかの残渣エンベロープグリコプロティンおよび外皮プロティンが沈澱層内に含まれていると思われるが、おそらく沈澱物中の優性プロティンからなっているヌクレオカプシドプロティンがヘルパーＴ細胞によって認識された抗原決定基を発現することも可能である。

次にＴ細胞クローンは、全ＨＣＭＶ抗原の非還元洗浄剤抽出物を陰イオン交換ＨＰＬＣ分別によって得られた精製グリコプロティン複合物によって刺激された（実施例１（１）祭照）。

カリ等ＣＢ、Ｋａｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＪｉｒｏｌｏｇｙ、　６０．３４５　（１９８６）コおよび前記第１表に記載されているように、ピーク２ＵＲおよびＪＵＲ内に含有されるグリコプロティン複合物は、モノクローナル抗体（９Ｅ１０）によって認識されたグリコプロティン複合物を含んでいる。

この抗体は２．３の他のウィルスと交差反応し、補体の非存在下でＨＣＭＶを中和することができる。これに対して、グリコプロティン複合物の分離および区別したグループは、ピーク３ｔ、ＩＲ中で高純度に分離され、ＨＣＭＶと特別に反応するモノクローナル抗体の分離クラスによって認識され、複合物の存在下のみでＨＣＭＶを効果的に中和する。

還元後、３ＵＲから誘導された主要なグリコプロティンは１３０゜０００．９０．０００および５０．０００〜５２．０ＯＯｋＤの分子量Ｕ　Ｒ／４　Ｕ　Ｒ複合物から誘導された２つのグリコプロティンは９３゜０００および５０．　ＯＯＯ〜５２，０００ｋＤの分子量を有している。

第３のグリコプロティンは、９Ｅ１０モノクロ一ナル抗体によって認識されたこれらグリコプロティンと区別されるピーク２ＵＲにおいて示される。したがって、ＨＣＭＶウィルスエンベロープ内の全グリコプロティンの９５％以上において取り込まれるとして定義されているＨＣＭＶのエンベロープ内に含まれる少なくとも３つの主要グリコプロティン複合物がある。これらＨＰＬＣ法によって、純度９５％以上のグリコプロティン複合物が得られるので、これら個々のグリコプロティン複合物に対するＴｈ反応性のノでターンを示すことが重要である。

第３表に示したように、ＨＰＣＬ精製グ精製グリコプロティン複合層応性に関して試験した１７のＴｂクローンのうち、２つがピーク２ＵＲではなく、ピーク３ＵＲおよび４ＵＲに応答した。第３のＴｈクローンは３つのＨＰＬＣビークの全てに応答した。これらのクローンは主として、ピーク３ＵＲ中に主に分離されているグリコプロティン複合物を検出するモノクローナル抗体によって認識されている主要なグリコプロティン複合物に応答している。ピーク３ＵＲのピーク４ＵＲへのテーリングが明白な交差反応性の原因となっていると思われる。この特異性は、ＴｈクローンＷＲＣ−Ｔ３：’３、ＷＲＣ−Ｔ　２　＃　４１およびＷＲＣ−Ｌｌｏについて確２．　サレ、インヒドロでのｇｌ）Ａ遺伝子の１−ＲＮＡ翻訳によって産生されるグリコペプチドｇＰＡに特異的に増殖する（データーは示していない）。

特に重要なこととして、クローンの大多数（１４／１７）は、物質２Ｌ″Ｒ１３ＵＲおよび４ＵＲによって表される大部分のエンベロープグリコプロティン複合物において発現された決定因子を認識しない。すなわち、これらクローン化ヘルパーＴ細胞によって認識された免疫優性ＨＣＭＶ抗原決定因子は、非グリコジル化膜プロティンまたは内部プロティンのいずれかに残ることができる。もしそうであるならば、これは、インフルエンザウィルスと同じであり、抗体認識は、主に表面グリコプロティン（すなわち、ヘマグルチニン）を含むが、細胞毒性１９７１球は主に内部ヌクレオカプシドプロティンを認識することがわかる。

第４表に、個々のＨＣＭＶ（グリコ）プロティンと反応性のあるＨＣＭＶ特異性Ｔｈクローンの特異性に関するデーターを示す。全ＨＣＭＶ抗原を有する血清陽性ドナーから、ＭＮＣｓの初期刺激によってクローンを発生させ、構造プロティンおよびＨＣＭＶのグリコプロティンとのＴｈ反応性について選択した。

第４表個々のＨＣＭＶ（グリコ）プロティンと反応性のあるＨＣＭＶ特異性クローン− ＭＮＣＩ＋抗原１クローンＷＲＣクローン　　＋　　全ＢＣＭＶ　　　　　　ＢＰＬＣ精製ａ、増殖性応答を、ＣＰＭにおける３Ｈ−チミジンの摂取量として測定した；以下の抗原を用いた：（ｉ）全ＣＭＶウィルス：スクロース勾配液における細胞培養上澄み液から精製したタウン菌株ＣＭＶウィルス。

（１１）エンベロープグリコプロティンｇｐＡ：タウンＣＭＶの洗浄性抽出物の陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製したピーク３ｔＪＲ。

（ｉｉｉ）６４ｋＤマトリックスプロティン：逆相／ゲル濾過ＨＰＬＣによる部分精製物。

（ｉｖ）ＨＳｖ、アデノ：感染した細胞培養の上澄み液から精製した全ウィルス。

ｂ、全タウンウィルスを用いた初期刺激にょるＥＲＣＴｈり；−ン；Ｔｂクローンの１８％がｇｐＡ＊異性であった：Ｔｈクローンの３３％がＨＰＬＣ精製した６４ｋＤプロテインに対して特異的であった。

ｃ、ＭＮＣ”　＝　ＡＰＣのような放射線照射されたオートロガスなＭＮＣ。

ｄ、　Ｎ、Ｄ、　＝測定していない実施例１．１に詳述したように試験されたＴｈクローンの１８％は、ｇｐＡに対して特異的である。代表的な例としては、ＷＲＣＴ：３’３ンの３３％は、全ウィルスおよび分子ｊｉ６４，０００ダルトンの部分精製したマトリックスプロティンと反応性があることがわかった。

