CN107148427B - 新型免疫原性肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的免疫原性肽，其包含MHC II类T细胞表位，以及与所述表位紧邻或分隔开的H‑X(0,2)‑C‑X(2)‑[CST]或[CST]‑X(2)‑C‑X(0,2)‑H氧化还原基序。

Description

新型免疫原性肽

技术领域

本发明涉及免疫原性肽。这些肽用于体外和体内系统来产生抗原特异性的细胞溶解性CD4+T细胞。这些肽和通过这些肽获得的细胞用作药物活性肽以用于多种疾病，包括自身免疫疾病，如多发性硬化症(multiple sclerosis)。

背景技术

WO2008/017517公开了一种包含抗原的MHC II类T细胞表位和氧化还原基序序列的新型肽。

在文献Fomenko et al.(2003)Biochemistry 42，11214-11225中已经综述了氧化还原基序序列。所述氧化还原基序列的不同替代物是C(X)2C[SEQ ID NO:71]，C(X)2S[SEQID NO:72]，C(X)2T[SEQ ID NO:73]，S(X)2C[SEQ ID NO:74]和T(X)2C[SEQ ID NO:75]。氧化还原基序序列上的其他现有技术评论了组氨酸在所述氧化还原基序序列内的相关性[Kortemme et al.(1996)Biochemistry 35，14503-14511]。

WO2008/017517解释说明，肽内彼此邻近的T细胞表位与氧化还原基序序列的组合提供了以前从来未认识的性质。即，这样的肽具有引发特异性地杀死存在包含存在于所述肽中的所述T细胞表位的所述抗原的所述抗原呈递细胞的CD4+细胞溶解性T细胞群的能力。

因此，这些肽能够用于在非常早的阶段，即在抗原呈递水平上阻断免疫应答(immune response)。WO2008/017517展示了这些肽在治疗和预防过敏和免疫疾病中的医学用途。本发明的概念后来在文献Carlier et al.(2012)Plos one 7,10e45366中公开。其它专利申请表明，这样的肽能够用于其中避免免疫应答的其他医疗应用中，如肿瘤治疗，移植排异(rejection of transplant)，针对可溶性同种因子(allofactor)的免疫应答，针对由病毒载体的所述主链编码的病毒蛋白的免疫应答。

以上出版物讨论了氧化还原基序序列的类型和氧化还原基序与T细胞表位序列之间的所述间隔(spacing)。对这些肽可以提供改进的性质的所述肽中的其它决定因素尚未有报道。

发明内容

所述引言中提到的所述4氨基酸氧化还原基序序列的不同替代物也可以写成[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:76]或CX(2)-[CST][SEQ ID NO:77]。本发明表明，额外的组氨酸氨基酸紧邻所述基序(所述基序的N端(位置-1)或所述基序的C端(位置+5))之外的存在会增加所述氧化还原基序的稳定性。因此，本发明涉及具有一般结构或H-C-X(2)-[CST][SEQID NO:78]或[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:79]的改性氧化还原基序。

利用这种改进的稳定性，与不存在额外的组氨酸的肽相比，所述肽的特异性还原活性增加，而使例如能够使用更少的肽或减少注射的数量。

第一方面涉及适用作药物的包含抗原的MHC II类T细胞表位和与所述表位紧邻或相隔至多7个氨基酸的H-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:78]，[SEQ ID NO:90]或[SEQID NO:91])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H([SEQ ID NO:79]，[SEQ ID NO:92]或[SEQ ID NO:93])氧化还原基序序列的分离的13-100个氨基酸的免疫原性肽。

在某些实施方式中，所述抗原在其序列中不包含所述表位的10个氨基酸的距离内的所述基序，或甚至在其序列中不含所述基序。

在具体实施方式中，所述基序是H-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:90]或[CST]-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:92]氧化还原基序序列，或是H-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78]或[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:79]氧化还原基序序列。

在其它实施方式中，所述基序是H-X(0,2)-C-X(2)-C([SEQ ID NO:80]，[SEQ IDNO:96]或[SEQ ID NO:97])或C-X(2)-C-X(0,2)-H([SEQ ID NO:83]，[SEQ ID NO:94]或[SEQ ID NO:95])。

在还有的其它实施方式中，所述基序是H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:80]或C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:83]。

在具体实施方式中，所述肽具有13-75个氨基酸，13-50个氨基酸或13-30个氨基酸的长度。

所述MHC II类T细胞表位能够与所述基序分隔最多4个氨基酸的序列或2个氨基酸的序列。

在具体实施方式中，其中所述氧化还原基序中的X是Gly或Pro，或所述氧化还原基序内的X不是Cys。

在其它具体实施方案中，所述氧化还原基序外的X不是Cys，Ser或Thr。

所述肽能够用于预防或治疗多发性硬化症(MS)，由此所述抗原是参与多发性硬化症的自身抗原(auto-antigen)，如MOG。

用于MS的肽的具体实施方式包括所述表位序列VVHLYRNGK[SEQ ID NO:3]，如HCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:1]，HxCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:115]或HxxCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:116]。

所述肽能够用于预防或治疗糖尿病，其中所述抗原，例如，是胰岛素原(proinsulin)。

另一方面涉及包含抗原的MHC II类T细胞表位，和与所述表位紧邻或分隔至多7个氨基酸的H-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:78]或[SEQ ID NO:90]或[SEQ ID NO:91])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79]，[SEQ ID NO:92]或[SEQ ID NO:93]氧化还原基序序列的分离的13-100个氨基酸的免疫原性肽，条件是所述抗原在其序列中不含所述表位10个氨基酸的距离内的所述基序。

在某些实施方式中，所述抗原在其序列中不含所述基序。

基序的具体实施方式是H-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:90]，[CST]-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:92]，H-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78]或[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:79]，X(0,2)-C-X(2)-C([SEQ ID NO:80]，[SEQ ID NO:96][SEQ ID NO:97])，C-X(2)-C-X(0,2)-H([SEQ ID NO:83]，[SEQ ID NO:94][SEQ ID NO:95])H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:80]或C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:83]。

在肽的具体实施方式中，如果所述基序是H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78，90或91]，则所述基序位于所述肽内的所述T细胞表位的N端位，并且其中，如果所述基序是[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79，92或93]，则所述基序位于所述T细胞表位的C端。

所述基序能够位于所述T细胞表位的N端。所述肽能够具有13-75个氨基酸，13-50个氨基酸，13-30个氨基酸的长度。

在具体实施方式中，所述MHC II类T细胞表位与所述基序相隔至多4个氨基酸的序列，或与所述基序相隔2个氨基酸的序列。

在具体实施方式中，所述氧化还原基序内的X是Gly或Pro，或所述氧化还原基序内的X不是Cys。

在具体实施方式中，所述氧化还原基元外的X不是Cys，Ser或Thr。

来自所述自身抗原的具体肽是MOG或胰岛素原。

具体的肽包含所述表位序列VVHLYRNGK[SEQ ID NO:3]，如HCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:1]，HxCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:115]或HxxCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ IDNO:116]。

另一方面是包括给予有效量的包含抗原的MHC II类T细胞表位，和与所述表位紧邻或分隔至多7个氨基酸的H-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:78]，[SEQ ID NO:90]或[SEQ ID NO:91])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H([SEQ ID NO:79]，[SEQ ID NO:92]或[SEQ IDNO:93])氧化还原基序序列的13-100个氨基酸的免疫原性肽的步骤的治疗或预防方法。

本发明的另一方面涉及上述用于产生抗原特异性CD4+细胞溶解性T细胞的体外用途。

另一方面涉及获得抗细胞抗原的细胞溶解性的CD4+T细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：提供外周血细胞；在体外使所述细胞与包含抗原的MHC II类T细胞表位和与所述表位紧邻或相隔至多7个氨基酸的H-X(0,2)-C-X(2)-[CST]([SEQ ID NO:78]，[SEQ IDNO:90]或[SEQ ID NO:91])或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H([SEQ ID NO:79]，[SEQ ID NO:92]或[SEQ ID NO:93])氧化还原基序序列的13-100个氨基酸的免疫原性肽接触；并在IL-2存在下扩增所述细胞。

另一方面涉及能够通过上述方法获得的细胞群，用作药物。

另一方面涉及包括给予有效量的如上所述的细胞的步骤的治疗和预防方法。

附图说明

图1：原生(naive)人CD4+T细胞系对具有MOG的T细胞表位和没有(右侧条棒)[SEQID NO:7]和具有额外的组氨酸(左侧条棒)[SEQ ID NO:1]的氧化还原基序的肽的应答(response)。

具体实施方式

定义

本文中所用的所述术语“肽”是指包含通过肽键连接但能够包含非氨基酸结构的2-200个氨基酸的氨基酸序列的分子。根据本发明的肽能够包含任何所述常规的20种氨基酸或其修饰形式，或能够包含通过化学肽合成或通过化学或酶修饰(enzymaticmodification)引入的非天然存在的氨基酸。本文所用的所述术语“抗原”是指大分子的结构，通常是蛋白质(含或不含多糖)或由包含一个或多个半抗原并包含T细胞表位的蛋白质组合物制成。本文所用的所述术语“抗原性蛋白(antigenic protein)”是指包含一个或多个T细胞表位的蛋白质。本文所用的自身抗原或自身抗原性蛋白质是指所述体内存在的人或动物蛋白，其会在相同的人体或动物体内引起免疫应答。

