JP2017516752A - 単離されたドナーｍｈｃ由来ペプチド及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、移植拒絶の予防を必要とする患者において寛容を誘導することにより移植拒絶を予防する、ドナーＭＨＣクラスＩＩ分子の多型領域由来のペプチドに関する。本発明は、薬剤として使用するための、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含む、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドに関する。本発明は、移植患者が寛容であるかを判定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記移植患者から得られた生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの存在を判定する工程を含み、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの存在が寛容を示す、方法に関する。

Description

本発明は、免疫療法分野におけるものである。
特に、本発明は、移植拒絶の予防を必要とする患者において寛容を誘導することにより免疫拒絶を予防する、ドナーＭＨＣクラスＩＩ分子の多型領域由来の単離されたペプチドに関する。
同種のヒト間での移植は、疾患の進行により機能不全となった臓器を置き換えるのに、今でも最良の処置である。レシピエント細胞とドナー細胞との主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子間での不一致が、臓器移植の長期的成功に対する主な障壁である。移植臓器に対する寛容の誘導が、主な目標となっており、特定の寛容戦略が、臨床応用され始めている。種々の集団のＴｒｅｇが、同種臓器に対する寛容を誘導可能であると説明されている。これらのＴｒｅｇの大部分は、ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇである。一方、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇは、ほとんど十分に明らかにされていない。
臓器同種移植片生存を長くするのに最も効率的な戦略の一つである、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用の同時刺激阻害は、強力なサプレッシブ能を有するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇと呼ばれる）を誘導することが、以前から説明されている（１、２）。天然のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇだけでなく、ドナー特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、ナイーブな移植レシピエントに対して、寛容を伝達したことが示されている。加えて、これらの細胞は、移植臓器の生存がインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）のその分泌に依存するような珍しい方法で、樹状細胞（ＤＣ）及び移植片の内皮細胞（ＥＣ）によるインドールアミン ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現を向上させるように振る舞った（１）。また近年、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇのサプレッシブ活性は、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）の存在下において主に行われること、及び、フィブリノゲン様タンパク質２（ＦＧＬ２）が、このサプレッションに関与していたことが示されている（２）。
レギュラトリーＴ細胞集団の形をとるＴＣＲ相互作用のための要求は、活発で、進行中の議論である。ＴＣＲ特異性及び多様性が、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏでの機能及び活性に重要であることが、一部の研究で示唆されている（３）。ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇについての種々のモデルから、抗原特異的Ｔｒｅｇは、制限されていないＴｒｅｇ細胞より強力なサプレッサーであることが示されている。また、ＣＤ４＋ Ｔｒｅｇについて、ＴＣＲ多様性が胸腺選択に重要であることも公知である。Ｔｒｅｇ生成及び機能上の差異及びその影響が、近年説明されている。高スループットシークエンスから、高いＴＣＲ多様性を有するナイーブなＴｒｅｇが、ＴＣＲ制限Ｔｒｅｇより、効率的に増殖し、養子移植に基づく移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をサプレッションするのに、ＴＣＲ制限Ｔｒｅｇより、適応でき、効率的であることが示されている。Immunoscope（登録商標）を使用して、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、Ｖβ１１エレメントに対する偏ったレパートリーを蓄積したことが、以前に証明されている（２）。このことは、クローンエクスパンションの可能性を示唆している。今日、このＴｒｅｇ集団又はＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ集団の認識機構は、一般的にはほとんど知られていない。このため、Ｔｒｅｇ活性におけるＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチド相互作用の正確な役割は、今でも議論のトピックである。
さらに、移植物に対する免疫応答（例えば、抗体媒介性拒絶に関連するドナー特異的抗体）のＴｒｅｇ媒介性サプレッションに基づく効率的な治療戦略を提供することにより、日和見感染症（例えば、細菌、ウイルス、又は真菌感染）の罹患率を向上させ、移植患者の死亡率を向上させてしまう欠点を有する、非特異的な免疫抑制剤を使用する必要を回避するための重要な必要性が未だに存在している。
Van Denderen et al.（４）には、その移植臓器を寛容又は拒絶のいずれかをしている移植動物からのトータル脾細胞（大部分は、エフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞．．．）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖応答を誘導するドナーペプチドが記載されている。彼らは、その移植臓器を拒絶したレシピエントにおいて陽性の応答を誘導するドナーペプチド、その移植臓器を寛容したレシピエントにおいて陽性の応答を誘導するドナーペプチド、及び、両群において陽性の応答を誘導するドナーペプチドを特定した。
前記文献に記載されたペプチド１３は、拒絶又は寛容しているレシピエントにおいて、何ら応答を誘導しなかったことに留意する必要がある。この文献に関して、ペプチド１３は、寛容を誘導するのに、決して選択及び使用されることはないであろう。
加えて、ペプチド１４によるトータル脾細胞の刺激は、拒絶しているレシピエント由来の細胞の活性化をもたらし、寛容しているレシピエント由来の細胞のより小さい活性化をもたらした。この結果から、このペプチドは、両レシピエントに存在するが、特に拒絶しているレシピエントに存在する細胞により認識されたため、寛容を誘導するのには使用できないことが示唆された。
最後に、著者らは、種々のアロペプチドにより刺激された細胞の部分集合を特定していない。このｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ法に使用される細胞集団を仮定すれば、ペプチドは、脾細胞中の９０％のＴ細胞を表すエフェクター細胞により認識される可能性がある。
第１の態様において、本発明は、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドに関する。
第２の態様において、本発明は、本発明の単離されたペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド多量体に関する。
第３の態様において、本発明は、本発明の単離されたペプチドを含む培養培地により、形質細胞様樹状細胞集団の存在下において、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法に関する。
第４の態様において、本発明は、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法に関する。
第５の態様において、本発明は、薬剤として使用するための、寛容の誘導を必要とする患者において寛容を誘導するのに使用するための、及び、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、本発明の単離されたペプチド又はＭＨＣ／ペプチド多量体に関する。
第６の態様において、本発明は、
ａ）本発明の単離されたペプチド、又は
ｂ）本発明のペプチドをコードする核酸、又は
ｃ）このような核酸を含むベクター、又は
ｄ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｅ）本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｆ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｇ）本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球と、
薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物に関する。
第７の態様において、本発明は、移植患者（レシピエント）が寛容であるかを判定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記移植患者から得られた生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在を判定する工程を含み、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在が寛容を示す、方法に関する。
ドナー由来ペプチド刺激に対する応答におけるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ活性化の分析。（Ａ）ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを、ペプチドの存在下において、同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣと６日間共培養した。各実験について、ｐＤＣとのみ６日間共培養した後のＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇの割合を、値１とした。平均値１は、３２．８５±１．９８％に等しい。結果を、ペプチド刺激後のＣＤ２５陽性細胞の割合と、ペプチドなしの対照条件でのＣＤ２５陽性細胞の割合との間の比±ＳＥＭとして表わす。対照条件（値１．０）に対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。各ペプチドについて、ｎ＝４〜１８。（Ｂ）Ｂｕ３１のより短いペプチド誘導体に対する応答におけるＴｒｅｇ活性化の分析。左側に、１５個のＢｕ−３１誘導体が詳細に記載されており、ａａ配列の長さにより、９ａａ〜１５ａａで分類されている。ボックスは、ドナーとレシピエント間でのミスマッチａａを強調している。右側に、Ｂｕ３１誘導体に対する応答におけるＴｒｅｇ活性化を、ＣＤ２５発現により分析した。ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを、各ペプチドの存在下において、同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣと６日間共培養した。バーは、ペプチド刺激後のＣＤ２５陽性細胞の割合と、ペプチドなしの対照条件でのＣＤ２５陽性細胞の割合との間の比を表わす。Ｂｕ３１条件に対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。各ペプチドについて、ｎ＝３〜１４。 ドナー由来ペプチド刺激に対する応答におけるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ活性化の分析。（Ａ）ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを、ペプチドの存在下において、同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣと６日間共培養した。各実験について、ｐＤＣとのみ６日間共培養した後のＣＤ２５陽性Ｔｒｅｇの割合を、値１とした。平均値１は、３２．８５±１．９８％に等しい。結果を、ペプチド刺激後のＣＤ２５陽性細胞の割合と、ペプチドなしの対照条件でのＣＤ２５陽性細胞の割合との間の比±ＳＥＭとして表わす。対照条件（値１．０）に対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。各ペプチドについて、ｎ＝４〜１８。（Ｂ）Ｂｕ３１のより短いペプチド誘導体に対する応答におけるＴｒｅｇ活性化の分析。左側に、１５個のＢｕ−３１誘導体が詳細に記載されており、ａａ配列の長さにより、９ａａ〜１５ａａで分類されている。ボックスは、ドナーとレシピエント間でのミスマッチａａを強調している。右側に、Ｂｕ３１誘導体に対する応答におけるＴｒｅｇ活性化を、ＣＤ２５発現により分析した。ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを、各ペプチドの存在下において、同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣと６日間共培養した。バーは、ペプチド刺激後のＣＤ２５陽性細胞の割合と、ペプチドなしの対照条件でのＣＤ２５陽性細胞の割合との間の比を表わす。Ｂｕ３１条件に対する＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。各ペプチドについて、ｎ＝３〜１４。 ｅｘ ｖｉｖｏでのアロペプチド刺激後のＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ表現型。（Ａ）Ｔｒｅｇ及び同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣを、単独、対照ペプチドと共に、又は、ペプチドＢｕ３１と共に６日間培養した。示されたマーカーの発現を、培養上清中のＣＤ８＋ Ｔｒｅｇについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後にＥＬＩＳＡ（Ａ）又はフローサイトメトリー（Ｂ）により分析した。グラフは、平均±ＳＥＭを表わす。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ｎ＝４〜７。 ｅｘ ｖｉｖｏでのアロペプチド刺激後のＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ表現型。（Ａ）Ｔｒｅｇ及び同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣを、単独、対照ペプチドと共に、又は、ペプチドＢｕ３１と共に６日間培養した。示されたマーカーの発現を、培養上清中のＣＤ８＋ Ｔｒｅｇについて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後にＥＬＩＳＡ（Ａ）又はフローサイトメトリー（Ｂ）により分析した。グラフは、平均±ＳＥＭを表わす。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ｎ＝４〜７。 Ｂｕ３１活性化Ｔｒｅｇは効率的なサプレッシブ能を維持した。新鮮なＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ及び同系ＣｐＧ−成熟ｐＤＣを、Ｂｕ３１又は対照ペプチドのいずれかと共に、６日間共培養した。６日目に、Ｔｒｅｇを、細胞分取（ＴＣＲ＋）により単離した。そのレギュラトリー機能を、ＭＬＲアッセイ法をサプレッションするその能力を測定することにより分析した。ドナーＬＥＷ．１Ｗ ｐＤＣによる刺激後のナイーブなＣＦＳＥラベルされた分裂性ＬＥＷ．１Ａ ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の相対比を、１：１のエフェクター：サプレッサー比において、６日間のペプチド刺激ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの非存在又は存在下で、培養の６日目に分析した。グラフは、平均±ＳＥＭを表わす。＊ｐ＜０．０５（左側）。プロットは、４つの独立した実験を表わす（右側）。 ｉｎ ｖｉｖｏでのペプチドＢｕ３１注入後の寛容誘導。レシピエントを、処置しない（ｎ＝９）か、又は、ｉ．ｐ ミニ浸透圧ポンプにより、０．５mg/日（ｎ＝６）もしくは１mg/日（ｎ＝５）のいずれかでペプチドを送達する短期間の連続的なペプチド注入で処置するかのいずれかをした。未処置及びＢｕ３１ ０．５mg/日に対して、＊＊ｐ＜０．０１ Ｂｕ３１ １mg/日。 ｉｎ ｖｉｖｏでのペプチドＢｕ３１注入後の寛容誘導。レシピエントを、処置しない（ｎ＝９）か、又は、ｉ．ｐ ミニ浸透圧ポンプ（ALZET）により、２０．８３μg/時間 単独（Ｂｕ３１ ０．５mg/日：ｎ＝６）又は４０．６６μg/時間 ＬＥＷ．１Ｗ／ＬＥＷ．１Ａ（Ｄｕ５１ １mg/日：ｎ＝５）において、又は、枯渇性抗ＣＤ８ ｍＡｂ（ＯＸ８）（ｎ＝２）もしくはＢＮ／ＬＥＷ．１Ａ（Ｄｕ５１ １mg/日（ＢＮ／１Ａ）：ｎ＝４）株との組み合わせのいずれかを−７日目から２８日間送達する、連続的なペプチド注入で処置するかのいずれかをした。 抗−ドナー免疫応答。アロ抗体産生を、ナイーブ（ｎ＝３）、移植未処置（ｎ＝３）、及び長期Ｄｕ５１処置（ｎ＝４）動物において評価した。血清を、拒絶後３０日未満又は移植後１２０日超で収集した。血清を、ドナーの脾細胞とインキュベートし、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、又はＩｇＧ２ｂ Ａｂ産生について、フローサイトメトリーにより分析した。グラフは、ＭＦＩ±ＳＥＭを表わす。 Ｂｕ３１処置したレシピエントからのＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇのｉｎ ｖｉｔｒｏでのサプレッシブ活性。ドナーＬＥＷ．１Ｗ ｐＤＣで刺激したナイーブなＣＦＳＥラベルＬＥＷ．１Ａ ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の増殖を、種々のエフェクター：サプレッサー比でのナイーブ又はＢｕ３１処置したレシピエントからのＬＥＷ．１Ａ ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在下において、培養の６日後に分析した。ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞増殖は、約８０％であり、各実験において１００の値を与えた。グラフは、相対的なＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞増殖の平均±ＳＥＭを表わす。＊ｐ＜０．０５。
本発明者らは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇの優れたＴＣＲ特異性が、Ｔｒｅｇの機能及び移植臓器の生存に影響を及ぼすかどうかを調査し、これにより、誘導されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、ドナーＭＨＣクラスＩＩ分子の多型領域由来のサブドミナントなペプチド（Ｂｕ３１と呼ばれる）を認識したことを、移植において初めて証明した。このペプチドは、少なくともｅｘ ｖｉｖｏにおいて、ｐＤＣの存在下で、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇをエクスパンションさせ、ナイーブな移植レシピエントにおいて、更なる処置をすることなく寛容を誘導した。
本発明のペプチド
本発明の第１の態様は、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドに関する。
本発明の一実施態様では、本ペプチドは、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は下記ペプチド：