このプロティンは、クラークｒＢ、Ｒ，ｃＩａｒｋ、　ＪＪｉｒｏｌ、、　４９．２７９　（１！］１ｌ１４）コの方法の変形に従って逆相ＨＰＬＣおよびゲル濾過によって得られる。ＨＣＭＶ感染フィブロブラストの上澄み液の遠心分離によって得られた全タウンＨＣＭＶを、６Ｍ塩化グアニジン中に溶解し、Ｃ−１８カラムで逆相ＨＰＬＣにかけた。カラムに付着したプロティンをアセトニトリルで溶離し、２１４ナノメーターのカラム流出量を監視することによって検出した。回収したピークを集めて、６４ｋＤプロテインを５ＤＳ−ＰＡＧＥによって同定した。

さらに、直列に配置されたＴＳＫ　　４０００およびＴＳＫ　　３０００　　ＳＥＣカラムを用いて、サイズ選別クロマトグラフィーによって、相互溶離されたプロティンから６４ｋＤプロテインを精製した。

この方法を用いて５ＤＳ−ＰＡＧＥによって決定する場合、６４ｋＤプロテインの凝集形を単離した。

クローンＷＲＣ−Ｔ２／８８およびＷＲＣ−Ｔ２／１３１は、６４ｋＤマトリツクスプロテインに応答して増殖するＨＣＭＶ特異性Ｔｈクローンの代表例である。重要なこととして、多くのクローン（すなわち、ＷＲＣ−Ｌ３３およびＷＲＣ −Ｌ４２）Ｉｔ、主要エンベロープグリコプロティン、ｇｌ）Ａ、または豊富な６４ｋＤ内部マトリックスプロティンと非反応性であった。すなわち、ＨＣＭＶ特異性ヘルパーＴ細胞が種々の構造ＨＣＭＶプロティンに存在すると思われる。

実施例■ ＮＫ標的細胞、Ｋ５６２、ならびにＨｃＭＶ、Ｈ８Ｖ＊たはインフルエンザウィルスに感染したオートロガスなまたはアロジェネイックなフィブロブラストに対する細胞毒性について、ポリクローナルおよびモノクローナルＴｃ細胞を検査した。以下に詳述する方法を成人ドナーの皮膚生検および新生包皮からヒトデイブロイド皮膚フィブロブラスト（Ｓ　Ｆ）を入手した。細胞を少なくとも６回継代し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１０％０％ジメチルスルホキシドＭＳＯ）を含有するダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、１℃／分で凍結し、液体窒素中で保存した。使用前に、細胞を３７℃温浴中で解凍し、培地で洗浄し、２５ｃ１組織培養フラスコに接種した。ＳＦを全面成長させ、感染多重度０．２のＨＣＭＶで感染し、単層７０−９０％の細胞病理学的効果を示すまでインキユベートした。次いで、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃において細胞をＮａｔＣｒＯｔ　（培地２ｚ１２中３７５μＣｉ）で−晩標識した。細胞を３回洗浄し、１０％ＦＣＳのＲＰＭＩ中に再懸濁した。対照として、非感染の”Ｃｒ標識化ＳＦを使用した。

２．８ＳＶ−およびインフルエンザ−感染皮膚フィブロブラスト２５Ｃ１フラスコ中のＳＦ単層をＨＳＶまたはインフルエンザで感染多重度５−１０で感染し、 −晩インキユベートした。得られた細胞をＨＣＭＶ−感染フィブロブラストの場合と同じ方法で標識した。

３、に５６２赤白血痰セルラインに５６２を標的細胞の供給源として使用し、ＮＫ活性を測定した。Ｋ５６２細胞（ＩＸＩＯ＠）を培地１１１Ｉ２に想濁し、２５ｃｘ”フラスコ中、５％ＣＯ８雰囲気下、３７℃において細胞を３７５μＣ４のＮ　ａ　ｔ　Ｃｒ　Ｏ４で一晩標識した。３回洗浄した後、１０％ＦＣ３を加えたＲＰＭＩ中に再懸濁した。

サイクロへキサミド（１５μｇ／ｘＯの存在下にＳＦを感染多重度５−１０のＨＣＭＶで３時間感染させた。サイクロヘキサミドを除去した後、アクチノマイシンＤ　（５ｔｔ　ｇ／ｘ（１）およびＮａ、Ｃｒ０−（３７５μＣｉ）をその培養物に加えた。次いで、得られた細胞を３回洗浄し、標的細胞として１０％ＦＣＳ中ＲＰＭＩ中再懸濁した。

ＤＮＡ転写を妨害するアクチノマイシンＤの存在下に細胞毒性検定を行った。サイクロへキサミドおよびアクチノマイシンＤで同様に処置した非感染ＳＦを対照として使用した。

Ｂ、細胞毒性検定１００μｇ中、３０００個の標的細胞をＶ−底マイクロタイタープレートの各ウェルに入れた。次いで、１００μｇ中のエフェクター細胞の連続希釈物をその標的細胞に加え、エフェクター細胞二律的細胞の比率５０：１．２５：１および１２：１とした。このプレートを、１０時間ｖ　％　ＣＯを雰囲気下に、３７℃、５分間、５０９で遠心した。得られた上清１００μｇを採取し、ガンマ−カウンター［ベックマンガン？　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｇａａｎａ）　９０００　］でカタウンした。

標的細胞にそれぞれ培地中トリトン−Ｘ−１００を１００μｇ加えることによって、最大の細胞溶解を構成する対照、および自発放出を得た。計算は、以下の計算式にしたがって行う：実測値ＣＰＭ−自発放出ＣＰＭ％”Ｃｒ放出＝□ 最大ＣＰＭ−自発放出ＣＰＭ１分当たりの実験カウントによって、エフェクター細胞を含むウェル由来の細胞が示された。

比放出（ＳＲ）＝　［％”Ｃｒ放出ＨＣＭＶ感染標的］−［％”Ｃｒ放出非感染標的］得られた結果を３つまたは４つのウェルから得られた値の平均値として表した。

感染および非感染ＳＦ標的細胞から得られる自発放出は共に４０％よりも低かった。

１、タウン（Ｔｏｖｎｅ）　ＨＣＭ　Ｖ−感染オートロガス皮膚フィブロブラスト（Ｓ　Ｆ）によって刺激されたＨＣＭＶ−特異的ポリクローナルＴｃセルラインの細胞毒性活性血清反応陽性のドナー５Ｐ−ＣＮ由来の単核細胞を、タウンＨＣＭＶで２０時間感染させたオートロガス皮膚フィブロブラスト（ＳＦ）を含むバルク培養物中で７日−１０日間刺激した。ＨＣＭＶ−感染フィブロブラスト、供給細胞としてのオートロガス照射ＭＭＣ。