所述术语“食品或药物抗原性蛋白”是指天然存在于食品或药物产品，如疫苗中的抗原性蛋白。所述术语“表位”是指被抗体或其部分(Fab'，Fab2'等)特异性识别和结合的抗原性蛋白的一个或多个部分(其可以限定构象表位(conformational epitope))，或存在于B细胞或T细胞淋巴细胞的细胞表面，并能够通过所述结合诱导免疫应答的受体。在本发明的上下文中，所述术语“T细胞表位”是指显性，亚显性或次要(minor)T细胞表位，即由T淋巴细胞的所述细胞表面的受体特异性识别和结合的抗原性蛋白的一部分。表位是显性的(优势的，dominant)，亚显性的(亚优势的，sub-domainant)或是次要的(minor)，要取决于针对所述表位引起的所述免疫反应。显性(dominace)取决于T细胞在蛋白质的所有可能的T细胞表位中识别这些表位并能够激活它们的频率。

所述T细胞表位是由MHC II类分子识别的表位，其由适合于所述MHC II分子的沟槽(groove)中的+/-9个氨基酸的序列构成。在代表T细胞表位的肽序列内，所述表位中的氨基酸编号为P1至P9，所述表位的N-端的氨基酸编号为P-1，P-2等，所述表位C端的氨基酸编号为P+1，P+2等。由MHC II类分子识别而不是MHC I类分子识别的肽被称为MHC II类限制性T细胞表位。

所述术语“MHC”是指“主要组织相容性抗原”。在人类中，所述MHC基因被称为HLA(“人白细胞抗原”)基因。虽然没有一贯遵循的惯例，但一些文献使用了HLA指示HLA蛋白分子，而MHC指示编码所述HLA蛋白的基因。因此，当在本文中使用时，所述术语“MHC”和“HLA”是等同物。人体中的所述HLA系统在小鼠中，即H2系统中具有等效性。最深入研究的HLA基因是九种所谓的经典MHC基因：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DPA1，HLA-DPB1，HLA-DQA1，HLAsDQB1，HLA-DRA和HLA-DRB1。在人类中，所述MHC分为三个区域：I，II和III类。所述A，B和C基因属于MHC I类，而所述六种D基因属于II类。MHC I类分子由含有3个结构域(α1，2和3)的单个多态性链制成，其与细胞表面的β2微球蛋白相关。II类分子由2个多态性链制成，每条链含有2条链(α1和2，以及β1和2)。

I类MHC分子几乎在所有有核细胞上表达。

在I类MHC分子的背景中呈现的肽片段由CD8+T淋巴细胞(细胞溶解性T淋巴细胞或CTL)识别。CD8+T淋巴细胞经常成熟为细胞溶解性效应器，其能够溶解具有所述刺激抗原的细胞。II类MHC分子主要表达于活化的淋巴细胞和抗原呈递的细胞上。CD4+T淋巴细胞(辅助T淋巴细胞或Th)通过识别由II类MHC分子呈递的，通常发现于抗原呈递的细胞如巨噬细胞或树突状细胞上的独特肽片段而激活。CD4+T淋巴细胞增殖并分泌支持抗体介导的和细胞介导的应答的细胞因子如IL-2，IFN-γ和IL-4。

功能性HLA的特征在于内源的和外来的潜在抗原性肽结合的深结合沟槽。所述沟槽的特征进一步在于良好限定的形状和理化特性。HLA I类结合位点关闭，因为所述肽末端被向下固定(pin)于所述沟槽的端部。它们也参与了具有保守HLA残基的氢键的网络。鉴于这些约束，结合肽的长度被限于8-10个残基。然而，已经证明，最多达12个氨基酸残基的肽也能够结合HLA I类。不同HLA复合物的结构的比较证实了一般的结合模式，其中肽采用相对线性的扩展构象，或能够涉及中央残基从而从所述沟槽中凸出(bulge)。

与HLA I类结合位点相反，II级位点在两端都是开放的。这允许肽从所述结合的实际区域延伸，从而在两端“悬挂出(hanging out)”。因此，II类HLA能够结合可变长度的肽配体，其范围为9至超过25个氨基酸残基。类似于HLA I类，II类配体的亲和力由“恒定”和“可变”组分确定。恒定部分再次由所述HLA II类沟槽中的保守残基与结合肽的主链之间形成的氢键网络引起。然而，该氢键模式不限于所述肽的N-和C-端残基，而是分布于整个链上。后者是重要的，因为它将复合肽的构象限制于严格线性的结合模式。这对于所有II类同种异体(allotype)是很常见的。决定肽的所述结合亲和力的第二组分由于II类结合位点内的多态性的某些位置而是可变的。不同的同种异型在沟槽内形成不同的互补口袋，从而支持了肽的亚型依赖性选择或特异性。重要的是，对保持于II类口袋中的所述氨基酸残基的限制通常比I类“更软”。在不同的HLA II类同种异型体中存在大得多的肽的交叉反应性。适合于所述MHC II分子的沟槽中的MHC II类T细胞表位的所述+/-9个氨基酸的序列通常编号为P1-P9。所述表位N-端的额外的氨基酸编号为P-1，P-2等，所述表位C端的氨基酸编号为P+1，P+2等。

本文中对于本发明的上下文中使用的表位而使用的所述术语“同源物(homologue)”是指与天然存在的表位具有至少50％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％的氨基酸序列一致性的分子，从而保持所述表位结合抗体或B和/或T细胞的细胞表面受体的能力。表位的具体同源物对应于至多三个，更特别是至多2个，最特别是一个氨基酸中修饰的所述天然表位。

本文中关于本发明的所述肽而使用的所述术语“衍生物(derivative)”是指至少含有所述肽活性部分(即，能够引起细胞溶解性CD4+T细胞活性)，并且除此之外还包含可以具有不同的目的如稳定所述肽或改变所述肽的药代动力学(pharmacokinetic)或药效学(pharmacodynamic)性质的互补部分的分子。

本文使用的所述术语，两个序列的“序列一致性(sequence identity)”涉及当两个序列比对时具有相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以较短序列中的核苷酸或氨基酸的数目。具体而言，所述序列一致性为70％-80％，81％-85％，86％-90％，91％-95％，96％-100％，或100％。

本文中的所述术语“肽编码多核苷酸(peptide-encoding polynucleotide)(或核酸)”和“编码肽的多核苷酸(polynucleotide encoding peptide)(或核酸)”是指在适当的环境中表达时导致所述相关肽序列或其衍生物或同源物产生的核苷酸序列。这样的多核苷酸或核酸包括编码所述肽的正常序列，以及能够表达具有所需活性的肽的这些核酸的衍生物和片段。编码根据本发明的肽或其片段的核酸是编码源自哺乳动物或对应于哺乳动物，最特别是人肽片段的肽或其片段的序列。

所述术语“免疫失调(immune disorder)”或“免疫疾病(immune disease)”是指其中所述免疫系统的反应是负责或维持生物体中的功能失调或非生理状况的疾病。免疫失调中包括过敏性疾病和自身免疫性疾病等。

本文所用的所述术语“过敏性疾病”或“过敏性失调”是指特征为所述免疫系统对被称为过敏原(如花粉，叮咬，药物或食物)的特定物质的超敏反应的疾病。过敏是当特应性个体患者遇到已被致敏的过敏原时观察到的体征(sign)和症状(symptom)的总体，这可能导致各种疾病，特别是呼吸系统疾病和症状如支气管哮喘的发展。存在各种类型的分类，并且多数情况是过敏性疾病具有不同的名称，这取决于哺乳动物身体发生的位置。“超敏性”是指当暴露于已经变得致敏的抗原时个体中产生的不希望的(损害的，产生不适的，有时是致命的)反应；“立即超敏性(immeditate hypersensitivity)”取决于lgE抗体的产生，因此等同于过敏。

所述术语“自身免疫性疾病”或“自身免疫性失调”是指由生物体对其自身的细胞和组织由于生物体不能识别其自身的组成部分(直到亚分子水平)为“自我(self)”的异常免疫应答引起的疾病，这组疾病能够分为器官特异性和全身性疾病两类，“过敏原”定义为一种物质，通常是在倾向于，特别是遗传上倾向性的个体(特应性)患者中引起lgE抗体产生的大分子或蛋白质组合物。文献Liebers et al.(1996)Clin.Exp.Allergy 26，494-516中给出了相似的定义。

所述术语“治疗有效量”是指本发明的肽或其衍生物的量，其在患者体内产生所需的治疗或预防效果。例如，关于疾病或病症，其是在一定程度上减少所述疾病或病症的一种或多种症状，并更特别是部分地或完全地恢复至正常的与所述疾病或病症相关的或引起所述疾病或病症的生理或生物化学参数的量。通常而言，治疗有效量是本发明的所述肽或其衍生物的量，其将导致正常生理情况的改善或恢复。例如，当治疗上用于治疗受免疫疾病影响的哺乳动物时，其是日剂量肽/所述哺乳动物kg体重。可替代地，当通过基因疗法进行给药时，调整裸DNA或病毒载体的量以确保局部产生本发明的肽，其衍生物或同源物的相关剂量。

当涉及肽时，所述术语“天然”涉及所述序列与天然存在的蛋白质(野生型或突变体)的片段相同的事实。相比之下，所述术语“人工的”是指在自然界中不存在的这样的序列。通过有限的修饰，如在天然存在的序列内改变/删除/插入一个或多个氨基酸，或通过添加/除去天然存在的序列的N-或C-端的氨基酸而从所述天然序列获得人工序列。

在此上下文中，实现了通常在表位扫描的背景下，从抗原产生所述肽片段。碰巧的是(by coincidence)，这种肽可以在其序列中包含MHC II类表位，并在其附近具有所述修饰的氧化还原基序H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78，90或91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79，92或93]的序列。本文中“附近”是指在MHC II类表位序列之间和在上述H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78、90或91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ IDNO:79，92或93]基序之间，能够存在至多7个氨基酸，至多4个氨基酸，至多2个氨基酸，或甚至0个氨基酸(换句话说，表位和基序序列彼此紧邻)的氨基酸序列。