を除く、その機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドである。
本発明の一実施態様では、本ペプチドは、アミノ酸配列：ＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：２１）又はその機能保存変異体を含む。
本明細書で使用する場合、「機能保存変異体」という用語は、参照ペプチド（すなわち、最小配列である配列番号：１又は配列番号：２１を含むペプチド、例えば、以下に記載された配列番号：２（Ｂｕ３１）のペプチド）に対して、少なくとも７０％、更により好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の同一性を含み、かつ、参照ペプチド（例えば、配列番号：２（Ｂｕ３１）のペプチド）と実質的に同じ方法で、寛容を誘導することにより、臓器拒絶を予防可能でもある変異体を意味する。
本発明の一実施態様では、前記ペプチドは、ドナーＭＨＣクラスＩＩ分子の多型領域由来である。
本発明の一実施態様では、前記ペプチドは、最大で１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のアミノ酸を含む。
特定の実施態様では、前記ペプチドは、アミノ酸配列：ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥ（配列番号：２）（Ｂｕ３１とも呼ばれる）又はその機能保存変異体からなる。
一実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号：２のペプチドに対して、少なくとも７０％、更により好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の同一性を含み、かつ、配列番号：２のペプチドと実質的に同じ方法で、寛容を誘導することにより、臓器拒絶を予防可能でもある。
本発明のクエリーアミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ペプチド配列が、照会アミノ酸配列のアミノ酸１００個当たりに、最大５個のアミノ酸改変を含む場合があることを除いて、対象ペプチドのアミノ酸配列が、照会配列と同一であることを意図している。すなわち、照会アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するペプチドを得るには、対象配列中の最大５％（１００個中５個）のアミノ酸残基が、挿入、欠失、又は、別のアミノ酸により置換されることができる。
本願の枠組みにおいて、同一性の割合は、グローバルアライメントを使用して算出される（すなわち、２つの配列が、その全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当技術分野において周知である。「needle」プログラムは、ニードルマン−ワンチ・グローバルアライメント・アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用して、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を、その全長を考慮して見出す。例えば、このプログラムを、使用することができる。needleプログラムは、例えば、ebi.ac.ukのワールド・ワイド・ウェブサイトで入手できる。本発明に基づく同一性の割合は、好ましくは、EMBOSS::nedddle（グローバル）プログラムを使用して、１０．０に等しい「Gap Open」パラメータ、０．５に等しい「Gap Extend」パラメータ、及びBlosum62マトリクスで算出される。
一実施態様において、本発明のペプチドは、配列番号：２（Ｂｕ３１）に対して、１、２、３、又は４個のアミノ酸が異なってもよい。
このようなペプチドは、例えば、参照配列と比較して置換のみを含んでもよい。この置換は、好ましくは、以下の表に示された保存的置換に相当する。
典型的には、本発明は、配列番号：２（Ｂｕ３１）からなるペプチドに対して実質的に同一のペプチドを包含する。このペプチドでは、１つ以上の残基が、機能的に類似する残基により保存的に置換されており、このペプチドは、以下に記載されたように、配列番号：２（Ｂｕ３１）からなるペプチドの機能的局面を示す、すなわち、所定のアミノ酸配列からなるペプチド（例えば、ペプチドＢｕ３１）と実質的に同じ方法で、寛容を誘導することにより、臓器拒絶を予防することもできる。
また、「保存的置換」という用語は、誘導体化されていない残基の代わりに、化学的に誘導体化された残基の使用も含む。「化学的な誘導体」は、機能性側鎖基の反応により化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有するペプチドを意味する。このような誘導体化分子の例は、例えば、遊離アミノ酸基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、又はホルミル基を形成している分子を含む。遊離カルボキシル基は誘導体化されて、塩、メチル及びエチルエステルもしくは他の種類のエステル、又はヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基は誘導体化されて、Ｏ−アシル又はＯ−アルキルの誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成することができる。また、化学誘導体は、２０個の標準的なアミノ酸の１つ以上の天然アミノ酸の誘導体を含有するペプチドを含む。例えば、４−ヒドロキシプロリンは、プロリンについて置換することができる。５−ヒドロキシリシンは、リシンについて置換することができる。３−メチルヒスチジンは、ヒスチジンについて置換することができる。ホモセリンは、セリンについて置換することができる。オルニチンは、リシンについて置換することができる。また、「保存的置換」という用語は、ペプチド又はタンパク質の二次構造を制御及び安定化するのを目的に、非天然アミノ酸の使用も含む。これらの非天然アミノ酸は、以下に記載されるように、化学的に改変されたアミノ酸、例えば、プロリノアミノ酸、ベータ−アミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、シクロプロピルアミノ酸、アルファ，アルファ−置換アミノ酸である。また、これらの非天然アミノ酸は、フッ化、塩化、臭化、又はヨウ化改変アミノ酸を含んでもよい。
新たに生じたペプチドが、最初に特徴付けられたペプチドＢｕ３１と同じ生物学的特性を含むかを検証するために、ｉｎ ｖｉｖｏでのペプチド注入後における、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ活性化分析及び／又は寛容誘導分析（例えば、実施例セクションに記載）を、各ペプチドに行うことができる。さらに、移植臓器モデルにおいて行われるタイムコース及び用量応答から、各ペプチドについての最適条件が決定されるであろう。
一実施態様において、前記単離されたペプチドは、