およびＩＬ−２を用いてＴ細胞ブラストを１週間、再度器（刺激した。得られたポリクローナルＣＤ８＋　Ｔセルラインを、非感染およびＨＣＭＶ−ｇ染オートロガスフイブロブラスト、およびＮＫ標的セルラインに５６２に対する細胞毒性活性について評価した。この試験の結果を以下の第５表に示す。

第５表タウンＨＣＭＶｇ染オートロガス皮膚フィブロブラスト（ＳＦ）によって刺激された５Ｐ−ＣＮセルラインの細胞毒性活性ｂ）　４つのウェルから得られた比” ｃｒ放出の平均値上記第５表におけるデータから理解されるように、即時型の初期および後期ウィルスタンパクを発現する、オートロガスＨＣＭＶ２０時間感染フィブロブラストに対し、ならびに前もってサイクロヘキサミド（ＣＨ）およびアクチノマイシンＤ　（ａｃｔ、Ｄ）で処置してＨＣＭＶの即時型の初期タンパクを選択的に発現する、ＣＭＶ感染オートロガスフイブロブラストに対し、両セルラインは細胞毒性活性を現した。さらにこれらセルラインは、ＮＫ一様細胞毒性活性をも顕著なレベルで表した。

ＭＮＣをシヨ糖勾配精製タウンＨＣＭＶウィルス粒子で初期刺激シタ後、ＨＣＭＶウィルス粒子、供給細胞としてのオートロガス照射ＭＮＣ５およびＩ　Ｌ−２での刺激を繰り返すことによって、血清クローンを入手した。以下の第６表に示すように、３つのＣＤｇ＋ラインおよびＣＤ８＋５Ｐ−ＲＫクローン＃３は、ＨＣＭＶ−感染オートロガスフイブロブラストを細胞溶解するが、アロジェネイック（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）な非適合性ＨＣＭＶ−感染フイブロブラスト、またはＨ５Ｖもしくはインフルエンザウィルスで感染されたオートロガスフイブロブラストは細胞溶解しなかった。

第６表シジ糖勾配精製タウンＨＣＭＶウィルス粒子によって刺激された５Ｐ−ＲＫ　Ｔセルラインおよびクローンの細胞毒性活性これらのセルラインは、Ｋ５６２ＮＫ標的細胞に対しては細胞毒性活性を少ししか示さなかった。従って、これらのＴセルラインおよびクローンの特徴は、ウィルス抗原全体（即ち、構造タンパク質）によって発現される抗原（群）を認識する、ＨＣＭＶ−特異的な、ＭＮＣクラスＩＬＡ−制限されたＴ−細胞毒性細胞であることである。

リスボンダー細胞（応答細胞）の供給源としてＨＣＭＶ−ＴｈクローンＷＲＣ− Ｔ３＃３をウェル毎に１．５Ｘ１０’個細胞の濃度で使用した。オートロガスなＸ−線照射ＭＮＣ（１０’）を抗原−提示細胞の供給源として加えた。最適な希Ｆｉの全ＨＣＭＶ抗原または０、１ｔｔｇ／ｘＱ　ＨＰＬＣ精製３ＵＲをＨＣＭＶ−特異的抗原性側１物の供給源として加えた。免疫優勢なグリコプロティンＡ　（ｇｐＡ　）を認識するモノクローナル抗体４１Ｃ２、またはプロティンＤと称されるグリコジル化されていないタンパク質を認識する対照のモノクローナル抗体３５Ｆ１０の連続希釈物を、各ウェルについて濃度ｌ０から０．０１ｇｇ／ｚ（ｌまでで加えた。この実験によって得られた結果を以下の第７表に示す。

第７表ＨＣＭ　ＶグリコプロティンＡ　（ｇｐＡ　）に指向するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）は、ｇＰＡ特異的ＴｂクローンｗＲｃ−Ｔ：３：３の増殖応答性を増大させるｂ）希釈度１：１０００で使用した全ＨＣＭＶ　ウィルス抗原（株ＡＤ１６９）上記第７表で表されるデータは、モノクローナル抗体４１Ｃ２が、３Ｌ］Ｒまたは全ＨＣＭＶ抗原を抗原刺激物として使用した場合、Ｔｈクローンの増殖応答性を顕著に増大させることを示している。これとは対照的に、プロティンＤ指向性のモノクローナル抗体では、３ＵＲまたは全ＨＣＭＶ抗原のいずれを使用しても顕著な増大は認められなかった。

このように、個々のＴｈクローンを顕著に刺激する、免疫原性グリコプロティン複合体抗原に指向したモノクローナル抗体は、増殖応答性を増大させるようである。

次に、全ＨＣＭＶ抗原と反応することが証明された６つのＨＣＭＶ−Ｔｈクローンを、全ＨＣＭＶ抗原÷モノクローナル抗体４１Ｃ２（対ｇｐＡ）またはモノクローナル抗体３５Ｆ１０（対プロティンＤ）のいずれかの連続希釈物を用いて刺激した。血清反応陽性の、および血清反応陰性の全血清をも同条件で試験した。

