KR20220149684A - 동종이계 종양-특이적 cd4+ t 세포의 수혈을 이용한 암 면역요법 - Google Patents

동종이계 종양-특이적 cd4+ t 세포의 수혈을 이용한 암 면역요법 Download PDF

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헤더 질 시몬스
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Abstract

본 발명은 내인성 종양 반응성 CD8+ T 세포에 대한 CD4+ T 세포 도움의 외인성 공급원으로서 동종이계 림프구의 투여를 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

Description

동종이계 종양-특이적 CD4+ T 세포의 수혈을 이용한 암 면역요법
관련 출원에 대한 교차 참조
[0001] 본 출원은 2020년 2월 10일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 16/786,761의 35 U.S.C. §119(e)에 따른 우선권의 이익을 주장하며, 이는 2018년 3월 28일에 출원된 미국 출원 일련 번호 15/939,059의 일부 계속 출원이며, 2014년 11월 3일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 14/398,724의 계속 출원으로서, 현재 미국 특허 번호 9,931,359로서 공고되었으며; 이는 현재 만료된 2013년 3월 15일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2013/032129의 35 USC §371 국내 단계 출원이며; 이는 현재 만료된 35 USC §119(e)에 따라 2012년 5월 8일자로 출원된 미국 출원 일련 번호 61/644,126의 이점을 주장한다. 각각의 선행 출원의 개시내용은 본 출원의 개시의 일부로 간주되고 참고로 포함된다.
연방 후원 연구 또는 개발에 관한 성명서
[0002] 이 발명은 국립 보건원에서 수여한 CA105148 및 CA015396에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
서열 목록의 통합
[0003] 첨부된 서열 목록의 자료는 본 출원에 참조로 포함된다. 첨부된 서열 목록 텍스트 파일 명칭 JHU3680_3WO_Sequence_Listing.txt는 2021년 2월 8일에 생성되었으며 12kb이다. 파일은 Windows OS를 사용하는 컴퓨터에서 Microsoft Word를 사용하여 평가될 수 있다.
발명의 분야
[0004] 본 발명은 일반적으로 면역학, 및 보다 구체적으로 암을 치료하기 위한 방법 및 동종이계 림프구를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
배경 정보
[0005] 숙주의 면역계는 병원성 미생물에 대한 보호 반응을 신속하고 구체적으로 설정하고 악성 종양의 거부에 기여하는 수단을 제공한다. 면역 반응은 분화된 B 림프구에 의해 항원에 특이적인 항체가 생성되는 체액성 반응과 다양한 유형의 T 림프구가 다양한 메커니즘에 의해 항원을 제거하는 세포 매개 반응을 포함하는 것으로 일반적으로 설명되어 왔다. 예를 들어, 특정 항원을 인식할 수 있는 CD4(CD4+라고도 함) 헬퍼 T 세포는 면역 반응에 참여하도록 면역계의 추가 세포를 모집하기 위해 사이토카인과 같은 가용성 매개체를 방출함으로써 반응할 수 있다. CD8(CD8+라고도 함) 세포독성 T 세포는 또한 특정 항원을 인식할 수 있으며, 항원을 보유하는 세포 또는 입자에 결합하여 이를 파괴하거나 손상시킬 수 있다. 특히, 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 포함하는 세포 매개 면역 반응은 종양 세포 및 바이러스, 박테리아 또는 기생충과 같은 미생물에 의해 감염된 세포의 제거에 중요할 수 있다.
[0006] 암은 광범위한 질병을 포함하며, 전 세계적으로 약 4명 중 1명에게 영향을 미친다. CTL 반응은 효과적인 암 백신의 핵심 특징이며; 효과적인 CD4 T 세포 도움은 CD8 T 세포의 세포독성 활성을 유지하는데 중요한 역할을 하며, 따라서 임상적 이점을 제공한다.
[0007] 미생물 감염과 관련하여 말라리아, 결핵, HIV-AIDS 및 엡스타인-바르 바이러스, B형 및 C형 간염 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 감염 및 인간 유두종바이러스(HPV)와 같은 다른 바이러스 감염은 계속해서 글로벌 건강 문제를 일으킨다. 바이러스는 모든 인간 암의 약 15%를 초래하는 것으로 추정된다. 발암성 및 비-발암성 혈청형 둘 모두를 포함하는 인간 유두종바이러스는 세계에서 가장 흔한 성병이다. 대부분의 면역 능력이 있는 개체는 바이러스를 제거하는 반면, 건강한 개체의 일부는 HPV의 발암성 균주를 제거하는 데 실패하여 상피 세포에서 지속성을 확립하고 악성 형질전환을 유도할 수 있다.
[0008] 새로운 증거는 암이 암에 의해 고유하게 발현되는 항원에 대해 특이적인 림프구에서 무반응 상태를 유도한다는 것을 시사한다. 그러나, 이러한 무반응은 되돌릴 수 있어야 한다. 몇몇 인간 종양은 CD8+ T 세포에 의해 침윤되며, CD8+ T 세포 침윤 정도는 종종 전이 부재 및 개선된 생존율과 상관관계가 있다. 그러나, 이들 CD8+ T 세포는 종양-특이적 CD4+ T 세포의 기능적 마비로 인해 암을 제거하지 못할 수 있다.
[0009] 이필리무맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙을 포함하는 면역학적 체크포인트 억제제(CI)는 다양한 암의 치료에 성공했으며, 이는 면역계의 T 세포가 종양을 퇴행시켜 생존을 연장시키고 삶의 질을 향상시킬 수 있다고 결론적으로 확정지었다. 그러나, 모든 암 면역요법의 성공은 증식, 사이토카인 분비 및 종양-특이적 T 세포의 사멸 능력 손상을 특징으로 하는 현상인 T 세포 고갈에 의해 제한될 수 있다. 따라서, 항암 면역요법에서 T 세포 고갈을 역전시키는 전략을 개발하는 데 상당한 관심이 있다.
[0010] 최근 증거에 따르면 CI는 T 세포 고갈을 되돌릴 수 없음을 시사한다. 대조적으로, 동종이계 세포 요법, 특히 주요 조직적합성 복합체(MHC)-불일치 공여자의 CD4+ T 세포의 주입은 공여자 세포의 최종 거부에도 불구하고 면역학적 체크포인트 차단에도 내성이 있는 진행성 암의 퇴행을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 공여자 림프구로부터 CD8+ 세포의 고갈은 주입의 항종양 효능을 손상시키지 않으면서, 지속적인 공여자 세포 생착 및 치명적인 이식편대숙주병(GVHD)의 위험을 저지하였다. 공여자와 수용자가 서로 MHC-일배수동종일때(부모가 자식에게 또는 그 반대의 경우), 인간 유두종바이러스(HPV) 혈청형 16(HPV16)의 E7 항원에 대한 공여자의 백신접종은 E7-발현 폐암인 TC-1에 대한 CD8-고갈된 비-생착 공여자 림프구 주입(NEDLI)의 항-종양 효능을 증가시켰다. E7-프라이밍된 공여자로부터의 NEDLI의 항-종양 효능은 증가될 수 있고, 수용자는 주입 전에 HPV16의 E7로부터의 펩티드로 펄싱된 숙주- 또는 공여자-유래된 수지상 세포와 함께 프라이밍된 세포를 배양함으로써 치유될 수 있다. E7-프라이밍된 NEDLI에 의해 진행된 TC-1 종양이 치유된 마우스는 공여자 키메라 현상의 증거가 없었지만, 숙주-유래된 E7-특이적 메모리 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 확장된 집단을 포함하며, 이는 항종양 면역이 NEDLI에 의해 수용자에게 각인되었음을 나타낸다. 이러한 결과는 바이러스-유도된 종양이 바이러스 항원에 대해 백신접종된 부분적으로 또는 완전히 HLA-일치된 공여자로부터의 림프구 주입에 의해 치료될 수 있음을 입증하고, 종양 신생항원에 대해 백신접종된 공여자로부터의 림프구를 제공함으로써 산발성 종양을 치료할 가능성이 있음을 시사한다.
[0011] 또한, NEDLI에 의해 TC-1이 치료된 마우스는 동일한 종양에 대한 공격에 저항하였으며, 치료된 동물의 비장 세포는 TC-1-보유 MHC-일배수동종 수용자에게 항종양 면역을 전이시켰다. 종양-특이적 항원에 대한 건강한 공여자의 백신접종 및 후속하여 종양-특이적 항원으로부터 유래된 펩티드로 백신접종된 공여자의 림프구 배양은 항원-발현 종양을 보유하는 동종이계 수용자에게 비-생착 공여자 림프구 주입의 항-종양 효과를 현저하게 증가시킬 수 있다.
발명의 개요
[0012] 본 발명은 CD4+ T 세포를 함유하는 동종이계 림프구의 주입이 비록 공여자 세포가 수용자에게 장기간 생착하지 않더라도 숙주 항-종양 CD8+ T 세포의 내성을 깨뜨릴 수 있으며; 동종반응성 및 신생항원-특이적 CD4+T 세포의 주입은 내인성 종양 특이적 CD8+ T 세포의 소진을 역전시켜 종양 퇴행을 발생시킬 수 있다는 획기적인 발견에 기초한다. 본 발명은 내인성 종양-특이적 CD8+ T 세포의 소진을 역전시켜 종양 퇴행을 발생시킬 목적으로 암이 발병하거나 발병하기 쉬운 대상체로의 동종이계 바이러스-특이적 및/또는 종양 신생항원(neoAg)-특이적 CD4+ T 세포의 주입과 관련된 방법 및 조성물을 포함한다.
[0013] 일 구현예에서, 본 발명은 림프구 조성물을 제조하는 방법으로서, a) 공여자로부터 말초 혈액 세포 조성물을 수득하는 단계로서, 공여자는 임의적으로 수용자에 존재하는 항원에 대해 백신접종되며, 말초 혈액 세포 조성물은 CD8+ T-세포, CD4+ T-세포 및 천연 킬러 세포를 포함하는, 단계; b) CD8+ T-세포의 말초 혈액 세포 조성물을 고갈시키는 단계로서, CD8+ T-세포의 말초 혈액 세포 조성물의 고갈이 말초 혈액 세포 조성물의 CD8+ T-세포의 수를 적어도 한자릿수만큼 감소시키는, 단계; 및 c) CD4+ T 세포와 항원을 배양함으로써 항원에 특이적인 CD4+ T 세포를 확장시켜 림프구 조성물을 제조하는 단계로서, 공여자가 수용자에 대해 HLA-일치하거나, 부분적으로 HLA-일치하거나 HLA-일배수동종인, 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
[0014] 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, a) 대상체에 림프-고갈 화학요법을 시행하는 단계; 및 b) 대상체에 림프구 세포 조성물을 투여하는 단계로서, 림프구 조성물은 HLA-일치, 부분적 HLA-불일치 또는 HLA-일배수동종 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 수득되고, 공여자는 대상체에 존재하는 바이러스 항원 및/또는 종양 신생항원에 대해 선택적으로 백신접종되며, 조성물은 CD8+ T 세포가 고갈되며, 조성물은 대상체에 존재하는 바이러스 및/또는 종양 신생항원에 특이적인 CD4+ T 세포의 확장된 집단을 포함하는, 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 부분적 HLA-일치 또는 HLA-일배수동종 공여자는 수용자에 대해 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 가지며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치한다.
[0015] 추가의 구현예에서, 본 발명은 바이러스 항원, 종양 신생항원 또는 이들의 조합물에 특이적인 CD4+ T 세포를 포함하는 세포 은행을 제공하고, 세포 은행은 CD4+ T 세포의 개별 세포주를 포함하며, 각 세포주는 상이한 인간 백혈구 항원(HLA) 유형의 단일 공여자로부터 수집되었다. 일 양태에서, 바이러스 항원은 HPV 또는 엡스타인 바르 바이러스이다.
[0016] 도 1은 골수이형성 증후군에 대한 HLA-일배수동체 골수 이식 후 이식 거부를 경험한 5명의 환자의 헤마토크리트를 보여주며, 둘쭉날쭉한 부분은 수혈 효과를 반영한다(그래프).
[0017] 도 2는 비-생착 DLI가 항종양 면역을 유도함을 보여준다(그래프).
[0018] 도 3a는 백신으로서의 공여자 세포와 alloCD4의 생착이 생존을 연장함을 보여준다(그래프).
[0019] 도 3b는 공여자 CD4+ T 세포 키메라 현상과 이식 후 일의 그래프를 보여준다.
[0020] 도 4는 백혈구 성분채집 생성물 및 정맥 절개 시료를 사용한 CD8 고갈에 대한 검증 실행을 보여준다(유세포 분석 결과).
[0021] 도 5는 일시적으로 생착된 MHC-불일치 공여자 림프구 주입의 항종양 효능을 설명하는 모델을 보여준다.
[0022] 도 6a는 도 6b의 결과를 수득하는데 사용되는 프로토콜을 보여준다. C57BL/6 x C3H(B6 x C3H; B6C3) F1 또는 BALB/c x C57BL/6(BALB/c x B6; CB6) F1 마우스에 인간 유두종바이러스 혈청형 16의 E7에 대한 DNA 백신인 pcDNA-3-CRT/E7 25 μg을 총 3회 용량으로 매주 백신 접종하였다. 1주 후, 나이브 또는 백신 접종한 마우스로부터의 비장 세포를 CD8+ T 세포가 고갈되지 않은 상태로 두거나 고갈되게 하고, 2주 전 50,000 E7-발현 TC1 폐암 세포 및 하루 전 사이클로포스파미드 200 mg/kg을 IP 투여받은 B6 x C3H F1 마우스에 2천만개 세포를 주입하였다. 종양-보유 마우스의 생존은 왼쪽에 동종 B6 x C3H F1 세포의 수용자와 오른쪽에 MHC-일배수동종 BALB/cx B6 F1 세포의 수용자에 대해 표시된다.
[0023] 도 7a는 도 7b의 결과를 수득하는데 사용되는 프로토콜을 보여준다. 도 7b는 종양 Ag-프라이밍된 공여자로부터의 비장 세포의 생체외 배양에 의한 NEDLI의 항종양 효능의 증대를 예시하는 그래프를 나타낸다. E7-프라이밍된 CB6 F1 공여자의 비장 세포는 HPV16(JPT Peptide Tech.)의 E7의 중첩 펜타데카머로 펄싱된 CB6 F1(syn) 또는 B6C3 F1(haplo) 수지상 세포(DC)로 배양되었다.
[0024] 도 8a-h는 유세포분석에 의해 수득된 수용자 CD8+ T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 8a는 나이브 B6C3 F1 마우스에서 펩티드로 펄싱된 H-2K-b 테트라머로 염색하여 결정된 바와 같이 면역우성인 E7의 H-2Kb-제한 펩티드에 반응성인 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. 도 8b는 haploDLI에 의해 치유된 마우스에서 펩티드로 펄싱된 H-2Kb 테트라머로 염색하여 결정된 바와 같이 면역우성인 E7의 H-2Kb-제한 펩티드에 반응성인 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. 도 8c는 TC-1 공격접종 후 14일차에, haploDLI에 의해 치유된 마우스에서 펩티드로 펄싱된 H-2Kb 테트라머로 염색하여 결정된 바와 같이 면역우성인 E7의 H-2Kb-제한 펩티드에 반응성인 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. 도 8d는 TC1 공격접종 후 60일차에, haploDLI에 의해 치유된 마우스에서 펩티드로 펄싱된 H-2Kb 테트라머로 염색하여 결정된 바와 같이 면역우성인 E7의 H-2Kb-제한 펩티드에 반응성인 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. 도 8e는 도 8a에서 동일한 조건에서 게이팅된 E7-특이적 CD8+ T 세포에서 CD127 및 PD-1의 세포 표면 발현을 나타낸다. 도 8f는 도 8b에서 동일한 조건에서 게이팅된 E7-특이적 CD8+ T 세포에서 CD127 및 PD-1의 세포 표면 발현을 나타낸다. 도 8g는 도 8c에서 동일한 조건에서 게이팅된 E7-특이적 CD8+ T 세포에서 CD127 및 PD-1의 세포 표면 발현을 나타낸다. 도 8h는 도 8d에서 동일한 조건에서 게이팅된 E7-특이적 CD8+ T 세포에서 CD127 및 PD-1의 세포 표면 발현을 나타낸다.
[0025] 도 9a는 펄싱되지 않은 B6 x C3H F1 수지상 세포로 자극한 후 5일차에 처리되지 않은 B6 x C3H F1 나이브 마우스로부터의 CD4+ T 세포의 세포내 인터페론 감마(IFNγ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 염색을 나타내는 도트-플롯을 보여준다. 도 9b는 E7 펩티드로 펄싱된 DC로의 자극 후 5일차에 처리되지 않은 B6 x C3H F1 나이브 마우스로부터 CD4+ T 세포의 세포내 인터페론 감마(IFNγ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 염색을 나타낸다. 도 9c는 E7 펩티드로 펄싱된 DC로의 자극 후 5일차에 비-생착 공여자 림프구 주입에 의해 치료된 마우스로부터의 CD4+ T 세포의 세포내 인터페론 감마(IFNγ) 및 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 염색을 예시한다. 도 9d는 도 9a-c에 예시된 바와 같은 동일한 세포의 IFNγ 분비의 ELISPOT 검정에 의한 정량화의 그래프를 나타낸다.
[0026] 도 10a는 도 10b의 결과를 수득하는데 사용되는 프로토콜을 보여준다. TC1-보유 B6 x C3H F1 마우스를 E7-백신접종 공여자로부터 채취하고, E7 펩티드로 생체외에서 확장시킨 CD8-고갈 림프구와 사이클로포스파미드에 의해 치유하였다. 림프구 주입 후 300일차에 치유된 마우스로부터의 비장 세포는 CD8+ 세포를 고갈시키고, E7 펩티드와 1주 동안 배양시키고, 사이클로포스파미드로 하루 전에 처리한 TC1 보유 BALB/c x B6 F1 마우스에 전이시켰다(2천만개 세포가 수용자 당 배양물에 투입됨). 대안적으로, CD8+ 세포가 고갈되고, 입양 전이 전 1주 동안 E7 펩티드와 배양된 나이브 B6 x C3H F1 공여자로부터의 비장 세포를 TC1 보유 BALB/c x B6 F1 마우스에 제공하였다. 생존은 도 10b에 나와 있다.
[0027] 도 11a는 종양 면역에서 APC 허가 요건을 결정하기 위한 양친 골수 키메라의 개략도를 나타낸다. 도 11b는 종양 면역에서 APC 허가 요건을 결정하기 위한 F1 골수 키메라의 개략도를 나타낸다.
[0028] 도 12는 CD4+ T 세포가 종양 세포 사멸에 의해 해방된 신생항원 B, C 및 E에 특이적인 CD8+ T 세포(eCTL) 소진을 역전시키는데 어떻게 도움이 되는지 설명하는 개략도를 보여준다.
발명의 상세한 설명
[0029] 본 개시내용은 암에 대한 면역 반응이 환자의 CD4+ T 세포의 기능적 결함에 의해 방해된다는 중대한 발견으로부터 적어도 부분적으로 발생한다. 동종이계 림프구의 주입은 내인성 종양-반응성 CD8+ T 세포에 대한 CD4+ T 세포 도움의 외인성 공급원을 제공할 수 있다. 공여자 림프구 주입으로 인한 CD8+ T 세포의 고갈은 지속적인 생착 및 이식편대숙주병의 위험을 감소시킨다. 주입된 집단으로부터 조절 T 세포의 제거는 항종양 면역의 내인성 이펙터에 도움을 제공하는 비-조절성 T 세포의 능력을 증가시킬 수 있다. 동종이계 T 세포 요법은 일반적으로, 환자가 고도의 면역억제성 전처치 후 선택되지 않은 성숙한 T 세포 집단을 함유하는 줄기 세포 이식편을 주입하는 동종이계 줄기 세포 이식의 맥락에서 제공된다. 본원에 설명된 치료에서, 이식편은 지속적인 공여자 세포 생착 가능성을 최소화하도록 조작되고, 항-종양 이펙터 T 세포는 숙주로부터 유도된다. 따라서, 치료는 일시적인 공여자 세포 생착 기간 동안 숙주와 공여자 림프구의 독특한 협력을 수반한다.
[0030] 본 발명의 조성물 및 방법을 설명하기 전에, 본 발명은 설명된 특정 조성물, 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않는데, 이러한 조성물, 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문임이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구범위에 제한될 것이기 때문에 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
[0031] 이 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 하나 이상의 방법 및/또는 본원에 기술된 유형의 단계를 포함하며, 이는 본 개시내용 등등을 읽을 때 당업자에게 자명해질 것이다.
[0032] 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고문헌으로 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 참고문헌으로 본원에 포함된다.
[0033] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 하기 참고 문헌은 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 정의를 가진 숙련자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 수정 및 변형이 본 개시내용의 사상 및 범위 내에 포함된다는 것이 이해될 것이다. 이제 바람직한 방법 및 재료가 설명된다.
[0034] 동종이계 세포 주입 전에 화학요법의 시행은 전이된 림프구의 항상성 확장을 촉진하고/하거나 숙주 조절성 T 세포 및 골수 유래 억제제 세포를 고갈시킴으로써 일시적으로 생착하는 림프구의 항종양 효과를 증가시킬 수 있다. 동종이계 림프구의 주입은 내인성 종양-반응성 CD8+ T 세포에 대한 CD4+ T 세포 도움의 외인성 공급원을 제공할 수 있다. 공여자 림프구 주입으로 인한 CD8+ T 세포의 고갈은 지속적인 생착 및 이식편대숙주병의 위험을 감소시킨다. 주입된 집단으로부터 조절성 T 세포의 제거는 항종양 면역의 내인성 이펙터에 도움을 제공하는 비-조절성 T 세포의 능력을 증가시킬 수 있다.