からなる群より選択される。
本発明に基づいて、本発明のペプチドは、従来の自動ペプチド合成法又はリコンビナント発現により産生することができる。タンパク質を設計及び調製するための全体的な原理は、当業者に周知である。
本発明のペプチドは、従来技術に基づいて、溶液中又は固体支持体上で合成することができる。種々の自動合成機が市販されており、Stewart and Young；Tam et al., 1983；Merrifield, 1986、及びBarany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979に記載されたように、公知のプロトコールに基づいて使用することができる。また、本発明のペプチドは、例示的なペプチド合成機、例えば、Applied Biosystems Inc.からのモデル４３３Ａを利用する固相技術により合成することができる。自動ペプチド合成又はリコンビナント法により生成された任意の所定のペプチドの純度は、逆相ＨＰＬＣ分析を使用して決定することができる。各ペプチドの化学的信頼性は、当業者に周知の任意の方法により確立することができる。自動ペプチド合成の代替手段として、リコンビナントＤＮＡ技術を利用することができる。この場合、選択されたペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター内に挿入され、適切なホスト細胞中にトランスフォーメーション又はトランスフェクションされ、以下に記載されたように、発現に適した条件下で培養される。リコンビナント法は、より長いペプチド（ポリペプチド）を産生するのに特に好ましい。
核酸、ベクター、及びリコンビナントホスト細胞
あるいは、本発明のペプチド（例えば、配列番号：２で示されたペプチド）をコードする核酸、このような核酸を含むベクター、又はこのような発現ベクターを含むホスト細胞も、本発明の文脈内で対象となるものである。
一実施態様において、本ペプチドは、上記されたアミノ酸配列からなる。
本発明の核酸は、当技術分野においてそれ自体は公知の任意の技術により産生することができる。同技術は、例えば、任意の化学的、生物学的、遺伝学的、又は酵素的な技術を、単独又は組み合わせのいずれかであるが、これらに限定されるわけではない。
その最も広い意味において、「ベクター」は、核酸の細胞への輸送を促進可能な任意の媒体である。一般的には、本発明に有用なベクターは、対象となる核酸配列の挿入又は包含により操作された、プラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス又は細菌ソースから得られた他の媒体を含むが、これらに限定されるわけではない。ウイルスベクターは、好ましい種類のベクターであり、下記ウイルス：レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベーマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス、及びマウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ関連ウイルス；ＳＶ−４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス、ポリオウイルス；ならびにＲＮＡウイルス、例えば、レトロウイルス由来の核酸配列を含むが、これらに限定されるわけではない。命名されていないが、当技術分野において公知の他のベクターを、容易に利用することができる。
好ましいウイルスベクターは、非細胞変性真核生物ウイルスに基づいている。同ウイルスにおいて、必須でない遺伝子が、対象となる遺伝子により置換されている。非細胞変性ウイルスは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）を含む。同ウイルスのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含み、ホスト細胞内ＤＮＡへのその後のプロウイルスインテグレーションを伴う。レトロウイルスは、ヒトの遺伝子治療の臨床試験に承認されている。複製欠損の（すなわち、所望のペプチドの合成に向けることができるが、感染性粒子を作製することができない）レトロウイルスが最も有用である。このように遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける遺伝子の高効率なトランスダクションのための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコール（外来性遺伝子材料のプラスミドへの包含、パッケージング細胞株のプラスミドによるトランスフェクション、パッケージング細胞株によるリコンビナントレトロウイルスの産生、ウイルス粒子の組織培養培地からの回収、及びターゲット細胞のウイルス粒子による感染の工程を含む）は、KRIEGLER （「A Laboratory Manual」, W.H. Freeman C.O., New York, 1990）及びMURRY（「Methods in Molecular Biology」, vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991）に提供されている。
特定の用途に好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスである。これらのウイルスは、遺伝子治療において、ヒトへの使用について既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ関連ウイルスは、複製欠損になるように操作することができ、広い範囲の細胞の種類及び細胞種に感染することができる。さらに、同ウイルスは、熱及び脂肪族溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞への高トランスダクション頻度；及び重複感染阻害の欠損による複数回のトランスダクションが可能等の利点を有する。報告によれば、アデノ関連ウイルスは、部位特異的な方法において、ヒトの細胞内ＤＮＡにインテグレーションすることにより、レトロウイルス感染の挿入変異誘発の可能性及び挿入された遺伝子発現特性の変異性を最少化することができる。加えて、野生型アデノ関連ウイルスの感染は、アデノ関連ウイルスのゲノムインテグレーションが比較的安定なイベントであることを含めて、選択圧の非存在下において、１００通りを超える経路のための組織培養でフォローされてきた。また、アデノ関連ウイルスは、過剰染色体様式においても機能することができる。
他のベクターは、プラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において広く説明されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。この数年の間に、プラスミドベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗原コード遺伝子を細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。プラスミドベクターは、これについて特に有利である。プラスミドベクターは、多くのウイルスベクターが有するのと同じ安全性の懸念を有さないためである。一方で、ホスト細胞に適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内に操作可能にコードされた遺伝子から、ペプチドを発現することができる。一部の一般的に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、プラスミドは、制限酵素及びライゲーション反応を使用し、ＤＮＡの特定フラグメントを除去及び追加して、カスタム設計することができる。プラスミドは、各種の非経口、粘膜、及び局所経路により送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路により注入することができる。また、ＤＮＡプラスミドは、鼻内スプレー又は液滴、直腸坐剤、及び経口により投与することができる。また、ＤＮＡプラスミドは、表皮又は粘膜表面に、遺伝子銃を使用して投与することができる。該プラスミドは、水溶液、金粒子上で乾燥させた状態、又は別のＤＮＡ送達システム（リポソーム、デンドリマー、及びマイクロ封入を含むが、これらに限定されるわけではない）と会合した状態で与えることができる。
本発明に基づいて、使用することができるホスト細胞の例は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、ヒト樹状細胞又は単球（特に、処置されるべき患者から得られた細胞）である。
遺伝子を運ぶベクターを細胞内に導入することができる手段は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、又は、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウム、もしくは当業者に公知の他の手法を使用するトランスフェクションを含むが、これらに限定されるわけではない。
ＭＨＣ／ペプチド多量体
本発明の別の態様は、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は上記されたその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドを含む、ＭＨＣ／ペプチド多量体である。
本発明の一実施態様では、前記ペプチドは、最大で１１、１２、１３、１４、１５、又は１６個のアミノ酸を含む。
本明細書で使用する場合、「ＭＨＣ／ペプチド多量体」という用語は、本発明のペプチドがロードされた主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質サブユニットで構成された、安定した多量体複合体を意味する。本発明に基づいて、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体（本明細書において、ＭＨＣ／ペプチド複合体とも呼ばれる）は、ＭＨＣ／ペプチド二量体、三量体、四量体、又は五量体を含むが、これらに限定されるわけではない。
「主要組織適合複合体」（ＭＨＣ）という用語は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を含む種々の種において説明された、組織適合抗原系を包含することを意味する総称である。
本発明の一実施態様では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体である。
本発明の特定の実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ラットＭＨＣＲＴ１．Ａａ／ペプチド多量体である。また、非古典的なラットＭＨＣクラスＩ分子も、本発明の文脈内に包含されることにも更に留意する必要がある。
別の特定の実施態様では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体に対応するＨＬＡである。
ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩ分子をコードする、３種類の主な遺伝的ローカス：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃが存在する（ヒトのＭＨＣ分子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも指定される）。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、及びＨＬＡ−Ａ＊１１が、これらのローカスから発現することができる種々のＭＨＣクラスＩアレルの例である。
また、非古典的ヒトＭＨＣクラスＩ分子、例えば、ＨＬＡ−Ｅ（マウスにおける機能性ホモログは、Ｑａ−１ｂと呼ばれる）及びＭＩＣＡ／Ｂ分子も、本発明の文脈内に包含されることも、更に留意する必要がある。
したがって、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＨＬＡ−Ａ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｂ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｃ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｅ／ペプチド多量体、ＭＩＣＡ／ペプチド多量体、及びＭＩＣＢ／ペプチド多量体からなる群より選択されるＨＬＡ／ペプチド多量体である。
一実施態様において、前記単離されたペプチドは、

からなる群より選択される。
ＭＨＣ／ペプチド四量体を得るための方法は、国際公開公報第９６／２６９６２号及び同第０１／１８０５３号に記載されている。これらの文献は、参照により組み入れられる。
本発明の一実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、上記されたＭＨＣクラスＩ ＲＴ１．Ａａ／ペプチド複合体又はＭＨＣクラスＩ／ペプチド複合体に対応するＨＬＡに特異的なＴ細胞集団を可視化するのに使用することができる。
ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣの重鎖がビオチン化されている多量体でもよい。このビオチン化により、ストレプトアビジンとの四量体としての組み合わせが可能である。このようなＭＨＣ／ペプチド四量体は、適切なＴＣＲ−担体Ｔリンパ球に対する向上した結合活性を有するため、免疫蛍光法により反応性集団を可視化するのに使用することができる。
本発明の別の実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、上記されたＭＨＣ／ペプチド複合体に特異的なＴ細胞集団をスクリーニングすることにより（フローサイトメトリーにおいて、又は、免疫磁性スクリーニングにより）、検出及び／又は単離に使用することができる。
本発明の特定の実施態様では、ＭＨＣクラスＩ ＲＴ１．Ａａ／ペプチド多量体又はＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体に対応するＨＬＡは、上記された前記ＭＨＣクラスＩ ＲＴ１．Ａａ／ペプチド複合体又はＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体に対応する前記ＨＬＡに特異的なＴ細胞集団をスクリーニングすることにより（フローサイトメトリーにおいて、又は、免疫磁性スクリーニングにより）、検出及び／又は単離に使用することができる。
本発明の別の態様は、上記されたＭＨＣ／ペプチド多量体をコートした、ビーズ、マイクロスフェア、又はナノ粒子である。
抗原提示細胞及びその使用
本発明の別の態様は、上記された本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含むペプチド提示細胞である。
本発明の一実施態様では、前記ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＭＨＣクラスＩ ＲＴ１．Ａａ／ペプチド多量体である。
別の特定の実施態様では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、上記で定義されたＭＨＣクラスＩ／ペプチド多量体に対応するＨＬＡである。
したがって、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、ＨＬＡ−Ａ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｂ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｃ／ペプチド多量体、ＨＬＡ−Ｅ／ペプチド多量体、ＭＩＣＡ／ペプチド多量体、及びＭＩＣＢ／ペプチド多量体からなる群より選択されるＨＬＡ／ペプチド多量体である。
一実施態様において、前記ペプチドは、

からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、前記抗原提示細胞は、処置されるべき患者から得られる。
本明細書で使用する場合、「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、本明細書において、「ペプチド提示細胞」とも呼ばれ、互換的に使用され、抗原を内部移行及び処理可能な免疫細胞のクラスを意味する。これにより、抗原決定基が、免疫系（例えば、ＭＨＣクラスＩ制限細胞傷害性Ｔリンパ球及び／又はＭＨＣクラスＩＩ制限ヘルパーＴリンパ球）により認識されることができる方法において、ＭＨＣ会合複合体として細胞表面上に提示される。細胞をＡＰＣとして機能させる２つの必須の特性は、細胞内に取り込まれた抗原を処理する能力及びＭＨＣ遺伝子産物の発現である。ＡＰＣの例は、樹状細胞（ＤＣ）、単核食細胞（例えば、マクロファージ）、Ｂリンパ球、皮膚のランゲルハンス細胞、及び、ヒトにおいては、内皮細胞を含む。
本発明の一実施態様では、前記ＡＰＣは、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）である。
本明細書で使用する場合、「形質細胞様樹状細胞」（ｐＤＣ）という用語は、血中を循環し、末梢のリンパ器官に見出される、生来の免疫細胞を意味する。ｐＤＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）グループに属する細胞グループを構成する。ヒトｐＤＣは、典型的には、表面マーカーであるＩＬ−３レセプター鎖（ＩＬ−３Ｒａ、ＣＤ１２３）、ＢＤＣＡ−２（ＣＤ３０３）、及びＢＤＣＡ−４（ＣＤ３０４）を発現しているが、ＣＤ１１ｃ又はＣＤ１４を発現していない。ｐＤＣは、従来の樹状細胞又は単球とは区別される。
本発明の一実施態様では、前記ｐＤＣは、成熟ｐＤＣである。成熟ｐＤＣは、典型的には、表面マーカーであるＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６を発現しており、多量のＩＦＮアルファ及びＩＦＮベータを産生する。
本発明のこのようなＡＰＣを調製するために、抗原提示能を有する細胞を、処置されるべき患者から単離し、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて、本発明のペプチドによりパルスして、ＭＨＣ分子を有する複合体を形成する。
樹状細胞を使用する場合、本発明のＡＰＣを、以下のようにして調製することができる。リンパ球を、処置されるべき患者の末梢血から、フィコール法により単離する。付着細胞を、付着しなかった細胞から分離する。ついで、この付着細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で培養して、樹状細胞に誘導する。この樹状細胞を、本発明のペプチドと共に培養することによりパルスして、本発明のＡＰＣを得る。樹状細胞を、抗原が内部移行及びこの樹状細胞表面に提示可能な十分な時間、ペプチドに曝す必要がある。ついで、得られた樹状細胞を、処置されるべき患者に再投与することができる。このような方法は、国際公開公報第９３／２０８１８５号及び欧州特許第０５６３４８５号に記載されている。これらの文献は、参照により組み入れられる。
Ｔリンパ球及びその使用
本発明の別の態様は、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は本発明の機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドを特異的に認識するＴリンパ球である。
一実施態様において、前記ペプチドは、