得られた結果を以下の第８表に示す。

第８表ＨＣＭＶグリコプロティンＡ（ｇｐＡ）と反応するＭｏＡｂは、ＨＣＭＶ特異的 ’ｒｈりｏ−：／の、全ＨＣＭＶ抗原に対する増殖応答性を増大させる１０ｇｇ／ｚ（１２５，９１３６，９４ｇ　　　　９，５６５　　１６．１２８　　２５．２９２３μｇ／ｉｉ２　　　２６．２７５　　８．６２７　　１Ｌ３２１　　１７．２２４　　１９．３７０１ｇｇ／ｘＩ２２２．０７３　　７，８１５　　　９，５７７　　１７，１８３　　２０，５９９０．３μｇ／収　　２１．５５ｇ　　　６．８６７　　　８．０１０　　１４．８０７　　２０．４８９０．１μｓ／ｘ（１１６，６７７４，１００５，２１０１１，４５６２１，４８２０，０３ｇｇ／ｘＱ　　　１７，０２６　　４，２０２　　　６．２１１１３　　１１．０６３　　１６，８０２０．０１ｇｇ／ｘ（１１６，３１５３，２９４５，４０３７，６７０１８，０６９ＭｏＡｂ　３５Ｆ　１０（抗−ｐＤ）１０ｇｇ／好　　　　１８．５８７　　　６．７３７　　　４，６８３　　　７．５８４　　１＋１ｔ、８４０３ｇｇ／村　　　　１９．１００　　　５．０６１　　　６．６１６　　　９．４８８　　１８．９６７１ｇｇ／ｌ、（１２０，４７１５，９０３６，３８２７，３７６１７，７９９０，３μｇ／ｚ（ｌ　　　　［，９１６ｇ、００１　　　４，８２６　　　８．３４２　　１８．６０５０．１ｇｇ／ｘ（１１ｇ、８４２　　　３，５４２　　　５．４０４　　　７，５７０　　１８．５１８０．０３ｇｇ／ｚＱ　　　１７，４３９　　　３，５５０　　　６，３２１　　　９，２２６　　１８，９９３ｏ、０１μｓ／Ｋｃ　　　Ｉｇ、２４ｇ　　　　２，９６４　　　５，９７１　　　７，２６２　　２２．５１１血清反応陽性の全血清（ドナーＣＲ）３．３ラムダ／Ｉｆｆ　　５１．０６ｇ　　　１１，４１２　　１７，６１６　　１６．３４５　　２４．９１８血清反応陰性の全血清（ドナー５Ｆ）３．３ラムダ／ｖＱ　　２７，５０６　　６．７８４　　　　ｇ、１０３　　１５，４６４　　２０，４４５ａ）　１．５Ｘ］０’　Ｔｈ／ウェル　÷　１０５オートロガスＩｄＮＣ”″／ウェル　÷　全ＨＣｉ抗原ｂ）カウント７分驚くべきことに、抗体の不存在下では、６個のＴｈクローンのうちの３個しかＨＰＬＣ精製ｇｐＡと反応しなかったにも拘わらず（第７表参照）　、ｇｐＡ指向性のモノクローナル抗体４１Ｃ２は、６個すべてのＴｈクローンの、全ＨＣＭＶ抗原に対する応答性を増大させた。プロティンＤ指向性モノクローナル抗体は、試験したいずれのクローンの応答も増大させなかった。血清反応陽性ドナー由来の全血清はすべてのクローンの応答を増大させたが、血清反応陰性ドナー由来の全血清は増大させなかった。これらのデータが示す事項は、増大の機序は、抗体と、特異的ウィルスタンパク質またはＴｈクローンに認識されるグリコプロティンとの直接的な相互作用には本質的に関連していない、ということである。

Σ茹！ハツＭＮＣ，ＬＣＬ、またはそれらの混合物によるヘルパーＴ細胞クロ血清反応陽性ドナー５Ｐ−ＣＮ由来のオートロガスＬＣＬ（ＳＰ−ＣＮ　ＬＣＬ）を、スーダンら（Ｓｕｇｄｅｎ　ａｎｄ　Ｍａｒｋ）らの方法［Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　２３．５０３　（１９７７）］によって樹立させ、１０％熱−不活化ウシ胎仔血清（Ｆｅ２）を加えたＲＰＭ１１６４０培地（ギブコ（ＧＩＢＣＯ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）、　二＋Ｌ−ヨーク）に増殖させた。ＡＭＧ　ＬＣＬ　（ＤＲ２，２／Ｄｗ　２．２）およびＮＨＳ　　ＬＣＬ　（ＤＲ３，８）　ｌ；ｆ：、Ｆ、パフ博士ＥＦ、　Ｂａｃｈ、　ＪＲＣ，ミネソタ大学、ミニアポリス、ＭＮＮコムら提供を受けた。

２、ＨＣＭＶ−特異的Ｔ細胞クローンの調製ＨＣＭＶ−特異的Ｔ特異的Ｔｈクローン反応陽性ドナー（ＳＰ−ＣＮ）から調製した。手短に言えば、１５％熱不活化ＨＣＭＶ−血清反応陰性ヒト血清（ＰＨＳ）および１Ｈｇ／ｚＱ全ＨＣＭＶ抗原を加えたＲＰＭ１１６４０培地において、単核細胞（ＭＮＣ）を１０６細胞／村テ培養した。７−１０ＥＩ後、ｌｏ、ｏｏｏｔ−ト。

ガスなＸ−線照射（５，○ＯＯＲ）ＭＮＣ，１μｇ／ｚＱ全ＨＣＭＶ−抗原（タウン株）、および１５％Ｉ　Ｌ−２［ＴＣＧＦ、Ｂｉｏｔｏｓｔ。

フランクフルト、西ドイッコを加えたＲＰＭＩ−１５％ＰＨＳ培地０．２３！（を入れた丸底ウェル中で希釈度を０．３細胞／ウエルに限定することによって、Ｔ細胞ブラストを単離、クローンした。平板効率２％−１２％が認められた。得られたクローンを１０−２０％ＩＬ−２を含有する培養培地で増殖させ、オー）ｏガスなＸ線−照射ＭＮＣ／ＬＣＬ混合物およびｌμｇ／ｒ１２全ＨＣＭＶ抗原を用いて１−２週間毎に再度刺激した。

３、増殖検定クローンされたＨＣＭＶ−特異的Ｔｈ細胞を再刺激の７−１４日後に検定した。

１０’個ＨＣＭＶ−特異的Ｔｈ細胞、各種１度のＸ線−照射オートロガスＭＮＣおよび／またはＬＣＬ、ならびに全ＨＣＭＶ抗原（タウン株）またはＨＳＶ抗原を全ＩＩＱ、２Ｘｆｆ／ウェルで加えた丸底プレート［Ｆｌｏｖ　Ｌａｂ、　、　Ｉｎｃ、　、　ＶＡＪにマイクロカルチャーを準備した。その培養物を３日間インキニベートし、培養の終わり１６−２４時間に、ＩμＣｉ／ウェルの３Ｈ− チミジンＩＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン、ＭＡ］を各ウェルに加えた。自動細胞捕集機によってウェルを採取し、細胞をガラスファイバー濾紙に採り、そしてベックマン５８０１液体シンチレーション分光測定器によって放射活性を測定した。