[0035] 동종이계 T 세포 요법은 일반적으로, 환자가 고도의 면역억제성 전처치 후 선택되지 않은 성숙한 T 세포 집단을 함유하는 줄기 세포 이식편을 주입하는 동종이계 줄기 세포 이식의 맥락에서 제공된다. alloSCT의 목표는 공여자 세포의 지속적인 생착을 얻는 것인데, 이식편대숙주병으로 인한 사망 위험을 수반한다. 본원에 설명된 치료에서, 이식편은 지속적인 공여자 세포 생착 가능성을 최소화하도록 조작되고, 항-종양 이펙터 T 세포는 숙주로부터 유도된다. 따라서, 치료는 일시적인 공여자 세포 생착 기간 동안 숙주와 공여자 림프구의 독특한 협력을 수반한다.
[0036] 이는 임의의 인간 또는 동물 암에 적용될 수 있는 치료이다. 본 발명의 변형은 하기를 포함한다: 1) 동종이계 림프구의 주입 전에 제공되는 화학요법 계획의 변형(사이클로포스파미드, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 다사티닙, 이들의 조합물을 포함할 수 있음); 2) 공여자 림프구 공급원의 변형 (혈연 또는 비혈연 공여자로부터 비롯될 수 있으며, HLA 클래스 I 또는 클래스 II 유전자좌에서 정의된 불일치를 포함할 수 있음); 3) CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 고갈, CD8+ T 세포의 고갈과 같은 주입을 위해 선택된 세포 유형의 변형. 공여자는 림프구 주입 전에 정의된 항원에 대해 면역화될 수 있거나 생체외에서 사이토카인 또는 약물로 극성화되어 타입 I(IFN-감마 생성) 또는 타입 17(IL-17-생성) CD4+ T 세포를 풍부화시킬 수 있다.
[0037] 면역계의 CD8+ T 세포는 암세포의 돌연변이에 의해 발생하는 아미노산 서열인 종양 신생항원을 인식하고 이들을 건강한 정상 대응물로부터 구별함으로써 암 세포를 파괴할 수 있다. 그러나, 암은 신생항원-특이적 CD8+ T 세포가 소진되는 것을 방지하는데 "도움"이 필요한 CD4+ T 세포의 기능을 마비시킴으로써 면역 파괴를 피할 수 있다. 본 발명의 동종이계 이식편은, 환자의 종양으로부터의 신생항원에 대해 백신접종된 건강한 공여자로부터 CD4+ 헬퍼 T 세포의 신선한 공급원을 제공함으로써 신생항원-특이적 CD8+ T 세포의 소진을 역전시키고 항암 면역 반응을 회복시키는데 사용될 수 있다.
[0038] 일 구현예에서, 본 발명은 인간 수용자에게 투여하기 위한 동종이계 림프구 조성물을 제조하는 방법으로서, 수용자에 존재하는 항원에 대해 인간 공여자를 백신접종시키는 단계; 수용자에 대해 동종이계인 인간 공여자로부터의 말초 혈액 세포 조성물을 제공하는 단계로서, 말초 혈액 세포 조성물은 다수의 CD4+ T 세포, 다수의 CD8+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, 여기서 (i) 공여자는 수용자에 존재하는 항원에 대해 CD4+ T-세포 면역을 가지며, (ii) 공여자는 수용자 대비 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치하며, (iii) 수용자는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 검출가능한 항체 반응성을 갖지 않는, 단계; 및 말초 혈액 세포 조성물의 CD8+ T-세포의 수를 적어도 한자릿수만큼 감소시킴으로써 말초 혈액 세포 조성물로부터 동종이계 림프구 조성물을 제조하는 단계로서, 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, 동종이계 림프구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포와 동일하거나 그 미만인, 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
[0039] 본 발명은 수용자에 투여할 림프구 조성물을 제조하는 방법으로서,
[0040] a) 공여자로부터 말초 혈액 세포 조성물을 수득하는 단계로서, 공여자가 수용자에 존재하는 항원에 대해 임의적으로 백신접종되고, 말초 혈액 세포 조성물은 CD8+ T-세포, CD4+ T-세포 및 천연 킬러 세포를 포함하는, 단계; b) CD8+ T-세포의 말초 혈액 세포 조성물을 고갈시키는 단계로서, CD8+ T-세포의 말초 혈액 세포 조성물을 고갈시키는 것이 말초 혈액 세포 조성물 중의 CD8+ T-세포의 수를 적어도 한자릿수만큼 감소시키는, 단계; 및 c) CD4+ T 세포를 항원과 배양함으로써 항원에 특이적인 CD4+ T 세포를 확장시켜 림프구 조성물을 제조하는 단계로서, 공여자는 수용자에 대해 HLA-일치하거나 부분적으로 HLA-일치하거나 -일배수동종인, 단계를 포함하는, 방법을 제공한다. 일 양태에서, 부분적 HLA-일치 또는 HLA-일배수동종 공여자는 수용자에 대해 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 가지며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및/또는 HLA-DPB1로부터 선택되는 유전자에서 일치한다.
[0041] 바람직하게는, 공여자 및 수용자는 동일한 인간이 아니다. 방법은 수용자에 동종이계인 인간 공여자로부터의 말초 혈액 세포 조성물을 제공하는 단계를 포함하며, 말초 혈액 세포 조성물은 다수의 CD4+ T-세포, 다수의 CD8+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, 일부 천연 킬러 세포는 CD8+ 항원을 가지며, "감소" 단계에 의해 제거될 수 있으며; 그러나, 본 발명의 바람직한 림프구 조성물은 공여자로부터 적어도 일부 천연 킬러 세포를 포함한다. 일 양태에서, (i) 공여자는 공여자 대 수용자 방향으로 수용자에 대해 불일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자(공여자 대 수용자 방향으로 HLA 클래스 II 대립유전자 불일치, "이식편대숙주 방향)를 포함하며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 또는 HLA-DPB1와 같은 유전자에서 불일치한다. 수용자는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖지 않는다 (이 맥락에서 "검출가능한 항체"는 이러한 결정을 내리는 표준 방법을 사용하여 정의된다(예를 들어, 수용자는 보체 의존성 세포독성, 양성 결과가 바람직하지 않은 유세포 분석 교차-일치 검정, 또는 고체상 면역검정에서 허용되지 않은 3000 이상의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 검출가능한 공여자 HLA 분자에 대한 항체를 갖지 않는다). 일 양태에서, 공여자는 공여자 항-수용자(이식편대숙주) 방향으로 수용자에 대해 적어도 하나의 HLA 클래스 II 대립유전자 불일치를 가지며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 불일치한다.
[0042] 바이러스-특이적 또는 종양 신생항원-특이적 T 세포의 세포 집단을 "확장"한다는 것은 바이러스 또는 종양 신생항원에 노출되지 않은 건강한 개체에서 발견된 것보다 바이러스 또는 종양 신생항원에 반응성인 더 높은 빈도의 T 세포를 함유하는 림프구 집단의 생성을 나타낸다.
[0043] 동종이계 림프구 조성물은 말초 혈액 세포 조성물의 CD8+ T-세포의 수를 적어도 한자릿수만큼 감소시킴으로써 말초 혈액 세포 조성물로부터 제조되며, 여기서 (a) 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하다. 바람직한 구현예에서, 림프구 조성물의 CD4+의 수/CD8+ T 세포의 수의 비는 바람직하게는 약 30 이상이다. 일부 구현예의 예는 비제한적으로 수용자 이상 체중 킬로그램 당 하기 용량을 포함한다: 105 CD4+ 세포를 포함하는 림프구 조성물은 전형적으로 3.2 X 103 이하의 CD8+ 세포를 가지며, 106 CD4+ 세포는 전형적으로 3.2 X 104 이하의 CD8+ 세포를 가지며, 107 CD4+ 세포는 전형적으로 3.2 X 105 이하의 CD8+의 세포를 가지며, 108 CD4+ 세포는 전형적으로 3.2 X 106 이하의 CD8+ 세포를 가지며, 5 X 108 CD4+ 세포는 전형적으로 1.6 X 107 이하의 CD8+ 세포를 갖는다.
[0044] 동종이계 림프구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포의 수 이하이다. 한자릿수, 바람직하게는 약 두자릿수, 더욱 바람직하게는 약 다섯자릿수만큼 감소된다. 일 구현예에서, CD8+ 세포의 수는 약 2.5 자릿수만큼 감소된다(예를 들어, 자성 비드 세포 분류기 방법을 이용함).
[0045] "CD8+ T 세포가 고갈된"은 혼합된 세포 집단에서 CD8 플러스 보체에 대한 항체와 같은 방법에 의해 또는 자성 세포 분리에 의해 감소된 CD8+ T 세포의 수를 가져, CD8+ T 세포의 수가 고갈되지 않은 집단과 비교하여 CD4+ T 세포와 같은 다른 세포에 비해 적어도 10배 더 낮음을 의미한다. 예를 들어, 고갈되지 않은 말초 혈액 집단에서 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율이 1.5:1인 경우, CD8+ T 세포가 고갈된 집단에서 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비율은 15:1 이상이다.
[0046] 본원에 사용된 바와 같은 용어 "백신접종"은 백신, 약학적 제조물(약학적 조성물) 또는 투여시 면역 반응, 특히 세포 면역 반응을 유도하는 생성물의 투여에 관한 것이며, 이는 암세포와 같은 병원체 또는 병든 세포를 인지하고 공격할 수 있다. 백신은 질병의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 용어 "면역 반응"은 항원에 대한 통합된 신체 반응을 나타내며, 바람직하게는 세포성 면역 반응 또는 세포성 및 체액성 면역 반응을 나타낸다. 면역 반응은 보호/방지/예방 및/또는 치료적일 수 있다. 면역 반응 유도는 유도 전에 특정 항원에 대한 면역 반응이 없었다는 것을 의미할 수 있지만, 또한 유도 전에 특정 항원에 대한 일정 수준의 면역 반응이 있었으며 유도 후에 상기 면역 반응이 강화되었음을 의미할 수 있다. 따라서, "면역 반응 유도"는 또한 "면역 반응 강화"를 포함한다. 바람직하게는, 대상체에서 면역 반응을 유도한 후, 상기 대상체는 암 질환과 같은 질병의 발병으로부터 보호되거나 질병 상태가 면역 반응 유도에 의해 개선된다. 예를 들어, 종양 발현 항원에 대한 면역 반응은 공여자에서 유도될 수 있으며, 이는 암 질환을 앓고 있는 수용자 대상체가 암 질환과 싸우는데 도움이 될 것이다. 이 경우 면역 반응을 유도한다는 것은 대상체의 질병 상태가 호전되거나, 대상체가 전이를 일으키지 않거나, 암 질환이 발병할 위험이 있는 대상체가 암 질환을 일으키지 않음을 의미할 수 있다.
[0047] 본 발명에서, "종양-항원에 대한 백신접종"은 종양에 존재하는 종양 항원에 대해 면역화된 특정 공여자 대상체 또는 암에 걸린 수용자 대상체에 관한 것이다. 백신 접종은 예를 들어, 단일 neoAg, 단일 용량의 백신 또는 항-종양 면역을 증가시키기 위한 백신 제형을 사용하여 수행될 수 있다. 충분한 면역화가 달성되지 않은 경우, 공여자는 mRNA 펜타토프 백신으로 백신접종될 수 있다.
[0048] 용어 "대상체"는 본원에 기술된 방법이 수행될 수 있는 임의의 개체 또는 환자를 나타낸다. 일반적으로, 대상체는 인간이지만, 당업자가 이해하는 바와 같이 대상체는 동물일 수 있다. 따라서 설치류(마우스, 쥐, 햄스터 및 기니피그 포함), 고양이, 개, 토끼, 소, 말, 염소, 양, 돼지 등을 포함한 농장 동물과 같은 포유동물을 포함한 다른 동물 및 영장류(원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)는 대상체의 정의에 포함된다.
[0049] 본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "치료하다", "치료하는", "치료"는 장애 및/또는 이와 관련된 증상을 감소 또는 개선하는 것을 나타냄을 의미한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것은 장애, 병태 또는 이와 관련된 증상이 완전히 제거될 것을 요구하지 않음이 이해될 것이다.
[0050] 본원에 기술된 치료는 암 또는 질병, 장애 또는 이의 증상을 앓고 있거나, 갖고 있거나, 이에 걸리기 쉽거나 이에 걸릴 위험이 있는 대상체, 특히 인간에게 적합하게 투여될 수 있다. "위험이 있는" 대상체의 결정은 대상체 또는 의료 제공자의 진단 테스트 또는 의견(예를 들어, 유전자 검사, 효소 또는 단백질 마커, 마커(본원에 정의된 바와 같음), 가족력 등)에 의한 임의의 객관적 또는 주관적 결정으로 이루어질 수 있다.
[0051] 일 양태에서, 공여자 및 수용자가 부적합한 ABO 혈액형이고, 말초 혈액 세포 조성물이 다수의 적혈구를 포함하는 경우, 동종이계 림프구 조성물을 제조하는 것은 적혈구 수를 감소시키는 것을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "부적합한 ABO 혈액형"은 수용자가 공여자에 대해 주요 ABO 적혈구 부적합이 있는 경우, 예를 들어 수용자가 혈액형 O형이고 공여자가 혈액형 A, B 또는 AB인 경우, 수용자가 A 형이고 공여자가 B형 또는 AB형인 경우, 또는 수용자가 B형이고 공여자가 A형 또는 AB형인 경우를 나타낸다.
[0052] 일부 양태에서, 공여자는 암이 없는 공여자이고, 여기서 암이 없는 공여자는 암에 걸린 대상체와 일치하는 적어도 하나의 HLA 클래스 II 대립유전자를 갖는다.
[0053] 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "공여자"는 백신접종된 대상체로서, 이로부터의 세포가 분리되어 림프구 조성물을 생성하는, 대상체를 나타낸다. 전체에 걸쳐 더 자세히 설명된 바와 같이, 공여자는 수용자와 적어도 부분적으로 HLA와 호환되는 동종이계 공여자이다. 암이 없다는 것은 공여자가 암을 갖지 않으며, 적어도 당시에는 말초 혈액 세포 조성물이 공여자로부터 수득됨을 의미한다.
[0054] 일부 양태에서, 적혈구의 수는 패킹된 부피로 약 50 ml 이하; 예를 들어, 패킹된 부피로 약 50 ml 이하, 바람직하게는 패킹된 부피로 약 30 ml 이하를 포함하며, 추가로 "패킹된 부피"가 예를 들어, 림프구 조성물의 원심분리가 50 ml 이하의 적혈구의 패킹된 부피를 발생시키는 것으로 정의될 것이며; 림프구 조성물의 측정된 부피 샘플은 또한 패킹된 혈액 세포의 비례적으로 대표하는 부피를 제공하기 위해 스크리닝될 수 있다.
[0055] 일부 양태에서, 수용자에 존재하는 항원은 신생물 항원, 신생물 아이디오타입, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 비인간 동물 항원, 종양 신생항원 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0056] "종양 신생에피토프" 또는 "종양 신생항원"은 종양 조직의 전체 게놈 또는 전체 엑솜 서열 대 동일한 암 환자로부터의 비-종양 조직의 전체 게놈 또는 전체 엑솜 서열을 비교하는 것과 같은 방법, 발현된 신생에피토프를 확인하기 위한 RNAseq, 및 암환자 및 암이 없는 공여자가 공유하는 특정 HLA 클래스 II 대립유전자에 의해 제시된 에피토프를 확인하기 위한 예측 알고리즘, 태깅된 대립유전자 작제물로의 모노-대립유전자 정제, 또는 면역펩티돔의 심층 모티프 데콘볼루션과 같은 방법에 의해 확인된 에피토프이다.
[0057] 다양한 양태에서, 항원은 신생물 항원이고, 신생물 항원은 종양 항원이다.
[0058] 일 양태에서, 수용자에 존재하는 항원은 신생물 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다(신생물 항원은 신생물과 관련된 항원이며, 여기서 신생물은 임의의 새롭고 비정상적인 세포 성장으로서 정의되는 것으로서, 특히 세포 복제가 비제어되고 점진적인 것이다). 신생물은 양성, 전암성 또는 악성일 수 있으며, 암은 악성 신생물이다. 따라서, 모든 암 항원은 신생물 항원이지만, 모든 신생물 항원이 암 항원은 아니다. 신생물 아이디오타입(Id)은 예를 들어, B 세포 악성종양의 종양-특이적 표적이며, 이러한 B 세포 악성종양은 이들의 세포 표면, 예를 들어 림프종 또는 다발성 골수종에 이 분자를 발현하며, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원 및 비인간 동물 항원을 포함한다.
[0059] 일부 양태에서, 바이러스 항원은 인간 유두종바이러스(HPV) E6 항원, HPV E7 항원 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 바이러스 항원은 엡스타인-바르 바이러스 잠복성 막 단백질 1(LMP1), 잠복성 막 단백질 2a(LMP 2a) 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0060] 일 양태에서, 종양 항원은 수용자 종양으로부터의 항원이다.
[0061] 많은 양태에서, 수용자, 공여자 및 하나 이상의 잠재적 동종이계 공여자(들)로 구성된 군으로부터 선택되는 대상체는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 간염 바이러스 항원 및 사이토메갈로바이러스 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 감염원 항원에 대한 혈청학적 반응성에 대해 스크리닝되었다.
[0062] 일부 양태에서, 하나 이상의 선택 특징(들)에 대한 스크리닝이 수행되고, 스크리닝은 수용자, 공여자 및 하나 이상의 잠재적 동종이계 공여자(들)로 구성된 군으로부터 선택되는 대상자에 대해 수행된다. 예를 들어, 선택 특성은 감염원 항원에 대한 혈청학적 반응성에 대한 스크리닝이다. 감염원 항원은 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 간염 바이러스 항원 및 사이토메갈로바이러스 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 선별되어야 하는 중요한 인자에는 예를 들어 HIV-1 항원(들), HIV-2 항원(들), A형 간염 바이러스 항원(들), B형 간염 바이러스 항원(들), C형 간염 바이러스 항원(들), CMV 항원, 감염성 질환 등을 포함한다. 바이러스 또는 감염원 또는 이의 항원이 치료 표적이었다면, 그 인자에 대해 원하는 CD4+ 매개된 면역 반응을 갖는 공여자를 배제하지 않을 것이다.
[0063] 일 양태에서, 감염원 항원은 사이토메갈로바이러스 항원이며, 수용자 및 공여자가 스크리닝되고, 수용자 또는 공여자에서 사이토메갈로바이러스 항원에 대한 혈청학적 반응성이 없다. 일 양태에서, 바이러스 항원은 인플루엔자 항원이며, 인플루엔자 항원은 헤마글루티닌 항원 또는 뉴라미니다제 항원이다.
[0064] 또 다른 양태에서, 선택 특징은 하나 초과의 HLA 클래스 II 대립유전자에 대한 스크리닝이다. 특정 예에서, 잠재적 동종이계 공여자는 잠재적 동종이계 공여자 대 수용자 사이에 잠재적 동종이계 공여자 대 수용자 방향으로, 하나 초과의 HLA 클래스 II 대립유전자에서 최대 불일치를 기반으로 선택되고, 잠재적 동종이계 공여자는 공여자로서 선택된다. 특정 예에서, 선택 특징은 하나 이상의 HLA 클래스 I 대립유전자(들)에 대한 스크리닝이다.
[0065] 잠재적 동종이계 공여자는 하나 초과의 HLA 클래스 I 대립유전자(들)에서 잠재적 동종이계 공여자와 수용자 사이의 불일치를 최소화하는 것을 기반으로 하여 선택될 수 있으며, 잠재적 동종이계 공여자가 공여자로 선택된다.
[0066] 일 양태에서, 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 20% 미만으로 상이하다. 일부 구현예에서, CD4+ T-세포는 약 50% 미만, 약 40% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 10% 미만이다. 일부 구현예에서, CD4+ T-세포의 생체외 확장이 수행될 수 있고, 이러한 구현예에서 CD4+ T-세포의 수는 원래 수를 크게 초과할 수 있다. 그러한 확장은 대안적인 구현예이다. 추가로, "말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만의 차이"는 말초 혈액 조성물의 CD4+ T-세포 수의 플러스 또는 마이너스 50% 미만을 의미한다. 예를 들어, 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포 수가 1X105 CD4+ 세포인 경우, "말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포 수와 약 50% 미만의 차이"은 CD4+ T 세포의 수가 1.5X105 내지 0.5X105임을 의미한다.
[0067] 다양한 양태에서, 공여자로부터 수득된 CD4+ T-세포는 생체외에서 의도적으로 확장되거나 의도적으로 분화되지 않는다. 의도적으로 확장되거나 의도적으로 분화된 것은 방법의 단순한 부작용(의도적이거나 부주의한 것이 아님)인 CD4+ T 세포의 확장 또는 분화와 구별되며, 예를 들어, CD4+ T 세포는 때때로 플라스틱과 접촉하여, 그러한 우연한 사건의 다른 예에 의해 분화를 겪을 수 있다. 또 다른 구현예에서, 줄기 세포가 수용자에 대해 동종이계인 말초 혈액 세포 조성물 공여자에서 동원되지 않았다는 추가 조건이 있다.