からなる群より選択される。
本発明の一実施態様では、前記Ｔリンパ球は、レギュラトリーＴリンパ球（Ｔｒｅｇ）である。本発明の別の実施態様では、前記Ｔリンパ球は、Ｔｒｅｇクローンである。
本明細書で使用する場合、「レギュラトリーＴ細胞」又は「レギュラトリーＴリンパ球」という用語は、互換的に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、レスポンダーＴ細胞の増殖を優先的にサプレッションし、過剰な免疫応答に関連する、又は、同免疫応用により生じる疾患及び症状、例えば、自己免疫疾患、移植拒絶、又は移植片対宿主病等を防止する能力を有するＴリンパ球の特定集団を意味する。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞集団として元々特定されたが、フォークヘッドファミリー転写因子であるＦｏｘＰ３の発現によっても特徴付けられる。またごく最近、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ細胞も、以前に記載されたように特定されている。
特定の実施態様では、前記Ｔｒｅｇは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇである。
別の実施態様では、前記Ｔリンパ球は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴＣＲを発現する、遺伝的に改変されたＴリンパ球である。
したがって、Ｔリンパ球は、偏って制限されたＴＣＲレパートリーを発現している。偏った（ＴＣＲ）は、当業者に周知である。ＴＣＲの偏りの例は、古典的な多型の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）制限免疫応答において観察され、説明されている（１３）。
レギュラトリーＴ細胞集団を得るための方法
別の態様では、本発明は、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は本発明のその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドを含む培養培地により、樹状細胞集団の存在下において、Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法に関する。
一実施態様において、本発明は、本発明の単離されたペプチドを含む培養培地により、形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）集団の存在下において、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法に関する。
一実施態様において、ｐＤＣは、成熟ｐＤＣである。
一実施態様において、前記単離されたペプチドは、

からなる群より選択される。
本明細書で使用する場合、「培養培地」という用語は、Ｔ細胞の増殖及びレギュラトリーＴ細胞への分化を支持可能な任意の培地を意味する。典型的には、培養培地は、栄養（炭素源、アミノ酸）、ｐＨバッファー、及び塩を含有する基礎培地からなり、成長因子及び／又は抗生物質を添加することができる。典型的には、基礎培地は、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ、又はＡＩＭ−Ｖ培地であることができる。これらは全て、市販の標準的な培地である。
ナイーブなＴ細胞の増殖及びレギュラトリーＴ細胞への分化を支持するであろう好ましい培地配合は、合成培地（ＣＤＭ）を含む。本明細書で使用する場合、「合成培地」（ＣＤＭ）という用語は、特定成分、好ましくは、公知の化学構造の成分のみを含有する、細胞を培養するための栄養液を意味する。合成培地は、血清フリー及びフィーダーフリーの培地である。
ｐＤＣ集団の存在下において本発明のペプチドと共にＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ集団を培養する工程は、ｐＤＣによるＣＤ８＋ Ｔｒｅｇに対する前記ペプチドの提示に必要とされる時間行うものとする。
典型的には、ｐＤＣ集団の存在下において本発明のペプチドと共にＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ集団を培養するのは、１日〜１週間以上行うものとする。
特定の実施態様では、前記方法は、レギュラトリーＴ細胞集団を単離することにより、生成する更なる工程を含んでもよい。
あるいは、本発明は、上記で定義された本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法に関する。
一実施態様において、本発明は、上記で定義された本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法に関する。
一実施態様において、該多量体は、ナノ粒子上にコートされている。このため、このナノ粒子は、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体をその表面に提示する。
本発明の文脈内において、ナノ粒子は、小型で、Ｔｒｅｇの細胞表面上に提示するのに十分小さいものである。好ましい実施態様では、ナノ粒子は、０．５〜１０nm、より好ましくは１〜２．５nmの平均径を有するコアを有する。
ナノ粒子のコアは、ポリマー製のコアでもよい。好ましくは、ナノ粒子は、炭水化物系ポリマー（例えば、セルロース系ナノ粒子、キトサン系ナノ粒子）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、及びＰＥＧとＰＰＧとのコポリマー、ＰＥＧとカプロラクトン、ＰＥＧとラクチド、及びＰＥＧと［ラクチド−コ−グリコリド］を含有する分岐コポリマーからなる群より選択されるポリマーを含む。
また、ナノ粒子のコアは、金属製のコアでもよい。好ましくは、金属製のコアは、Ａｕ、Ａｇ、又はＣｕ、例えば、Ａｕ／Ａｇ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ａｇ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｐｔ、Ａｕ／Ｐｄ、Ａｕ／Ａｇ／Ｃｕ／Ｐｄ、Ａｕ／Ｆｅ、Ａｕ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｇｄ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｃｕ、Ａｕ／Ｆｅ／Ｇｄ、又はＡｕ／Ｆｅ／Ｃｕ／Ｇｄから選択される合金を含む。
好ましくは、ナノ粒子は、大部分の有機溶媒、及び特に、水に可溶性である。ナノ粒子は、当技術分野において周知の技術に基づいて調製することができる。
一実施態様において、本発明は、上記で定義された本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体でコートしたナノ粒子を含む培養培地により、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法に関する。
別の態様では、本発明は、先に記載された方法のいずれか１つにより得られたＴｒｅｇ集団、特に、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団に関する。
医薬組成物
本発明の別の態様は、
ａ）アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくはその機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチド、又は
ｂ）本発明のペプチドをコードする核酸、又は
ｃ）このような核酸を含むベクター、又は
ｄ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｅ）本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｆ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｇ）本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球と、
薬学的に許容し得る担体とを含む、医薬組成物に関する。
特定の実施態様では、前記医薬組成物は、

からなる群より選択される、単離されたペプチドを含む。
上記された本発明のいずれかの治療剤は、薬学的許容し得る賦形剤、及び場合により、持続放出性マトリックス、例えば、生分解性ポリマーと組み合わせられて、治療組成物を形成することができる。
「薬学的に」又は「薬学的に許容し得る」は、哺乳類、特に、ヒトに適切に投与された場合、有害で、アレルギー性又は他の不都合な反応を生じさせない分子実体及び組成を意味する。薬学的に許容し得る担体又は賦形剤は、任意の種類の、無毒性の固体、半固体、又は液体状の充填材、希釈剤、封入材料、又は配合助剤を意味する。
医薬組成物の形態、投与経路、用量、及び投与計画は、患者の処置されるべき症状、疾患の重篤さ、年齢、体重、及び性別等により自ずと決まる。
本発明の医薬組成物は、局所、経口、鼻内、眼内、静脈内、筋肉内、又は皮下投与用に配合することができる。好ましくは、医薬組成物は、注射可能な配合のための薬学的に許容し得る媒体を含有する。これらは、特に、等張性で無菌の生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはマグネシウム等、又はこのような塩の混合物）又は、乾燥、特に、凍結乾燥させた組成物でもよい。凍結乾燥組成物の場合には、注射液構成を可能にする滅菌水又は生理食塩水を加えてもよい。
投与に使用される用量は、種々のパラメータの関数として、特に、使用される投与方式、関連する病理、あるいは、所望の処置期間の関数として採用することができる。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要とされる用量より低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、用量を徐々に増大させることは、十分当業者の範囲内である。ただし、製品の日量は、成人１日当たりに、０．０１〜１，０００mgの広い範囲にわたって変動させることができる。好ましくは、本組成物は、処置されるべき対象に対する用量の症候調節のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mg 活性成分を含有する。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mg 活性成分、好ましくは、１mg〜約１００mg 活性成分を含有する。有効量の薬剤は、通常、１日当たり体重１kg当たりに、０．０００２mg〜約２０mg、特に１日当たり体重１kg当たりに、約０．００１mg〜７mgの用量レベルで供給される。
医薬組成物を調製するために、有効量の本発明のポリペプチド又は核酸を、薬学的に許容し得る担体又は水性媒体中に、溶解又は分散させることができる。
注射用途に適した薬学的形態は、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性ポリエチレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射液又は分散液の即席調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、これらの形態は、無菌でなければならず、容易に注射針を通過する程度に流動性を有しなければならない。これらの形態は、製造及び保管の条件下において安定でなければならず、微生物、例えば、細菌及び真菌の汚染に対して保存されなければならない。
遊離塩基又は薬理学的に許容し得る塩としての活性化合物の溶液を、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと安定的に混合された水中において調製することができる。また、分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、それらの混合物中、及び油中においても調製することができる。保存及び使用の通常の条件下において、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。
本発明のペプチド及び本発明の他の治療剤は、中性又は塩の形態で組成物に配合することができる。薬学的に許容し得る塩は、（タンパク質の遊離アミノ基により形成された）酸付加塩を含む。酸付加塩は、無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸等、又は、有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等と形成される。また、遊離カルボキシル基により形成された塩は、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは鉄、及び、有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等から得ることができる。
また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する、溶媒又は分散媒体でもよい。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には、必要とされる粒径の維持により、及び、界面活性剤の使用により維持することができる。微生物活動の防止は、ほぼ、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によりもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注射組成物の持続性吸収は、ほぼ、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に使用することによりもたらすことができる。
無菌注射液は、必要とされる量で活性化合物を、上記列記された他の成分の幾つかと共に適切な溶媒中に包含させ、必要に応じて、ろ過滅菌することにより調製される。一般的には、分散液は、種々の無菌の活性成分を、基礎分散媒体及び上記列記された成分から必要とされる他の成分を含有する無菌の媒体中に包含させることにより調製される。無菌の注射液調製用の無菌粉末の場合には、好ましい調製法は、その予め無菌ろ過された溶液から、任意の更なる所望の成分を含む活性成分の粉末を産生する、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
また、直接注入のためのより濃縮され、又は、高度に濃縮された溶液の調製も考慮される。この場合、極度に速い浸透、小さい領域への高濃度の活性剤の送達をもたらすために、溶媒としてのＤＭＳＯの使用が想定される。
配合に基づいて、溶液は、投与製剤に適合する方法において、治療的に有効な量で投与されるであろう。この配合は、各種の剤型、例えば、上記された注射液の剤型で容易に投与される。ただし、薬剤放出カプセル剤等も利用することができる。
水溶液における非経口投与のために、例えば、この溶液を、適切に緩衝させてもよく、まず、液状の希釈剤を、十分な生理食塩水又はグルコースで等張性にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。この点について、利用することができる無菌水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知であろう。例えば、１回分の投与量を、等張性ＮａＣｌ溶液 １mLに溶解させ、皮下点滴流体 １０００mLに加えるか、又は、目的の注入部位に注入するかのいずれかをすることができる（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。用量におけるいくらかの変動が、処置される対象の症状に応じて、必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与を担う者が、個々の対象に適切な用量を決定するであろう。
非経口投与、例えば、静脈内又は筋肉内注射用に配合された化合物に加えて、他の薬学的に許容し得る形態は、例えば、錠剤又は経口投与用の他の固体、徐放性カプセル剤、及び現在使用されている任意の他の形態を含む。
治療法及び用途
本発明は、免疫寛容の誘導を必要とする患者において免疫寛容を誘導するのに使用するための、方法及び組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
また、本発明は、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、方法及び組成物を提供する。
したがって、本発明は、薬剤として使用するための、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドに関する。
一実施態様において、前記ペプチドは、