抗原の提示Ｘ線−照射オートロガスＭＮＣ（１０’／ウエル）またはＸ線−照射オートロガスＬＣＬ　（１０’−３Ｘ１０’／ウエル）のいずれかをＡＰＣとして使用し、血清反応陽性ドナー（ＳＰ−ＣＮ）か４生成されたＨＣＭＶ−特異的Ｔｈクローンのパネルを）（ＣＭＶ−特異的な増殖活性について試験した。ＨＳＶ抗原を特異性の対照としてインキ１ベートした。第９表に、７つのクローンを使用して得られた結果を示す。

第９表照射オートロガスＭＮＣまたはＬＣＬのいずれかを使用したＨＣＭＶ特異的Ｔｈ細胞クローンの増殖活性ａ）放射オートロガスＭＮＣ（５，０００ｒａｄｓ）を１０’　ＭＮＣ／ウェルで加えた。

ｂ）放射オートロガスＭＮＣ（＋！、　０００ｒａｄｓ）をｔｏ’　３ｘｌＯ’ ／ウエルで加えた。

Ｃ）熱不活化（５６℃／１時間）全ＨＣＭＶ抗原（タウン）またはＨＳＶ抗原を２μｇ抗原／ウェルで加えた。

ｄ）データは、３つのウェルから得られたＣＰＭ（平均±１３．Ｄ、）として表す。

第９表に挙げたＴｈクローンはすべて、ＭＮＣを培養物にＡＰＣとして加えた場合、ＨＣＭＶ抗原に対して十分に増殖したが、ＨＳＶ抗原に対しては増殖しなかった。増殖の規模は、８１１４から６８．３０７ｃｐｍの範囲であった。これらクローンの殆どは、ＬＣＬを１．０２０から２１．３７０の範囲でＡＰＣとして使用した場合にも、ＨＣＭＶ抗原特異的増殖応答を示Ｃた。クローン５Ｐ−ＣＮ／Ｔ２−１３１および５Ｐ−ＣＮ／７．５−４３は、ＨＣＭ　Ｖに対し、放射オートロガスＭＮＣの存在下で良好に増殖したが、放射オートロガスＬＣＬの存在下では貧弱な増殖であった。

他方、クローン５Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−１６および５Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−９は、放射オートロガスＬＣＬの存在下にＨＣＭＶに対して良好に増殖したが、もっとも放射ＭＮＣの存在下におけるＨ　ＣＭ　Ｖに対するこれらの増殖は、他の５つのクローンよりも良好でなかった。

このように、ＡＰＣとしてＭＮＣを使用した場合の）（ＣＭＶに対する増殖とＡＰＣとしてＬＣＬを使用した場合の増殖とは明確な相関関係はない。

抗原特異的ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）が、ＡＰＣの表面上のクラスＩ［ＭＨＣ産物に関連した抗原を認識することは周知である［エルグ（Ｐ、　Ｅｒｂ）らのＪ、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、　、　１４２．４６０（１９７５）コ。本発明者らは、ＡＰＣとしてＬＣＬを使用し、これらＴｈクローンのいくつかのＭＨＣ制限作用を調査し、すべての試験したり９−ンがクラス■制限されることを見いだした。他のＭＨＣクラス■適合ドナー由来のＬＣＬも、２つの高い応答クローン（ＳＰ−ＣＮ／Ｔ３−１６および５Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−９）に対して良好にＨＣＭＶ抗原を提示したが、５つの低い応答クローンに対しては貧弱であった。例えば、５Ｐ−ＣＮ　　ＬＣＬ　（オートロガス、ＤＲ２，４／ＤＷ２．４）およびＡＭＧ　ＬＣＬ　（ＤＲ２，２／ＤＷ２．２）は、クローンＳ　Ｐ　−ＣＮ　／　Ｔ３ −９に対してＨＣＭＶ抗原を提示シタ力、他方、ＮＨＢ　ＬＣＬ（ＤＲ３，８）は、この同じクローンに対してＨＣＭＶを提示しなＨＣＭＶ−特異的Ｔｈ細胞を刺激するためには、Ａ　Ｐ　Ｃとしてのオートロガス？ｖＬＮＣの供給が限定されており、またオートロガスＬＣＬを単独で使用した場合には不十分な提示であったために、Ｔｈクローンの再活性化に、ＭＮＣとＬＣＬとを組み合わせてＡＰＣおよび供給細胞として使用した。驚くべきことに、ＬＣＬおよびＭＮＣの組み合わせによって、増殖応答に対する相乗作用が認められた。

この結果を以下の第１０表に示す。

第１０表オートロガスＷＲＣＭＮＣおよび／またはＬＣＬをＡＰＣとして使用したヘルパーＴ細胞クローンＳ　Ｐ−ＣＮ／Ｔ５−４３の増殖応答５）１０’Ｔ細胞／ウエル、１０′″−１０’ＭＮ　Ｃ１Ｒ”および／またはＬＣＬ１１１１１／ウェルならびに２μｇ／ウェル全タウンＨＣＭＶ抗尿を使用して増殖検定を行った。

クローンＳ　Ｐ−ＣＮ／Ｔ　５−４３および５Ｐ−ＣＮ　ＬＣＬ”（１０’−１０’／ウエル）の３Ｈ−チミジン取り込みは５９〜９２の範囲であった。

ＬＣＬ濃度１０′／ウェル、３Ｘ１０’／ウエルおよび１０Ｓ／ウエルのクローンＳ　Ｐ−ＣＮ／Ｔ　５−４３および５Ｐ−ＣＮ　ＬＣＬ””の”Ｈ−チミジン取り込みは、それぞれ６２９、ｌ、２７９、および２．４６６であった。

ＩＱ’ＬｃＬ／ウェルから１０’ＬＣＬ／ウエルの範囲のＬＣＬをＡＰＣとして単独で使用した場合には、バックグラウンド以上に、全ＨＣＭＶ抗原に対する顕著なＴ細胞増殖応答を刺激することはなかった。しかし、１０’ＬＣＬ／ウエルおよび３Ｘ　１０’ＬＣＬ／ウエルのＬＣＬを追加した場合には、ＭＮＣおよび全ＨＣＭＶに対するＴｈ細胞の３日間の増殖応答は実質的に増大したが、１０５ＬＣＬ／ウエルでは、増大応答が抑制されたようであった。このことはおそらく培養物中の細胞密度が過剰になったことに由来するものと思われる。