因此，本发明的具体实施方式排除了还意外包含彼此紧邻或相隔最多达2，4或7个氨基酸的氨基酸序列的MHC类T细胞和氧化还原基序序列的抗原的肽片段。

不管表位和基序修饰的氧化还原基序之间的间距，本发明的其它具体实施方式排除了意外地也包含MHC II类T细胞表位和氧化还原基序序列的抗原的肽片段。

对于所述免疫原性性质对抗原的肽片段进行了研究，但通常不使用治疗剂(除了过敏和肿瘤疫苗的领域之外)。因此，在没有关于本发明的所述肽的改进性质的任何知识的情况下，这种肽作为药物的使用是前所未有的。

氨基酸在本文中以其全称，其三字母缩写或其一个字母缩写进行指代。

氨基酸序列的基序在本文中根据Prosite的格式书写。基序用于描述序列特定部分的某种序列变化。所述符号X用于任何氨基酸被接受的位置。通过在方括号('[]')之间列出给定位置的所述可接受氨基酸而表示替代物。例如：[CST]代表选自Cys，Ser或Thr的氨基酸。作为替代物排除的氨基酸通过将其列于大括号('{}')之间而指出。例如：{AM}代表除Ala和Met之外的任何氨基酸。基序中的不同元件通过连字号-彼此分开。通过在所述元件后面括号之内放置数值或数值范围就能够指示基序内的相同元件的重复。例如：X(2)对应于X-X；X(2,5)对应于2，3，4或5个X氨基酸，A(3)对应于A-A-A。

因此，H-C-X(2)-C[SED ID NO:80]能够写成HCXXC[SED ID NO:80]。

同样地，C-X(2)-C-X(0,2)代表三种可能性，其中H和C之间不存，存在一个或两个氨基酸；即CXXCH[SEQ ID NO:83]，CXXCXH[SEQ ID NO:94]和CXXCXXH[SEQ ID NO:95]。

同样H-X(0,2)-C-X(2)-C表示三种可能性，其中H和C之间不存在，存在一个或两个氨基酸。即HCXXC[SEQ ID NO:80]，HXCXXC[SEQ ID NO:96]和HXXCXXC[SEQ ID NO:97]。

为了区分所述氨基酸X，将H和C之间的那些称为外部氨基酸X(在上述序列中单下划线)，所述氧化还原基序内的那些称为内部氨基酸X(在上述序列中双下划线)。

X表示任何氨基酸，特别是L-氨基酸，更特别是所述20种天然存在的L-氨基酸中之一。

具有还原活性的肽(包含T细胞表位和修饰的肽基序序列)，能够针对抗原呈递细胞产生抗原特异性的细胞溶解性CD4+T细胞群。

因此，在其最广泛的意义上，本发明涉及包含具有引发免疫反应的潜势的抗原(自身或非自身)的至少一个T细胞表位，以及对肽二硫键具有还原活性的修饰的硫还原酶(thioreductase)序列基序的肽。所述T细胞表位和所述修饰的氧化还原基序序列可以在所述肽中彼此紧邻或可选地相隔一个或多个氨基酸(所谓的连接子序列)。可选地，所述肽另外包含内体靶向序列和/或另外的“侧翼”序列。

本发明的所述肽包含具有引发免疫反应能力的抗原(自身或非自身)的MHC II类T细胞表位，以及修饰的氧化还原基序。可以针对其还原巯基的能力测定所述肽中的基序序列的还原活性，如在胰岛素溶解度分析测定中，其中在还原时，或使用荧光标记的底物如胰岛素改变胰岛素溶解度。在本申请的实验部分中将会更详细地描述这种分析测定的实施例。

所述修饰的氧化还原基序可以位于所述T细胞表位的所述氨基端侧或所述T细胞表位的羧基端。

在硫还原酶(thioreductase)(其是包括谷氧还蛋白(glutaredoxin)，核铁氧还蛋白(nucleoredoxin)，硫氧还蛋白(thioredoxin)和其他硫醇/二硫化物的氧化还原酶的小二硫化物还原酶)中会遇到具有还原活性的肽片段(Holmgren(2000)Antioxid.RedoxSignal.2，811-820；Jacquot et al.(2002)Biochem.Pharm.64，1065-1069)。它们是多功能的，普遍存在的(ubiquitous)，并发现于许多原核生物和真核生物中。它们通过保守的活性结构域一致序列内的氧化还原活性半胱氨酸，对蛋白质(如酶)上的二硫键发挥还原活性：C-X(2)-C[SEQ ID NO:71]，C-X(2)-S[SEQ ID NO:72]，C-X(2)-T[SEQ ID NO:73]，S-X(2)-C[SEQ ID NO:74]，T-X(2)-C[SEQ ID NO:75](Fomenko et al.(2003)Biochemistry 42，11214-11225；Fomenko et al.(2002)Prot.Science 11，2285-2296)，其中X代表任何氨基酸。这种结构域也存在于更大的蛋白，如蛋白质二硫键异构酶(PDI)和磷酸肌醇特异性磷脂酶C中。

根据例如Fomenko和WO2008/017517可知的所述4氨基酸氧化还原基序，包含位置1和/或4处的半胱氨酸；因此所述基序是C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:77]，或[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:76]。这种四肽序列将称为“所述基序(motif)”，肽中的所述基序能够是任何所述替代物C-X(2)-C[SEQ ID NO:71]，S-X(2)-C[SEQ ID NO:74]，T-X(2)-C[SEQ ID NO:75]，C-X(2)-S[SEQ ID NO:72]或C-X(2)-T[SEQ ID NO:73]。具体而言，肽包含所述序列基序C-X(2)-C[SEQ ID NO:71]。

本发明的所述肽的所述“修饰的”氧化还原基序与现有技术的不同之处在于紧邻半胱氨酸和所述基序之外存在组氨酸，换句话而言，所述修饰的氧化还原基序被写成H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78，90或91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79，92或93]。

其实施方式是H-XX-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:91]，H-X-C-X(2)-[CST][SEQ IDNO:90]，H-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78]，[CST]-X(2)-C-XX-H[SEQ ID NO:93][CST]-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:92]和[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:79]，更具体的实施方式是

H-C-X(2)-S[SEQ ID NO:81]，

H-X-C-X(2)-S[SEQ ID NO:98]，

H-XX-C-X(2)-S[SEQ ID NO:99]，

H-C-X(2)-T[SEQ ID NO:82]，

H-X-C-X(2)-T[SEQ ID NO:100]，

H-XX-C-X(2)-T[SEQ ID NO:101]，

S-X(2)-C-H[SEQ ID NO:84]，

S-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:102]，

S-X(2)-CXX-H[SEQ ID NO:103]，

T-X(2)-C-H[SEQ ID NO:85]，

T-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:104]，

T-X(2)-C-XX-H[SEQ ID NO:105]，

C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:83]，

C-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:94]，

C-X(2)-C-XX-H[SEQ ID NO:95]，

H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:80]，

H-X-C-X(2)-C[SEQ ID NO:96]，

H-XX-C-X(2)-C[SEQ ID NO:97]。

在本发明的具体实施方式中，具有H-C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:86]基序的肽被排除在本发明的范围之外。

其它具体实施方式是其中所述氧化还原基序的半胱氨酸氨基酸侧接两个组氨酸序列如HCHxC[SEQ ID NO:106]或CxxHCH[SEQ ID NO:107]的肽。

正如进一步对其的详细说明，本发明的所述肽能够通过化学合成制备，其允许引入非天然氨基酸。因此，上以上引述的氧化还原修饰的氧化还原基序中的“C”表示半胱氨酸，或表示具有硫醇基(巯基)的另一氨基酸，如巯基缬氨酸，高半胱氨酸或具有硫醇官能团的其它天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，存在于修饰的氧化还原基序中的半胱氨酸不应该作为胱氨酸二硫桥的一部分出现。然而，氧化还原修饰的氧化还原基序可以包含修饰的半胱氨酸，如甲基化半胱氨酸，其在体内被转化成具有游离巯基的半胱氨酸。X能够是所述20种天然氨基酸中任何一种，包括S，C或T，或能够是非天然氨基酸。在具体实施方式中，X是具有小侧链的氨基酸，如Gly，Ala，Ser或Thr。在进一步的具体实施方式中，X不是具有大体积(bulky)侧链的氨基酸如Trp。在进一步的具体实施方式中，X不是半胱氨酸。在进一步的具体实施方式中，所述修饰的氧化还原基序中的至少一个X是His。在其它进一步的具体实施方式中，所述修饰的氧化还原中的至少一个X是Pro。

肽可以进一步包括增加稳定性或溶解度的修饰，如所述N-端NH₂基团或C-端COOH基团的修饰(例如，将所述COOH修饰为CONH₂基团)。

在本发明包含修饰的氧化还原基序的肽中，所述基序经过定位使得在所述表位配合到所述MHC沟槽中时，所述基序保留在所述MHC结合沟槽的外部。所述修饰的氧化还原基序置于所述肽内的表位序列紧邻(换句话而言，基序和表位之间零氨基酸的连接子序列)，或与所述T细胞表位相隔包含7个氨基酸或更少的氨基酸序列的连接子。更具体而言，所述连接子包含1，2，3或4个氨基酸。具体实施方式是在表位序列和修饰的氧化还原基序序列之间具有0，1或2个氨基酸连接子的肽。可替代地，连接子可以包含5，6，7，8，9或10个氨基酸。在所述修饰的氧化还原基序序列与所述表位序列相邻的那些肽中，与所述表位序列相比，这指示为位置P-4至P-1或P+1至P+4。除了肽连接子之外，其它有机化合物能够用作连接子而将所述肽的部分彼此连接(例如，将所述修饰的氧化还原基序序列连接至所述T细胞表位序列)。