からなる群より選択される。
別の態様では、本発明は、寛容の誘導を必要とする患者において寛容を誘導するのに使用するための、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドに関する。
一実施態様において、前記ペプチドは、

からなる群より選択される。
本明細書で使用する場合、「免疫寛容」という用語は、免疫応答を誘導する能力を有する物質又は組織に対する、免疫系の無応答状態を意味する。本発明のペプチドは、該移植物の移植に基づく移植物に対する寛容又は部分的な寛容を達成するのに有用である。本明細書で使用する場合、「部分的な寛容」は、免疫応答の低下をもたらす部分的な免疫寛容である。
本明細書で使用する場合、「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性及び／又はＢ細胞媒介性の免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生及び細胞性細胞傷害を含む。加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化により間接的に達成される免疫応答、例えば、抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。免疫応答に関与する免疫細胞は、リンパ球、例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１、及びＴｈ２細胞）；抗原提示細胞（例えば、プロフェッショナル抗原提示細胞、例えば、樹状細胞）；ナチュラルキラー細胞；骨髄系細胞、例えば、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。
例えば、免疫応答は、移植拒絶及び、このような免疫反応に伴う生理学的結果、例えば、間質性線維症、慢性移植片動脈硬化症、又は血管炎等に関与する。
したがって、本発明のペプチド（及び、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は、本明細書で定義されたペプチド特異的Ｔｒｅｇ）により処置された患者は、処置されていない患者と比較して、下記の生理学的特徴：ａ）（少なくとも部分的にＢ細胞媒介性免疫応答、特に、ドナー特異的抗体により媒介されると考えられる）移植物に対する免疫応答レベルの低下、ｂ）移植物に対する免疫応答の開始もしくは進行の遅延、又は、ｃ）移植物に対する免疫応答の開始もしくは進行リスクの低下を表わす。
「それを必要とする患者」は、処置されるべき移植拒絶を患う、又は、同移植拒絶を患う可能性がある個体を意味する。本発明の枠組みにおいて処置されるべき個体は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。
更に別の態様では、本発明は、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は機能保存変異体を含むＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドに関する。
一実施態様において、前記ペプチドは、

からなる群より選択される。
本明細書で使用する場合、「移植拒絶を予防又は減少させる」という用語は、免疫移植拒絶の予防又は防止、及び、免疫移植拒絶の開始又は進行の遅延を包含するのを意味する。また、この用語は、患者における移植物生存の延長、又は、患者における移植物の機能不全の逆行を包含するのも意味する。さらに、この用語は、例えば、免疫拒絶に関連する免疫学的合併症、例えば、間質性線維症、慢性移植片動脈硬化、又は血管炎等の緩和を含む、免疫移植拒絶兆候の緩和を包含するのも意味する。
本明細書で使用する場合、「移植拒絶」という用語は、急性及び慢性の移植拒絶を両方とも包含する。「急性拒絶」は、移植された組織が免疫学的に外来性である場合の、組織移植レシピエントの免疫系による拒絶である。急性拒絶は、レシピエントの免疫細胞による移植組織の浸潤により特徴付けられる。同免疫細胞は、そのエフェクター機能を実行し、移植組織を破壊する。急性拒絶の開始は急速であり、一般的には、ヒトにおいて移植手術後数週間以内に生じる。一般的には、急性拒絶は、免疫抑制剤、例えば、ラパマイシン、シクロスポリン等により阻害又はサプレッションすることができる。「慢性拒絶」は、一般的には、ヒトにおいて、急性拒絶の成功した免疫抑制の存在下であっても、移植後数か月〜数年以内に生じる。線維症は、全種類の臓器移植の慢性拒絶に共通する要因である。
「移植」という用語及びそのバリエーションは、移植が同系（ドナーとレシピエントとが遺伝的に同一である場合）、同種（ドナーとレシピエントとが異なる遺伝的起源であるが、同じ種である場合）、又は異種（ドナーとレシピエントとが異なる種である場合）であるかに関わらず、移植物（移植片とも呼ばれる）のレシピエントへの挿入を意味する。このため、典型的なシナリオにおいて、ホストはヒトであり、移植片は、同じか又は異なる遺伝的起源のヒトから得られた同系移植片である。別のシナリオでは、移植片は、移植される種とは異なる種（系統学的に大きく離れた種の動物を含む）から得られる。例えば、ヒヒの心臓は、ヒトのホストに移植される
一実施態様において、移植物のドナーは、ヒトである。移植物のドナーは、生きているドナー又は死亡したドナー、いわゆる、死体ドナーであることができる。
一実施態様において、移植物は、臓器、組織、又は細胞である。
本明細書で使用する場合、「臓器」という用語は、生物における特定の機能又は機能群を行う固体血管新生化臓器を意味する。臓器という用語は、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、子宮、骨、軟骨、小腸又は大腸、膀胱、脳、乳房、血管、食道、卵管、胆嚢、卵巣、膵臓、前立腺、胎盤、脊髄、上肢及び下肢を含む肢、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、子宮を含むが、これらに限定されるわけではない。本明細書で使用する場合、「組織」という用語は、ヒト又は動物における任意の種類の組織を意味し、血管組織、皮膚組織、肝臓組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、消化管組織、骨及び軟骨を含む骨格組織、脂肪組織、腱及び靭帯を含む結合組織、羊水組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔組織、眼組織を含むが、これらに限定されるわけではない。
本発明の特定の実施態様では、移植物は、心臓の移植臓器である。
本明細書で使用する場合、「細胞」という用語は、対象となる細胞について濃縮された組成物、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６５％の前記細胞を含む組成物を意味する。
特定の実施態様では、細胞は、骨髄、末梢血、又は臍帯血由来の多分化性造血幹細胞、又は、多能性（すなわち、胚性幹細胞（ＥＳ）又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）、又は、種々の細胞系統の多能性幹細胞由来の分化細胞、例えば、心筋細胞、ベータ−膵細胞、肝細胞、ニューロン等．．．からなる群より選択される。
一実施態様において、細胞組成物は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に使用されるため、通常、骨髄、末梢血、又は臍帯血由来の多分化性造血幹細胞を含む。
ＨＳＣＴは、白血病及びリンパ腫を患う患者に治癒的であることができる。ただし、同種ＨＳＣＴの重大な制限は、この治療を受けた約３０〜５０％のヒトに重篤な症状で起こる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の進行である。
本発明のペプチドは、免疫寛容を誘導することにより、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防又は減少させるのに有用である。
したがって、一実施態様において、それを必要とする患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄形成異常症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖症候群、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び多発性骨髄腫からなる群より選択される疾患に冒されている。
別の態様では、本発明は、免疫寛容の誘導を必要とする患者において免疫寛容を誘導するのに使用するための、
ａ）本発明のペプチドをコードする核酸、又は
ｂ）このような核酸を含むベクター、又は
ｃ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｄ）本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｅ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｆ）本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球に関する。
更に別の態様では、本発明は、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、
ａ）本発明のペプチドをコードする核酸、又は
ｂ）このような核酸を含むベクター、又は
ｃ）このような発現ベクターを含むホスト細胞、又は
ｄ）本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
ｅ）複合体ＭＨＣ分子及び本発明のペプチドを含む抗原提示細胞、又は
ｆ）本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球に関する。
本発明の別の態様は、免疫寛容の誘導を必要とする患者において免疫寛容を誘導するための方法であって、予防的に有効な量の、上記された本発明の単離されたペプチド、又は、本発明の核酸、又は、本発明の発現ベクター、又は、本発明のホスト細胞、又は、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球を、前記患者に投与する工程を含む、方法に関する。
本発明の別の態様は、移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるための方法であって、予防的に有効な量の、上記された本発明の単離されたペプチド、又は、本発明の核酸、又は、本発明の発現ベクター、又は、本発明のホスト細胞、本発明のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は、本発明のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球を、前記患者に投与する工程を含む、方法に関する。
本明細書で使用する場合、「予防的に有効な量」という用語は、患者における移植拒絶を予防、減少、緩和、又は遅延させるのに必要な活性剤の最少量を意図している。
本発明の診断方法
更なる態様では、本発明は、移植患者（レシピエント）が寛容であるかを判定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記移植患者から得られた生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在を判定する工程を含み、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在が寛容を示す、方法に関する。
本明細書で使用する場合、「判定する」という用語は、対照又は所定値に対する参照の有無に関わらず、定性的及び／又は定量的検出（すなわち、検出及び／又は量の測定）を含む。本明細書で使用する場合、「検出する」は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇが生体サンプル中に存在するか否かを判定することを意味する。「測定する」は、生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの量を決定することを意味する。
本明細書で使用する場合、「生体サンプル」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価の目的のために、患者から得ることができる任意のサンプルを意味する。好ましい生体サンプルは、血液サンプル（例えば、全血サンプル、血清サンプル、又は血漿サンプル）である。
例えば、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在の判定は、生体サンプルを、選択試薬、例えば、抗体と接触させることにより、前記生体サンプル中の対象となる細胞の元からの存在を検出し、又は、同細胞量を測定する工程を含んでもよい。接触は、任意の適切な装置、例えば、プレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、ガラス、カラム等において行うことができる。
したがって、本発明の方法は、生体サンプルを、前記生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇと選択的に相互作用可能な結合パートナーと接触させる工程を含む。
本発明の一実施態様では、結合パートナーは、上記された本発明のペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド多量体である。
好ましい実施態様では、ＭＨＣ／ペプチド多量体は、