この同じ培養物を、１５％Ｉ　Ｌ−２の存在下に１２日間増殖させ、培養を始めた後７日目および１２２日目細胞をカウント（計数）した。

これらの実験の結果を以下の第１１表に示す。

第１１表ＡＰＣとしてオートロガスＭＮＣおよび／またはＬＣＬを存在させてＨＣＭＶ抗原で再刺激した後における増殖した５Ｐ−ＣＮ／Ｔ５−４３細胞の数１）ａ）培養は第６表における条件下で行った。同条件の３つのウェルから得られた細胞を３日目にまとめ、Ｉ　Ｌ−２の存在下に１２日間増殖させた。

ｂ）分析せず。

第１１表から分かるように、ＭＮＣが存在しない場合は、Ｔｈ細胞は、ＬＣＬおよび全ＨＣＭＶ抗原の両者を培養物に加えた場合でさえ増殖しなかった。ＭＮＣおよび全ＨＣＭＶ抗原を組み合わせることで、関与したＭＮＣの量に応じて、培養１２日間でＴ細胞の数が３−から４３−倍増加する。ＬＣＬをＭＮＣおよびＨＣＭＶ抗原と共に加えた場合、同じ期間、同じ組織培養条件下で２９−から６２０−倍のＴ細胞の数の増加が観察されたが、このことは、明らかにＬＣＬが活性化Ｔｈ細胞の増殖を増大させたことを示すものである。

これらの培養物の一部標本を、３つの９６−ウェル平底マイクロタイタープレートに、７日間、０．２ｘ（１／ウエルでプレートした。

−晩経過後、［３Ｈ］−チミジンを適用し、取り込まれた［”Ｈ：］−チチミンを測定して細胞増殖に対するＬＣＬの作用が同様に増大したことを観察した。この結果を以下の第１２表に示す。

第１２表ＡＰＣとしてオートロガスＭＮＣおよび／またはＬＣＬを存在させてＨＣＭＶ抗原で再刺激した後における培養７日月の［′Ｈ］−チミジン取す込み１】ａ）第７表に示すように７日目に培養物から細胞を採取し、それを３つの平底ウェルに０．２ｘＱ／ウエルで加えた。採取前に得られた培養物を［’Ｈ］−チミジンで１８時間標識した。

これら得られた結果により、Ｔｈクローンを活性化し、増殖する上で、供給細胞としてＭＮＣおよびＬＣＬを共に抗原と一緒に使用する実行可能性が確認された。Ｔｈ細胞の増殖程度は、１０４がらＩＱ’ＭＮｃ／ウェルの範囲でＭ　Ｎ　Ｃｆｆ１ｍの濃度に比例するが、ＬＣｌ、２１１″の濃度とは比例しない。ＬＣＬとクローン化Ｔｈ細胞との最適の比率は、約１：１から３：１の範囲である。

抗原提示セルライン５Ｐ−ＣＮ／Ｔ３−４３　［アクセスコード：ＩＶＩ−１０１２２コ、および５Ｐ−ＣＮ／Ｔ５−４３　［アクセスコード：　ＩＶＩ−１０１２３コの試料は、ドラフトＰＴＯデポジット・ポリシー・フォー・バイオロジカル・マテリアルズ（Ｄｒａｆｔ　ＰＴＯＤｅｐｏｓｉｔ　Ｐｏ１ｉｃｙ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）に基づいてイン・ビトロ・インターナショナル（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ＋、リンチカム。

ＭＤ）にも寄託されている［Ｂ１１Ａ　ＰＴＣＪ、　３２．９０（１９８６ル。

これらの寄託されたセルラインの培養物は、本出願に基づく特許が発行された時点で一般に入手可能となる。寄託物の入手が、米国特許局で許可された特許権の毀損となる、本発明を実施する実施許諾の権能を有するものでないことは理解されるであろう。

本発明を説明するために、ある特定の代表的な態様を説明してきたが、当業者にはこれらの変法が本発明の要旨および範囲を逸脱しない限り可能であることは理解されるであろう。

本発明者らは、ここに、本研究についてｐチルドレンズ・ホスピタル（Ｃｈｉ］ｄｒｅｎ’　ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、セント・ボール、ミネソタ）の惜しみないご支援と激励に心から感謝するものである。