本发明的所述肽能够进一步包含另外的包含所述T细胞表位和所述修饰的氧化还原基序的所述序列N或C端的短氨基酸序列。这种氨基酸序列通常在本文中被称为“侧翼序列(flanking sequence)”。侧翼序列能够位于所述表位和内体靶向序列之间和/或所述修饰的氧化还原基序和内体靶向序列之间。在某些不包含内体靶向序列的肽中，短氨基酸序列可以存在于所述肽中的所述修饰的氧化还原基序和/或表位序列的N和/或C端。更具体而言，侧翼序列是1-7个氨基酸的序列，最特别的是2个氨基酸的序列。

所述修饰的氧化还原基序可以位于所述表位的N-端。

在所述修饰的氧化还原基序包含一个半胱氨酸的某些实施方式中，这种半胱氨酸存在于远离所述表位的位置上的所述修饰的氧化还原基序中，因此所述修饰的氧化还原基序，例如，作为所述表位的N-端的H-C-X(2)-T[SEQ ID NO:82]或H-C-X(2)-S[SEQ ID NO:81]出现，或作为所述表位C-端的T-X(2)-C-H[SEQ ID NO:85]或S-X(2)-C-H[SEQ ID NO:84]出现。

在本发明的某些实施方式中，提供了包含一个表位序列和修饰的氧化还原基序序列的肽。在进一步的具体实施方式中，所述修饰的氧化还原基序在所述肽中，例如，作为所述修饰的氧化还原基序的重复(其可以彼此间隔一个或多个氨基酸)或作为彼此紧邻的重复出现了多次(1，2，3，4或甚至更多次)。可替代地，在所述T细胞表位序列的N和C端都提供一个或多个修饰的氧化还原基序。

对本发明的所述肽设想的其它变体包括含有T细胞表位序列的重复的肽，其中每个表位序列在所述修饰的氧化还原基序之前和/或之后(例如，“修饰的氧化还原基序-表位”的重复或“修饰的氧化还原基序-表位-修饰的氧化还原基序”的重复)。在本文中，所述修饰的氧化还原基序都能够具有相同的序列，但这不是必须的。注意，包含本身包含修饰的氧化还原基序的表位的肽的重复序列还将导致包含“表位”和“修饰的氧化还原基序”的序列。在这种肽中，一个表位序列内的所述修饰的氧化还原基序发挥了第二表位序列之外的修饰的氧化还原基序的功能。

通常而言，本发明的所述肽仅包含一个T细胞表位。正如下所述，蛋白质序列中的T细胞表位能够通过功能分析测试和/或二氧化硅预测分析测试中的一种或多种识别。T细胞表位序列中的所述氨基酸根据其在所述MHC蛋白的所述结合沟槽中的位置进行编号。存在于肽内的T细胞表位由8-25个氨基酸，更特别的是8-16个氨基酸，而最特别的是由8，9，10，11，12，13，14，15或16个氨基酸构成。

在更具体的实施方式中，所述T细胞表位由9个氨基酸的序列构成。在进一步的具体实施方式中，所述T细胞表位是通过MHC-II类分子[MHC II类限制性T细胞表位]呈递于T细胞的表位。通常而言，T细胞表位序列是指所述八肽或更具体而言配合至MHC II蛋白质的所述裂隙(cleft)的九肽序列。

本发明的所述肽的T细胞表位能够对应于蛋白质的天然表位序列，或能够是其修饰形式，条件是所述修饰的T细胞表位要保持其类似于所述天然T细胞表位序列在所述MHC裂缝内结合的能力。所述修饰的T细胞表位能够具有与所述天然表位相同的对所述MHC蛋白的结合亲和力，但也能够具有降低的亲和力。具体而言，所述修饰肽的结合亲和力不低于所述原始肽的10倍更少，更具体而言不小于5倍更少。本发明的肽对蛋白质复合物具有稳定化作用。因此，所述肽-MHC复合物的稳定化作用补偿了所述修饰的表位对于所述MHC分子的所述降低的亲和力。

包含所述T细胞表位和所述肽内的所述还原化合物的序列能够进一步连接至促进所述肽摄入晚期内体(late endosome)用于在MHC II类决定子内进行处理和呈递的氨基酸序列(或另一种有机化合物)。所述晚期内体靶向是通过存在于蛋白质的细胞质尾部的信号介导的，并对应于良好识别的肽基序，如所述基于二亮氨酸的[DE]XXXL[LI][SEQ ID NO:87]或DXXLL[SEQ ID NO:88]基序，基于酪氨酸的YXXΦ[SEQ ID NO:89]基序或所谓的酸性簇基序。所述符号Φ表示具有庞大的疏水性侧链如Phe、Tyr和Trp的氨基酸残基。所述晚期内体靶向序列允许由MHC-II类分子进行处理和有效地呈递所述抗原衍生的T细胞表位。这种内体靶向序列，例如，包含于所述gp75蛋白(Vijayasaradhi et al.(1995)J.Cell.Biol.130，807-820)，所述人CD3γ蛋白，所述HLA-BM11(Copier et al.(1996)J.lmmunol.157，1017-1027)，所述DEC205受体的细胞质尾(Mahnke et al.(2000)J.CellBiol.151，673-683)内。在文献Bonifacio and Traub(2003)Annu.Rev.Biochem.72，395-447的综述中公开了发挥对所述内体的信号排序功能(sorting)的肽的其它实例。可替代地，所述序列能够是来自蛋白质的亚显性(亚优势，subdominant)或次要(minor)T细胞表位的序列，其有助于晚期内体中的摄入而无需克服针对所述抗原的T细胞应答。所述晚期内体靶向序列能够位于所述抗原衍生肽的氨基端或羧基端以有效摄入和加工，并也能够通过侧翼序列如最多达10个氨基酸的肽序列而连接。当使用次要T细胞表位完成靶向目的时，后者通常位于所述抗原衍生肽的氨基端。

因此，本发明设想了抗原性蛋白的肽及其在引发特异性免疫反应中的用途。这些肽能够对应于在其序列内包括相隔至多10个，优选7个或更少氨基酸的还原化合物和T细胞表位的蛋白质的片段。可替代地，对于大多数抗原性蛋白质，本发明的所述肽通过将还原化合物，更具体而言是如本文所述的还原修饰的氧化还原基序在N-端或C-端(直接与其相邻，或者用至多10个，更具体而言至多7个氨基酸的连接子)连接至所述抗原性蛋白的T细胞表位而产生。此外，与天然存在的序列相比，所述蛋白质的T细胞表位序列和/或所述修饰的氧化还原基序能够进行修饰和/或一个或多个侧翼序列和/或靶向序列能够引入(或进行修饰)。因此，取决于是否能够在所关注的抗原性蛋白的序列内发现本发明的特征，本发明的所述肽能够包含“人工的”或“天然存在”的序列。

本发明的所述肽能够在长度上发生显著变化。所述肽的长度能够从13或14个氨基酸变化，即，由8-9个氨基酸的表位构成，与之相邻，所述修饰的氧化还原基序具有所述组氨酸的5个氨基酸，最高达20，25，30，40，50，75，100或200个氨基酸。例如，肽可以包含40个氨基酸的内体靶向序列，约2个氨基酸的侧翼序列，本文所述的5个氨基酸的基序，4个氨基酸的连接子和9个氨基酸的T细胞表位肽。

因此，在具体实施方式中，所述完整的肽由13个氨基酸到最多50，75，100个或200个氨基酸构成。更具体而言，当所述还原化合物是如本文中所述的修饰的氧化还原基序时，则包含可选地通过连接子连接的所述表位和修饰的氧化还原基序的(人工或天然)序列(本文称为“表位修饰的氧化还原基序”序列)的长度，没有内体靶向序列，是很关键的。所述“表位修饰的氧化还原基序”更具体而言具有13，14，15，16，17，18或19个氨基酸的长度。这种13或14-19个氨基酸的肽能够可选地连接于尺寸不太重要的内体靶向信号。

如上所述，在具体实施方式中，本发明的所述肽包含与T细胞表位序列连接的如本文所述的还原性修饰的氧化还原基序。

少量蛋白质序列，蛋白片段或合成肽可以一致地(by coincidence)包含修饰的氧化还原基序序列。然而，这些蛋白质包含在所述修饰的氧化还原序列附近的MHC类T细胞表位的机会变得非常小。如果存在，则这种肽可能是从其中合成了重叠肽片段的组的表位扫描实验获知的。在这样的出版物中，所述兴趣转移到所述表位并忽略了修饰的氧化还原基序与组氨酸的相关性以及这种肽在医学应用中的相关性。

因此，这种肽是意外公开的，与本发明的发明构思无关。

在进一步的具体实施方式中，本发明的所述肽是包含不含在其天然序列内具有氧化还原性质的氨基酸序列的T细胞表位的肽。

然而，在替代实施方式中，所述T细胞表位可以包含确保所述表位与所述MHC裂缝结合的任何氨基酸序列。在抗原性蛋白的所关注表位在其表位序列中包含本文中所述的修饰的氧化还原基序的情况下，根据本发明的免疫原性肽包含本文所述的修饰的氧化还原基序的序列和/或N-或C-端连接至表位序列的另一还原序列的序列，而使(与包埋于所述裂缝内的所述表位内存在的所述修饰的氧化还原基序相反)所述附连的修饰的氧化还原基序能够确保所述还原活性。