[0068] 일부 양태에서, 말초 혈액 세포 조성물의 CD8+ T-세포를 감소시키는 것은 자성 입자와 회합된 항-CD8+ 항체 또는 항-CD8+ 항체와 보체를 사용하는 것을 포함한다. 말초 혈액 세포 조성물은 예를 들어 전혈 생성물 또는 성분채집 생성물일 수 있다. 또한, 공여자 대 수용자 방향의 HLA 클래스 II 대립유전자 불일치는 HLA-DRB1에서의 불일치일 수 있다. 공여자 대 수용자 방향으로 HLA 클래스 II 대립유전자 불일치가 있는 이러한 제한은 예를 들어, "이식편대숙주 방향"이며, 여기서 동종이계 공여자 대 수용자 방향으로 적어도 하나의 HLA 클래스 II 대립유전자(들) 불일치는 동종이계 공여자 대 수용자의 일촌 이상의 친척 사이의 동일한 HLA 클래스 II 대립유전자(들) 불일치를 추가로 포함하며, 이는 수용자에 대한 일촌 친척으로부터 골수 이식의 기회를 보존하기에 바람직하며; 이상적으로는 공여자 대 수용자 사이의 불일치 모두는 잠재적인 가족 골수 공여자 대 수용자 사이에 존재하지 않는다.
[0069] 일 양태에서, 킬로그램(kg)의 수용자의 이상적인 체중을 기반으로 하는 공여자 CD4+ T-세포의 수는 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg이다. 조성물에서, 공여자 CD4+ T-세포의 수는 이상적인 체중을 기준으로 하며, 이상적인 체중(IBW)은 키를 기반으로 한다. 남성의 경우 IBW = 50 + 2.3 kg/5피트 초과 인치. 여성의 경우, 킬로그램(kg)의 수용자의 IBW = 45.5 + 2.3 kg/5피트 초과 인치는 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg(바람직한 구현예에서, 약 1X106 CD4+ T-세포/kg 내지 약 5X108 CD4+ T-세포/kg)이며; 동종이계 림프구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포의 수보다 적거나 같고, 동종이계 림프구 조성물은 말초 혈액 세포 조성물에 비해 적어도 한자릿수 적은 CD8+ T-세포를 갖는다.
[0070] 다른 양태에서, 동종이계 림프구 조성물은 말초 혈액 세포 조성물에 비해 적어도 한자릿수 적은 CD8+ T-세포를 갖는다.
[0071] 일부 양태에서, 공여자는 수용자에 존재하지 않는 항원에 대해 CD4+ T-세포 면역을 갖는다.
[0072] 많은 양태에서, 공여자는 수용자에 존재하는 항원에 대해 CD4+ T-세포 면역을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같은 "CD4+ T-세포 면역을 갖는"은 백신접종 목적으로 사용된 특정 항원에 대해 지시된 CD4+ T-세포의 새로운 클론의 공여자에서 확장으로 해석되는, 공여자에서 면역 반응을 유도하기 위한 백신 접종의 효율성을 의미한다.
[0073] 다른 양태에서, 수용자는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖지 않는다.
[0074] 또 다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에 림프-고갈 화학요법을 시행하는 단계; 및 대상체에게 림프구 조성물을 투여하는 단계로서, 림프구 조성물이 대상체에 존재하는 바이러스 항원 및/또는 종양 신생항원에 대해 백신접종된 HLA-일치 또는 HLA-일배수동종 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 수득되고, 조성물은 CD8+ T 세포가 고갈되며, 조성물은 대상체에 존재하는 바이러스 및/또는 종양 신생항원에 특이적인 CD4+ T 세포의 확장된 집단을 포함하는, 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
[0075] 본 발명의 조성물 및 방법은 방광암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 자궁경부암, 위장관암, 비뇨생식기암, 두경부암, 폐암, 난소암, 전립선암, 신장암, 피부암 및 고환암을 비제한적으로 포함하는 광범위한 암 및 종양 유형에 대해 사용될 수 있다. 더욱 특히, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암은 비제한적으로 하기를 포함한다: 예를 들어 육종, 예를 들어 혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종 및 지방육종을 포함하는 심장암; 점액종; 횡문근종; 섬유종; 지방종 및 기형종; 예를 들어, 기관지 암종, 예를 들어 편평 세포, 미분화 소세포, 미분화 대세포 및 선암종을 포함하는 폐암; 폐포 및 세기관지 암종; 기관지 선종; 육종; 림프종; 연골종 과오종; 및 중피종; 예를 들어, 식도암, 예를 들어 편평 세포 암종, 선암종, 평활근육종 및 림프종을 포함하는 위장관암; 위암, 예를 들어 암종, 림프종 및 평활근육종; 췌장암, 예를 들어 관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 카르시노이드 종양 및 비포마(vipoma); 소장암, 예를 들어 선암종, 림프종, 카르시노이드 종양, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종 및 섬유종; 대장암, 예를 들어 선암종, 세뇨관 선종, 융모 선종, 과오종 및 평활근종; 예를 들어, 신장암, 예를 들어 선암종, 빌름 종양(신모세포종), 림프종 및 백혈병을 포함하는 비뇨생식기암; 방광 및 요도의 암, 예를 들어 편평 세포 암종, 이행 세포 암종 및 선암종; 전립선암, 예를 들어 선암종 및 육종; 고환암, 예를 들어 정액종, 기형종, 배아 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 간질 세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 선종 종양 및 림프종; 예를 들어, 간암, 예를 들어 간세포 암종을 포함하는 간암; 담관암종; 간모세포종; 혈관육종; 간세포 선종; 및 혈관종; 골암, 예를 들어 골형성 육종(골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 림프종(세망 세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대 세포 종양 척삭종, 연골종(골종 외골종), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 골골종 및 거대세포종양을 포함하는 골암; 예를 들어, 두개골의 암, 예를 들어 골종, 혈관종, 육아종, 황색종 및 골염을 포함하는 신경계 암; 수막암, 예를 들어 수막종, 수막육종 및 신경교종증; 뇌암, 예를 들어 성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 뇌실막종, 생식세포종(송과종), 다형 교모세포종, 희소돌기아교종, 신경초종, 망막모세포종 및 선천성 종양; 및 척수암, 예를 들어 신경섬유종, 수막종, 신경교종 및 육종; 예를 들어, 자궁암, 예를 들어 자궁내막 암종을 포함하는 부인과 암; 자궁경부암, 예를 들어 자궁경부암종, 및 전종양 자궁경부 이형성증; 난소암, 예를 들어 장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 분류되지 않은 암종, 과립막 수막 세포 종양, 세르톨리 라이디히 세포 종양, 배아 이상종 및 악성 기형종을 포함하는 난소 암종; 외음부암, 예를 들어 편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종 및 흑색종; 질암, 예를 들어 투명 세포 암종, 편평 세포 암종, 보트로이드 육종 및 배아 횡문근 육종; 및 나팔관의 암, 예를 들어 암종; 혈액암, 예를 들어 혈액암, 예를 들어 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종 및 골수이형성 증후군, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(악성 림프종) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함하는 혈액암; 예를 들어, 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 두더지 이형성 모반, 지방종, 혈관종, 피부 섬유종, 켈로이드, 건선을 포함하는 피부암; 및 예를 들어 신경모세포종을 포함하는 부신암. 특정 구현예에서, 질환이 암인 경우, 이는 예를 들어 폐암 종양, 유방암 종양, 전립선암 종양, 뇌암 종양, 또는 피부암 종양을 포함할 수 있다.
[0076] 본 발명의 조성물은 다양한 경로, 예를 들어 경구, 국소, 비경구, 질내, 전신, 근육내, 직장 또는 정맥내로 개체에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 약학적 담체와 함께 제형화된다. 바람직하게는, 조성물은 정맥내 투여된다.
[0077] 일부 구현예에서, 조성물은 다른 항바이러스제 또는 항암제의 투여, 방사선 요법, 광선요법 또는 면역요법과 같은 다른 항바이러스 또는 항암 요법과 조합된다. 항바이러스제 또는 항암제는 치료를 향상시키기 위해 동일한 제형 또는 별도의 제형으로 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있다. 이들 구현예에서, 조성물 및 기타 요법은, 원하는 효과를 갖기에 충분히 가까운 시간에 이러한 방식으로 시행된다면, 동시에(동시에) 또는 별도의 시간에(순차적으로) 투여될 수 있다.
[0078] 본 발명의 조성물은 또한 예를 들어 화학요법, 방사선 또는 수술에 의해 암을 치료하는 기존 방법과 조합하여 투여될 수 있다. 따라서, 유효량의 본 발명의 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 추가로 제공되며, 여기서 유효량의 적어도 하나의 추가 암 화학요법제가 개체에게 투여된다. 적합한 화학요법제의 예에는 아바렐릭스(abarelix), 알데스류킨(aldesleukin), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알리트레티노인(alitretinoin), 알로푸리놀(allopurinol), 알트레타민(altretamine), 아나스트로졸(anastrozole), 아르센 트리옥사이드(arsenic trioxide), 아스파라기나제(asparaginase), 아자시티딘(azacitidine), 베바시주맙(bevacizumab), 벡사로텐(bexarotene), 블레오마이신(bleomycin), 보르테좀비(bortezombi), 보르테조밉(bortezomib), 부설판(busulfan) 정맥주사, 부설판 경구약, 칼루스테론(calusterone), 카페시타빈(capecitabine), 카르보플라틴(carboplatin), 카르무스틴(carmustine), 세툭시맙(cetuximab), 클로르암부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 달테파린 소듐(dalteparin sodium), 다사티닙(dasatinib), 다우노루비신(daunorubicin), 데시타빈(decitabine), 데니류킨(denileukin), 데니류킨 디프티톡스(denileukin diftitox), 덱스라족산(dexrazoxane), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate), 에쿨리주맙(eculizumab), 에피루비신(epirubicin), 에를로티닙(erlotinib), 에스트라무스틴(estramustine), 에토포시드 포스페이트(etoposide phosphate), 에토포시드(etoposide), 엑셈에스탄(exemestane), 펜타닐 시트레이트(fentanyl citrate), 필그라스팀(filgrastim), 플록스우리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 플루오로우라실, 플루베스트란트(fulvestrant), 게피티닙(gefitinib), 젬시타빈(gemcitabine), 겜투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 히스트렐린 아세테이트(histrelin acetate), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan), 아이다루비신(idarubicin), 아이포스파미드(ifosfamide), 이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate), 인터페론 알파 2a, 이리노테칸(irinotecan), 라파티닙 디토실레이트(lapatinib ditosylate), 레날리도미드(lenalidomide), 레트로졸(letrozole), 류코보린(leucovorin), 류프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 레바미솔(levamisole), 로무스틴(lomustine), 메클로레타민(meclorethamine), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 멜팔란(melphalan), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 메톡트렉세이트, 메톡살란, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론(mitoxantrone), 난드롤론 펜프로피오네이트(nandrolone phenpropionate), 넬라라빈(nelarabine), 노페투모맙(nofetumomab), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 파미드로네이트(pamidronate), 파니투무맙(panitumumab), 페가스파르가세(pegaspargase), 페그필그라스팀(pegfilgrastim), 페메트렉세드 디소듐(pemetrexed disodium), 펜토스타틴(pentostatin), 피포브로만(pipobroman), 플리카마이신(plicamycin), 프로카르바진(procarbazine), 퀴나크린(quinacrine), 라스부리카세(rasburicase), 리툭시맙(rituximab), 소라페닙(sorafenib), 스트렙토조신(streptozocin), 수니티닙(sunitinib), 수니티닙 말레에이트(sunitinib maleate), 타목시펜(tamoxifen), 테모졸로미드(temozolomide), 테니포시드(teniposide), 테스토락톤(testolactone), 탈리도미드(thalidomide), 티오구아닌(thioguanine), 티오테파(thiotepa), 토포테칸(topotecan), 토레미펜(toremifene), 토시투모맙(tositumomab), 트라스투주맙(trastuzumab), 트레티노인(tretinoin), 우라실 머스타드(uracil mustard), 발루비신(valrubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 비노렐빈(vinorelbine), 보리노스타트(vorinostat), 및 졸레드로네이트(zoledronate) 중 임의의 것을 포함한다.
[0079] 일 양태에서, 대상체에게 투여하기 위한 동종이계 림프구 조성물을 제조하는 방법은, 수용자에 존재하는 항원에 대한 인간 공여자를 백신접종시키는 단계로서, 수용자가 대상체인 단계; 수용자에 대해 동종이계인 인간 공여자로부터의 말초 혈액 세포 조성물을 제공하는 단계로서, 말초 혈액 세포 조성물은 다수의 CD4+ T 세포, 다수의 CD8+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, 여기서 (i) 공여자는 수용자에 존재하는 항원에 대해 CD4+ T-세포 면역을 가지며, (ii) 공여자는 수용자 대비 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치하며, (iii) 수용자는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖고 있지 않는, 단계; 및 말초 혈액 세포 조성물의 CD8+ T-세포의 수를 적어도 한자릿수만큼 감소시킴으로써 말초 혈액 세포 조성물로부터 동종이계 림프구 조성물을 제조하는 단계로서, 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, 동종이계 림프구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포와 동일하거나 그 미만인, 단계를 포함한다.
[0080] 다양한 양태에서, 대상체에게 동종이계 림프구 조성물을 투여하기 전에, 방법은 대상체에서 일시적인 림프구감소증을 유도하기 위해 대상체에게 림프-감소 비-림프-절제(lympho-reductive non-lympho-ablative) 치료를 시행하거나; 골수-유래된 억제제 세포를 고갈시키거나 억제하는 치료를 시행하거나; 종양 관련 대식세포를 고갈 또는 억제하기 위한 치료를 시행하거나 조절성 T 세포를 고갈시키기 위한 치료를 시행하는 것을 추가로 포함하며; 또는 방법은 대상체에게 동종이계 림프구 조성물을 투여한 후, 동종반응성 T-세포의 선택적 고갈을 유도하기 위해 약물을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
[0081] 일 양태에서, 림프-감소 비-림프-절제 치료는 대상체를 알킬화제, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아, 트리아젠, 항대사물질, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 빈카 알칼로이드, 에피포도필로톡신, 항생제, 디브로모만니톨, 데옥시스페구알린, 디메틸 마일러란 및 티오테파(thiotepa)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포감소제로 처리하는 것을 포함한다. 일 양태에서, 림프감소성 비-림프절제 치료는 대상체를 알킬화제로 처리하는 것을 포함하며, 알킬화제는 사이클로포스파미드이다. 일 양태에서, 제1 동종이계 림프구 조성물을 대상체에게 투여한 후, 방법은 대상체에게 항종양 모노클로날 항체 또는 항-종양 모노클로날 항체/약물 컨쥬게이트의 투여를 추가로 포함한다.
[0082] "림프-고갈 요법", "림프-감소 요법" 등은 말초 혈액에서 림프구의 농도를 감소시키는 화학 요법과 같은 약물 또는 기타 제제를 나타냄을 의미한다. "감소"는 적어도 10%, 25%, 50%, 75% 또는 100%의 음의 변경을 의미한다.
[0083] 일 양태에서, 방법은 항-종양 모노클로날 항체의 투여를 추가로 포함하며, 항-종양 모노클로날 항체는 리툭시맙, 세툭시맙, 트라스투주맙 및 퍼투주맙으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 양태에서, 본 발명은 항-종양 모노클로날 항체/약물 컨쥬게이트의 투여를 포함하고, 항종양 모노클로날 항체/약물 컨주게이트는 브렌툭시맙 베도틴, 겜투주맙 오조가미신, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가미신, 글렘바투무맙 베도틴, 로르보투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신 및 밀라투주맙-독소루비신으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 투여는 먼저 동종이계 림프구 조성물이고, 이어서 대상체에 대한 화학요법제의 투여이다. 예를 들어, 화학요법제는 다사티닙, 닐로티닙, 포나티닙, 이마티닙, 라파티닙 및 비스모데깁으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0084] 다른 양태에서, 동종이계 림프구 조성물을 대상체에게 투여하기 전에 치료는 다사티닙, 5-플루오로우라실, 탁소테레, 클로드로네이트, 젬시타빈, 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 데닐류킨 디프티톡스 및 다클리주맙으로 구성된 군으로부터 선택된 약물의 투여를 포함한다.
[0085] 일부 양태에서, 말초 혈액 세포 조성물은 전혈 생성물 또는 성분채집 생성물일 수 있다.
[0086] 다양한 양태에서, 대상체는 나노입자 조성물을 종양 내로 주사하였고, 여기서 나노입자 조성물은 대상체에 존재하지 않는 항원을 포함하는 나노입자를 포함한다. 많은 양태에서, 나노입자는 사이토카인을 추가로 포함하고, 여기서 사이토카인은 인터류킨이고, IL-2, IL-7, IL-12 및 IL-15로 구성된 군으로부터 선택되거나; 사이토카인은 인터페론이고, 인터페론 감마, 인터페론 베타, 인터페론 알파, 인터페론, 타우, 인터페론 오메가 및 콘센서스 인터페론으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0087] 추가의 구현예에서, 본 발명은 바이러스 항원, 종양 신생항원 또는 이들의 조합물에 특이적인 CD4+ T 세포를 포함하는 세포 은행을 제공하고, 세포 은행은 상이한 인간 백혈구 항원(HLA) 유형의 공여자로부터 수집된 CD4+ T 세포를 포함한다.
[0088] 다양한 양태에서, 바이러스 항원은 HPV 항원이다.
[0089] 일 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 수득된 인간 수용자에게 투여하기 위한 동종이계 림프구 조성물을 제공한다.
[0090] 수용자가 CMV 항원에 대해 혈청양성이면, 공여자의 상태는 중요하지 않다. 공여자가 수용자에게 존재하거나 수용자에게 전달될 항원에 대해 면역화되지 않은 특정 구현예에서, CD4+ T-세포 도움의 전달은 수용자 세포 상의 동종이계 HLA 클래스 II 분자의 공여자 CD4+ T-세포 인지에 달려있다. 그 후, 본 발명의 이들 구현예를 예시할 목적으로 "이상적인 공여자"의 예는 HLA 클래스 II 대립유전자(특히, HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1)에서 완전히 불일치하고, 클래스 I 대립유전자에 대해 완전히 일치한다(수용자에서 공여자 세포의 생존을 최대화하기 위해 그리고, 클래스 I 분자에 대한 동종항체 형성을 최소화하기 위해). 또한 이상적인 공여자는 동종 줄기 세포 이식을 위한 잠재적 공여자인 수용자의 일촌 친척의 비공유된 HLA와 완전히 불일치한다.
[0091] 일 구현예에서 인간 수용자에게 투여하기 위한 인간 동종이계 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 유래된 동종이계 림프구 조성물이 있으며, 동종이계 림프구 조성물은 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 다수의 CD4+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, 여기서 (i) 공여자는 공여자 대 수용자 방향으로 수용자에 대해 불일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 불일치하며, (ii) 수용자는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖고 있지 않으며, (iii) 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T 세포의 수와 약 50% 미만(비제한적으로, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 바람직하게는 약 20% 미만, 더욱 바람직하게는 약 10% 미만)으로 상이하다.
[0092] 또한, 인간 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 대상체에서 일시적 림프구감소증을 유도하기 위해 림프-감소(본 발명의 이 양태의 일부 구현예에서, 투여된 림프구 조성물의 항상성 확장 및 분화를 촉진하기 위해 림프-감소 비-림프-절제 치료를 제공하는 것이 바람직하며; 다른 구현예에서, 치료는 또한 골수-감소성인 것이 바람직함(즉, 골수-유래된 억제제 세포, 종양 관련 대식세포 및 또는 N2 호중구를 포함하는 억제성 골수 집단을 억제하거나 고갈시킴)) 비-림프-절제 치료를 대상체에 시행하는 단계; 및 후속하여 대상체에게 인간 동종이계 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 유래된 제1 동종이계 림프구 조성물을 투여하는 단계로서, 제1 동종이계 림프구 조성물은 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 다수의 CD4+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, 여기서 (i) 공여자는 공여자 대 대상체 방향으로 대상체에 대해 불일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하고, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA- DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 불일치하며, (ii) 대상체는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출 가능한 항체를 갖고 있지 않으며, (iii) 제1 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, (iv) 킬로그램(kg)의 대상체의 이상적 체중을 기반으로 하는 공여자 CD4+ T-세포의 수는 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg이며, (v) 제1 동종이계 림프구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포의 수 이하이고, (vi) 제1 동종이계 림프구 조성물은 말초 혈액 세포 조성물에 비해 적어도 한자릿수 적은 수의 CD8+ T-세포를 갖는, 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
[0093] 특정 이론에 얽매이기를 원하지 않지만, 주입된 CD4+ 세포는 다른 세포 유형, 주로 대상체의 CD8+, 대식세포 및/또는 대상체에서 이들 세포의 세포독성 기능을 증가시키는 항원 제시 세포에 신호를 제공하며(대상체의 용인된 CD4+/대상체의 소진된 CD8+); 이 방법에 의한 질병 또는 질환의 치료, 적어도 골수이형성 증후군의 치료의 예가 예시되어야 한다.