国際調査報告ｍ−枠−１静−―−ｍ、　ｐ（：’：　７ｇ５８Ｂ１０Ｏ３Ｂ３

Claims

【特許請求の範囲】

１．ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の均質な集団の製造方法であって、（ａ）ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞、およびオートロガスな非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する単核細胞（ＭＮＣ）集団をドナー哺乳動物の血液から単離する工程；（ｂ）単離したＭＮＣ集団を、該抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な量の該ウイルス抗原と混合する工程；（ｃ）非増殖性ＭＮＣの生存性を失わせるに有効な期間、該ヘルパーＴ細胞を増殖させる工程；および（ｄ）クローンした抗原特異的なヘルパーＴ細胞の増殖に有効な量の、該ウイルス抗原、並びに（ｉ）オートロガスなＭＮＣ、アロジェネイックなＭＮＣまたはこれらの混合物、および（ｉｌ）オートロガスなリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）、アロジェネイックなＬＣＬまたはこれらの混合物の混合物からなる非増殖性の抗原提示細胞の存在下に、該抗原特異的なヘルパーＴ細胞をクローン増殖させて均質な集団を得る工程：ここで、ＬＣＬはＭＮＣと協同してヘルパーＴ細胞の増殖速度を増加させるに有効な量で存在する；を包含することを特徴とする方法。
２．ヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な追加量のウイルス抗原およびオートロガスな非増殖性のＡＰＣを工程（ｃ）の期間中に加えて該ヘルパーＴ細胞の増殖性をさらに高める請求項１記載の方法。
３．工程（ｄ）において非増殖性ＡＰＣが、抗原特異的なヘルパーＴ細胞の増殖に有効な（ｉ）オートロガスなＭＮＣ；および（ｉｉ）オートロガスなＬＣＬの混合物からなり、該ＬＣＬが、ＭＮＣと協同してヘルパーＴ細胞の増殖速度を増加させるに有効な量で存在している請求項１記載の方法。
４．ＬＣＬがウイルスで形質転換したリンパ芽球様セルラインから導かれるものである請求項１記載の方法。
５．ウイルスで形質転換したリンパ芽球様セルラインがエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したリンパ芽球様セルラインである請求項４記載の方法。
６．ウイルス抗原がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原である請求項１記載の方法。
７．ＨＣＭＶ抗原がウイルスの構造タンパクである請求項６記載の方法。
８．ＨＣＭＶ抗原がウイルスのエンベロープ分画中に存在するものである請求項７記載の方法。
９．ＨＣＭＶ抗原がウイルス表面に存在するグリコペプチド複合体、またはそれから導かれるウイルス性グリコペプチドからなる請求項７記載の方法。
１０．ＨＣＭＶ抗原がウイルスの表面に存在する約９３ＫＤの免疫原性グリコペプチドまたは約５０−５２ＫＤの免疫原性グリコペプチドである請求項９記載の方法。
１１．ＨＣＭＶ抗原が約６４ｋＤのマトリックスタンパク質である請求項６記載の方法。
１２．工程（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が、ヘルパーＴ細胞の増殖速度を増加させるに有効な量の、ウイルス抗原に特異的なモノクローナル抗体の存在下で行われる請求項１記載の方法。
１３．モノクローナル抗体がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異的なものである請求項１２記載の方法。
１４．モノクローナル抗体がウイルスの表面に存在する分子量約９３ｋＤの免疫原性グリコペプチドまたは分子量約５０−５２ｋＤの免疫原性グリコペプチドに特異的なものである請求項１３記載の方法。
１５．モノクローナル抗体がハイプリドーマＩＶＩ−１０１１７、ＩＶＩ−１０１１８またはＩＶＩ−１０１１９から産生されるものである請求項１４記載の方法。
１６．工程（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が有効量のインターロイキン−２（ＩＬ −２）の存在下で行われる請求項１記載の方法。
１７．ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の均質な集団の製造方法であって、（ａ）ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞およびオートロガスな非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する単核細胞（ＭＮＣ）集団をドナー哺乳動物の血液から単離する工程；（ｂ）単離したＭＮＣ集団を、該抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な量の、該ウイルス抗原および該ウイルス抗原に特異的なモノクローナル抗体と混合する工程；（ｃ）非増殖性ＭＮＣの生存性を失わせるに有効な期間、該ヘルパーＴ細胞を増殖させる工程；および（ｄ）クローンした抗原特異的なヘルパーＴ細胞の増殖に有効な量の、非増殖性のオートロガスな抗原提示細胞、非増殖性のアロジェネイックな抗原提示細胞またはこれらの混合物；ウイルス抗原；および該ウイルス抗原に特異的なモノクローナル抗体の存在下に、該抗原特異的なヘルパーＴ細胞をクローン増殖させて均質な集団を得る工程；を包含することを特徴とする方法。
１８．ウイルス抗原がＨＣＭＶ抗原である請求項１７記載の方法。
１９．工程（ｄ）においてオートロガスな非増殖性ＡＰＣが非増殖性のＭＮＣを含有している請求項１７記載の方法。
２０．工程（ｄ）においてオートロガスなＡＰＣまたはアロジェネイックなＡＰＣが、非増殖性ＭＮＣによって引き起こされる以上にヘルパーＴ細胞の増殖速度を増加させるに有効な量で非増殖性ＬＣＬをさらに含有している請求項１９記載の方法。
２１．ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の構造タンパク質に存在する抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の均質な集団の製造方法であって、（ａ）ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異性を有するヘルパーＴ細胞および非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含有する単核細胞（ＭＮＣ）集団をドナー哺乳動物の血液から単離する工程；（ｂ）単離したＭＮＣ集団を、該ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な量の該ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原と混合する工程；（ｃ）非増殖性ＭＮＣの生存性を失わせるに有効な期間、該ヘルパーＴ細胞を増殖させる工程：および（ｄ）増殖に有効な量の該ＨＣＭＶ抗原、該ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異的なモノクローナル抗体、並びにＸ線照射したオートロガスなＭＮＣ、Ｘ線照射したエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換のリンパ芽球様セルライン（ＬＣＬ）およびこれらの混合物からなる群から選ばれるオートロガスな抗原提示細胞の存在下に、該抗原特異的なヘルパーＴ細胞をクローン増殖させて均質な集団を得る工程；を包含することを特徴とする方法。
２２．ヘルパーＴ細胞の増殖を引き起こすに有効な追加量のウイルス抗原、該ウイルス抗原に特異的なモノクローナル抗体、およびオートロガスな非増殖性のＡＰＣを工程（ｃ）の期間中に加えて該ヘルパーＴ細胞の増殖性をさらに高める請求項２１記載の方法。