因此，所述T细胞表位和基序紧邻或彼此分隔开并且不重叠。为了评价“紧邻(immediatedly adjacent)”或“分隔开(separated)”的概念，确定了适合于所述MHC裂缝的所述8或9个氨基酸序列，并确定了这八肽或九肽与所述修饰的氧化还原基序五肽之间的距离。

通常而言，本发明的所述肽不是天然的(因此不存在这样的蛋白质的片段)，而是包含除了T细胞表位之外的如本文所述的修饰的氧化还原基序的人工肽，由此所述修饰的氧化还原基序立即与所述T细胞表位相隔由最多7个，最特别是至多4个或至多2个氨基酸构成的连接子。

已经证明，在向哺乳动物给药(即，注射)根据本发明的所述肽(或包含这种肽的组合物)时，所述肽会引起识别所述抗原衍生T细胞表位的T细胞的活化，并通过表面受体的还原而向所述T细胞提供额外的信号。这种超最佳激活作用导致T细胞获得呈递所述T细胞表位的所述细胞的细胞溶解性质，以及对旁观T细胞的抑制性质。以这种方式，包含本发明中所描述的肽的所述肽或组合物(其含有抗原衍生T细胞表位，和在所述表位外的修饰的氧化还原基序)能够用于直接免疫哺乳动物，包括人类。因此，本发明提供了本发明适用作药物的肽或其衍生物。因此，本发明提供了包括向有需要的患者给予根据本发明的一种或多种肽的治疗方法。

本发明提供了藉此能够通过用小肽免疫引起赋予细胞溶解性质的抗原特异性T细胞的方法。据发现，含有(i)编码来自抗原的T细胞表位的序列和(ii)具有氧化还原性质的一致序列，并也可选地包含有助于将所述肽摄入晚期内体内进行有效的MHC-II型呈递的序列的肽，会引发抑制T细胞。

本发明的所述肽的免疫原性质在治疗和预防免疫反应中是特别感兴趣的。

本文所述的肽用作药物，更特别的是用于制备用于预防或治疗哺乳动物，更具体而言是人的免疫疾病的药物。

本发明描述了通过使用本发明的所述肽、其同源物或衍生物治疗或预防需要这种治疗或预防的哺乳动物的免疫病症的方法，所述方法包括向所述遭受免疫疾病或处于其风险中的哺乳动物给予治疗有效量的本发明的所述肽、其同源物或衍生物从而减少所述免疫病症的症状的步骤。本发明设想了人类和动物如宠物和农场动物的治疗。在一个实施方式中，待治疗的哺乳动物是人。以上所指的免疫疾病在具体实施方式中选自过敏性疾病和自身免疫疾病。过敏性疾病通常被描述为1型介导的疾病或lgE介导的疾病。过敏性疾病的临床表现包括支气管哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，食物超敏反应和对昆虫叮咬或药物的过敏反应。过敏性疾病是由所述免疫系统对称之为过敏原(如花粉，叮咬(sting)，药物或食物)的特异性物质的超敏性反应引起的。过敏性疾病最严重的形式是过敏性休克，这是一种医疗紧急情况。过敏原包括空气中的过敏原，如房尘螨，宠物和花粉的那些。过敏原还包括负责食物超敏性的摄食过敏原，包括水果，蔬菜和牛奶。为了治疗上述疾病，根据本发明的肽由已知的或被认为是所述疾病的致病因素的所述抗原性蛋白或过敏原产生。能够用于选择T细胞表位的过敏原通常是选自由以下这些组成的组中的过敏原：花生中存在的食物过敏原，鱼例如鳕鱼(codfish)，蛋白，甲壳类例如虾，奶例如牛奶，小麦，谷物，蔷薇科(Rosacea family)的果实(苹果，李子，草莓)，百合科(Liliacea)、十字花科(Cruciferae)、茄科(Solanaceae)和伞形科(Umbelliferae)的植物，树坚果，芝麻，花生，大豆和其它豆科(legume)过敏原，香料(spices)，甜瓜，鳄梨(avocado)，芒果，无花果(fig)，香蕉，....，获自尘螨属(Dermatophagoides spp)或欧洲室尘蟎(D.pteronyssinus)，粉尘螨(D.farinae)和微角尘螨(D.microceras)，梅氏嗜酶蟎(Euroglyphus maynei)或无爪螨属(Blomia sp.)的房尘螨过敏原，来自存在于蟑螂(cockroach)或膜翅目(Hymenoptera)中存在的昆虫的过敏原，来自花粉特别是树木、草(grass)和杂草(weed)的花粉的过敏原，来自动物特别是猫、狗、马和啮齿动物的过敏原，来自真菌特别是来自曲霉属(Aspergillus)、交链孢霉(Altemaria)或分子孢子菌属(Cladosporium)的过敏原，以及诸如乳胶、淀粉酶等的产品中存在的职业过敏原。

作为关于过敏原的实例，在本发明的上下文中，所述derp 2肽CGFSSNYCQIYPPNANKIR[SEQ ID NO:9]在HCGFSSNYCQIYPPNANKIR[SEQ ID NO:10]或HCGFCSNYCQIYPPNANKIR[SEQ ID NO:11]进行修饰。作为进一步的实例，关于过敏原所述Derp2肽CHGSEPCIIHRGKPF[SEQ ID NO:12]，被修饰为HCHGSEPCIIHRGKPF[SEQ ID NO:13]，HCHGCEPCIIHRGKPF[SEQ ID NO:14]，更典型地修饰为HCxGSEPCIIHRGKPF[SEQ ID NO:15]或HCxGCEPCIIHRGKPF，其中x不是His或Cys[SEQ ID NO:16]。

作为关于过敏原的进一步实例，所述β-乳球蛋白肽CHGCAQKKIIAEK[SEQ ID NO:17]被修饰为HCHGCAQKKIIAEK[SEQ ID NO:18]，更典型地为HCxGCAQKKIIAEK，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:19]。

作为自体免疫疾病的实例，所述甲状腺过氧化物酶肽CGPCMNEELTERL[SEQ ID NO:20]被修饰为HCGPCMNEELTERL[SEQ ID NO:21]。

作为自身免疫疾病的实例，所述甲状腺球蛋白肽CGPSAALTWVQTH[SEQ ID NO:22]被修饰为HCGPCAALTWVQTH[SEQ ID NO:23]。

本发明进一步涉及具有所述包含通过基因疗法和基因疫苗接种中使用的病毒载体的所述骨架编码的病毒蛋白的MHC II类T细胞表位的改性氧化还原基序的肽。本发明进一步涉及治疗或预防对病毒载体的免疫原性应答的方法。病毒载体(例如，来自腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒或痘病毒，逆转录病毒或慢病毒)和病毒蛋白(例如，衣壳蛋白)的实例公开与WO2009101204中。

作为本发明教导的一个实例，所述腺病毒肽CHGCPTLLYVLFEV[SEQ ID NO:24]被修饰为HCHGCPTLLYVLFEV[SEQ ID NO:25]，更典型修饰为HCxGCPTLLYVLFEV，其中X不是Cys或His[SEQ ID NO:26]。

作为进一步的实例，腺病毒晚期蛋白2肽CGPCGGYVPFHIQVP[SEQ ID NO:27]被修饰为HCGPCGGYVPFHIQVP[SEQ ID NO:28]。

本发明进一步涉及具有所述包含胞内病原体的蛋白质的MHC II类T细胞表位的改性氧化还原基序的肽。本发明进一步涉及治疗和预防具有胞内病原体的感染的方法。胞内病原体(病毒[DNA vs RNA病毒，ss vs ds病毒，细菌，分枝杆菌或具有胞内生命周期的寄生虫)和抗原的实例在WO2009101208进行了讨论(例如，疱疹病毒，黄病毒和小核糖核酸病毒，流感病毒，麻疹病毒和免疫缺陷病毒，乳头状瘤病毒(papilloviruses)。细菌和分枝杆菌包括结核分枝杆菌，以及人类或动物病原性的其他分枝杆菌如耶尔辛氏菌亚科(yersiniae)，布鲁氏杆菌族(Brucellae)，衣原体(Chlamydiae)，支原体(Mycoplasmae)，立克次体(Rickettsiae)，沙门氏菌(Salmonellae)和志贺氏菌(Shigellae)。寄生虫包括疟原虫，利士曼原虫(Leishmanias)，锥体虫(Trypanosomas)，刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)，李斯特菌(Listeria sp.))，组织胞浆菌(Histoplasma sp)。

作为进一步的实例，疟疾CGHCDKHIEQYLK[SEQ ID NO:29]的所述CSP抗原，被修饰为HCGHCDKHIEQYLK[SEQ ID NO:30]，更典型地被修饰为HCGxCDKHIEQYLK，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:31]。

作为进一步的实施例，相同抗原的所述CGHCEKKICKMEK[SEQ ID NO:32]肽被修饰为HCGHCEKKICKMEK[SEQ ID NO:33]，更典型地被修饰为HCGxCEKKICKMEK[SEQ ID NO:34]，其中x不是Cys或His。

作为进一步的实例，来自流感病毒血凝素的肽从CGHCKYVKQNTLK[SEQ ID NO:35]被修饰为HCGHCKYVKQNTLK[SEQ ID NO:36]，更典型地修饰为HCGxCKYVKQNTLK，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:37]。

作为进一步的实例，来自利什曼原虫缺乏(Leishmania Lack)抗原CGHCEHPIVVSGS[SEQ ID NO:38]的肽被修饰为HCGHCEHPIVVSGS[SEQ ID NO:39]，更典型地被修饰为HCGxCEHPIVVSGS，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:40]。