[0094] 일 양태에서, 대상체의 질병 또는 질환을 치료하는데 사용하기 위한 키트가 제공되며, 키트는 본원에 기술된 바와 같은 림프구 조성물(여기서 대상체는 인간 수용자임); 및 인간 수용자에 존재하지 않은 항원을 포함하는 나노입자를 포함하는 나노입자 조성물을 포함한다. 일 양태에서, 나노입자는 사이토카인, 예를 들어 인터류킨 또는 인터페론을 추가로 포함한다. 사이토카인은 인터류킨일 수 있으며, IL-2, IL-7, IL-12 및 IL-15로 구성된 군으로부터 선택된다. 사이토카인은 인터페론, 예를 들어, 인터페론 감마, 인터페론 베타, 인터페론 알파, 인터페론 타우, 인터페론 오메가 및 콘센서스 인터페론일 수 있다.
[0095] 나노입자는 케모카인, 영상화제, 광안테나 분자, 열 안테나 분자 및 Toll-유사 수용체 리간드, CD4+ T-세포의 타입 I(예를 들어, IFN-감마 생성) CD4+ 메모리 T-세포로의 분화를 촉진하는 리간드, 항원 제시 세포의 활성화를 유도하는 수용체에 대한 리간드(예를 들어, 항-CD40 항체 또는 앱타머)로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 나노입자는 나노입자를 종양 세포 또는 항원-제시 세포로 표적화하는 제제를 포함할 수 있다.
[0096] 일 양태에서, 대상체에게 제1 동종이계 림프구 조성물을 투여한 후, 방법은 대상체에 모노클로날 항체/CD4+ T-세포 에피토프 컨쥬게이트의 투여를 추가로 포함한다. 일 양태에서, 대상체에 제1 동종이계 림프구 조성물을 투여한 후, 방법은 대상체에서 일시적 림프구감소증을 유도하기 위해 대상체에게 연속적인 림프-감소 비-림프-절제 치료를 시행하는 단계; 및 후속하여 추가적인 인간 동종이계 공여자의 추가적인 말초 혈액 세포 조성물로부터 유래된 연속적인 동종이계 림프구 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 연속적인 동종이계 림프구 조성물은 추가 공여자의 추가적인 말초 혈액 세포 조성물로부터 다수의 CD4+ T 세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며; 여기서 (i) 추가적인 공여자는 추가적인 공여자 대 대상체 방향으로 대상체에 비해 불일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 불일치하며, (ii) 대상체는 추가적인 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 가지지 않으며, (iii) 연속적인 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 추가의 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, (iv) 대상체의 이상적인 체중 킬로그램(kg)을 기반으로 하는 추가의 공여자 CD4+ T-세포의 수는 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg이며, (v) 성공적인 동종이계 림프구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 추가의 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포의 수와 같거나 그 미만이며, (vi) 성공적인 동종이계 림프구 조성물은 추가적인 림프구 혈액 세포 조성물에 비해 적어도 한자릿수 적은 CD8+ T-세포를 갖는, 단계를 추가로 포함한다. 대상체에게 제1 동종이계 림프구 조성물을 투여한 후, 방법은 T-세포에서 음성 신호전달을 차단하는 제제의 투여를 추가로 포함한다. T-세포에서 음성 신호전달을 차단하는 제제는 항-PD-1 항체, 이필리무맙, 항-PD-L2 항체 및 PD-1 융합 단백질로 구성된 군으로부터 선택된다. 질환 또는 질병은 암, 자가면역 장애, 장기 이식, 동종이식 거부 및 바이러스 감염으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 질병 또는 질환은 암이며, 암은 골수이형성 증후군이다.
[0097] 일 구현예에서, 본 발명은 인간 수용자에게 투여하기 위한 동종이계 림프구 조성물을 제조하는 방법으로서, 수용자에 대해 동종이계인 인간 공여자로부터의 말초 혈액 세포 조성물을 제공하는 단계로서, 말초 혈액 세포 조성물은 다수의 CD4+ T 세포, 다수의 CD8+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, 여기서 (i) 공여자는 수용자에 존재하는 항원에 대해 CD4+ T-세포 면역을 가지며, (ii) 공여자는 수용자에 대해 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치하며, (iii) 수용자는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖고 있지 않은, 단계; 및 말초 혈액 세포 조성물의 CD8+ T-세포의 수를 적어도 한자릿수만큼 감소시킴으로써 말초 혈액 세포 조성물로부터 동종이계 림프구 조성물을 제조하는 단계로서, (a) 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, (b) 동종이계 림프구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포와 동일하거나 그 미만인 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
[0098] 일 양태에서, 잠재적 동종이계 공여자는 하나 초과의 HLA 클래스 II 대립유전자에서 잠재적인 동종이계 공여자와 수용자 사이의 불일치를 최소화하는 것을 기반으로 하는 하나 이상의 잠재적인 동종이계 공여자(들)로부터 선택되며, 잠재적인 동종이계 공여자는 공여자로서 선택된다. 잠재적 동종이계 공여자는 하나 초과의 HLA 클래스 II 대립유전자(들)에서 잠재적인 동종이계 공여자와 수용자 사이의 불일치를 최소화하는 것을 기반으로 하는 하나 이상의 잠재적인 동종이계 공여자(들)로부터 선택되며, 잠재적인 동종이계 공여자는 공여자로서 선택된다.
[0099] 일 양태에서, 공여자가 면역성을 갖는, 수용자에 존재하는 항원은 바이러스 항원이고, 바이러스 항원은 인간 유두종바이러스 항원, 엡스타인 바르 바이러스 항원, 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV) 항원, A형 간염 바이러스 항원, B형 간염 바이러스 항원 및 C형 간염 바이러스 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 바이러스 항원은 인간 유두종바이러스 항원이고, 인간 유두종바이러스 항원은 E6 또는 E7 항원 펩티드이다. 일 양태에서, 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 20% 미만으로 상이하다.
[0100] 일 구현예에서, 인간 수용자에게 투여하기 위한 인간 동종항원 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 유래된 동종항원 림프구 조성물이 제공되며, 동종이계 림프구 조성물은 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 다수의 CD4+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, (i) 도너는 수용자에 존재하는 항원에 대한 CD4+ T-세포 면역을 가지며, (ii) 공여자는 수용자에 대해 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하고, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치하며, (iii) 수용자는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖고 있지 않으며, (iv) 대립유전자 백혈구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, 수용자의 이상적 체중 킬로그램(kg)을 기반으로 하는 공여자 CD4+ T-세포의 수는 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg이며, 대립유전자 백혈구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포의 수와 동일하거나 그 미만이며, 동종이계 림프구 조성물은 말초 혈액 세포 조성물에 비해 적어도 한자릿수 더 적은 CD8+ T-세포를 갖는다.
[0101] 본 발명은 인간 수용자에게 투여하기 위한 인간 동종항원 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 유래된 동종항원 림프구 조성물을 제공하며, 동종이계 림프구 조성물은 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터의 다수의 CD4+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, (i) 공여자는 수용자에 존재하지 않는 항원에 대한 CD4+ T-세포 면역을 가지며, (ii) 공여자는 수용자에 대해 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하고, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치하며, (iii) 수용자는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖고 있지 않으며, 대립유전자 백혈구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, 수용자의 이상적 체중 킬로그램(kg)을 기반으로 하는 공여자 CD4+ T-세포의 수는 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg이며, (vi) 대립유전자 백혈구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포의 수와 동일하거나 그 미만이며, (vii) 동종이계 림프구 조성물은 말초 혈액 세포 조성물에 비해 적어도 한자릿수 더 적은 CD8+ T-세포를 갖는다.
[0102] 본 발명은 인간 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 인간 동종이계 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 유래된 동종이계 림프구 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하며, 동종이계 림프구 조성물은 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터의 다수의 CD4+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, (i) 공여자는 대상체에 존재하는 항원에 대한 CD4+ T-세포 면역을 가지며, (ii) 공여자는 대상체에 대해 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하고, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치하며, (iii) 대상체는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖고 있지 않으며, (iv) 대립유전자 백혈구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, (v) 대상체의 이상적 체중 킬로그램(kg)을 기반으로 하는 공여자 CD4+ T-세포의 수는 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg이며, (vi) 대립유전자 백혈구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포의 수와 동일하거나 그 미만이며, (vii) 동종이계 림프구 조성물은 말초 혈액 세포 조성물에 비해 적어도 한자릿수 더 적은 CD8+ T-세포를 갖는다.
[0103] 본원에 기재된 본 발명의 방법에서, 임의적으로 동종이계 림프구 조성물을 대상체에게 투여하기 전에 방법은 골수-유래 억제제 세포를 고갈시키거나 억제하기 위한 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 골수-유래된 억제제 세포를 고갈시키거나 억제하는 치료는 예를 들어, 다사티닙, 5-플루오로우라실, 탁소테레, 클로드로네이트 및 젬시타빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 약물의 투여를 포함할 수 있다. 임의적으로, 동종이계 림프구 조성물을 대상체에게 투여하기 전에, 방법은 종양 관련 대식세포를 고갈시키거나 억제하기 위한 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 임의적으로, 동종이계 림프구 조성물을 대상체에게 투여하기 전에, 방법은 조절성 T 세포를 고갈시키기 위한 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 조절성 T 세포를 고갈시키는 치료는 사이클로포스파미드, 이델라리십, 데닐류킨 디프티톡스 및 다클리주맙으로 구성된 군으로부터 선택된 약물의 투여를 포함할 수 있다.
[0104] 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간 대상체에서 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 나노입자 조성물을 종양에 주사하는 단계로서, (나노입자는 대상체에 주사되거나 주입될 수 있으며, 나노입자는 표적화제를 추가로 포함하며, 표적화제는 표적 세포, 예컨대 분산/비국소화된 신생물(예를 들어, 림프종 또는 백혈병)에 결합하며, 여기서 모든 가능한 부위에서 직접 주사는 실제적이거나 적합하지 않음) 나노입자 조성물은 대상체에 존재하지 않은 항원을 포함하는 나노입자를 포함하여, 항원을 대상체에 도입시키는 단계; 인간 동종이계 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 유래된 동종이계 림프구 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 동종이계 림프구 조성물은 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터의 다수의 CD4+ T-세포 및 다수의 천연 킬러 세포를 포함하며, (i) 공여자는 항원에 대한 CD4+ T-세포 면역을 가지며, (ii) 공여자는 대상체에 대해 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 포함하고, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치하며, (iii) 대상체는 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖고 있지 않으며, (iv) 대립유전자 백혈구 조성물의 CD4+ T-세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이하며, (v) 대상체의 이상적 체중 킬로그램(kg)을 기반으로 하는 공여자 CD4+ T-세포의 수는 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg이며, (vi) 대립유전자 백혈구 조성물의 천연 킬러 세포의 수는 말초 혈액 세포 조성물의 천연 킬러 세포의 수와 동일하거나 그 미만이며, (vii) 동종이계 림프구 조성물은 말초 혈액 세포 조성물에 비해 적어도 한자릿수 더 적은 CD8+ T-세포를 갖는, 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 항원은 비인간 동물 항원이고, 비인간 동물 항원은 키홀 림펫 헤모시아닌 항원이다. 또 다른 양태에서, 항원은 바이러스 항원이고, 바이러스 항원은 인간 유두종바이러스 항원, 엡스타인 바르 바이러스 항원, 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스(KSHV) 항원, A형 간염 바이러스 항원, B형 간염 바이러스 항원 및 C형 간염 바이러스 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0105] 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
[0106] 골수이형성 증후군(MDS)은 혈액 세포의 이형성의 비효율적인 골수 생성 및 급성 백혈병으로의 다양한 변형 위험을 특징으로 하는 악성 줄기 세포 장애의 다양한 그룹이다. 이러한 장애는 새로 발생하거나 잠재적으로 돌연변이 유발 화학요법에 노출되고 몇 년 후에 발생할 수 있다.
[0107] 올해 미국에서 약 12,000-20,000건의 새로운 MDS 사례가 진단될 것이며, 발병 연령 중앙값은 60 내지 72세이다. 골수이형성 증후군에 대한 현재의 치료 결과는 실망스러웠다. IPSS(International Prognostic Scoring System)에 의해 결정된 연령, 수행 상태 및 질병 위험 범주는 일반적으로 치료 방식의 선택을 결정한다. 60세 미만, 수행 상태가 양호하거나 우수하고 IPSS 중간-2 또는 고위험 범주에 속하는 환자는 이러한 IPSS 범주가 각각 1.2년 및 0.4년의 생존 중앙값을 제공하기 때문에 주로 고강도 요법에 대해 고려될 것이다. 고강도 요법은 집중 병용 화학요법 및 조혈 세포 이식을 포함하여 입원이 필요한 치료로 정의된다.
[0108] 저급 또는 중급-1 범주의 환자는 일반적으로 저강도 요법으로 고려된다. 여기에는 조혈 성장 인자, 분화 유도제, 생물학적 반응 조절제 및 저강도 화학 요법과 같은 외래 진료소에서 시행될 수 있는 치료를 포함한다. 수행 상태가 좋지 않은 환자에는 보충 요법 또는 저강도 요법이 고려될 것이다.
실시예 1- IDE 장치
[0109] 이 시험에 사용되는 임상시험용 제제는 인간 혈액 생성물로부터 CD8+ T 세포를 풍부화하거나 고갈시키는 데 사용되는 의료 기기인 CliniMACS® CD8 시약을 갖는 CliniMACS 시스템이다. CD8+ 세포 선택을 위해 의도된 CliniMACS® 시스템은 4가지 기본 구성요소를 포함한다: 1) CliniMACS® CD8 시약 - 인간 CD8에 대한 뮤린 항체에 연결된 콜로이드성 초상자성 철-덱스트란 비드; 2) CliniMACSplus 기기 - 혈액 샘플(세포 생성물)을 처리하는 소프트웨어 제어 기기; 3) CliniMACS® 튜빙 세트(표준 또는 LS) - 2개의 독점 셀 선택 컬럼이 있는 단일 사용의 멸균 일회용 튜빙 세트; 및 4) CliniMACS® PBS/EDTA 완충액 - 혈액 세포의 시험관 내 제조를 위한 외부 세척 및 수송 유체로 사용되는 멸균 등장성 인산염 완충된, 1mM EDTA, 식염수 용액. 이 시스템은 많은 세포 유형을 분리하기 위한 강력한 도구인 자성 세포 분류(MACS®)를 활용하여 관심 세포 집단을 선택적으로 풍부하게 하거나 고갈시킨다. 이 경우, CD8+ T 세포는 초상자성 입자에 연결된 모노클로날 항체로 표지된 다음 표지된 세포를 제거하기 위해 강자성 기질이 있는 분리 컬럼과 강력한 영구 자석이 통합된 CliniMACS 시스템을 통과하여 혈액 생성물로부터 고갈된다. 치료제인 CD8+ T 세포-고갈된 혈액 세포는 장치에서 나오며, 장치의 임의의 구성 요소를 함유하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 2 - 일시적으로 이식된 공여자 림프구는 임상 종양 반응을 유도한다
[0110] 현재까지 MDS 환자의 생존을 연장할 수 있는 치료법은 단지 두 가지뿐이다. 첫 번째, 동종이계 BMT는 질병 진행 지연뿐만 아니라 일부 장기간 치료를 달성하였다. 이 요법은 연령, 공여자 이용 가능성 및 동반 질환으로 인해 침범 환자의 일부에만 적용가능하다. 두 번째는 메틸트랜스퍼라제 억제제인 5-아자시티딘이다. 이 요법은 보충 요법 단독에 비해 생존 중앙값을 7개월 연장하는 것으로 나타났다. 일부 MDS 환자는 혈구 수가 지속적으로 증가하면서 사이클로스포린, 항흉선세포 글로불린(ATG) 또는 스테로이드와 같은 면역억제 요법에 반응한다. 이 발견은 면역억제가 혈구감소증을 유발하는 자가면역 성분을 처리하는 재생불량성 빈혈과 유사하다. 면역계를 특이적으로 표적으로 하는 제제로 얻은 유리한 결과는 MDS가 면역 조절에 민감한 질병임을 시사한다. ATG, 사이클로스포린 및 스테로이드의 이점에 대한 한 가지 가능성 있는 설명은 이러한 약물이 항종양 면역을 억제하는 림프구를 선택적으로 억제하거나 치사시킴으로써 내인성 항종양 면역 반응의 활성을 드러낸다는 것이다. 또한, MDS에 대한 알려지지 않은 내인성 면역 반응의 존재에 대한 잠재적인 증거는 비-골수-절제, 부분적 HLA-불일치(일배수동종) 동종이계 골수 이식의 시험에서 나타났으며, 여기서 이식 거부에도 불구하고 5명의 환자가 질병 반응을 경험하였다. 5명의 환자 모두 골수 아세포의 백분율이 적어도 일시적으로 감소하였으며, 각각 이식 전에 적혈구 +/- 혈소판 수혈에 의존하였던 5명의 환자 중 3명은 수혈에 의존하지 않게 되었다. 표 1은 BMT 후 30일차에 공여자 세포 생착의 부재에도 불구하고, 5명의 환자 중 적어도 3명이 BMT 후 적어도 6개월 동안 지속되는 골수 아세포의 감소가 있었음을 입증한다.
표 1
Figure pct00001
[0111] 도 1은 BMT 후 동일한 5명의 환자의 헤마토크리트를 보여주며, 들쭉날쭉한 부분은 수혈의 효과를 반영한다. 5명의 환자 중 3명은 수혈에 의존하지 않게 되었으며, 환자 #1은 적어도 3년 동안 형태학적 및 혈액학적 완화 상태를 유지하였다. 더욱 흥미롭게도, 환자 #2는 지연된 혈액학적 반응을 보이며, 이는 BMT 후 4개월 및 이식 거부 기록 후 3개월에 수혈 독립이 되었다. 면역요법에 대한 MDS의 민감도에 비추어 볼 때, 내인성(즉, 숙주-유래된) 항종양 면역 반응이 일시적으로 생착된 공여자 림프구에 의해 제공되는 면역학적 교란에 의해 다시 깨어날 수 있다는 가능성이 제기되었다. 이식 거부 후 내인성 항-반응의 각성인 이러한 가정된 기전은 또한, 전처치 없이 또는 단지 100 cGy 전신 조사 후에 백혈구 수혈을 받은 환자에서 백혈병 완화 유도를 설명할 수 있다. 일시적으로 생착된 공여자 림프구 주입(DLI)이 마우스 모델에서 숙주 T 세포로부터 항종양 면역 반응을 유도할 수 있다는 가설이 테스트되었다. BALB/c x C57BL/6 F1 마우스는 -1일에 Cy로 처리하였으며, 0일차에 106개의 A20 림프종 세포(BALB/c 기원)를 단독으로, 일배수동종 DLI 단독과, 자가 종양 세포 백신 단독과, 또는 DLI+ 백신과 함께 IV 투여하였다. Cy 전처치 후 백신 단독을 투여하거나 치료제를 투여하지 않은 동물과 비교하여, Cy로 전처치된 후 DLI 단독 또는 DLI + 백신으로 처리된 것은 각각 5마리 및 4마리 동물에서 명백한 치유가 달성되어 현저하게 더 오래 생존하였다(도 2). 9마리의 치유된 동물 중 어느 것도 DLI 후 >100일에 테스트했을 때 어떠한 검출가능한 공여자 키메라 현상도 없었으며, 이는 공여자 T 세포가 거부되었음을 시사한다.
[0112] 이러한 결과는 Cy에 이어 부분적 MHC-불일치 DLI의 조합은 유의한 항-종양 효과를 유도하였음을 입증하였다. 항종양 효과에서 공여자 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 역할을 특성 규명하기 위해, 실험은 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 이 둘 모두가 고갈되거나 비처리된 Cy + 백신 + 5천만개의 불일치 비장 세포의 수용자에서 반복하였다. 이 실험에서, 전체 비장 DLI의 수용자는 모두 20일 전에 GVHD로 치사하였다(도 3a). 대조적으로, 백신과 CD8+ T 세포 고갈된 비장 세포가 투여된 마우스는 백신과 범-T 세포 고갈된 비장 세포를 투여받은 마우스보다 현저하게 더 오래 살았으며(p=.04), 이는 CD8+ T 세포의 고갈이 항종양 면역을 저지하지 않으면서 치명적 GVHD를 저지하였음을 나타낸다. 동종이계 DLI로부터의 CD8+ T 세포의 고갈이 GVHD를 저지한 이유를 이해하기 위해, Cy로 전처치된 후, T 세포 서브세트 중 하나 또는 둘 모두가 고갈되거나 비처리된 불일치 비장 세포를 주입한 마우스에서 공여자 세포의 생존을 연구하였다. 흥미롭게도, CD8+ T 세포-고갈된 비장 세포는 DLI 후 7일차에 정점에 도달하고 21일차까지 검출불가능한 수준으로 감소하는 공여자 CD4+ T 세포 키메라 현상과 함께 일시적으로만 생착되었다(도 3b). 대조적으로, CD8+ T 세포를 함유하는 DLI를 투여받은 모두 마우스에서 공여자 세포의 지속적인 생착이 관찰되었으며, 이들 동물 대부분으로 결국 GVHD로 사망하였다. 종합하면, 동물 연구는 Cy에 이어서 CD8+ T 세포 고갈 DLI가 급성 GVHD를 유도하지 않으면서 공여자 세포의 일시적인 생착과 상당한 항종양 효과를 유도한다는 것을 보여준다. 더욱 최근에는, "Cy + DLI" 이전에 숙주 CD8+ T 세포의 고갈이 치료 효과를 유의하게 감소시키는 것으로 밝혀졌으며, 이는 항종양 효과의 중요한 매개체로서의 숙주 CD8+ T 세포를 강력하게 내포한다.