からなる群より選択されるペプチドを含むＭＨＣ／ペプチド四量体である。
一実施態様において、患者は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。
本発明は、以下の図面及び実施例により、更に例証されるであろう。ただし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定すると全く解釈されるべきではない。
実施例：ＭＨＣＩＩ＋アロペプチドが誘導する寛容
材料及び方法
動物及び心臓移植モデル
心臓のアロ移植を、以前に説明されたように（１）、全体としてＭＨＣ不一致の、ＬＥＷ．１Ｗ（ドナーとしてのＲＴ１．Ａｕ）及びＬＥＷ．１Ａ（レシピエントとしてのＲＴ１．Ａａ）のメスラット間で行った。
アデノウイルス媒介性遺伝子伝達
ヒトＩｇＧ１の定常ドメインに融合したマウスＣＤ４０の細胞外部分をコードするＡｄ（ＡｄＣＤ４０Ｉｇ）及びリコンビナント非コードアデノウイルス（Ａｄ）Ａｄｄｌ３２４と、移植組織内送達の手法とは、以前に記載されている（１）。簡潔に、アデノウイルス粒子（２．１０１０個の感染性粒子）を、心室壁内の３点にゆっくり注入した。
ペプチドライブラリ
４ａａのラギングを有する１６mer オーバーラップペプチドライブラリを、以前に公開されたように（４〜６）、ＭＨＣ−Ｉ ＲＴ１．Ａｕ（アルファ１、２、及び３ドメイン）、ＭＨＣ−ＩＩ ＲＴ１．Ｂｕ（全ドメイン）、及びＭＨＣ−ＩＩ ＲＴ１．Ｄｕ（アルファ２及びベータ１ドメイン）の多型配列全体をカバーするように設計し、GL Biochem Ltd.により調製した。凍結乾燥させたペプチドを、０．４％ 無菌ＤＭＳＯ／滅菌水中に溶解させ、−８０℃で保存した。対照ペプチドとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、種々の同種非活性化ペプチド＃７、２６、及び３９を使用した。
１〜２ａａのラギングを有する変性させた９〜１５mer オーバーラップペプチドを、ポジティブに単離された１６mer ペプチドの配列をカバーするように設計し、GL Biochem Ltd.により合成した。
全てのペプチドは、分析用逆相ＨＰＬＣにより、９５％を超える均一性を有することを示し、ａａ配列を確認した。ペプチドを、完全ＲＭＰＩ−１６４０中に、１２０μg/mLの濃度に希釈した。
細胞精製
Ｔ細胞を、以前に記載されたように（２）精製した。簡潔に、トータル脾細胞を、抗−γδ Ｔ細胞（Ｖ６５）、抗−ＣＤ４５ＲＡ細胞（ＯＸ３３）、抗−ＣＤ１６１ ＮＫ細胞（３．２．３）、及び抗−ＣＤ１１ｂ／ｃ単球（ＯＸ４２）のカクテルにより、磁性ビーズ（Dynal）を使用して枯渇させた。濃縮されたＴ細胞を、抗−ＣＤ４５ＲＣ−ビオチン（ＯＸ２２）及びストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ７、抗−ＣＤ８α−ＰＥ（ＯＸ８）、抗−ＴＣＲαβ−Ａｌｅｘａ ６４７（Ｒ７３）、ならびに抗−ＣＤ２５−ＦＩＴＣ（ＯＸ３９） ｍＡｂｓによりラベルした。ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞を、FACSAria（BD Biosciences）によるＴＣＲαβ＋細胞のゲーティング後に分取した。分取した集団の純度は、９９％超であった。
形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）を、以前に記載されたように（２）精製した。簡潔に、コラゲナーゼ消化後に回収した脾細胞を、抗−ＴＣＲ（Ｒ７３及びＶ６５）Ｔ細胞及び抗−ＣＤ４５ＲＡ（ＯＸ３３）Ｂ細胞 ｍＡｂによるネガティブな枯渇により、更に精製した。濃縮された細胞を、抗−ＣＤ４５Ｒ−ＰＥ（Ｈｉｓ２４）、抗−ＣＤ４−ＡＰＣ（ＯＸ３５）、抗−ＴＣＲ−ＦＩＴＣ（Ｒ７３）、及び抗−ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ（ＯＸ３３）によりラベルした。ＣＤ４５Ｒ及びＣＤ４陽性細胞として規定されたｐＤＣを、ＦＩＴＣ陰性細胞についてゲーティングした後に分取した。
混合型リンパ球反応
ＭＬＲ共培養アッセイ法のために、ＬＥＷ．１ＡナイーブラットからのｐＤＣ（１．２５×１０４個）、同系ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ（５×１０４個）、及び１２０μg/mL 同種ペプチドを、丸底９６ウェルプレート中の完全ＲＰＭＩ−１６４０培地 ２００μL中に、トリプリケートで、３７℃、５％ ＣＯ２で６日間蒔いた。ｐＤＣを、０．５μM ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６で成熟させた。
ＭＬＲサプレッシブアッセイ法のために、ＬＥＷ．１Ａ起源の分取したＣＦＳＥ−ラベルＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞（５×１０４個）及びドナーＬＥＷ．１Ｗ動物から単離された同種ｐＤＣ（１．２５×１０４個）を、ＦＡＣＳ−分取し、新鮮に精製したナイーブなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ細胞又はペプチドエクスパンションしたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ細胞（５×１０４個）と共に、丸底９６ウェルプレート中の完全ＲＰＭＩ−１６４０培地 ２００μL（最終容量）中に、トリプリケートで６日間蒔いた。
抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８刺激のために、丸底９６ウェルプレートを、抗−ＣＤ３（１μg/mL、BD Biosciences）ｍＡｂにより、３７℃、５％ ＣＯ２で１時間コートし、ついで、洗浄し、５．１０４個 ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ細胞を、抗−ＣＤ２８（１０μg/mL）を加えた完全ＲＰＭＩ−１６４０ ２００μL中において各ウェルに、１、２、３、及び６日間加えた。
ＣＦＳＥラベルしたナイーブなＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の増殖及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの表現型を、生きた細胞（ＤＡＰＩ陰性）の中から、ＴＣＲ＋ＣＤ４＋細胞又はＴＣＲ＋ＣＤ８＋細胞についてゲーティングした後、FACSCanto IIサイトメーター（BD Biosciences）におけるフローサイトメトリーにより分析した。
細胞外及び細胞内染色
細胞外染色のために、細胞を、下記ｍＡｂ：抗−ＴＣＲαβ（Ｒ７３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７−コンジュート）、抗−ＣＤ８α（ＯＸ８、ＰＥ−Ｃｙ７−コンジュート、Ebiosciences）、抗−ＣＤ４（Ｗ３．２５、ＰＥ−Ｃｙ７−コンジュート）、抗−ＣＤ４５ＲＣ（ＯＸ２２、ＦＩＴＣ−コンジュート）、抗−ＣＤ２８（ＪＪ３１９、ビオチンラベル）、抗−ＣＤ７１（ＯＸ２６、ビオチンラベル）、抗−ＣＤ２５（ＯＸ３９、ビオチンラベル）、及び抗−ＭＨＣ−ＩＩ（ＯＸ６、ビオチンラベル）で染色した。
細胞内染色のために、ついで、細胞を、Ｆｏｘｐ３（ビオチンラベル、Ebiosciences）で、BD cytofix/cytopermキット（BD Biosciences）を使用し、製造メーカーの説明書に従って染色した。
全てのビオチン化ｍＡｂを、ストレプトアビジン−PerCP.Cy5.5（BD Biosciences）を使用して可視化した。FACSCanto IIサイトフルオロメーター（BD Biosciences）を使用して、蛍光を測定した。データを、FlowJoソフトウェア（Tree Star, Inc. USA、バージョン７．６．５）を使用して分析した。まず、細胞を、その形態によりゲーティングした。死んだ細胞を、ＤＡＰＩ陰性の生きた細胞を選択することにより除外した。
サイトカインアッセイ
ＩＦＮγ、ＩＬ−１０を、共培養上清中において、BD BiosciencesからのＥＬＩＳＡであるOptEIAを使用して測定し、ＩＬ−１２及びＴＧＦβをそれぞれ、Invitrogen及びR&D SystemからのＥＬＩＳＡを使用して測定した。
統計学的分析
ペプチド活性化試験のために、ノンパラメトリックなウィルコクソンの符号順位検定を、１．０の仮定値に対するカラムメジアンと比較して行った。活性化された細胞の表現型、サイトカイン発現、及び増殖アッセイ法についての統計学的有意性を、両側マン・ホイットニーｔ検定により評価した。移植片生存を、カプランマイヤー・ログランク検定により分析した。分析を、GraphPad Prism 5.04ソフトウェア（GraphPad）により行った。
試験の承認
全ての動物実験は、動物管理及び利用についてのPays de la Loire地方フランス倫理委員会により承認された。
ビオチン化ＲＴ−１−Ａａ−ペプチド複合体の産生
簡潔に、重鎖ＲＴ１−Ａａ及びβ２ミクログロブリン（ｂ２ｍ）を、ｐＥＴ２４中にクローニングし、Escherichia coli BL21-DE3中で産生した。リコンビナントタンパク質を、封入体として産生し、８M 尿素中に溶解させ、ヒトＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体について以前に記載されたように（１５）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでリフォールディングさせた。ＲＴ１−Ａａ、ｂ２ｍ、及びペプチドＢｕ３１−１０を、０．４M Ｌ−アルギニン、０．１M Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２mM ＥＤＴＡ、５mM 還元型グルタチオン、及び０．５mM 酸化型グルタチオン中において、４℃で５日間リフォールディングさせた。ついで、この溶液を濃縮し、アミコンメンブラン１０Ｋｄ（Millipore, Bedford, MA）上でバッファー交換した。フォールディングされたＭＨＣ／ペプチド複合体を、BirA酵素（Avidity, Denvers CO）により、３０℃で５時間ビオチン化し、Hiprep 26/10脱塩カラム（GE Healthcare）で脱塩した。ついで、ＭＨＣ／ペプチド複合体を、アニオン交換Q-Sepharoseクロマトグラフィーにより精製した。ビオチン化を、４：１のモル比でのストレプトアビジン（Sigma Aldrich）との四量体化により試験した。
四量体化及び染色
ＲＴ１．Ａａ／Ｂｕ３１−１０の四量体化を、４：１のモル比での、ストレプトアビジン−ＰＥ（Jackson ImmunoResearch）又はストレプトアビジン−ＡＰＣ（BD Biosciences）を、１５分間隔で加えた４等分アリコートにおいて加えることにより室温で行った。同様に、対照四量体ＲＴ１．Ａａ／ＭＴＦ−Ｅ（ＩＬＦＰＳＳＥＲＬＩＳＮＲ）（配列番号：２２）を、ストレプトアビジン−ＢＶ４２１（Biolegend）にコンジュゲートさせ、Ｂｕ３１−１０−特異的細胞の中でも、１．６＋／−０．７％ 非特異的染色を表わした。これら３つの試薬を混合し、蒔いた細胞に１０μg/mLで４℃において１時間加えた。さらに、細胞を、ＣＤ８及びＣＤ４５ＲＣで染色した。蛍光を、FACSCanto IIサイトメーター（BD Biosciences, Mountain View, CA）で分析した。まず、細胞を、その形態によりゲーティングし、死んだ細胞を、ＤＡＰＩ陰性細胞を選択することにより除外した。
ｉｎ ｖｉｖｏでのペプチド処置
１６mer ペプチドを、注入前に０．４％ ＤＭＳＯ／ＰＢＳ中に溶解させた。１回目のプロトコールについて、単回投与のペプチド（５００μg/注入）を、移植前後の種々の時点である、−６、−３、０、＋３、及び＋７日目に、移植したＬＥＷ．１Ａレシピエント内にｉ．ｖ注入した。２回目のプロトコールについて、ミニ浸透圧ポンプ（ALZET, Cupertino, CA, USA）を、レシピエントの腹腔内（ｉ．ｐ）に埋め込み、２０．８３又は４１．６６μg/時間のいずれかで、１６mer ペプチドを連続的に１４日間送達させた。１回目のポンプを、移植前−７日に埋め込み、＋７日目に２回目のポンプに置き換えた。このポンプは、２８日間連続で動物当たりに１４又は２８mg ペプチドの送達が可能である。枯渇性抗−ＣＤ８α ｍＡｂ（ＯＸ８、ＩｇＧ１、３mg/kg）を、−７日目から拒絶までに週２回、ｉ．ｐ注入した。移植臓器を、触診により毎日モニターした。移植臓器拒絶を、触知できる心拍の完全な停止として定義した。
移植心の形態計測分析
移植片の上１／３を、パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋した。５μm 冠状切片を、ヘマトキシリン−エオシン−サフランで染色した。組織を、群に対して盲検の病理医により分析した。慢性拒絶を、以前に記載されたように（１６）評価した。
ドナー特異的アロ抗体検出
アロ抗体を、他の箇所で記載されたように（１４）、サイトフルオロメーターにより分析した。簡潔に、コラゲナーゼＤによる消化及び赤血球溶解後に、同種の脾細胞を、希釈（１／８）した熱不活性化血清と共にインキュベートし、ついで、ＦＩＴＣ−コンジュゲート ヤギ抗−ラットＩｇＧ抗体（Ｈ＋Ｌ鎖特異的）（Jackson Laboratories）、マウス抗−ラットＩｇＧ１ ＭＡｂ（ＭＣＡ １９４、Serotec）、又はＩｇＧ２ｂ（ＭＣＡ １９５、Serotec）と共にインキュベートした。抗体が結合したことを、ＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ）’２ ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Jackson Laboratories）を使用して証明した。細胞を、FACS Canto IIサイトフルオロメーター（BD Biosciences, Mountain View, CA）を使用して分析した。結果を、各血清についての平均チャネル蛍光として表わした。
結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ活性化
ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇによる同種ＭＨＣ／ペプチド複合体のＴＣＲ認識、及び、その機能のその後の活性化を特定するために、抗原性刺激に対する曝露に従って、フローサイトメトリーによる分析を可能にする活性化の特異的マーカーを選択する必要があった。したがって、ポリクローナル抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８抗体による刺激に基づいて、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇにより、種々の時点で発現された分子をスクリーニングした。新鮮に単離されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇにおける分子の発現は、Ｑ ＲＴ−ＰＣＲにより以前に評価されており（１）、これらの分子の中でも、ＣＤ２５及びＩＦＮγが、他の細胞集団から、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇを区別するマーカーであったことが証明された。ＣＤ７１、ＣＤ２５、及びＩＦＮγの発現を、０、１、２、３、及び６日目において、フローサイトメトリーにより分析した。
０日目において、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、低レベルのＣＤ７１（０．８３±０．１％）、ＣＤ２５（１２．７４±６．１％）、及びＩＦＮγ（５．５７±３．３％）を発現していたことが確認された。ポリクローナル刺激後に、ＣＤ７１、ＣＤ２５、及びＩＦＮγの発現は、初日から有意に増大し、それぞれ８２±４．５％、９８．１±１．９％、及び９１．７±７％の陽性細胞として、６日目に経時的に安定したままであった。
まとめると、低いベース発現と刺激に基づく有意なアップレギュレーションを有する、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇに対する対象となる３つのマーカーが特定された。ＣＤ２５が、最多であり、最も早くアップレギュレーションされたマーカーであったため、また、ＣＤ２５が、本発明者らにより以前に説明されたマーカーであったため（１、３）、このマーカーを、この研究の残りの局面について、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ活性化を評価するのに選択した。
ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ細胞は２つのドナーＭＨＣクラスＩＩ由来ペプチドを認識した