作为进一步的实例，HIV的所述Env蛋白的gp120亚单元的所述肽，从CGHCRAMYAPPIA[SEQ ID NO:41]被修饰为HCGHCRAMYAPPIA[SEQ ID NO:42]，更典型地被修饰为HCGxCRAMYAPPIA，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:43]。

本发明进一步涉及具有包含如在置换疗法中使用的水溶性外源因子(allofactor)的MHC II类T细胞表位的所述改性氧化还原基序的肽。本发明进一步涉及治疗和预防针对可溶性外源因子的免疫反应的方法。可溶性外源因子的实例公开于WO2009101206中。

作为本发明的一个实例，B02C11抗体的所述VH区的互补性决定区(CDR)3的肽(针对因子VIII，CHGCYCAVPDDPDA[SEQ ID NO:44])，被修饰为HCHGCYCAVPDDPDA[SEQ ID NO:45]，更典型地修饰为HCxGCYCAVPDDPDA，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:46]。

作为进一步的实例，源自另一抗因子(anti-factor)VIII抗体的所述肽，CGHCGGIRLHPTHYSIR[SEQ ID NO:47]被修饰为HCGHCGGIRLHPTHYSIR[SEQ ID NO:48]，更典型地修饰为HCGxCGGIRLHPTHYSIR，其中X不是Cys或His[SEQ ID NO:49]。

本发明进一步涉及具有包括肿瘤相关抗原的MHC II类T细胞表位的所述改性氧化还原基序的肽。本发明进一步涉及治疗和预防肿瘤的方法。相关的肿瘤(例如，癌基因，原癌基因，病毒蛋白，存活因子，克隆型决定子)和肿瘤相关抗原的实例公开于WO2009101205中。这种肿瘤相关抗原包括肿瘤引起病毒的病毒抗原如HPV，具有野生型序列但在肿瘤中具有增加的表达的患者肿瘤相关抗原，或具有通过点突变、缺失、框架漂移(frame shift)或染色体重排的突变序列的抗原。

作为本发明的教导的一个实例，所述MAGE-3肽CHGCYRQVPGSDP[SEQ ID NO:50]被修改为HCHGCYRQVPGSDP[SEQ ID NO:51]，更典型地修饰为HCxGCYRQVPGSDP，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:52]。

作为进一步的实例，所述细胞周期蛋白(cyclin)D肽CHGCFVALCATDV[SEQ ID NO:53]被修饰为HCHGCFVALCATDV[SEQ ID NO:54]，更典型地修饰为HCxGCFVALCATDV，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:55]。

作为进一步的实例，所述幸存肽(surviving peptide)CHGCFKELEGWEP[SEQ IDNO:56]被修饰为HCHGCFKELEGWEP[SEQ ID NO:57]，更典型地修饰为HCxGCFKELEGWEP，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:58]。

作为进一步的实例，所述爱泼斯坦巴尔(Epstein Barr)病毒肽CHGCVASSYAAAQ[SEQ ID NO:59]被修饰为HCHGCVASSYAAAQ[SEQ ID NO:60]，更典型地修饰为HCxGCVASSYAAAQ，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:61]。

本发明进一步涉及具有包括异基因移植物(allograft)的同种异体抗原性蛋白(alloantigenic protein)的MHC II类T细胞表位的所述改性氧化还原基序的肽。本发明进一步涉及治疗和预防异基因移植物排异的方法。实例有骨髓移植物，实体器官移植物如肾脏、肺、心脏、肝脏、胰脏、骨或皮肤，或诸如脐带血细胞移植物、干细胞移植物或胰岛细胞移植物的细胞移植物。同种异体抗原性蛋白的实例公开于WO2009100505中，如次要组织相容性抗原，主要组织相容性抗原或组织特异性抗原。

作为本发明的实例，来自鼠Dby抗原的肽CHGCFNSNRANSS[SEQ ID NO:62]被修饰为HCHGCFNSNRANSS[SEQ ID NO:63]，更具体而言修饰为HCxGCFNSNRANSS，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:64]。

在另一实例中，来自人Dby的序列CGHCLVLAPTREL[SEQ ID NO:65]，被修饰为HCGHCLVLAPTREL[SEQ ID NO:66]，更具体而言修饰为HCGxCLVLAPTREL，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:67]。

在另一个实例中，所述鼠黑6菌株特异性肽CGHCPEFLEQKRA[SEQ ID NO:68]被修饰为HCGHCPEFLEQKRA[SEQ ID NO:69]，更典型地修饰为HCGxCPEFLEQKRA，其中x不是Cys或His[SEQ ID NO:70]。

对于所有上述的肽，设想了其他变体，其中在组氨酸和半胱氨酸之间，存在一个或两个氨基酸X。通常而言，这些外部氨基酸X不是His，Cys，Ser或Thr。

本发明的所述肽也能够用于体外诊断方法用于检测样品中的II类限制性CD4+T细胞。在这种方法中样品与MHC II类分子和根据本发明的肽的复合物接触。通过测定所述复合物与所述样品中的细胞的所述结合而检测所述CD4+T细胞，其中所述复合物与细胞的所述结合是CD4+T细胞在样品中存在的指示。

所述复合物能够是所述肽和MHC II类分子的融合蛋白。

可替代地，所述复合物中的MHC分子是四聚体。所述复合物能够作为可溶性分子提供或能够附连于载体。

对应于适合本发明的上下文中使用的抗原性蛋白(或免疫原)的所述T细胞表位通常是通用的或混杂的T细胞表位(即，能够结合到大多数所述MHC II类分子的T细胞表位)，更具体而言存在于空气携带的过敏原或食物携带的过敏原。在具体实施方式中，所述过敏原选自由鼻-鼻窦炎过敏原，过敏性支气管哮喘过敏原和特应性皮炎过敏原组成的组中。过敏原也能够是存在于霉或各种药物如激素、抗生素、酶等中的主要过敏原(也参见Clin.Exp.Allergy 26，494-516(1996)和R.Bush主编的过敏和免疫学的分子生物学(Molecular Biology of Allergy and Immunology)(1996)的定义)。涉及特异性过敏性疾病的其它过敏原在本领域中也是众所周知的并能够在互联网，例如，在www.allergome.org上找到。

自身免疫疾病大致分为两大类，器官特异性和全身性疾病。全身性自身免疫性疾病的精确病因还并未确定。与此相反，器官特异性自身免疫疾病涉及包括B细胞和T细胞的特异性免疫应答，其靶向所述器官，由此诱导和维持局部炎症的慢性状态。器官特异性自体免疫疾病的实例包括1型糖尿病，重症肌无力(myasthenia gravis)，甲状腺炎和多发性硬化。在每一种这些病症中，单个或少数自体抗原已经分别确定，包括胰岛素，乙酰胆碱肌肉受体，甲状腺过氧化物酶和主要碱性蛋白。公认的是，这种器官特异性免疫应答的抑制作用是有益的，并会导致器官功能的部分或完全恢复。然而，还没有将能以病原特异性方式抑制这种免疫应答的疗法。目前的疗法相反却利用通过使用糖皮质激素和免疫抑制剂获得的非特异性抑制作用，全部表现出与其特异性缺乏相关的显著副作用，从而限制了其用途和其整体效果。本发明中涉及的器官特异性自身免疫性疾病和自身抗原的实例的非限制性列表(它们都设想于本发明上下文中)为：

根据本发明，提供了免疫原性肽，其包含具有触发免疫反应的能力的抗原(自或非自身)的T细胞表位。在一个具体的实施方式中，所述T细胞表位是显性(dominant)T细胞表位。

因此，在具体的实施方式中，本发明的治疗和预防方法包括给予如本文中所述的免疫原性肽，其中所述肽包含在要治疗的疾病中发挥作用的抗原性蛋白的T细胞表位(例如，如上面描述的那些)。在进一步的具体实施方式中，所使用的表位是一种显性表位。

本发明进一步涉及生产具有MHC II类T细胞表位和修饰的氧化还原基序的肽的方法。

在第一步骤中，所述方法包括提供所关注的抗原性蛋白的序列和识别所述抗原中的MHC II类T细胞表位序列的步骤。表位序列也可以对于所考虑的所述抗原性蛋白进行描述。可替代地，它们通过在计算机方法(silico method)，体外方法或体内方法中进行确定。此外，所述抗原性蛋白对于所述修饰的氧化还原基序的存在进行筛选，这在计算机方法中不需要特异性。

具有非常小的，但存在的机会是，抗原性蛋白在其序列中紧邻T细胞表位序列(即，与所述T细胞表位相隔7个或更少氨基酸)包含H-X(0,2)C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78，90或91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79，92或93]基序。如果如此，包含T细胞表位和基序的所述抗原性蛋白的片段能够用于本发明的方法和用途。在这种蛋白中的所述表位可能已经在现有技术中进行讨论，但所述存在，更不用说，这种修饰的氧化还原基序的相关性并没有进行讨论。因此，在现有技术中，并没有动机选择这种肽片段，或使用这种肽片段用于本文中所述方法。在某些实施方式中，其中所述肽基于包含MHC II类T细胞表位和修饰的氧化还原基序的蛋白的片段，从而肽序列可以通过改变所述表位和所述修饰的氧化还原基序之间的序列的长度，将所述连接子(linker)序列中的氨基酸改变，将所述基序中的Ser或Thr变成半胱氨酸或改变所述基序中一个或两个X位置上的氨基酸而进一步修饰。

适用于肽设计的其他抗原性蛋白可以在其序列中包含H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78，90或91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79，92或93]序列，其进一步远离MHC II类T细胞表位(离开所述表位序列超过7个氨基酸)。