실시예 3 - CD8+ T 세포 고갈된 동종이계 줄기 세포 또는 림프구 주입에 대한 임상 경험
[0113] Cy로 처리한 후 일배수동종 공여자로부터의 CD8+ T 세포 고갈된 PBC를 주입한 환자에 대한 보고는 없으며, 따라서 예비 안전성 데이터를 제공하는 것이 불가능하다. 그러나, CD8+ T 세포 고갈된 PBMC 주입물이 투여된 alloBMT 후의 재발 환자 또는 CD8+ T 세포-고갈된 이식편이 제공된 alloBMT 진행 중인 환자의 보고가 있었다. CD8+ T 세포 고갈의 목표는 주입된 항-백혈병 효과를 유지하면서 GVHD의 발생을 줄이는 것이었다. GVHD와 관련하여 연구는 결정적인 답변을 얻지 못하였으며, 일부 연구에서는 가능한 이점을 보여주고, 다른 연구에서는 아무것도 보여주지 못하였다. 흥미롭게도, CD8+ T 세포-고갈된 DLI의 주입은 내인성 CD8+ T 세포의 활성화를 유도하였으며, CD8+ T 세포-고갈된 DLI가 암에 대한 숙주 CD8+ T 세포 반응을 효과적으로 각성시킬 수 있다는 가설과 일치하는 발견이다.
[0114] 다른 두 연구의 결과는 제안된 임상 시험의 안전성에 대한 고려 사항과 관련이 있다. 첫 번째 연구에서, 다양한 혈액 악성 종양이 있는 환자는 하나의 HLA-DR 대립유전자 또는 하나의 HLA 클래스 I(HLA-A 또는 HLA-B) 항원과 불일치하는 혈연이 없는 공여자로부터 골수를 받았다. 환자는 적정 용량의 CD8+ T 세포를 함유하는 CD4+ T 세포 고갈된 이식편을 받았다. 주요 발견은 <3.1 x 106 CD8+ T 세포/수용자 체중 kg을 함유하는 이식편을 받은 10명의 환자 중 6명은 골수-절제 전처치에도 불구하고 이식 거부가 발생하였지만, >3.1 x 106개의 CD8+ T 세포/kg을 받은 15명의 환자 중에는 아무도 없었다는 것이다. 따라서 골수-절제 전처치 후에도 CD8+ T 세포 고갈은 이식 거부의 위험을 상당히 증가시키며, 이는 이식-유도 무형성 및 GVHD의 위험을 무효화한다.
[0115] 두 번째 연구에서 환자는, 약 1-1.5 x 104/kg의 CD8+ T 세포 용량으로 해석되는 평균 2.7 x 104 또는 3.5 x 104 CD3+ T 세포/kg을 각각 함유하는 T 세포-고갈된 일배수동종 말초 혈액 줄기 세포(PBSC; n = 15) 또는 PBSC + 골수 이식편(n = 28)을 받았다. T 세포 고갈에 직면하여 생착을 용이하게 하기 위해, 환자는 집중적으로 전처치하였고, PBSC 단독 대 PBSC + 골수의 수용자에 대해 각각 평균 14.0 x 106 또는 10.6 x 106 CD34+ 세포/kg을 함유하는 "메가-용량" 줄기 세포 이식편을 받았다. 낮은 T 세포 함량의 관점에서, GVHD 예방은 시행되지 않았다. 43명 환자 모두에서 생착이 발생하였으며, 이식 절차의 결과로서 급성 또는 만성 GVHD를 경험한 환자는 없었다. 이들 데이터는, 골수-절제 전처치를 받은 환자에서 지속된 생착이 발생하더라도 <104 CD8+ T 세포/kg을 함유하는 일배수동종 이식편이 GVHD를 초래할 가능성이 없음을 보여준다. 장치는 일반적으로 CD8+ T 세포의 >2 log 고갈을 달성하기 때문에, 시험에서 CD8+ T 세포 고갈된 PBC의 출발 용량은 아마도 104 CD8+ T 세포/kg보다 적게 함유할 것이다. 그 후, 이 용량을 투여받은 환자는 생착되지 않거나, 지속적인 생착이 발생하더라도 GVHD를 경험하지 않을 가능성이 있다.
실시예 4 - CliniMACS-CD8 시약을 갖춘 CliniMACS 시스템을 사용한 CD8 고갈
[0116] 이 시험에 있어서, CD8+ T 세포는 CliniMACS CD8 시약과 CliniMACS 시스템(Miltenyi Biotec, Woburn, MA)을 사용하여 고갈될 것이다. 첫 번째는 백혈구 성분채집 생성물을 사용하고 마지막 두 번은 정맥절개 시료를 사용하여 세 가지 검증 실행을 수행하였다. 마지막 고갈로부터의 유세포 분석 결과는 도 4에 나와 있으며, 이는 전체 세포의 8.40%에서 0.03%로의 CD8+ T 세포의 탁월한 고갈과 이에 상응하는 CD4+ T 세포 및 CD16+ 또는 CD56+ NK 세포의 풍부화를 보여준다. 아래 표는 세 생성물 모두 CD4+ T 세포 수의 3.2% 미만인 CD8+ T 세포 수를 갖는 프로토콜 기준을 충족함을 보여준다. 생성물 #2 및 #3을 사용하여 이상적인 체중 70kg의 수용자에게 106개의 CD4+ T 세포/kg의 용량을 전달하였다면, 이들은 생착 또는 GVHD 유도에 대한 임계값보다 훨씬 낮은 용량인 각각 2.6 x 103 및 7.7 x 102 CD8+ T 세포/kg IBW를 함유할 것이다. 이에 비해 이식 거부에도 불구하고 반응한 5명의 환자는 중앙값 1.43 x 107 CD4+ T 세포/kg(범위 0.84-3.14 x 107/kg) 및 1.86 x 107 CD8+ T 세포/kg(범위 0.43-2.16 x 107/kg)을 함유하는 골수를 받았다. 따라서 MDS 환자는 이 많은 T 세포를 함유하는 일배수동종 세포 주입을 거부할 수 있다.
표 2- CE8 고갈된 세포 생성물 검증 결과
Figure pct00002
실시예 5 - 요법에 대한 반응을 예측하기 위한 상관적 실험실 연구
[0117] MDS 환자에서 항흉선세포 글로불린과 같은 면역억제 요법의 잠재적인 독성에 비추어, 많은 조사자들은 요법에 대한 반응과 상관관계가 있는 환자 특성을 확인하기 위해 노력하였다. 질병 반응을 예측하는 이러한 특성에는 저세포성 골수, 스펙트럼형 분석에 의한 T 세포 수용체 베타 사슬 가변 영역 CDR3 크기에 의한 비정상적 T 세포 수용체 레퍼토리, 발작성 야간 혈색소뇨증(PNH)의 표현형 특징을 갖는 세포의 존재, HLADR15의 발현, 티로소마이 8, 더 어린 연령 및 더 짧은 수혈 이력을 포함한다. 따라서 한 목표는 면역억제 요법에 대한 반응을 예측하는 특성이 Cy + CD8+ T 세포-고갈된 일배수동종 DLI에 대한 반응을 또한 예측할 수 있는지 여부를 결정하는 것이었다. 이 시험에 참가한 환자는 치료 전과 후 모두에서 T 세포 수용체 베타 사슬 가변 영역 다양성에 대한 검사를 받을 것이다. 세포유전학 및 HLA 타이핑은 모든 환자에 대해 관례적으로 수행될 것이다.
[0118] 최근 연구는 일배수동종 줄기 세포 이식 후 급성 백혈병의 재발을 예방하는 데 공여자 천연 킬러 세포 동종반응성의 역할을 밝혀내었다. 더욱 최근에는 공여자 기원의 동종반응성 천연 킬러 세포가 HLA-동일 줄기 세포 이식 후 AML 및 MDS의 재발을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 HLA 리간드가 수용자 세포에서 누락된 KIR을 발현하는 공여자를 식별하도록 분자 및 유세포 분석 방법 둘 모두를 사용하여 공여자 NK 세포에서 킬러 면역글로불린-유사 수용체 또는 KIR의 발현된 레퍼토리를 특성화할 필요성을 강조한다.
실시예 6 - 제안된 시험 설계에 대한 근거
[0119] 이것은, 시험의 페이스 I 부분에서 사이클로포스파미드(Cy) 후 주입되는 경우 CD8+ T 세포-고갈된 일배수동종 말초 혈액 세포(CD8-PBC)의 최대 허용 용량(MTD)을 결정하고, 그 후 시험의 페이스 II 부분에서 Cy와 CD8-PBC의 MTD로의 처리 효능을 추정하기 위한 표준 페이스 I/II 시험 설계이다. 고용량 Cy(>100 mg/kg)는 혈액 악성 종양 환자에 대한 이식 전처치의 일부로서 광범위하게 사용되었으며, 골수이형성 증후군이 있는 고령 환자(55-66세)를 포함하여 이 집단에서 안전성이 잘 기록되어 있다. 사망을 유발할 가능성이 있기 때문에 치료의 가장 심각한 위험은 장기간 무형성 및 이식편대숙주병이며, 이들 둘 모두 공여자 세포의 지속적인 생착을 필요로 한다. 초기 세포 용량, 105 CD4+ T 세포/kg 및 <3.2 x 103 CD8+ T 세포/kg의 선택은 전적으로 안전성 고려 사항을 기반으로 하였다. 특히, <104 CD8+ T 세포/kg을 함유하는 이식편은 치명적인 전처치를 받고, 이식 후 약리학적 면역 억제를 받지 않은 환자 사이에서도 심각한 GVHD를 일으키지 않았다. 더욱이, 표준 골수 이식편에서 CD8+ T 세포의 부분적 고갈은 이식 거부의 위험을 상당히 증가시키며33, 이는 이 시험에서 원하는 치료 결과이다. 이러한 이유로 < 104 CD8+ T 세포/kg을 함유하는 DLI 생성물은 심각한 부작용을 일으키지 않을 것으로 생각된다.
[0120] CD8+ T-세포 고갈이 없는 일배수동종 DLI에 대한 경험이 최근에 발표되었다. 페이스 I/II 시험에서, 재발성/불응성 악성 종양이 있는 41명의 환자는 100 cGy 전신 방사선으로 비절제적 전처치를 받은 후 1 x 106 내지 2 x 108 일배수동종 CD3+ 세포/kg을 주입하였으며, 29명의 환자가 최고 용량을 받았다. 목표 반응은 더 높은 용량 수준에서 달성되었다. 특히, 1 x 108 CD3+ 세포/용량은 반응과 관련된 최소 용량(25% 반응률 또는 8명의 환자 중 2명)이었고, 2 x 108 CD3+ 세포/용량(가장 높은 평가)은 가장 큰 반응률(거의 50%, 환자 21명 중 10명)과 관련이 있다. 원칙의 증거로 모든 반응은 지속적인 공여자 키메라 현상의 부재하에 발생하였다. 최고 용량 코호트에서 일시적인 공여자 키메라 현상이 관찰되었으나, 대부분의 환자에서 2주까지 사라졌으며, 완전 공여자 키메라 현상으로 전환된 2명의 환자 중 한 명은 중증 급성 GVHD(스테로이드 반응성, 후속적으로 치명적인 패혈증 발생)를 발생시켰다. 사이토카인 플럭스(발열, 권태감, LFT 이상, 발진 및 설사 중 1개 이상을 특징으로 함)에 대해 아마도 이차적인 "하플로(haplo) 면역폭풍"이라는 급성 임상 증후군은 더 높은 용량 수준에서 일반적으로 관찰되었고 스테로이드에 대해 절묘하게 반응성이었다. 이 연구는 이 접근법의 생물학적 활성과 관리 가능한 안전성 프로파일을 입증하였다. 해당 연구에서 반응에 필요한 최소 CD3+ T-세포 용량(CD8+ 고갈 아님)은 1 x 108 세포/kg이었다.
실시예 7 - 특허 선택
[0121] 환자는 병리학적으로 확인되어야 한다: 골수이형성 증후군(MDS), IPSS 점수 Int-2 이상(IPSS 점수 시스템 사용). 환자는 5-아자시티딘 치료에 실패하였거나 부적격이거나 내약성이 없어야 한다.
실시예 8 - 치료 계획
[0122] 모든 환자는 자세한 병력 및 신체 검사에 대한 기록 및 심장, 간 및 신장 기능의 표준 평가가 필요할 것이다. 모든 환자는 프로토콜 등록 전 1개월 안에 형태학적, 세포유전학적(해당되는 경우) 및 유세포 분석(해당되는 경우) 평가를 위해 골수 흡인 및 생검과 함께, 해당되는 경우 다른 표준 질병 평가(예를 들어, 흉부, 복수, 골반의 CT)를 받을 것이다.
[0123] 치료전 평가
[0124] 사이클로포스파미드는 -2일과 -1일에 1-2시간(부피에 따라 다름)에 걸쳐 iv 주입으로 투여될 것이다. 사이클로포스파미드의 용량은 50 mg/kg/일이다. 용량은 조정된 이상적인 체중 또는 실제 체중 중 작은 쪽을 기준으로 계산된다. 체중과 신장은 직접 측정된다. 키에 대한 대략적인 체중은 이상적인 "값"을 반영하는 표준 테이블 또는 방정식으로부터 계산될 것이다.
[0125] 사이클로포스파미드 및 사전-DLI 요법
[0126] 환자는 사이클로포스파미드 투여 전에 밤새 체액을 증가시키도록 지시받을 것이다. 3cc/kg/hr iv의 생리 식염수를 이용한 수화는 사이클로포스파미드 투여 2시간 전에 시작한 다음, 사이클로포스파미드 전 1시간 동안 2cc/kg/hr로 속도 감소되고, 사이클로포스파미드 후 8시간 동안 계속될 것이다. 메스나(Mesna)는 사이클로포스파미드 30분 전과 사이클로포스파미드 후 3, 6 및 8시간에 분할된 용량으로 iv 제공될 것이다.
[0127] 메스나 용량은 주어진 사이클로포스파미드 용량을 기준으로 할 것이다. 메스나의 총 1일 용량은 사이클로포스파미드의 1일 총 투여량의 80%와 같다.
[0128] 예방적 항균 요법은 0일에 시작될 것이며, 기관의 관행을 따를 것이다.
[0129] 항진균 예방은 다음과 같이 시행될 것이다: 플루코나졸 400 mg po 또는 IV qd, 0일부터 시작하여 ANC가 >500이 될 때까지 연속 3일 동안 계속된다(또는 3일 기간에 걸쳐 2회 연속 측정). 또 다른 적절한 예방적 항진균제로 대체될 수 있다. 뉴모사이스티스 카리니이(Pneumocystis carinii) 폐렴(PCP) 예방은 0일차에 시작하여 60일차까지 계속되어야 한다. 트리메토프림/설파메톡사졸(박트림(Bactrim))에 내성이 없는 환자는 PCP 예방으로서 답손 또는 펜타미딘을 투여받을 것이다. 바이러스 예방은 0일차부터 60일차까지의 발라사이클로비르 또는 아사이클로비르로 구성될 것이다. 경구 퀴놀론(예를 들어, 목시플록사신 또는 노르플록사신)은 DLI 후 연속 3일 동안(또는 3일 기간에 걸쳐 2회 연속 측정 동안) ANC가 >500이 될 때까지 기관 선호도에 따라 투여될 것이다.
[0130] 모든 환자는 CliniMACS® CD8 시약과 함께 CliniMACS® 시스템을 사용하여 CD8+ T 세포가 고갈된 일배수동종 PBC를 주입 받게 될 것이다. 용량 수준의 넘버링은 가장 낮은 세포 용량에서 가장 높은 세포 용량까지이다. 제1 환자 코호트(용량 수준 1)는 1 x 105 CD4+ T 세포/수용자 IBW kg의 의도된 용량을 함유하는 CD8+ T 세포-고갈된 일배수동종 PBC(CD8-PBC) 플러스 Cy를 받게 될 것이다. 용량 증량 기준이 충족되면 용량 수준 2, 2b, 3 또는 4의 환자는 각각 1 x 106, 3 x 106, 1 x 107 또는 5 x 107 CD4+ T 세포/kg의 의도된 용량을 함유하는 CD8-PBC를 받게 될 것이다.
[0131] DLI 용량 계산
[0132] 의도된 용량의 CD4+ T 세포를 전달할 최종(CD8-고갈된) 생성물의 부피를 계산하는 공식은 다음과 같다: 의도된 부피(ml) = 의도된 CD4+ T 세포 용량(세포/kg) x 수용자 IBW*(kg)/ CD4+ T 세포 농도(세포/ml) *참고- 실제 중량 < 이상적 중량인 경우, 실제 중량을 사용한다.
[0133] 그러나, 주입되는 CD8+ T 세포의 총 수는 주입하려는 CD4+ T 세포의 의도된 수(위 방정식의 분자)의 3.2%를 초과할 수 없다. 고갈된 생성물의 CD4+/CD8+ 세포 비율이 31.25(= 1/.032) 미만인 경우, 주입할 생성물의 부피는 다음 공식에 의해 결정될 것이다: 최종 생성물의 CD4/CD8 비율 < 31.25이면: 주입 부피(ml) = 의도된 부피 x (CD4/CD8 비율)/31.25. 고갈된 생성물에서 CD4+/CD8+ 세포의 비율이 31.25 이상인 경우, 주입할 생성물의 부피는 의도된 부피이며(공식 1): 최종 생성물의 CD4/CD8 비율 > 31.25인 경우: 주입 부피(ml) = 의도된 부피이다.
[0134] 수혈 지원
[0135] 혈소판 및 포장 적혈구 수혈은 현재 기관 권장 사항에 따라 제공될 것이다.
실시예 9 - 치료 기간
[0136] 환자는 단지 한 번의 림프구 주입을 받을 수 있다. 이러한 제한은, 주입된 림프구의 거부가 공여자의 세포 또는 심지어 다른 가까운 친척에 대한 기억반응 면역을 유도할 것으로 예상되기 때문에 적용된다. 환자의 말초 혈액은 60일차에 수득되고, 인간 항-마우스 항체(HAMA)의 존재 및 공여자 세포에 대한 세포독성 항체에 대해 테스트될 것이다.
[0137] 후속 조치 기간
[0138] DLI 후 최소 60일 동안 환자를 추적한 다음 사망 또는 질병 진행 중 먼저 발생하는 시점까지 추적될 것이다. 허용할 수 없는 유해 사례로 인해 연구에서 제외된 환자 또는 치료 관련 유해 사례가 발생한 환자는 유해 사례가 해소되거나 안정화될 때까지 추적될 것이다.
[0139] DLI 후 모니터링:
[0140] 연구에 남아 있는 환자는 DLI 후 14, 28, 60일차와 6개월차에 혈액을 채취할 것이다. 이러한 채혈로 수동 감별이 있는 CBC를 얻을 것이다. CD4 또는 CD8을 발현하는 세포의 백분율을 포함하는 림프구 서브세트는 유세포 분석에 의해 분석될 것이다. 60일 후, 환자는 DLI 후 6개월까지 기록된 질병 진행이 없는 한 백혈구 감별과 함께 월별 전혈구 수를 갖게 될 것이다.
[0141] 질병 평가.
[0142] 위에 명시된 질병 평가에 추가하여, 표준 치료로 수행된 추가 질병 평가 결과는 사망 또는 질병 진행 중 먼저 발생하는 시점까지 연구 목적으로 수집될 것이다.
실시예 10 - 투여 지연/용량 수정
[0143] 사이클로포스파미드 용량은 변경되지 않을 것이다. DLI 용량은 CD8+ T 세포의 함량이 과도할 경우 수정될 것이다.
[0144] 유해 사례: 목록 및 보고 요건
[0145] 모든 급성 GVHD 환자에 대해 다음 정보를 수집해야 한다:
[0146] 발병 날짜(GVHD를 확인하는 첫 생검 날짜로 정의됨) 발병시, GVHD가 해소될 때까지 및 60일까지 매주 GVHD 평가지, 초기 전체 임상 등급, 최대 전체 임상 등급, 존재하는 경우, III-IV 등급 급성 GVHD 발병 날짜.
[0147] 60일 후 급성 및 만성 GVHD의 발생 및 중증도는 환자의 6개월 평가에서 포착될 것이다.
[0148] II-IV 등급 급성 GVHD의 모든 사례는 유해 사례로서 포착될 것이다. III-IV 등급 GVHD는 심각한 유해 사례로 보고될 것이다.
[0149] DLI로 유발된 무형성증은 60일 또는 그 이후에 공여자 키메라 현상의 증거가 있는 호중구감소증(절대 호중구 수 <500/ml)으로 정의된다. DLI로 인한 무형성증의 모든 사례는 심각한 유해 사례로 보고될 것이다.
실시예 11 - 약학적 정보
[0150] 사이클로포스파미드(Cytoxan®)
[0151] 사이클로포스파미드는 시중에서 입수가능하다. 사이클로포스파미드는 주로 DNA 가닥을 교차 연결하여 세포 분열을 방지하는 알킬화제이다. 사이클로포스파미드는 세포 주기에 비특이적이다. 주사용 사이클로포스파미드는 100ml 주사용 멸균수로 재구성된 2000 mg 바이알로 입수가능하다. 재구성된 생성물의 농도는 20 mg/ml이다. 계산된 용량은 물 중의 5% 덱스트로스 250-500 ml로 추가로 희석될 것이다. 각 용량은 1-2시간에 걸쳐 주입될 것이다. (총 부피에 따라 다름).