ラットのＭＨＣミスマッチ心臓移植臓器モデルにおいて、ドナー（ＲＴ１ｕ）とレシピエント（ＲＴ１ａ）とは、全てのＭＨＣ分子についてミスマッチである。したがって、ドナーとレシピエントとのＭＨＣＩ及びＩＩアミノ酸（ａａ）配列をアライメントし、ドナーＭＨＣＩ及びＩＩ分子の多型ドメインとマッチした８２個のオーバーラップした１６merペプチドを設計した（４〜６）。まず、ペプチドを、６〜８個のペプチド（３０μg/mL 各ペプチド）のプールに分類し、未成熟又は成熟した同系のレシピエント形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）とＣＤ４０Ｉｇ処置した長期移植臓器保有レシピエントから分取したＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇを３又は６日間共培養したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ法で試験した。未成熟ｐＤＣに関して、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇの有意な活性化は、ペプチドの同種プールのいずれについても、３日目又は６日目において観察されなかった。成熟ｐＤＣ及び同種ペプチドプールによる刺激後、３日目に、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇの小集団におけるＣＤ２５発現のわずかなアップレギュレーションが観察され、６日目に、同種刺激により、ＣＤ２５発現の有意なアップレギュレーションが観察された。これらの結果から、一部の同種ペプチドは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇにより効率的に認識され、この認識により、ＣＤ２５発現の増大がもたらされることが示唆された。また、ｐＤＣは、当該アッセイ法おいて成熟している必要があることも証明された。
次に、ナイーブで成熟した同系ｐＤＣ及び６日の培養において長期生存細胞から精製したＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇの存在下において、８２個のアロペプチド個々の刺激能を試験した（図１Ａ）。２つのペプチド：ペプチド＃３１（Ｂｕ３１と呼ばれる、ペプチドなしに対して１．６７±０．０９倍、ｐ＜０．０００１）（ペプチド＃３１の配列は、ペプチド＃３２（ｐ＜０．０５）の配列とオーバーラップする）及びペプチド＃５１（Ｄｕ５１と呼ばれる、ペプチドなしに対して２．０７±０．１８倍、ｐ＜０．００１）が、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇの細胞表面において、ＣＤ２５発現の非常に有意なアプレギュレーションを誘導したことが観察された。Ｄｕ５１は、Ｂｕ３１と比較して、ＣＤ２５発現のより強いアップレギュレーションを誘導した。このことは、Ｄｕ５１が、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇにより認識されるドミナントなペプチドである一方で、Ｂｕ３１はサブドミナントであることを示唆している。これらの結果から、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、２つのペプチドＢｕ３１（ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲＡＶＴＥ）及びＤｕ５１を、主に認識したことが証明された。これらのペプチドはそれぞれ、ドナーＭＨＣクラスＩＩ ＲＴ１．Ｂｕ及びＲＴ１．Ｄｕ分子のa１鎖由来である。
ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇは幾つかの長い同種のサブドミナントなペプチドを認識した
抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇにより認識される天然のサブドミナントなドナーペプチド配列を決定するために、変性ペプチドのライブラリを使用した。この変性ペプチドは、１つのａａラギングを有する９mer ペプチド〜サブドミナントな１６mer Ｂｕ３１及びペプチド３２由来の２つ以上のａａラギングを有する１５mer ペプチド（＃３１−１〜＃３１−１５でラベル）の範囲とした（図１Ｂ及び表１）。このライブラリ設計は、以前の結果に基づいており、レポートで報告されており（７〜１０）、上記されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ法と同様に試験した。興味深いことに、ランダムペプチドライブラリから、ラットＭＨＣクラスＩ ＲＴ１−Ａａ分子が、Ｃ末端にアルギニン（Ｒ）を有する９〜１５mer ペプチドに対する強力な優位性を示したことが確立されている（１０）。
誘導体である９mer ペプチド＃３１−１〜＃３１−８は、１６mer Ｂｕ３１により観察された活性化に相当するＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇの活性化を誘導することができなかった。一方、４つの誘導体ペプチド３１−１０、３１−１３、３１−１４、及び３１−１５について、非常に強力で、有意なＣＤ２５アップレギュレーションを誘導することができた。このことは、共通配列ＳＤＶＧＥＹＲを有する長めの誘導体が認識されることを示唆している。他の誘導体とは対照的に、これらのペプチドにより誘導されたＣＤ２５アップレギュレーションは、Ｂｕ３１により誘導されたアップレギュレーションと有意には異ならなかった（図１Ｂ）。
要するに、これらの結果から、９ａａより長く、共通配列（ＳＤＶＧＥＹＲ）を含む幾つかのサブドミナントなＭＨＣクラスＩＩ由来ペプチドが、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇに対して提示され、このような提示が、特定の細胞の活性化を誘導することが示された。
Ｂｕ３１活性化ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ細胞は改変された表現型を示し、抗原特異的活性化Ｔ細胞を効率的にサプレッションした
Ｂｕ３１活性化ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇの表現型を、刺激後６日で分析した（図２Ａ及び２Ｂ）。ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、高レベルのＩＦＮγの分泌を介して働き、次に、ＤＣ及び移植片ＥＣによりＩＤＯ発現を誘導し、この反応が、ｉｎ ｖｉｖｏでの寛容誘導に必須であったことが、以前証明されている（１）。これらの結果に基づいて、ｐＤＣの存在下におけるペプチドによるＣＤ８＋ Ｔｒｅｇの刺激が、大方活性化されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇにより、ＩＦＮγの有意に増大した発現をもたらすことが観察された（図２Ａ）。同じ培養上清中において、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇ及びｐＤＣの両方により産生することができるＩＬ−１２、ＴＧＦβ、及びＩＬ−１０発現の改変は観察されなかった。また、ＣＤ７１、ＣＤ２８、及びＭＨＣクラスＩＩのアップレギュレーションも観察されたが、ペプチド刺激の６日後のＦｏｘｐ３発現の改変は観察されなかった（図２Ｂ）。
同種ｐＤＣ又は同系ｐＤＣ及びドナー細胞ライゼートの存在下において、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、同系エフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の増殖をサプレッションすることができることが、以前に証明されている。このことは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、非自己認識の直接的又は間接的な経路を介して働いたことを示し、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、ナイーブなＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇより効率的なサプレッサー細胞であることを示している（２）。ここで、Ｂｕ３１刺激ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇが、エフェクターＴ細胞増殖を、６日の共培養後に効率的にサプレッションすることにより、そのサプレッサー能を維持することができるかを、非活性化対照ペプチドにより刺激されたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇと比較して調査した。ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇを同系ｐＤＣ及びＢｕ３１又は非活性化ペプチドの存在下で６日間刺激するＭＬＲアッセイ法を行った。ついで、ペプチド刺激ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇを、FACS Ariaを使用して分取し、分取した同種ｐＤＣ及び同系ＣＦＳＥラベルＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞の直接的なＭＬＲアッセイ法に加えた。エクスパンションしたＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇは、直接的な非自己認識経路により刺激されたエフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の増殖におけるバイスタンダーレギュレーションを発揮するであろうと推定された（１１、１２）。これを評価するために、共培養の６日目における分裂性ＣＤ４＋ＣＤ２５− Ｔ細胞の相対比を測定した（図３）。Ｔｒｅｇの非存在下において、６日目における分裂性ＣＤ４＋ＣＤ２５− エフェクターＴ細胞の、８０．５％の相対比が観察された。このことは、応答性エフェクターＴ細胞が非常に増殖していたことを示唆している。Ｄｕ５１刺激Ｔｒｅｇの添加は、分裂性ＣＤ４＋ＣＤ２５− エフェクターＴ細胞の相対比における、有意な減少をもたらした。このことは、非活性化ペプチドにより刺激されたＴｒｅｇと比較して、応答性エフェクターＴ細胞分裂の有意な阻害を示している。このため、Ｂｕ３１抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化後に効率的なサプレッシブ能を維持した。６日間刺激されないままであったＴｒｅｇは、そのサプレッシブ能を失い、放置により死に始めた。
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるサブドミナントなペプチド処置による認容誘導
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏでの生成及び移植臓器の生存において特定されたサブドミナントなペプチドの活性を更に決定するために、単剤治療として、動物をペプチドで処置した。小さなペプチド自体は、レシピエントの体内から急速に排出された。ミニ浸透圧ポンプの使用により、移植前−７日で開始する２８日間の０．５mg/日の一定の腹腔内送達が可能となった。この用量は、移植臓器の生存を長くするのを誘導するのに十分ではなかった。興味深いことに、２倍高い用量のペプチド、すなわち、１mg/日は、８０％のレシピエントにおいて、明確でない移植臓器生存を誘導した（０．５mg/日及び未処置と比較して、＊＊ｐ＜０．０１）（図４）。
ＭＨＣクラスＩ四量体を使用するＢｕ３１−１０特異的ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの特定によりＣＤ４０Ｉｇ処置レシピエントにおける濃縮が証明された
フィコエリスリン（ＰＥ）及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）でラベルした、ＭＨＣクラスＩ四量体であるＲＴ１．Ａａ／Ｂｕ３１−１０を生成し、脾臓及び移植片中において特定の集団を染色した。まず、細胞を、ＰＥコンジュゲート、及びＡＰＣコンジュゲートしたＲＴ１．Ａａ／Ｂｕ３１−１０四量体の混合物により、以前に記載されたＢＶ４２１でラベルされた対照四量体であるＲＴ１．Ａａ／ＭＴＦ−Ｅと共に染色した。細胞を、ＣＤ８−ＰｅＣｙ７及びＣＤ４５ＲＣ−ＦＩＴＣにより二次染色して、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇを特定した。このような戦略について、脾臓において０．２８１％、移植片において１．１１％のＢｕ３１特異的細胞を、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇの中から特定することができた。ナイーブな脾臓のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団において、前駆体頻度を０．１８７％と評価した。このことは、移植及びＣＤ４０Ｉｇ処置後１２０日でも、この頻度は、脾臓において２倍近くに増大し、移植片においてかなり濃縮され、ナイーブな動物において、ドナー特異的Ｔｒｅｇのプールを特定することができたことを証明している。
要するに、これらの結果から、移植及びＣＤ４０Ｉｇ処置に基づいて有意に増大した集団であるサブドミナントなアロ抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇを検出する機能的なＲＴ１Ａａ／Ｂｕ３１−１０四量体を生成することができたことが証明された。
ｉｎ ｖｉｖｏでのサブドミナントなペプチドであるＢｕ３１処置による寛容誘導はＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇのサプレッシブ能の向上及び抗ドナー抗体応答の総体的な阻害に関与した
ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇのｉｎ ｖｉｖｏでの増強及び移植臓器生存において特定されたサブドミナントなペプチドの活性を更に決定するために、１日当たりに０．５又は１．０mg ペプチドの一定の腹腔内送達するためのミニ浸透圧ポンプで、移植前−７日から開始して２８日間、動物を処置した。興味深いことに、このプロトコールは、対照ペプチドと比較して、１mg/日 Ｂｕ３１ペプチドを使用して、８０％の明確でない移植臓器生存を伴って、移植臓器生存の有意な延長を可能にした（対照ペプチド及び未処置と比較して、ｐ＜０．０１）（図５）。ペプチド注入により誘導された寛容が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とは依存していたことを証明するために、以前説明されたように（１）、レシピエントを、ペプチド注入及び枯渇性抗−ＣＤ８ ｍＡｂ（ＯＸ８）により同時処置した。抗−ＣＤ８抗体の投与により、移植臓器生存が完全に消滅した。このことは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＭＨＣクラスＩ／抗原の認識が、ペプチド注入により得られた寛容の確立に必要であったことを示している。
重要なことに、Brown Norway（BN）という第三者の移植片は、移植後７日目に著しく拒絶された。このことは、ペプチドＢｕ３１注入が、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇにより媒介されるドナー特異的寛容を誘導することを証明している。
ペプチドＢｕ３１により処置された長期間生存しているレシピエントの移植心を、慢性拒絶のサイン、抗−ドナー抗体の存在、及びＣＤ４＋エフェクターＴ細胞に対するＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇのｉｎ ｖｉｔｒｏサプレッションについて分析した（図６及び７）。長期レシピエントの移植片についての解剖病理学的分析から、以前に確立されたスコア（１４）に基づく慢性拒絶のサインは示されなかった。長期間生存しているＢｕ３１処置されたレシピエントにおいて、未処置ラットと比較して、慢性拒絶の非存在に関連する（１４）総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ｂアロ抗体産生の総体的な阻害が観察された（図６）。最後に、これらのペプチド誘導活性化ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇは、ｅｘ ｖｉｖｏにおける優れたサプレッシブ能を示すことが確認された。ペプチド誘導活性化ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇは、エフェクターＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖を、用量依存的方法で有意に阻害し、新鮮に精製したＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ Ｔｒｅｇより効率的に阻害するためである（図７）。
参考文献
本願全体を通して、種々の参考文献が、本発明が属する技術分野の状態を説明している。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。