在这种情况下，能够生产肽，其中仅所述表位和所述基序之间的距离缩短，并由此保留了所述基序的序列和邻近氨基酸。如果认为合适，所述基序之外的氨基酸，所述基序内的丝氨酸或苏氨酸或一个或两个X位置被改变。

更一般而言，适用于肽设计的抗原性蛋白将会在它们的蛋白序列中不含H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78，90或91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79，92或93]序列。根据本发明的肽将通过合成肽而制备，其中T细胞表位和修饰的氧化还原基序将会相隔0至7个氨基酸。在某些实施方式中，所述修饰的氧化还原基序能够通过在所述表位序列之外引入1，2或3个突变而获得，以保持所述蛋白质中出现所述序列内容(sequencecontext)。通常P-2和P-1，以及在P+10及P+11中的氨基酸(参照作为所述天然序列的部分的所述九肽(nonapeptide))被保留于所述肽序列。这些侧翼残基一般而言会稳定对MHC II类的结合。在其它实施方式中，所述表位的N-端或C-端序列将与含所述T细胞表位序列的所述抗原性蛋白质的序列无关。

在其他具体的实施方式中，肽通过用T细胞表位和C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:77]或[CST]-X(2)-C[SEQ ID NO:76]基序修饰肽而制备(如WO2008/017517中公开的)。组氨酸添加或氨基酸修饰成组氨酸导致了本发明的肽具有H-X(2,0)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78，90或91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79，92或93]序列。

因此，基于设计肽的上述方法，通过化学肽合成、重组表达方法或在更例外的情况下，蛋白水解或蛋白质的化学断裂(chemical fragmentation)来产生肽。

如在上述方法中产生的肽能够用于体外和体内方法中T细胞表位的存在进行测试，能够在体外分析测试中测试其还原活性。作为最后的质量控制，所述肽能够在体外分析测试中进行测试，以验证所述肽是否能够产生经由呈递所述抗原(包含也存在于所述具有所述修饰的氧化还原基序的肽中的表位序列)的抗原呈递细胞的细胞凋亡途径的属于细胞溶解性的CD4+T细胞。

从抗原性蛋白识别和选择适合于本发明上下文中使用的T细胞表位对于本领域技术人员而言是已知的。

为了识别适合于本发明的上下文中使用的表位，抗原性蛋白的分离的肽序列通过，例如，T细胞生物学技术进行测试以确定所述肽序列是否会引发T细胞应答。那些据发现能够引发T细胞应答的肽序列被定义为具有T细胞刺激活性。

人T细胞刺激活性能够进一步通过采用源自所述过敏原的肽/表位培养从对于，例如，螨过敏原敏感的个体(即，对于螨过敏原具有IgE介导的免疫应答的个体)获得的T细胞，并确定T细胞是否响应所述肽/表位发生增殖而进行测试，例如，通过氚代胸苷(tritiatedthymidine)的细胞摄取测定的。通过T细胞对肽/表位的响应的刺激指数能够计算为响应于肽/表位的最大CPM除以对照CPM。T细胞刺激指数(S.I.)等于或大于2倍所述背景水平被认为是“阳性”。阳性结果用于计算每种肽/表位对于所测试的肽/表位的组的平均刺激指数。

非天然的(或修饰的)T细胞表位能够进一步可选地测试其对MHC II类分子的结合亲和力。这能够用不同的方式进行实施。例如，可溶性HLA II类分子通过溶解对于给定II类分子纯合的(homozygous)细胞而获得。后者(给定II类分子)通过亲和色谱法纯化。可溶性II类分子采用根据其对所述II类分子的强结合亲和力产生的生物素标记对照肽进行孵育。对于II类结合进行评价的肽随后以不同的浓度孵育，并且它们的从其II类结合中置换所述对照肽的能力通过加入中性抗生物素蛋白(neutravidin)进行计算。方法能够例如在文献Texier et al.，(2000)J.Immunology 164，3177-3184中发现。

根据本发明，T细胞表位的免疫原性性质通过将其连接至具有增强的还原性能的所述修饰的氧化还原基序而增加。具体而言，包含至少一个T细胞表位和所述修饰的氧化还原基序的本发明的肽(如本文所述)具有大于或等于2.0的平均T细胞刺激指数。具有大于或等于2.0的T细胞刺激指数的肽被认为作为治疗剂是有用的。更具体而言，根据本发明的肽具有至少2.5，至少3.5，至少4.0，或甚至至少5.0的平均T细胞刺激指数。此外，肽通常具有至少约100，至少150，至少约200或至少约250的阳性指数(positivity index)(P.I.)。肽的阳性指数通过所述平均T细胞刺激指数乘以在具有免疫应答的个体群(例如，对房尘螨敏感)(例如，至少9个个体，至少16个个体或至少29或30，或甚至更多)中具有对所述肽应答的T细胞的个体的百分数(因此，对应于所述SI乘以所述肽/表位的所述混杂性质(promiscuous nature))而确定。因此，所述阳性指数代表T细胞对肽应答的强度(S.I.)和在具有对房尘螨敏感的免疫应答(例如)的个体群中对于肽的T细胞应答的频率两者。

为了通过，例如，精确绘图技术(fine mapping technique)确定最佳T细胞表位，具有T细胞刺激活性以及由此包含至少一个T细胞表位的肽(如通过T细胞生物学技术测定)，通过在所述肽的氨基-或羧基端加入或缺失氨基酸残基进行修饰并经过测试而确定对于所述修饰的肽T细胞反应性的变化。如果发现两个或更多个在所述天然蛋白序列中共享重叠的区域的肽具有人T细胞刺激活性(如通过T细胞生物学技术测定)，则就能够生产出包括所有或部分这种肽的额外的肽，以及这些额外的肽能够通过类似的程序进行测试。按照这种技术，肽被筛选出并进行重组地或合成地生产。T细胞表位或肽基于各种因素，包括对于所述肽/表位所述T细胞响应的强度(例如，刺激指数)和在个体群中对于所述肽的所述T细胞应答的频率进行选择。

另外和/或可替代地，一个或多个体外算法能够用于识别抗原性蛋白中的T细胞表位序列。合适的算法包括，但不限于，文献Zhang et al.(2005)Nucleic Acids Res 33，W180-W183(PREDBALB)；Salomon&Flower(2006)BMC Bioinformatics 7，501(MHCBN)；Schuler et al.(2007)Methods Mol.Biol.409，75-93(SYFPEITHI)；Donnes&Kohlbacher(2006)Nucleic Acids Res.34，W194-W197(SVMHC)；Kolaskar&Tongaonkar(1990)FEBSLett.276，172-174，Guan et al.(2003)Appl.Bioinformatics 2，63-66(MHCPred)和Singhand Raghava(2001)Bioinformatics 17，1236-1237(Propred)中描述的那些。

更具体而言，这种算法允许在抗原性蛋白中预测将会匹配于MHC II分子的所述沟槽的一个或多个八-或九-肽序列，以及这针对不同HLA型。

本发明的所述肽能够使用重组DNA技术，在细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中产生。鉴于所述肽的有限长度，它们能够通过化学肽合成而制备，其中肽通过不同的氨基酸相互连接而制备。化学合成特别适合于包含，例如，D-氨基酸，具有非天然存在的侧链的氨基酸或具有修饰的侧链的天然氨基酸如甲基化的半胱氨酸。

化学肽合成方法进行了充分描述以及肽能够从多个公司，诸如AppliedBiosystems公司和其他公司订购。

肽合成能够按照固相肽合成(SPPS)或与溶液相肽合成相反进行实施。所述最有名的SPPS方法是t-Boc和Fmoc固相化学：

在肽合成期间使用了多种保护基。例如，羟基和羧基官能团通过叔丁基保护，赖氨酸和色氨酸通过t-Boc基团保护，而天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸通过三苯甲基保护，并且精氨酸通过所述pbf基团进行保护。如果合适，这种保护基团能够在合成后保留于所述肽上。肽能够使用由Kent(Schnelzer&Kent(1992)lnt.J.Pept.Protein Res.40，180-193)首次描述并例如在文献Tam et al.(2001)Biopolymers 60，194-205中综述的连接技术(ligation stragegy)(2个未受保护的肽片段的化学选择性连接)相互连接而形成更长的肽，提供了实现超出SPPS范围的蛋白合成的巨大潜力。具有100-300残基的许多蛋白质通过这种方法成功合成。合成肽继续在生物化学、药理学、神经生物学、酶学和分子生物学的领域中继续发挥越来越增长的至关重要的作用(因为在所述SPPS中的巨大进步)。

可替代地，所述肽能够通过使用在包括所述编码核苷酸序列的合适表达载体中编码本发明的所述肽的核酸分子进行合成。这种DNA分子可以使用自动化DNA合成仪和所述遗传密码的所述公知的密码子-氨基酸关系而易于制备。这种DNA分子也可以使用寡核苷酸探针和常规杂交方法作为基因组DNA或作为cDNA而获得。这种DNA分子可以引入到适于在合适的宿主如细菌，例如，大肠杆菌、酵母细胞、动物细胞或植物细胞中表达所述DNA和生产所述多肽的表达载体，包括质粒中。

感兴趣的肽的物理和化学性质(例如，溶解度，稳定性)经过检测以确定所述肽是否适合用于治疗组合物。通常而言，这通过调节所述肽的序列而优化。可选地，所述肽能够在合成后(化学修饰，例如，添加/缺失官能团)使用本领域中已知的技术进行修饰。