[0152] 사이클로포스파미드의 임상 독성에는 탈모증, 메스꺼움 및 구토, 두통 및 현기증, 출혈성 방광염, 심장독성, 면역억제, 골수억제, 폐 섬유증, 간 효소 증가 및 부적절한 항이뇨 호르몬 증후군(SIADH)이 포함된다. 사이클로포스파미드는 Oncology Pharmacy에서 조제하고 Mead Johnson Pharmaceuticals에서 생산될 것이다.
[0153] 메스나(소듐-2-메르캅토 에탄 설포네이트)
[0154] 메스나는 옥사소포스포린(사이클로포스파미드 및 이포스파미드)에 의해 유발되는 출혈성 방광염을 예방하는 데 사용되는 예방제이다. 내인성 세포독성이 없고 화학요법에 대한 길항 효과가 없다. 메스나는 옥사소포스포린에 의해 생성된 요로독성 대사산물인 아크롤레인과 결합하여 무독성 티오에테르를 생성하고 옥사소포스포린의 4-하이드록시 대사산물과 조합하여 아크롤레인 형성 속도를 늦춘다.
[0155] 메스나는 100 mg/ml 용액이 들어 있는 200 mg, 400 mg 및 1000 mg 바이알로 구입가능하다. 메스나의 각 용량은 50 ml의 생리 식염수로 추가로 희석되어 15분에 걸쳐 주입될 것이다. 메스나 용량은 주어진 사이클로포스파미드 용량을 기반으로 할 것이다. 메스나의 총 1일 용량은 사이클로포스파미드의 1일 총 용량의 80%와 같다. 요로보호에 사용되는 용량에서 메스나는 사실상 무독성이다. 그러나 메스나로 인한 것일 수 있는 부작용으로는 메스꺼움과 구토, 설사, 복통, 미각 변화, 발진, 두드러기, 두통, 관절 또는 사지 통증, 저혈압 및 피로 등이 포함된다.
[0156] CBER IDE 장치
[0157] 공여자는 말초 전혈 수집(CPDA-1에 450 ml) 또는 정상 상태 조건(동원 없이)에서 말초 백혈구를 수집하는 백혈구 성분채집 절차를 통해 혈액이 수집될 것이다. 각 백혈구 성분채집은 림프구 수집을 위한 제도적 표준 운영 절차를 사용하여 연속 유동 세포 분리기(COBE Spectra, Gambro)에서 수행될 것이다. 혈액 기증 방법인 정맥 절개술 대 백혈구 성분채집술은 기증 전 30일 이내에 말초 혈액 절대 CD4+ T 세포 수를 얻고 표적화된 CD4+ T 세포 용량을 얻는 데 필요한 혈액량을 추정하여 결정될 것이다. 말초 혈액 CD4+ T 세포 수의 정상 범위는 0.5-1.5 x 106/ml이므로, 용량 수준 1-2에는 단순 정맥 절개로 충분할 가능성이 있고 수준 2b에는 성분 분리가 필요할 수 있지만 용량 수준 3 및 4에는 백혈구 성분채집이 필요할 것이다.
[0158] 광범위한 이전 경험에 기초하여, 4시간의 백혈구 성분채집 절차는 5 x 107 CD4+ T 세포/수용자 IBW kg를 얻기에 충분해야 한다. 목표 수집량은 고갈 과정 중 세포 손실을 수용하기 위해 원하는 용량보다 적어도 30% 더 많을 것이다.
[0159] 생성물은 Graft Engineering Laboratory에서 CD8 고갈로 처리될 것이다. 모든 표준 작업 절차를 따를 것이다. 생성물은 유핵 세포 수, CD3, CD4, CD8, CD16 및 CD56에 대해 분석될 것이다. 생성물은 밤새 보관될 것이며, CD8 고갈은 CliniMACS® Selection System(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)에서 발생할 것이다. CD8이 고갈되기 전에 전혈 생성물은 초기에 버피 코트 농축액(buffy coat concentration)을 준비하도록 처리되고, 주요 ABO 불양립성 공여자/수용자 쌍의 경우 버피 코트 농축액은 오염된 적혈구를 제거하기 위해 림프구 분리 배지를 사용하여 추가로 처리될 것이다. 그 후, 처리된 전혈 생성물 또는 성분채집 생성물은 농축되고, 0.5% 인간 혈청 알부민이 보충된 PBS/EDTA에 재현탁된다.
[0160] 철-덱스트란 초-상자성 입자에 컨쥬게이션된 뮤린 모노클로날 CD8 항체를 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 항체 1병이 최대 40 x 109 총 백혈구 및 최대 4 x 109 CD8+ 세포를 처리하는 데 사용될 것이다. 과량의 항체는 1회 세척에 의해 제거되고 생성물 부피는 알부민을 갖는 PBS/EDTA로 100 ml로 조정될 것이다. 그런 다음 멸균 일회용 튜브 세트를 사용하여 CliniMACS Selection System에 연결된다. 실행은 (i) 항체-처리된 세포의 흐름, (ii) 결합되지 않은 잔류 세포를 제거하는 세척, (iii) 컬럼 주변의 자기장을 제거하여 선택된 세포 방출 및 (iv) CD8 고갈된 세포의 백으로의 최종 수집을 제어하는 사전 설정된 컴퓨터 프로그램에 의해 시작된다. 전체 공정은 초기 생성물 농축 완료로부터 약 2-6시간이 소요된다. 후속 생성물은 세포 수, 생존력, CD3, CD4, CD8, CD16 및 CD56 함량에 대해 분석될 것이다. CD4 농도는 환자 용량을 계산하는 데 사용될 것이다. 계산된 부피는 제거되고 기관 표준 작업 절차에 따라 주입을 위해 준비될 것이다.
[0161] 상관/특수 연구
[0162] 표현형 면역 재구성
[0163] CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 림프구 서브세트의 말초 혈액 농도는 DLI 후 14, 28, 60 및 6개월차에 절대 림프구 수 및 유세포 분석을 사용하여 결정될 것이다.
[0164] 스펙트럼 유형 분석에 의한 숙주 CD8+ T 세포 레퍼토리 다양성의 분석. 최근 연구는 T 세포 레퍼토리의 다양성이 주어진 V_ 유전자를 발현하는 세포의 CDR3/다양성/결합 영역(Vf3- -D-J--Cf3)을 평가하는 T 세포 수용체 V_ 영역 스펙트럼 유형 분석에 의해 평가될 수 있음을 나타낸다. 이 영역은 T 세포 수용체의 특이성을 부여한다. 면역 스코핑 또는 V_ 스펙트럼 유형 분석은 치료 후 항종양 면역 반응과 골수 이식 후 면역 재구성을 평가하는 데 매우 유용하다49. 더욱이, 면역억제 요법 전후의 MDS 환자의 스펙트럼 유형 분석은 치료에 대한 반응으로 정상화되는 T 세포 레퍼토리의 왜곡을 밝혀내었다. 따라서 본 발명자들은 MDS 및 가능하게는 CMML을 가진 환자가 치료 전에 왜곡된 T 세포 레퍼토리를 가질 것이고, DLI가 초기에 동종반응성 T 세포의 집단을 유도할 것이고, 반응자가 결국 스펙트럼 유형 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 정상 T 세포 레퍼토리를 획득할 것이라고 가정한다. 치료 전 CD8+ T 세포는 환자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 얻을 것이다. 환자의 항-공여자 반응성 T 세포를 확인하기 위해 환자로부터의 처리 전 PBMC는 세포 분류 전에 조사된 공여자 PBMC와 7일 동안 배양될 것이다. 배양 기간은 환자 항-공여자 T 세포의 클론 확장을 허용한다. PBMC 또한 수집되고, CD8+ T 세포는 14, 28, 60일 및 6개월차에 정제될 것이다.
실시예 12 - 항종양 효과를 증대시키기 위한 NEDLI 모델
[0165] neoAg-특이적 CD8+ T 세포의 소진은 인간의 성공적인 암 면역요법에 대한 주요 장벽이다. 이 장벽을 극복하기 위한 현재의 노력은 면역 체크포인트 억제제(CI)를 단독으로 또는 종양 면역 미세환경을 변경하도록 설계된 제제와 조합하여 사용하는 것이다. 현재까지 이러한 노력은 미미한 성공을 거두었고, 따라서 대부분의 암 환자는 면역 치료 전략의 이점을 얻을 수 없다. CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포 소진을 예방할 수 있을 뿐만 아니라 확립된 소진을 역전시켜 항암 면역 반응을 회복시킬 수 있다. CD4+ T 세포는 항원-제시 세포(APC) 상의 CD40 분자를 통해 APC를 허가함으로써 CD8+ T 세포에 도움을 제공한다. CD4+ T 세포의 도움은 CD8+ T 세포 메모리의 생성과 CD8+ T 세포 고갈을 방지하는 데 필요하다. 중요하게는, 도움이 전달되게 하기 위해, CD4+ 및 CD8+ T 세포는 동일한 항원을 볼 필요는 없지만 이들은 동일한 APC 상에 제시된 항원을 볼 수 있어야 한다. CD4 도움이 기존의 소진을 역전시킬 수 있다는 증거가 나오기 시작하였으나, 성장하는 암은 종양-특이적 CD4+ T 세포에서 내성을 유도하고 현재까지 CD8+ T 세포에 대한 도움 기능을 복원하기 위해 CD4+ T 세포에서 내성을 역전시키는 알려진 전략은 없다. CD27 분자에 대한 효능제 항체는 CD4+ T 세포 도움의 일부 측면을 요약할 수 있으며, 특히 CI와 함께 항-종양 면역을 자극할 수 있지만, 아마도 잘-진행된 암에 대해 확립된 T 세포 소진을 역전시킬 수 없을 것이다.
[0166] 암에서 T 세포 소진을 역전시키기 위해 건강한 공여자로부터의 MHC-동종반응성 CD4+ T 세포의 주입은 주입된 세포의 최종 거부에도 불구하고 수용자 CD8+ T 세포를 필요로 하는 메커니즘에 의해 확립된 암의 퇴행을 촉진할 수 있다. 바이러스 항원으로의 건강한 동종이계 공여자의 백신접종은 항원을 발현하는 종양에 대한 비-생착 공여자 림프구 주입(NEDLI)의 치료 효능을 증가시키며, 따라서 산발적인 인간 암은 종양 신생항원에 대해 백신접종된 건강한 공여자로부터의 CD4+ T 세포로 치료될 수 있다.
[0167] CD4+ T 세포는 APC를 허가함으로써 CD8+ T 세포 소진을 역전시킨다. CD4+ T 세포는 APC를 허가함으로써 CD8+ T 세포에 도움을 제공하고, CD4+ T 세포는 CD8 T 세포 소진을 역전시키는 데 도움을 주지만, CD4+ T 세포가 APC를 허가함으로써 소진을 역전시킬 수 있는지의 여부는 불분명하다. NEDLI의 항종양 효과는 CD4 신생에피토프에 대해 공여자를 백신접종함으로써 증대될 수 있다. 공여자 백신접종은 alloBMT의 항종양 효과를 증가시킬 수 있으며, 건강한 공여자 CD8+ T 세포는 신생항원에 강력하게 반응하지만 CD4 신생에피토프는 식별하기 어렵다. 이미 검증된 CD4 신생에피토프인 M30은 CD4 신생에피토프를 식별하는 기술이 발전하는 동안 원리 증명을 입증하는 데 사용될 것이다.
[0168] 현재 이용 가능한 암 세포 요법(동종이계 혈액 또는 골수 이식, CAR T 세포 또는 T 세포-수용체 변형된 T 세포, 종양 침윤 림프구)은 암 세포를 직접 죽이는 림프구 주입을 사용한다. 대조적으로, NEDLI의 목표는 수용자 항원-제시 세포(APC)를 통해 헬퍼 신호를 제공하여 내인성 항-종양 면역을 회복시키는 것이다. CD4+ T 세포를 일시적으로 생착시키는 것이 neoAg-특이적 CD8+ T 세포에서 소진을 역전시킬 수 있다는 가설은 완전히 새로운 것이다. 미국 특허 US 9,931,359 B2는 내인성 항-종양 면역을 회복시키기 위해 CD8-고갈된 비-생착 공여자 림프구 주입을 위한 HLA 클래스 II 불일치 공여자를 선택하는 방법을 기술하고 있다. 본 출원에서, 공여자는 수용자와 일치하는 적어도 하나의 HLA 클래스 II 대립유전자를 가지며, 공여자는 종양 또는 바이러스 신생항원에 대해 백신접종되었고, 그 후 바이러스-특이적 또는 종양-특이적 T 세포가 생체외에서 추가로 확장된다.
[0169] 요법의 항종양 효과는 이식편대숙주 방향으로 MHC 클래스 II 불일치에 의해 증대되어 동종반응성 공여자 메모리 CD4+ T 세포의 높은 빈도를 보장한다(이종성 면역을 통해, 메모리로서 그러나 나이브 CD4+ T 세포는 종양-유도된 면역억제를 극복하고 적절한 헬퍼 신호를 전달할 수 있다. 외인성 CD4+ T 세포 도움은 표적화된 항원이 모든 암세포에서 발현될 필요가 없도록 에피토프 확산을 통해 다중 신생에피토프에 대해 CD8+ T 세포를 소생시킬 수 있다(도 12 참조).
[0170] 일시적으로 생착되는 림프구에 의해 유도된 질병 반응은 "단명한 공여자 세포에 의해 시작되지만 숙주의 세포에 의해 완료되는 간접적인 과정으로 가장 잘 설명될 수 있다." 본 발명의 발견은 비록 공여자 세포가 결국 숙주 면역계에 의해 거부되더라도 사이클로포스파미드(Cy)에 이어 CD8+ 세포-고갈된 MHC-불일치 공여자 림프구 주입(Cy + CD8-DLI)으로의 마우스 처리는 혈액 및 고형암 모델 모두에서 최소 독성으로 확립된 종양의 퇴행을 유도한다는 것이다. Cy + CD8-DLI의 최적의 항종양 효과는 공여자 CD4+ T 세포, 숙주 CD8+ T 세포의 존재 및 종양 조직이 아닌 정상 숙주에 의한 동종항원 발현을 필요로 한다. 중요하게는, DLI로부터의 CD8+ 세포 고갈은 지속적인 공여자 세포 생착 및 치명적인 GVHD의 위험이 저지되었지만 항종양 효능은 손상되지 않았다. 이러한 결과에 기초하여, 동종 반응성 공여자 CD4+ T 세포가 종양 항원을 교차 제시하는 APC를 통해 신호를 전달함으로써 종양 특이적 수용자 CD8+ T 세포의 소진을 역전시키는 모델(도 5)이 제안되었다. 도 5에 예시된 바와 같이, 주입된 동종반응성 타입 1(Th1) CD4+ T 세포에 의한 소진의 역전을 위해 제안된 메커니즘이다. 수용자 항원 제시 세포(APC)의 표면 상의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 동종항원의 인식은 동종반응성 공여자 CD4+ T 세포의 활성화로 이어지며, APC 상의 CD40에 대한 리간드인 CD154를 포함하는 활성화 리간드의 후속 상향조절로 이어진다. CD40의 결찰은 CD8+ T 세포 상의 CD27에 대한 리간드인 CD70을 포함하여 APC 표면 상의 분자의 상향조절을 유도한다. 이 신호전달 캐스케이드는 CD8+ T 세포 메모리의 유도에 필요한 것으로 나타났다; 동일한 상호작용이 CD8+ T 세포 고갈의 역전 및 CD8+ 메모리 T 세포로의 복귀와 관련되어 있는 것으로 제안된다. CD4+ T 세포에 의해 분비되는 인터페론 감마 및/또는 인터류킨 21은 또한 T 세포 소진의 역전에서 역할을 할 수 있다.
[0171] NEDLI가 혈액 악성 종양에 대한 강력한 항종양 효과를 유도할 수 있지만, 고형 종양에 대한 이의 효과는 일반적으로 더 약하고 치료가 불가능하다. 종양-특이적 항원에 대한 공여자의 프라이밍은 NEDLI의 항-종양 효과를 향상시킬 수 있다. 이 가설을 테스트하기 위해 건강한 동종 또는 MHC-일배수동종 공여자를 인간 유두종바이러스의 E7 항원에 대해 백신접종하고, E7-발현 폐암인 TC1이 14일 전에 접종된 마우스에 고갈되지 않았거나 CD8이 고갈된 프라이밍된 공여자로부터의 비장 세포를 주입하였다(도 6a).
[0172] 종양-보유 수용자는 E7-프라이밍된 동종 공여자로부터의 고갈되지 않은 DLI에 의해 치료되었으며(도 6b, 왼쪽 패널), 치료 효과는 CD8-고갈에 의해 저지되었다.
[0173] 흥미롭게도, 일배수동종 공여자가 사용되었고 공여자 세포가 거부되었을 때, CD8-고갈되었지만 프라이밍된 공여자로부터 고갈되지 않은 DLI로 유익한 효과를 얻었다(도 6b, 오른쪽 패널). CD8-고갈된 동종 DLI가 생존을 연장시키지 못하였기 때문에, 본 발명자들은 동종반응성 및 E7-특이적 CD4+ T 세포가 협력하여 비-생착 상황에서 항-종양 면역을 유도하고, 아마도 내인성 종양-특이적 CD8+ T 세포에서 소진을 역전시키는 신호를 제공하는 (수용자) APC를 치사시킴으로써 아마도 동종반응성 CD8+ T 세포가 항종양 면역을 손상시킨다는 결론을 내렸다.
[0174] 그런 다음 NEDLI의 항종양 효능이 E7-펩티드 펄싱된 수지상 세포로 생체외에서 프라이밍된 T 세포를 자극함으로써 증대될 수 있는지의 여부를 테스트하였다. E7-프라이밍된 CB6 F1 공여자로부터의 비장 세포는, HPV16의 전장 E7 단백질을 포괄하는 중첩 펜타데카머로 펄싱된 동종 CB6 F1 또는 일배수동종 B6C3 F1 수지상 세포와 1주 동안 생체외 배양 전에 CD8 고갈되거나 고갈되지 않은 상태로 유지되었다. 배양 후, 세포를 수확하고 Cy로 처리된 TC1-보유 B6C3 F1 마우스에 주입하였다. 도 7은 E7 펩티드로의 E7-프라이밍된 공여자 세포의 생체외 배양이 DLI의 항-종양 효능을 증가시킨다는 것을 보여준다. 또한, 생체외 배양된 공여자 CD8+ T 세포는 치명적인 GVHD를 유발하지 않았다.
[0175] 도 7의 치료된 마우스는 공여자(H-2d+) 키메라 현상의 증거가 없었지만, E7의 면역우세 Kb-결합 펩티드로 펄싱된 H-2Kb MHC 분자의 형광색소-컨쥬게이션된 테트라머로 염색하여 입증된 바와 같이 E7-특이적 CD8+ T 세포의 확장된 집단을 함유하였다(도 8b). E7-특이적 CD8+ T 세포의 이러한 확장된 집단은 메모리(CD127+PD-1-) 표현형을 나타내었다(도 8f). 치료된 동물은 E7-특이적 CD8+ T 세포의 추가 클론 확장(도 8c, d) 및 PD-1 발현의 이들의 상향 조절(도 8g, h)을 유도하는 TC1으로의 재-공격접종에 저항하였다.
[0176] 도 8에 도시된 바와 같이, E7의 면역우성 H-2Kb-제한된 펩티드에 반응성인 수용자 CD8+ T 세포의 백분율은 펩티드로 펄싱된 H-2K-b 테트라머로 염색하여 결정하였다(상단 행). 하단 행은 게이팅된 E7-특이적 CD8+ T 세포에서 CD127 및 PD-1의 세포 표면 발현을 보여준다. 메모리 CD8+ T 세포는 CD127+ 및 PD-1저이며; 활성화된 T 세포는 CD127+PD-1고이고, 소진된 T 세포는 CD127- 및 PD-1고이다.
[0177] E7 펩티드로 치료된 동물로부터의 CD8-고갈된 림프구의 배양(도 7의 백색 삼각형)은 IFN-γ 분비 CD4+ T 세포의 확장된 집단을 나타내었다(도 9a 및 9b). IFN-γ는 또한 E7 펩티드와 나이브 CD4+ T 세포의 배양에 의해 생성되었으며(도 9a 및 0B), 암의 입양 면역요법을 위한 neoAg-특이적 Th1 세포가 건강한 백신접종하지 않은 공여자로부터 생체외 확장될 수 있어 공여자 안전성에 대한 우려를 개선할 수 있다는 가능성을 높였다.
[0178] 도 9에 도시된 바와 같이, 미처리 B6 x C3H F1 마우스(나이브; a,b) 또는 비-생착 공여자 림프구 주입에 의해 치료된 마우스(c)로부터의 CD4+ T 세포의 세포내 인터페론 감마(IFNγ) 및 종양 괴사 인자 알파 염색이, 펄싱되지 않은 B6 x C3H F1 수지상 세포(a) 또는 E7 펩티드로 펄싱된 DC(b,c)로 자극한 지 5일 후에 측정되었다. 패널 d는 ELISPOT 검정에 의한 동일한 세포의 IFNγ 분비를 보여준다.