Claims (15)

  1. アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又は下記ペプチド：

    を除く、その機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの、単離されたペプチド。
  2. ペプチドが、アミノ酸配列：ＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：２１）又はその機能保存変異体を含む、請求項１記載のペプチド。
  3. ペプチドが、

    からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１又は２記載のペプチド。
  4. アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくはその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さのペプチドをコードする核酸配列、又は、この核酸配列を含む発現ベクター、又は、この発現ベクターを含むホスト細胞。
  5. アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドを含む、ＭＨＣ／ペプチド多量体。
  6. ペプチドが、ＹＬＲＹＤＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１３）である、請求項５記載のＭＨＣ／ペプチド多量体。
  7. アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドを特異的に認識する、Ｔリンパ球。
  8. アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチドを含む培養培地により、形質細胞様樹状細胞集団の存在下において、ＣＤ８＋ Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  9. 請求項５又は６記載のＭＨＣ／ペプチド多量体を含む培養培地により、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ集団を培養する工程を含む、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇ集団を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ方法。
  10. 薬剤として使用するための、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチド。
  11. 寛容の誘導を必要とする患者において寛容を誘導するのに使用するための、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチド。
  12. 移植拒絶の予防又は減少を必要とする患者において移植拒絶を予防又は減少させるのに使用するための、アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）又はその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチド。
  13. ペプチドが、

    からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１０〜１２のいずれか一項記載の使用のための単離されたペプチド。
  14. ａ）アミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくはその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さの単離されたペプチド、又は
    ｂ）このペプチドをコードする核酸、又は
    ｃ）この核酸を含むベクター、又は
    ｄ）この発現ベクターを含むホスト細胞、又は
    ｅ）請求項５又は６記載のＭＨＣ／ペプチド多量体、又は
    ｆ）複合体ＭＨＣ分子及びアミノ酸配列：ＳＤＶＧＥＹＲ（配列番号：１）もしくはその機能保存変異体を含む、ＭＨＣクラスＩＩ分子由来の、１１〜１６個のアミノ酸の範囲の長さのペプチドを含む抗原提示細胞、又は
    ｇ）請求項６記載のペプチドを特異的に認識するＴリンパ球と、
    薬学的に許容し得る担体とを含む、
    医薬組成物。
  15. 前記移植患者から得られた生体サンプル中のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在を判定する工程を含む、移植患者が寛容であるかを判定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ Ｔｒｅｇの存在が寛容を示す、
    方法。
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