２３．工程（ｂ）、（ｏ）または（ｄ）が有効量のインターロイキン−２（ＩＬ −２）の存在下で行われる請求項２１記載の方法。
２４．ウイルス抗原に特異的なヘルパーＴ細胞の均質な集団の増殖方法であって、ヘルパーＴ細胞の均質な集団を、該ヘルパーＴ細胞集団の増殖を引き起こすに有効な量の、ウイルス抗原、並びに（ｉ）オートロガスまたはアロジェネイックなウイルス−形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）および（ｉｉ）オートロガスまたはアロジェネイックな単核細胞（ＭＮＣ）を含有している非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の混合物と混合すること、およびＬＣＬがＭＮＣと協同してヘルパーＴ細胞の増殖速度を増加させるに有効な量で存在していることを特徴とする方法。
２５．ＬＣＬとＭＮＣの比が少なくとも約１：１−１０である請求項２４記載の方法。
２６．ウイルス抗原がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原である請求項２５記載の方法。
２７．ヘルパーＴ細胞集団を、該ヘルパーＴ細胞集団の増殖速度を増加させるに有効な量の、抗原に特異的なモノクローナル抗体と混合することをさらに包含する請求項２４記載の方法。
２８．ヘルパーＴ細胞集団を、該ヘルパーＴ細胞集団の増殖速度を増加させるに有効な量のインターロイキン−２（ＩＬ−２）と混合することをさらに包含する請求項２４記載の方法。
２９．ヘルパーＴ細胞とＬＣしの比が約１：１−３である請求項２４記載の方法。
３０．ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原に特異的なＴ細胞毒性細胞の均質な集団の製造方法であって、（ａ）ＨＣＭＶウイルス抗原に特異的なＴ細胞毒性細胞を含有する単核細胞（ＭＮＣ）集団をドナー哺乳動物の血液から単離する工程；（ｂ）単離したＭＮＣ集団を、（ｉ）オートロガスな非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、（ｉｉ）ＨＣＭＶ感染させたオートロガスなフィブロプラストまたは全ＨＣＭＶ抗原、および（ｉｉｉ）インターロイキン−２（ＩＬ−２）の、該ＡＰＣによって発現されるＨＣＭＶ抗原に特異的なＴ細胞毒性細胞の増殖を引き起こすに有効な量と混合する工程；（ｃ）非増殖性ＭＮＣの生存性を失わせるに有効な期間、該ヘルパーＴ細胞を増殖させる工程；および（ｄ）クローンした抗原特異的なＴ細胞毒性細胞の増殖に有効な量の、（ｉ）ＨＣＭＶ感染させた非増殖性のオートロガスな抗原提示細胞、ＨＣＭＶ感染させた非増殖性のアロジェネイックな抗原提示細胞またはこれらの混合物、（ｉｉ）ＩＬ−２、および（ｉｉｉ）オートロガスなＨＣＭＶ感染させたフィブロプラストまたは全ＨＣＭＶウイルス抗原の存在下に、該抗原特異的なＴ細胞毒性細胞をクローン増殖させて均質な集団を得る工程；を包含することを特徴とする方法。
３１．ドナー哺乳動物がヒトである請求項３０記載の方法。
３２．Ｔ細胞毒性細胞の増殖を引き起こすに有効な追加量の、ウイルス抗原、ＩＬ−２およびオートロガスな非増殖性のＡＰＣを工程（ｃ）の期間中に加えて該Ｔ細胞毒性細胞の増殖をさらに高める請求項３０記載の方法。
３３．工程（ｂ）においてＭＮＣ集団がＨＣＭＶ感染させたオートロガスなフィブロプラストと混合される請求項３１記載の方法。
３４．工程（ｄ）において抗原提示細胞が、オートロガスな単核の抗原提示細胞と協同してＴ細胞毒性細胞の増殖速度を増加させるに有効な量で、連続オートロガスＭＮＣラインから導かれる非増殖性ＭＮＣをさらに含有している請求項３３記載の方法。
３５．ＭＮＣラインがウイルスで形質転換したリンパ芽球様セルラインからなる請求項３４記載の方法。
３６．ウイルスで形質転換したリンパ芽球様セルラインがエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したリンパ芽球様セルラインからなる請求項３５記載の方法。
３７．工程（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が、Ｔ細胞毒性細胞の増殖速度を増加させるに有効な量の、ＨＣＭＶ抗原に特異的なモノクローナル抗体の存在下で行われる請求項３０記載の方法。
３８．病原体関連抗原に特異的なＴ細胞毒性細胞の均質な集団の増殖方法であって、Ｔ細胞毒性細胞の均質な集団を、該Ｔ細胞毒性細胞集団の増殖を引き起こすに有効な量の、インターロイキン−２（ＩＬ−２）および非増殖性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の混合物と混合すること、およびＡＰＣの混合物が該抗原を発現するアロジェネイックな単核細胞（ＭＮＣ）およびアロジェネイックなウイルス− 形質転換したリンパ芽球様細胞（ＬＣＬ）を含有していることを特徴とする方法。
３９．抗原がウイルス抗原である請求項３８記載の方法。
４０．ウイルス抗原がヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）抗原である請求項３９記載の方法。
４１．Ｔ細胞毒性細胞集団を、該細胞集団の増殖速度を増加させるに有効な量の、該抗原に特異的なモノクローナル抗体と混合することをさらに包含する請求項３８記載の方法。
４２．非経口投与したときに病理学的標的抗原に対する被投与哺乳動物の免疫応答を増加させるに有効な量の、Ｔｈ細胞またはＴｃ細胞を含む該病理学的標的抗原に対して抗原特異的なＴリンパ球の、被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ− 適合化した均質な集団を含有する薬学的単位投与剤。
４３．抗原特異的なＴリンパ球の複数の均質な集団の混合物を含有している薬学的単位投与剤であって；該混合物がＴｈ細胞、Ｔｃ細胞またはこれらの混合物からなり；それぞれの集団が病理学的標的抗原に対して特異的であり；複数のＴリンパ球集団の少なくとも１つが被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ−適合化されており；そして、非経口投与したときに混合物が、少なくとも１つの病理学的標的抗原に対する被投与哺乳動物の免疫応答を増加させるに有効である投与剤。
４４．複数の別々に包装した、Ｔｈ細胞またはＴｃ細胞を含む抗原特異的なＴリンパ球の均質な集団からなる薬学的単位投与剤であって、それぞれの集団が病理学的標的抗原に特異的なＴリンパ球を含有しており；Ｔリンパ球集団の非経口投与時にそれぞれの集団が、病理学的標的抗原に対するＭＨＣ−適合化した被投与哺乳動物の免疫応答を増加させるに有効であり；そして、集団の少なくとも１つが被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ−適合化されている投与剤。
４５．非経口投与したときに少なくとも１つの病理学的標的抗原に対する被投与哺乳動物の免疫応答を増加させるに有効な量の、Ｔｈ細胞、Ｔｃ細胞またはこれらの混合物を含む抗原特異的なＴリンパ球の不均質な集団を含有する薬学的単位投与剤であって、該Ｔリンパ球集団の少なくとも一部が被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ−適合化されている投与剤。
４６．それぞれのＴリンパ球集団が病理学的標的抗原に対して抗原特異的であり、少なくとも１つのＴリンパ球集団が被投与哺乳動物についてＭＨＣ　ＬＡ−適合化されている、Ｔｈ細胞またはＴｃ細胞を含む抗原特異的なＴリンパ球の複数の均質な集団を、薬学的に許容しうる液体の担体と混合することからなる方法によって製造される薬学的単位投与剤。
４７．複数のＴリンパ球集団が、特定の病理学的標的に関連する複数の抗原に対して抗原特異性を含有している請求項４４、４５または４６のいずれかに記載の薬学的単位投与剤。４８，複数のＴリンパ球集団が、複数のＨＣＭＶ関連抗原に対して抗原特異性を含有している請求項４４、４５または４６のいずれかに記載の薬学的単位投与剤。