[0179] 도 10에 예시된 바와 같이, TC1-보유 B6 x C3H F1 마우스를 E7-백신접종된 공여자로부터 채취하고, E7 펩티드와 생체외에서 확장시킨 CD8-고갈된 림프구와 사이클로포스파미드에 의해 치유하였다. 림프구 주입 후 300일차에 치유된 마우스로부터의 비장 세포는 CD8+ 세포를 고갈시키고, E7 펩티드와 1주 동안 배양시키고, 사이클로포스파미드로 하루 전에 처리한 TC1 보유 BALB/c x B6 F1 마우스에 전이시켰다(2천만개 세포가 수용자 당 배양물에 투입됨). 대안적으로, CD8+ 세포가 고갈되고, 입양 전이 전 1주 동안 E7 펩티드와 배양된 나이브 B6 x C3H F1 공여자로부터의 비장 세포를 TC1 보유 BALB/c x B6 F1 마우스에 제공하였다. 생존은 도 10b에 나와 있다.
[0180] NEDLI에 의해 치료된 B6C3 마우스로부터의 생체외 배양되고 CD8-고갈된 비장 세포는 다시 종양-보유 CB6 F1 수용자에 의해 거부되었음에도 불구하고 자체적으로 마우스의 생존을 연장시킬 수 있었다(도 10b). 따라서, 비-생착 공여자 림프구 주입으로 치료된 마우스는 NEDLI로 제공될 때 항-종양 면역을 연속적으로 전달할 수 있는 CD4+ T 세포를 함유한다.
[0181] 인간 유두종바이러스(HPV)는 인두암, 자궁경부암, 음경암 및 항문암을 포함하는 여러 인간 암과 관련이 있다. 이 바이러스는 두 개의 바이러스 항원 E6 및 E7의 세포내 발현을 통해 상피 세포를 변형시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. E6은 p53 종양 억제제 단백질을 비활성화시키고, E7은 망막모세포종 단백질을 비활성화하며, 두 단백질 모두는 세포 주기 조절에 밀접하게 관련되어 있다. 형질전환된 세포는 더 이상 성장 조절의 대상이 아니며, E6 및 E7 단백질은 악성으로 진행하는 데 필수적이다.
[0182] 면역계는 HPV에 반응하고 제거할 수 있다. 발암성 균주(일반적으로 HPV16 또는 HPV18)에 노출된 개체가 바이러스를 제거하거나 만성적으로 감염되는지 여부를 결정하는 중요한 요인은 HPV에 대한 T 세포 반응, 더욱 정확하게는 HPV에 대한 CD4+ T 세포 반응이다. IFN-γ의 생산을 포함하는 타입 I CD4+ T 세포 반응을 일으키는 개체는 일반적으로 바이러스를 제거하는 반면, 그러한 타입 I 반응을 하지 않는 개체는 만성적으로 감염되어 악성 형질전환에 취약할 수 있다. HPV16 및 HPV18의 E6 및 E7 항원에 대한 반응을 생성하기 위한 조사용 백신이 현재 이용 가능하다.
[0183] 동물 모델에서 공여자와 수용자가 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 모든 유전자에 대해 일치하는 경우 공여자를 HPV E7에 대해 백신접종하고 백신접종된 공여자 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 수용자에게 전달함으로써 항-종양 면역을 전달하는 것이 가능한 반면(도 6b, 왼쪽 패널), 공여자 및 수용자가 MHC-일배수동종인 경우, 공여자를 HPV E7에 대해 백신접종하고 백신접종된 CD4+ T 세포 및 백신접종되지 않은 CD8+ T 세포를 수용자에게 전달함으로써 항-종양 면역을 전달하는 것이 가능함(도 6b, 오른쪽 패널)이 밝혀졌다. 종양-특이적 항원에 대해 백신접종된 공여자로부터 NEDLI의 항종양 효능은 수용자에게 주입하기 전에 시험관내 백신접종된 T 세포를 종양 펩티드와 배양함으로써 증가될 수 있다(도 7b). 백신접종되고 생체외 자극된 공여자 CD4+ T 세포의 주입은 수용자 면역 반응을 회복시키고, 치료된 동물은 이제 공여자 세포가 제거되었음에도 불구하고 종양 항원에 대해 반응하고 종양 세포를 거부하는 CD8+ T 세포(도 8b-d) 및 CD4+ T 세포(도 9c, d)를 갖는다. 이는 HPV에 대한 면역이 공여자로부터 수용자에게 효과적으로 전달되었음을 의미한다.
[0184] 본 발명은 종양-특이적 항원(바이러스 항원 또는 종양 신생항원)에 대해 백신접종되고 바이러스 또는 신생-항원으로부터의 펩티드와 배양된 CD8-고갈된 세포의 주입을 고려한다. 대안적으로, 본 발명은 바이러스-특이적 또는 신생항원-특이적 CD4+ T 세포를 자극하기 위해 펩티드-펄싱된 수지상 세포로 생체외 자극된 면역화되지 않은 공여자 CD8-고갈 세포의 주입을 고려한다. 본 발명은 또한 상이한 인간 백혈구 항원(HLA) 유형의 공여자로부터의 HPV-프라이밍된 CD4+ T 세포를 함유하는 세포 은행의 생성을 고려한다. 예를 들어, 아래 표는, 각 세포주가 10개의 가장 일반적인 HLA 클래스 II 대립유전자 중 하나를 고유하게 발현하는 10개 세포주의 은행이 미국 백인 인구의 95.7%에 대한 치료제를 제공하기에 충분하다는 것을 보여준다. HLA 클래스 II 분자는 예로서 HLA-DRB1, HLA-DPB1 및 HLA-DQB1을 포함한다.
Figure pct00003
[0185] 주입에서 neoAg-특이적 CD4+ T 세포의 빈도를 증가시켜 NEDLI의 항종양 효능을 증가시킬 수 있는지 여부가 주요 조사 포인트이다. 예비 데이터가 NEDLI 후 항종양 면역을 매개하는데 있어서 동종반응과 종양 특이적 CD4+ T 세포 사이의 명백한 시너지를 보여주었으므로, 공여자 neoAg 백신접종 모델에서 MHC 불일치의 효과도 테스트될 것이다. 공여자와 수용자 계통을 현명하게 선택함으로써 항종양 효과에 대한 동종반응 대 neoAg 프라이밍의 상대적 역할을 쉽게 분석할 수 있어야 한다.
실시예 13 - NEDLI의 항종양 효과에 대한 건강한 공여자의 neoAg 백신접종 효과의 특성화
[0186] 생체내 공여자 백신접종 대 생체외 T 세포 확장의 이점 및 동종반응성과 neoAg-특이적 T 세포 간의 상호작용.
[0187] 이 실험의 목표는 "산발성" 종양에 대한 CD8-NEDLI의 항종양 효능을 증가시키기 위해 종양 neoAg에 대한 CD4+ T 세포 도움을 증가시키는 두 가지 방법을 테스트하는 것이었다: 1) 후속의 생체외 신생에피토프 자극의 존재 또는 부재하에 CD4+ T 세포 신생에피토프로 생체내 백신접종; 또는 2) 신생펩티드 +DC로의 CD4+ T 세포의 연속 자극을 사용한 시험관내 "프라이밍". 실험의 설계는 하기 표 3에 제시되어 있다. C57BL/6(B6; H-2b) 기원의 B16-F10 흑색종은 F1 하이브리드에서 성장한다; 면역원성 CD4+ 신생-에피토프가 확인되었다.
[0188] 1) B6 x C3H(B6C3; H-2bxk) F1 또는 MHC-일배수동종 BALB/c x B6(CB6; H-2bxd) F1 마우스는 Kinesin 패밀리 구성원 18b 유전자(Kif18b)로부터 인코딩된 돌연변이 신생-에피토프 M30(그룹 2,6) 또는 상응하는 야생형 펩티드(그룹 1,5)로 백신접종될 것이며, 100 jtg 합성 펩티드 및 50 jtg 폴리(I:C)를 포함하는 백신은 200 jtl 부피의 인산염 완충된 식염수로 옆구리 측면에 주사된다. 백신접종의 효능 및 반응 세포의 표현형(CD4 대 CD8)은 인터페론 감마(IFN y) 또는 종양 괴사 인자 알파(TNFa)에 대한 유세포 분석 및 세포내 사이토카인 염색(ICS)에 의해 테스트될 것이다. 백신 접종 2주 후, 공여자 마우스는 안락사되고, 비장 세포는 CD8+ 세포 고갈되고, 주입 전날 사이클로포스파미드(Cy)로 처리한 B16-F10 보유 B6C3 마우스에 주입될 것이다. 대안적으로, 면역화된 공여자로부터의 CD8-고갈된 세포는 주입 전 5일 동안 M30 펄싱된 공여자 DC와 함께 5일 동안 배양될 것이다(그룹 3,7);
[0189] 2) 나이브 B6C3 또는 CB6 F1 마우스로부터의 비장 세포는 M30-펄싱된 자가 수지상 세포와 20 U/ml IL-2(그룹 4,8)로 매주 2회 자극될 것이다. M30-특이적, IFN'y+ CD4+ T 세포의 빈도는 생체외 자극 전 및 후에 ICS에 의해 측정될 것이다. NeoAg-특이적 CD4+ T 세포는 IFN'γ 포획 검정(Miltenyi Biotec)을 사용하여 정제되고, 항-CD3 및 항-CD28로 코팅된 비드를 사용하여 추가로 확장될 수 있다.
표 3
Figure pct00004
*WT=PSKPSFQEFVDWEKVSPELNSTDQPFL (SEQ ID NO: 1); Mut (M30)=PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL (SEQ ID NO: 2)
[0190] 유사한 처리 그룹에서의 과거 데이터를 기반으로 하여, 두 치료 그룹을 비교하기 위한 비모수 만-화이트니(Mann-Whitney) 테스트를 시뮬레이션하였다. 검정력 80%와 양측 타입-I 오류가 0.05인 경우, 처리 그룹 당 14개의 샘플 크기가 충분할 것으로 추정되었다.
[0191] 성공의 기준은 M30-특이적 CD4+ T 세포의 (백신접종 또는 생체외 배양에 의한) 확장된 집단을 함유하는 CD8-고갈된 세포의 수용자에서의 생존의 상당한 연장일 것이며(그룹 6, 7 또는 8 대 5 비교), 이는 CD4+ T 세포가 종양 미세환경에 도움을 주는 이점을 반영하며, 이들은 골수 세포를 재프로그래밍하여 CD8+ T 세포에 도움을 줄 뿐만 아니라 더 많은 면역 자극이 되게 할 수 있다. 공여자 집단의 동종반응성은 아마도 프라이밍된 NEDLI의 항종양 효능을 증가시킬 것이다(예를 들어, 그룹 6 대 2, 7 대 3, 8 대 4 비교). 단일 neoAg, 단일 용량의 백신 또는 백신 제형이 항종양 면역을 증가시키기에 불충분할 수 있다. 생존 연장이 달성되지 않는 경우, 공여자에게 mRNA 펜타토프 백신이 백신접종될 것이다. 공여자 백신접종은 GVHD 또는 사이토카인 방출 증후군을 악화시킬 수 있다; 이는 공여자 세포의 용량을 줄임으로써 완화될 수 있다.
[0192] 단독의 또는 조합된 면역학적 체크포인트 차단(ICB) 대비 neoAg-프라이밍된 NEDLI의 항-종양 효과 비교. 최근 보고서는, CD4+ T 세포 도움의 전달에 관여하는 주요 분자인 CD40 리간드를 인코딩하는 재조합 아데노바이러스의 종양내 전달(도 5)이 피하 B16-F10에 대한 항-PD-1 + 항-CTLA4 항체와 조합된 ICB와 함께 시너지 효과를 발휘하는 것보다 탁월하였음을 보여주었다. 본 발명자들은 neoAg-프라이밍된 NEDLI가 ICB보다 탁월하고 시너지 효과가 있을 것으로 예측한다. 65마리의 B6C3 F1 마우스에 -8일에 옆구리에 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포를 각각 피하 접종하고, 0일에 Cy 200 mg/kg을 IP 투여할 것이다. 1일차에, 13마리의 마우스 그룹은 각각 다음 중 하나로 치료 받을 것이다: 1) 비처리; 2) 프라이밍되지 않은 CB6 F1 공여자로부터의 2천만개의 CD8-고갈된 비장 세포(이는 보통의 유의한 생존 이점을 제공함); 3) M30 펩티드-(실험 1 참조) 백신접종된 CB6 F1 공여자로부터의 2천만개의 CD8-고갈된 비장 세포; 4) 4회 용량으로 3일마다 복강내 제공된 마우스 PD-1(클론 RMP1-14) 및 CTLA-4(둘 모두 Bio X Cell의 클론 9H10)에 대한 200 jtg의 각각의 모노클로날 항체를 갖는 ICB; 또는 5) M30-프라이밍되고 CD8-고갈된 CB6 F1 비장 세포 + ICB. 종양 성장은 그룹당 7마리의 마우스에서 매주 3회 측정될 것이다. 내인성 종양-특이적 CD8+ T 세포에 대한 NEDLI의 효과를 조사하기 위해, B16-F10에서는 발현되지만 C57BL/6 마우스의 정상 조직에서는 발현되지 않은 레트로바이러스 단백질 gp70의 p15E 펩티드(KSPWFTTL)에 특이적인 H-2Kb-제한된 CD8+ T 세포의 표현형 및 기능이 특성 결정될 것이다. 각각의 처리 7일 및 14일차에 그룹당 3마리의 마우스가 희생되고, 비장, 종양-배수 림프절 및 분해된 종양으로부터의 단일 세포 현탁액이 CD62L, Tbet, CD127, CD27 및 KLRG-1에 대한 항체 및 p15E 펩티드 (MBL International, Woburn, MA)가 로딩된 H-2Kb의 형광색소-컨쥬게이션된 테트라머로 염색될 것이다. 종양 미세환경은 CD80, CD86 및 PD-L1의 CD11c+ 골수 세포 발현을 평가gkadmfhTJ 특성규명될 것이며, 전체 CD4+ T 세포에 대한 Foxp3+ Treg의 비율 및 CD8/Treg 비율을 특징으로 할 것이다. TIL 뿐만 아니라 림프절 및 비장 세포는 p15E 펩티드로 자극될 것이고, 세포내 사이토카인에 의한 IFN-γ, TNF-α 및 그랜자임 B 생성은 염색 및 유세포 분석에 의해 특성 결정될 것이다. NeoAg 프라이밍은 더 느린 sc 종양 성장 및 종양-특이적 CD8+ T 세포의 향상된 활성화에 의해 반영되는 바와 같이 NEDLI의 항종양 효능을 증가시킬 것으로 예상된다. CD4+ T 세포가 CD8+ T 세포 고갈을 역전시키는 데 도움이 된다는 증거가 있으나 ICI는 그렇지 않기 때문에, 본 발명자들은 neoAg-프라이밍된 NEDLI가 ICI보다 탁월한 항종양 효능을 가질 것으로 예측한다.
[0193] SAS(Cary, NC)의 MIXED 절차, 및 단지 흥미로운 비교만으로 제한되도록 사후 테스트를 조정하기 위한 Glinmix 절차를 사용하는 웨스트폴 및 영(Westfall and Young)의 매개변수 잔차 재표집 방법을 사용하는 혼합된 효과 모델 분석. 유세포 분석 데이터는 양성 세포의 평균%, 또는 신뢰 구간이 있는 평균 형광 강도(MFI)로 표시될 것이다. 그룹 평균은 만-화이트니 U 테스트를 사용하여 비교될 것이다.
실시예 14 - 바이러스-항원 또는 neoAg-프라이밍된 공여자의 NEDLI가 종양 면역을 유도하는 방법의 특성 규명
[0194] 동종반응성 공여자 CD4+ T 세포가 수용자 APC를 통해 종양 특이적 수용자 CD8+ T 세포에 신호를 제공함으로써 항종양 면역을 증강하는지 여부가 결정될 것이다.
[0195] 이전 연구에 따르면 MHC-불일치, CD8-고갈된 공여자 림프구 주입의 치료 효과는 공여자 CD4+ T 세포, 수용자 CD8+ T 세포 및 정상 숙주 조직 세포 상의 동종항원 발현을 필요로 한다. 이러한 결과에 기초하여, 동종반응성 CD4+ T 세포는 APC를 허가함으로써 종양-특이적 CD8+ T 세포의 소진을 역전시키는 것으로 가정된다. 그렇다면 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 의해 인식되는 항원은 동일한 APC에 제시되어야 한다.
[0196] 이 실험의 핵심은 다른 APC 상으로의 동종항원과 종양 항원 제시를 분리하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포가 소통하는 것을 방지하는 것이다. 이는 양부모 골수 키메라를 제조함으로써 수행되며(도 11a에 묘사됨; 및 하기 표 4의 그룹 3 및 4), 여기서 하나의 부모 균주인 B6(H-2b)는 종양-특이적인 H-2b 제한된 CD8+ T 세포에 종양 항원을 제시할 수 있는 반면, 다른 균주 C3H는 MHC 클래스 II 동종항원(H-2 I-Ak 또는 I-Ek)을 비-생착 공여자 CD4+ T 세포에 제시한다. 이 실험에 대한 양성 대조군은 F1-모 키메라를 만드는 것이며(도 11b; 하기 그룹 5 및 6), 이 경우 APC는 CD4+ T 세포와 신생항원-특이적 CD8+ T 세포 둘 모두에 대한 동종항원을 제시할 수 있으며, 따라서 T 세포가 소통할 수 있는 다리 역할을 할 수 있다.
[0197] 방법: 조사된(950 cGy) B6 마우스에 107 T 세포 고갈된(T-) B6C3 F1 골수(BM) 세포(그룹 3 및 4) 또는 5 x 106 T-B6 및 5 x 106 T-C3H(H-2k) BM 세포의 혼합물을 이식할 것이다. 2개월 후, 키메라에 5 x 104 E7-발현 TC1(H-2b) 폐암 세포를 IV 제공할 것이다. 2주 후, 종양-보유 수용자를 Cy 200 mg/kg IP로 처리한 후 다음날 아무것도 하지 않거나 E7-면역화된 공여자로부터의 생체외 E7-펩티드 자극된 CD8-비장 + LN 세포로 처리할 것이다(도 7의 백색 삼각형). 상이한 그룹의 생존은 로그 순위 테스트에 의해 비교될 것이다.
[0198] 그룹 1과 2는 이 실험에 대한 음성 대조군인데, B6 APC가 종양 항원을 교차 제시하지만 공여자 CD4+ T 세포 도움을 자극하는 동종항원이 없기 때문이다. MHC 클래스 II 동종항원과 종양 항원은 그룹 3과 4에서는 상이한 APC에 제시되지만, 그룹 5와 6에서는 동일한 APC에 제시된다. 동종반응성 공여자 CD4+ T 세포가 APC를 허가함으로써 내인성 항종양 면역을 증가시킨다면, 그룹 6의 마우스는 그룹 4의 마우스보다 현저하게 더 오래 생존할 것이다. 동종반응 공여자 CD4+ T 세포가 동종인식 후 사이토카인을 분비함으로써 독점적으로 생존을 연장하는 경우, 그룹 4 및 6의 마우스 생존은 대략 동일하지만 그룹 2의 마우스의 생존보다 탁월할 것이다.
Figure pct00005
[0199] 외인성 도움이 APC 허가를 통해 소진을 역전시키는 경우, 그룹 4는 비효율적인 동종 CD8-고갈된 DLI로 감소된다(도 6, 왼쪽 패널, 개방 붉은색 사각형). Cy 단독(도 7, 검은색 다이아몬드)을 펩티드-펄싱된 haploDC(개방 붉은색 삼각형, 그룹 6과 유사)로 생체외 자극된 CD8-DLI를 비교하면 위험 비율이 15이다. 각 그룹에서 .05의 양측 타입-I 오류 및 10의 샘플 크기에 있어서, 검정력 = 0.999이므로 주 가설을 테스트하기에 10/그룹이면 충분하다.
[0200] 에피토프 확산을 유도하는 NEDLI 능력의 평가.
[0201] 종양내 클론 이질성 및 HLA 또는 neoAg 손실은 단일 종양 항원(예를 들어, CAR T 세포, 항-종양 모노클로날 항체, 종양 백신)에 대해 지시된 면역요법의 효능을 제한할 수 있다. 에피토프 스프레딩은 치료에 의해 직접 표적화되지 않은 항원에 대한 반응을 확대함으로써 종양 회피를 중화시킨다. CD4+ T 세포가 neoAg-특이적 CD8+ T 세포에서 소진을 역전시켜 에피토프 스프레딩을 촉진하는 데 도움이 되는 것으로 가정된다(도 12). 도 12는 일시적으로 생착되는 종양-특이적 CD4+ T 세포의 주입 후 에피토프 스프레딩의 가정된 메카니즘을 예시한다. 항원 "A"에 특이적인 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL)에 의한 종양 세포의 사멸은 종양 미세환경에서 항원-제시 세포에 의한 항원 A-E의 방출 및 교차-제시로 이어진다. 주입된 타입 I(Th1) CD4+ T 세포는 MHC 클래스 II 분자가 제시하는 항원 A를 인식하고, 동일한 항원-제시 세포 상의 MHC 클래스 I 분자의 맥락에서 제시된 항원 B, C 및 E를 인식하는 CD8+ T 세포(eCTL)에서 소진을 역전시키는 신호를 제공한다.
[0202] 다음 실험은 이 가설을 테스트하기 위해 고안되었다.
[0203] OT-1 유전자전이 마우스(Jackson Labs)는 H-2 Kb MHC 클래스 I 분자에 의해 제시된 닭 오브알부민(OVA) 펩티드 257-264(SIINFEKL, SEQ ID NO: 3)에 대한 유전자전이 T 세포 수용체를 인코딩하는 CD8+ T 세포를 함유하는 반면, OT-II 마우스(Jackson Labs)는 H-2 I-Ab에 의해 제시된 OVA 펩티드 323 339(ISQAVHAAHAEINEAGR, SEQ ID NO: 4)에 특이적인 CD4+ T 세포를 함유한다. B16-OVA는 닭 오브알부민을 발현하도록 조작된 MHC 클래스 II-음성 B16-F10 흑색종 계통으로, OT-I T 세포에 의해 인식된다. B6.SJL x C3H(H-2kxb, CD45.1+), OT-I x C3H(H-2kxb, CD45.1-) 및 OT-II x BALB/c(H-2dxb) F1 마우스가 상응하는 근친교배 계통을 교배함으로써 생성될 것이다. 81마리의 B6.SJL x C3H F1 마우스에 각각 OT-I x C3H F1 마우스로부터의 2백만 개의 CD8+ T 세포를 IV 제공하고, 이틀 후 한쪽 옆구리에 5 x 105 B16-F10 흑색종 세포 및 반대쪽 옆구리에 5 x 105 B16-OVA 세포를 피하 접종할 것이다. 종양이 양쪽에서 약 5 mm로 성장하면 아래 연구를 위해 3마리의 마우스를 안락사시키고, 그룹당 13마리의 마우스에게 Cy 200 mg/kg를 IP 제공하고 하루 후 다음 중 하나를 제공할 것이다: 1) 비처리; 2) Kif18b-인코딩된 야생형 펩티드 (PSKPSFQEFVDWEKVSPELNSTDQPFL, SEQ ID NO: 5; 백신 접종의 상세한 내용에 있어서는 실험 1 참조)로 2주 전에 프라이밍된 CB6 F1; H-2dxb) 마우스으로부터의 2천만 개의 CD8-고갈된 비장 세포; 3) 2주 전에 M30(PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL, SEQ ID NO: 6) 신생에피토프로 프라이밍된 CB6 F1 마우스로부터의 2천만 개의 CD8-고갈된 비장 세포; 4) 면역화되지 않은 OT-II x BALB/c F1 마우스로부터의 1백만 개의 CD4+ T 세포를 함유하는 CD8-고갈된 비장 세포; 5) OT-II x BALB/c 마우스로부터 취해지고, IL-2, GM-CSF 및 1tM 이브루티닙(Th1 분화를 촉진하기 위해)이 보충된 OVA323-339-펄싱된 수지상 세포와 5일 동안 배양된 CD8-고갈된 비장 세포; 및 6) 그룹 5로부터의 분류된 CD4+ T 세포. 양쪽 옆구리 종양의 크기는 모든 생존 마우스에서 주 3회 측정될 것이다. 그룹 당 3마리 마우스가 NEDLI 후 3일 및 7일차 (또는 종양이 퇴행하기 시작하는 경우 더 일찍)에 희생될 것이다. 비장, 배수 LN 및 종양으로부터의 세포를 다음과 같이 분석할 것이다: 1) 종양-특이적 CD8+ T 세포: p15E 특이적 CD8 T 세포 및 OVA 특이적 T 세포(H-2k+) 상의 CD27, CD127, PD-1, KLRG1 발현; 2) 기능: 세포는 M30, p15E 펩티드 또는 클래스 I 및 II OVA 펩티드로 5시간 동안 개별적으로 자극될 것이다. IFN'y-, TNFa-, 그랜자임 B-, IL-4- 및 IL-2-생산 세포의 빈도는 ICS 및 유세포 분석에 의해 분석될 것이다; 3) 면역조직화학: 종양 단편은 액체 질소에서 급속 동결될 것이다. 7 tm 종양 분절은 KLRG-1, PD-1, CD127 또는 IFN'y와 함께 CD4, CD8, p15E 테트라머 또는 OVA 테트라머로 염색될 것이다; 4) DC 활성화: 종양, 배수 림프절 및 비장의 세포는 CD11b, CD11c, 클래스 II, CD70, CD80 및 CD86으로 염색될 것이다.
실시예 15 - 재료 및 방법
[0204] 실시예 13-15의 모든 실험은 Jackson Laboratories에서 구입한 근친교배 또는 형질전환 마우스 또는 상업적으로 구입하거나 집에서 번식하여 생성된 F1 하이브리드 마우스에 사용하였다. 마우스는 6-8주령에 구입하였으며, 실험 시작 시 대략 8-10주령이었다. 거의 모든 실험은 공여자 계통의 세포를 종양-보유 수용자에게 주입하는 것을 포함하였다. 동일한 수의 수컷과 암컷이 처리되는 각 그룹의 마우스에서 수용자로 사용되었다. 다음 절차가 수행될 것이다:
a) 입양 세포 요법. 수용자 마우스는 꼬리 정맥을 통한 림프구의 정맥내(IV) 주입 하루 전에 복강 내 사이클로포스파미드 200 mg/kg 또는 950 cGy 전신 방사선 조사(TBI)로 전처치하였다. TBI로 전처치된 동물에 또한 조혈을 구제하기 위해 T 세포-고갈된 골수 세포를 정맥 제공하였다.
b) 마우스 종양 모델 - 수용자를 B16-F10 흑색종 세포, 1 x 105 IV 또는 5 x 105 피하(sc), 5 x 105 B16-OVA(닭 오브알부민 유전자로 형질감염된 B16-F10) sc, 또는 5x104 TC1 폐암 세포 IV로 공격접종하였으며, 모두 치료 2주 전에 시작하였다.
c) 백신 - 면역화 전에 마우스를 드롭 방식으로 이소플루란으로 전신 마취시켰다. 마우스는 옆구리에 약 200 μl/마우스의 에멀젼을 주입하여 합성 펩티드 및 50 μg 폴리(I:C)로 면역화될 것이다. E7 cDNA 백신의 경우, 마우스에 cDNA(25 μg)를 근육내 전기천공법(106V, 8 펄스에 있어서 200-ms 간격으로 20-ms 펄스)으로 제공하였다. 면역화 후 통증의 증거에 대해 매일 마우스를 확인하고, 표시된 바와 같이 부프레노르핀 SR 0.05 내지 .1 mg/kg를 sc 또는 ip q 48-72 시간 투약하였다.
[0205] 백신접종. C57BL/6 x C3H(B6C3) F1 또는 BALB/c x C57BL/6(CB6) F1 마우스에 HPV16 혈청형의 E7 항원을 인코딩하는 DNA 백신인 pcDNA-3-CRT/E71 25 μg을 총 3회 매주 백신접종하였다. 백신은 106 V 전류의 8 펄스로의 전기천공에 의해 근육내로 전달되었으며, 각 펄스는 펄스 사이에 200 ms 간격으로 20 ms 지속되었다.
[0206] 입양 면역요법을 위한 세포의 준비. 마지막 백신접종 후 1주일, 백신접종되거나 백신접종되지 않은 공여자로부터의 비장 세포는 처리되지 않은 상태로 유지되거나 자성 세포 분리(MACS; Miltenyi Biotec)를 통해 CD8+ 세포가 고갈되었다. 배양되지 않은 비장세포를 사용한 실험에서 동물에게 2천만 개의 고갈되지 않은 세포 또는 2천만 개의 고갈되지 않은 비장세포에 존재하는 CD4+ T 세포의 수를 함유하는 CD8-고갈된 세포를 제공하였다. 일부 실험에서, 백신접종된 CB6 F1 공여자로부터의 전체 또는 CD8-고갈된 비장세포를 HPV16의 E7 단백질의 아미노산 서열로부터 22개의 중첩되는 15mer 각각 1 μg/ml로 펄싱된 동종 CB6 F1 또는 MHC-일배수동종 B6C3 F1 수지상 세포와 함께 배양하였다 (펩티드 서열: MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYCYEQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP; SEQ ID NO: 7) (JPT Technologies; ). E7 서열에서 서로 인접한 펜타데카펩티드는 C-말단 11개 아미노산이 중첩되었다. 22개의 펩티드 중 처음 4개는 다음과 같다; 나머지는 상기 서열로부터 추론될 수 있다:
[0207] MHGDTPTLHEYMLDL (SEQ ID NO: 8)
[0208] TPTLHEYMLDLQPET (SEQ ID NO: 9)
[0209] HEYMLDLQPETTDLY (SEQ ID NO: 10)
[0210] LDLQPETTDLYCYEQ (SEQ ID NO: 11)
[0211] 수지상 세포는 범-DC 자성 세포 분리(MACS; Miltenyi Biotec)에 의해 제조하였다. 2천만 개의 공여자 비장세포를 10% 우태혈청, 2-ME, 25 U/ml의 재조합 마우스 IL-2 및 20 ng/ml의 재조합체 마우스 GMCSF가 보충된 10 ml RPMI 배지에서 5일 동안 2천개의 펩티드-펄싱된 수지상 세포와 함께 배양하였다. 5일 말기에 세포를 세척하고 인산염 완충 식염수에 재현탁시켰다. 마우스에 2천만 개의 고갈되지 않은 비장세포에 함유된 CD4+ T 세포의 투입에 해당하는 생체외 배양된 세포의 용량을 제공하였다.
[0212] 처리 프로토콜. 입양 세포 요법의 항종양 효능을 테스트하는 실험에서, 수용자 마우스에게 0일차에 꼬리 정맥을 통해 5 x 104 TC1 종양 세포를 정맥내(IV) 제공한 다음, 13일차에 사이클로포스파미드 200 mg/kg을 복강내 제공하고, 14일차에 공여자 세포를 제공하였다. 자극되지 않고 고갈되지 않은 공여자 세포의 용량은 수용자당 2천만 개의 비장 세포였다. 배양되지 않은 CD8-고갈된 비장 세포의 용량은 2천만 개의 고갈되지 않은 비장 세포에 함유된 것과 동일한 수의 CD4+ 세포를 함유하도록 정규화되었다. 생체외 배양된 세포의 용량은 배양물에 투입된 CD4+ 세포의 수로 정규화되었다. 예를 들어, 마우스 비장이 1억 개의 총 세포와 2천만 개의 CD4+ 세포를 함유하는 경우, CD8-고갈된 집단이 8800만 개의 세포와 1800만 개의 CD4+ 세포를 함유하는 경우, 및 CD8-고갈된 비장 8800만 개를 펩티드 자극을 위한 배양물에 첨가하여 1천만 개의 세포 및 4백만 개의 CD4+ 세포를 함유하는 자극된 집단을 발생시키는 경우, DLI 용량은 2천만 개의 전체 비장(4백만 개의 CD4+ 세포 함유), 1,956만 개의 CD8-고갈된 비장(4백만 개의 CD4+ 세포 함유) 또는 220만 개의 펩티드-자극된 세포일 것이다.
[0213] 다양한 처리 그룹에서의 마우스의 생존은 Log-순위 테스트에 의해 비교하였다; 0.05 미만의 p 값은 유의한 것으로 간주되었다.
[0214] 제안된 실험은 이식편대숙주병(GVHD), 항종양 효과 및 치료 백신에 대한 림프구 반응을 포함한 현상을 초래하는 여러 동시 발생 세포 상호작용을 포함한다. 이러한 복잡한 생물학적 현상은 단순히 림프구에 대한 시험관 내 연구로 모델링하거나 재현할 수 없다. 근친 교배, 유전자전이 및 F1 하이브리드 계통의 광범위한 이용 가능성은 임상적으로 관련된 방식으로 GVHD 및 암의 입양 면역요법을 모델링 할 수 있게 해준다. HLA-일치된 형제 또는 HLA-일배수동종 비-생착 공여자 림프구 주입(NEDLI)의 인간 상황을 모델링하기 위해 특정 계통이 선택되었다. T 세포 수용체 유전자이식 마우스는 암을 가진 동물에서 내인성 종양-특이적 T 세포의 추적을 용이하게 한다. 또한, 화학요법 내성으로 이어지거나 정의된 "종양 항원"을 발현하는 정의된 유전자 이상이 있는 마우스 종양이 널리 이용가능하다. 이러한 실험은 근친교배 및 F1 계통이 널리 이용가능한 마우스 또는 래트와 같은 종에서만 수행될 수 있다.
[0215] 등쪽 꼬리 정맥을 통한 IV 주사에 의한 NEDLI 및 종양 이식 후, GVHD(체중 감소, 구부린 자세, 헝클어진 모피, 설사, 홍반, 불량한 이동성) 또는 사이토카인 방출 증후군(발열, 설사, 체중 감소, 부동성)을 포함하는 세포 주입의 임의의 종양 관련 이환율 또는 독성에 대해 마우스를 면밀히 모니터링된다. 정맥 주사는 일시적으로만 통증이 있으며 마취 없이 수행될 수 있다. 연구는 각 그룹의 무종양 생존율이 2주간의 관찰 기간에 걸쳐 변하지 않았을 때 결론지었다. 종양 접종 후 100일 동안 관찰하면 일반적으로 이 목적에 충분하다. 이는 미국 수의학 협회(AVMA)의 권장 사항과 일치한다. 동물은 동종이계 GVHD 또는 진행성 종양으로 인한 이환의 임의의 징후에 대해 종양 및/또는 동종이계 림프구 주입 후 적어도 주 3회 모니터링된다. 종양 관련 이환율이 진단되는 즉시, 종양-보유 동물은 과도한 고통을 방지하기 위해 안락사된다. GVHD로 고통받는 동물 또한 안락사될 것이다.
[0216] 마우스가 종양의 피하 주사를 받는 실험에서, 종양의 최대 2차원 측정이 100 mm2를 초과하거나 종양이 광범위한 궤양을 일으키는 경우 중 어느 것이 먼저 발생하든 일반적으로 안락사될 것이다. 모든 실험에서, 고통받는 것으로 보이는 동물은 안락사될 것이다. 고통받는 것으로 이어질 수 있는 실험 상태는 힘든 호흡을 유발하는 광범위한 폐 전이, 상당한 체중 감소, 설사 및 부동성을 동반한 이식편대숙주병 또는 종양 유발 마비를 포함한다.
[0217] 세포주: B16-F10 흑색종(ATCC), B16-OVA 흑색종 및 TC-1 폐암(Johns Hopkins University의 TC Wu 제공)
[0218] 마우스 세포주는 Short Tandem Repeat 프로파일링(National Institute of Standards and Technology Mouse Cell Line Authentication Consortium/American Type Culture Collaboration)에 의해 인증될 것이다. 세포는 또한 마이코플라즈마 오염에 대해 테스트될 것이다(Genetica Cell Line Testing, Burlington, NC).
[0219] TC-1에서 E7 종양유전자의 지속적인 발현은 HPV16 E7 오픈 리딩 프레임용 프라이머를 사용한 PCR에 의해 확인될 것이다.
[0220] ATCC에서 B16-F10을 얻으면 세포를 확장한 다음 각각 1백만 개 세포의 100개 분취량을 동결 보존할 것이다. 연속 계대를 통해 세포주를 유지하는 대신 각각의 새로운 실험에 대해 동결된 세포의 바이알을 해동할 것이다.
[0221] 유세포 분석을 위한 모든 항체는 상업적 공급업체(예를 들어, BD Biosciences)에서 구입할 것이다. 마우스에 투여하기 위한 PD-1 및 CTLA-4에 대한 항체는 Bio X Cell에 의해 제공된다. 항체 특이성은 표적 단백질이 과발현된 세포 추출물의 면역블롯 분석에 의해 확인될 것이다.
[0222] 이브루티닙은 Pharmacyclics에서 제공된다. 본 발명자들은 Johns Hopkins Drug Discovery Core에서 수행한 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법으로 확인할 것이다.
[0223] 척추동물: C57BL/6, B6.SJL, BALB/c, C3H, B6 x C3H F1, BALB/c x B6 F1, OT-I 및 OT-II 마우스 계통은 모두 Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME)에서 구입한다. 공급업체는 인증 인증서를 제공한다.
[0224] 당업자는 본 개시에 비추어, 개시되는 특정 구현예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 여전히 유사하거나 비슷한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다. 본 발명은 본 발명의 개별 측면의 단일 예시로서 의도된 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법 및 구성요소는 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본원에 도시되고 설명된 것에 더하여, 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 따라서, 본 발명은 다음 청구범위에 의해서만 제한된다.
참고문헌
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Claims (22)

  1. 수용자에게 투여하기 위한 림프구 조성물을 제조하는 방법으로서,
    a) 공여자로부터 말초 혈액 세포 조성물을 수득하는 단계로서, 공여자는 수용자에 존재하는 항원에 대해 임의적으로 백신접종되고, 말초 혈액 세포 조성물은 CD8+ T-세포, CD4+ T-세포 및 천연 킬러 세포를 함유하는, 단계;
    b) 말초 혈액 세포 조성물에서 CD8+ T-세포를 고갈시키는 단계로서, CD8+ T-세포를 말초 혈액 세포 조성물에서 고갈시키는 것은 말초 혈액 세포 조성물의 CD8+ T-세포의 수를 적어도 한자릿수 만큼 감소시키는 것인, 단계; 및
    c) CD4+ T 세포를 항원과 함께 배양함으로써 항원에 특이적인 CD4+ T 세포를 확장시키고, 이에 의해 림프구 조성물을 제조하는 단계로서, 공여자는 수용자와 HLA-일치하거나 부분적으로 HLA-일치하거나 일배수동종인, 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항원이 신생물 항원, 신생물 아이디오타입, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 진균 항원, 기생충 항원, 비인간 동물 항원, 종양 신생항원 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 바이러스 항원이 인간 유두종바이러스(HPV) E6 항원, HPV E7 항원 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 바이러스 항원이 엡스타인-바르 바이러스 잠복성 막 단백질 1(LMP1), 잠복성 막 단백질 2a(LMP 2a) 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 항원이 신생물 항원 또는 종양 신생항원인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 종양 신생항원이 수용자의 종양으로부터의 항원인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 공여자가 암이 없는 공여자인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 부분적 HLA-일치 또는 HLA-일배수동종 공여자가 수용자에 대해 일치하는 적어도 하나의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 대립유전자를 가지며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 일치하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 공여자가 공여자 항-수용자(이식편대숙주) 방향으로 수용자에 대해 불일치하는 적어도 하나의 HLA 클래스 II 대립유전자를 가지며, HLA 클래스 II 대립유전자는 HLA-DRB1, HLA-DQB1 및 HLA-DPB1으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자에서 불일치하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 수용자에 존재하는 항원에 대해 백신접종된 공여자가 수용자에 존재하는 항원에 대해 CD4+ T-세포 면역을 갖는 공여자인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 수용자가 공여자의 인간 백혈구 항원에 대해 반응성인 검출가능한 항체를 갖지 않는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 말초 혈액 세포 조성물의 CD8+ T-세포를 감소시키는 것이 자성 입자와 회합된 항-CD8+ 항체 또는 항-CD8+ 항체와 보체를 사용하는 것을 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 수용자, 공여자 및 하나 이상의 잠재적 동종이계 공여자(들)로 구성된 군으로부터 선택되는 대상체가 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 간염 바이러스 항원, 엡스타인-바르 바이러스 및 사이토메갈로바이러스 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는 감염원 항원에 대한 혈청학적 반응성에 대해 스크리닝된, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 동종이계 림프구 조성물의 CD4+ T-세포의 수가 말초 혈액 세포 조성물의 CD4+ T-세포의 수와 약 50% 미만으로 상이한, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 수용자의 이상적인 체중 킬로그램(kg)을 기반으로 하는 공여자 CD4+ T-세포의 수가 약 1X105 CD4+ T-세포/kg 내지 약 1X109 CD4+ T-세포/kg인, 방법.
  16. a) 대상체에게 림프-고갈 화학요법을 투여하는 단계; 및
    b) 대상체에게 림프구 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    림프구 조성물은 HLA-일치, 부분적 HLA-불일치 또는 HLA-일배수동종 공여자의 말초 혈액 세포 조성물로부터 수득되고, 공여자는 대상체에 존재하는 바이러스 항원 및/또는 종양 신생항원에 대해 임의적으로 백신접종되고,
    조성물은 CD8+ T 세포가 고갈되고,
    조성물은 대상체에 존재하는 바이러스 및/또는 종양 신생항원에 특이적인 CD4+ T 세포의 확장된 집단을 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 림프-고갈 화학요법이 림프-감소 비-림프 절제 치료; 일시적인 림프구감소증을 유도하는 치료; 골수-유래된 억제제 세포를 고갈시키거나 억제하는 치료; 종양 관련 대식 세포를 고갈시키거나 억제하는 치료 또는 조절성 T 세포를 고갈시키는 치료인, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 림프-고갈 화학요법이 다사티닙(dasatinib), 5-플루오로우라실, 탁소테레(taxotere), 클로드로네이트(clodronate), 젬시타빈(gemcitabine), 사이클로포스파미드, 플루다라빈(fludarabine), 데닐류킨 디프티톡스(denileukin diftitox) 및 다클리주맙(daclizumab)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제1항 또는 제16항에 있어서, 말초 혈액 세포 조성물이 전혈 생성물 또는 성분채집 생성물인, 방법.
  20. 바이러스 항원, 종양 신생항원 또는 이들의 조합물에 특이적인 CD4+ T 세포의 확장된 집단을 함유하는, 여러 다양한 세포주를 포함하는 세포 은행으로서, 각 세포주는 단일 공여자로부터 비롯되는, 세포 은행.
  21. 제20항에 있어서, 바이러스 항원이 HPV 항원인, 세포 은행.
  22. 제20항에 있어서, 바이러스 항원이 엡스타인-바르 바이러스의 항원인, 세포 은행.
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