它们自己的T细胞表位被认为通过结合至抗原呈递细胞的表面上的合适HLA分子并刺激所述相关T细胞亚群从而以所述T辅助细胞的水平引发早期事件。这些事件导致T细胞增殖，淋巴因子分泌，局部炎症反应，附加免疫细胞向所述位点的募集和导致抗体产生的B细胞级联的活化。这些抗体的一个亚型，IgE，在过敏症状的发展中是基本上重要的，以及其生产通过所述分泌的淋巴因子的性质在事件的级联中在所述T辅助细胞的水平上早期受到影响。T细胞表位是通过其中所述表位包括对于受体识别至关重要的氨基酸残基(其在所述蛋白的氨基酸序列中是连续)的T细胞受体识别的所述基本元件或最小单元。

然而，在给予具有T细胞表位和氧化还原基序的肽时，以下事件据信会发生：

抗原(ⅰ)特异性T细胞的激活，由与通过MHC-II类分子呈递的所述抗原衍生的肽同源相互作用(cognate interaction)而产生；

所述还原酶序列还原T细胞表面蛋白，如所述CD4分子。其中的所述第二结构域包含受约束的二硫键桥。这会将信号转导至T细胞中。在一系列涉及提高的氧化途径的结果中，重要的事件是钙流入(calcium influx)增加和所述NF-κB转录因子向所述细胞核的转移。后者导致IFN-γ和粒酶(granzyme)的转录增加，这允许细胞经由凋亡诱导机制获得细胞溶解性质；所述细胞溶解性质通过涉及粒酶B分泌，以及Fas-FasL相互作用的机制影响呈递所述肽的细胞。由于所述细胞杀灭作用通过细胞凋亡途径获得，细胞溶解性细胞是比细胞毒性细胞更适合于这些细胞的术语。所述抗原呈递靶细胞的破坏防止对于位于所述相同抗原，或将会用相同的抗原呈递细胞进行处理的无关抗原上的表位具有特异性的其他T细胞的活化；T细胞活化的附加结果是通过细胞-细胞接触依赖性机制抑制旁观者T细胞的活化。在这种情况下，通过由不同抗原呈递细胞呈递的抗原激活的T细胞也受抑制，条件是细胞溶解性和旁观者T细胞二者紧邻，即在相同抗原呈递细胞的表面上激活。

上述假定的作用机制采用以上引用的PCT申请中和本发明人的出版物中公开的实验数据证实(substantiate)。

本发明提供了用于体内或体外产生抗原特异性细胞溶解性CD4+T细胞的方法，及其独立地，从其他细胞群如Foxp3+Treg中基于特性表达数据区分出细胞溶解性CD4+T细胞的方法。

本发明描述了用于生产抗原特异性CD4+T细胞的体内方法。一个具体实施方式涉及通过采用如本文中描述的本发明的所述肽免疫动物(包括人)并随后从所述免疫动物中分离出所述CD4+T细胞而生产或分离所述CD4+T细胞的方法。本发明描述了生产针对APC的抗原特异性细胞溶解性CD4+T细胞的体外方法。本发明提供了用于产生对于APC的抗原特异性细胞溶解性CD4+T细胞的方法。

在一个实施方式中，提供了包括外周血细胞的分离，通过根据本发明的免疫原性肽的体外的所述细胞群的刺激和，更具体而言在IL-2的存在下的所述刺激的细胞群的扩增的方法。本发明的所述方法具有以下优点：产生大量的CD4+T细胞并且(通过使用包含抗原特异性表位的肽)能够产生对所述抗原性蛋白具有特异性的CD4+T细胞。

在替代实施方式中，能够在体内，即通过向受试者注射本文中描述的所述免疫原性肽并收集所述体内产生的所述细胞溶解性CD4+T细胞而生产CD4+T细胞。

通过本发明的所述方法可获得的所述对于APC的抗原特异性细胞溶解性CD4+T细胞，对于免疫疗法在预防过敏反应和自身免疫疾病的治疗中向哺乳动物给药是特别感兴趣的。使用同种异体(allogenic)和自体(autogeneic)细胞都进行了设想。

细胞溶解性CD4+T细胞群如下面所述获得。

如本文中描述的抗原特异性细胞溶解性CD4+T细胞能够用作药物，更具体而言适用于过继性细胞疗法，更具体而言用于急性过敏反应和自身免疫性疾病如多发性硬化症的复发的治疗。分离的细胞溶解性CD4+T细胞或细胞群，更具体而言如所述产生的抗原特异性细胞溶解性CD4+T细胞群，适用于制造用于预防或治疗免疫病症的药物。公开了通过使用所述分离的或产生的细胞溶解性CD4+T细胞的治疗方法。

正如WO2008/017517中的解释，对于APC的细胞溶解性CD4+T细胞能够基于所述细胞的表达特性从天然Treg细胞中区分出来。更具体而言，细胞溶解性CD4+T细胞群相比于天然Treg细胞群具有以下的特性的一种或多种：

一旦激活，包括CD103、CTLA-4、Fasl和ICOS的表面标记物的表达增加，

CD25的中间表达，

CD4、ICOS、CTLA-4，GITR表达以及CD127(IL7-R)低或无表达，CD27无表达。

转录因子T-bet和egr-2(Krox-20)表达，但所述转录抑制物Foxp3不表达，

高产IFN-γ而IL-10、IL-4、IL-5、IL-13或TGF-β没有或仅有痕量。

而且所述细胞溶解性T细胞表达CD45RO和/或CD45RA，不表达CCR7，CD27并存在高水平粒酶B和其他粒酶以及Fas配体。

本发明的所述肽，在给药于活的动物，通常是人类时，将会引发对旁观者T细胞发挥抑制活性的特异性T细胞。

这种机制也间接表明，和所述实验结果表明本发明的所述肽，虽然包含某些抗原的特异性T细胞表位，能够用于预防或治疗通过针对所述相同抗原的其他T细胞表位的免疫反应引起的病症，或如果它们通过相同的机制由通过本发明的所述肽激活的T细胞附近的MHC II类分子呈递，则在某些情况下甚至适用于治疗针对其他不同抗原的其他T细胞表位的免疫反应引起的病症。

公开了具有上述特性的，另外是抗原特异性的，即能够抑制抗原特异性免疫应答的所述细胞类型的分离细胞群。

本发明的所述肽也可以用于本领域中公知的基因治疗方法中，并且本文中所用解释根据本发明的肽的用途的所述术语也包括编码或表达根据本发明的免疫原性肽的核酸的用途。

本发明描述了编码本发明的所述肽的核酸序列及其使用方法。通过基因疗法的方式实现根据本发明的肽、其同源物或衍生物在哺乳动物体内的水平的不同方法都设想于本发明的上下文中。

编码蛋白序列的重组核酸分子能够作为裸DNA使用或用于递送到靶细胞的脂质体或其它脂质系统中。对于将质粒DNA直接转运到细胞中的其它方法对于本领域技术人员而言用于人类基因疗法中是众所周知的，并且涉及通过将所述质粒DNA复合(complex)到蛋白中而将所述DNA靶向细胞上的受体。在其最简单形式上，基因转运能够通过简单地将微量DNA通过显微注射的方法注射到细胞的所述核中而进行实施。一旦重组基因引入细胞中，它们能够通过用于转录和翻译的所述细胞正常机制进行识别，以及基因产物将被表达。已经尝试了其它方法用于将DNA引入更大量的细胞中。这些方法包括：转染，其中DNA与磷酸钙一起沉淀并通过胞饮作用(pinocytosis)摄入细胞中；电穿孔，其中细胞暴露于大电压脉冲而将孔引入所述膜中)；脂转染/脂质体融合，其中DNA包装到与靶细胞融合的亲脂囊泡(vesicle)中；和使用结合到抛射体(projectile)的DNA的颗粒轰击。用于将DNA引入细胞中的另一种方法是将所述DNA连接至化学修饰的蛋白。腺病毒蛋白能够使内体(endosome)失稳并增强DNA摄入细胞中。将腺病毒混合到含有DNA复合物的溶液中，或使用蛋白交联剂将DNA结合至共价附连于腺病毒的聚赖氨酸会显著改善所述重组基因的摄取和表达。腺相关的病毒载体也可以用于将基因递送到血管细胞中。正如本文中所用，“基因转运(genetransfer)”是指将外源核酸分子引入细胞的方法，这通常实施而使通过所述基因编码的特定产物能够表达。所述产物可以包括蛋白，多肽，反义DNA或RNA，或酶学活性RNA。基因转运能够在培养的细胞中或通过直接给药到哺乳动物中进行实施。在另一个实施方式中，提供了包含编码根据本发明的肽的核酸分子序列的载体(vector)。在具体实施方式中，生成所述载体而使所述核酸分子序列仅表达于特异性组织中。实现组织特异性基因表达的方法在本领域内是公知的。这能够，例如，通过在指导表达的启动子控制之下将编码根据本发明的所述序列置于一个或多个特定组织中而实现。

源于病毒如逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、RNA病毒或牛乳头状瘤病毒的表达载体可以用于将编码根据本发明的肽、其同系物或衍生物的核苷酸序列(例如，cDNA)递送到靶组织或细胞群。本领域技术人员公知的方法能够用于构建含有这种编码序列的重组病毒载体。

因此，本发明公开了能够在体内表达本发明的所述肽的核酸用于治疗和/或预防由针对外来或自身抗原的免疫应答驱动的疾病的用途。根据一个实施方式，在体内能够表达根据本发明的所述肽的核酸是一个编码这种肽的序列，其可操作地连接至启动子。这种序列能够直接或间接进行给药。例如，包含根据本发明的肽的编码序列的表达载体可以插入到细胞中，之后所述细胞进行体外生长，并随后注射或输注到患者体内。可替代地，能够体内表达根据本发明的所述肽的核酸是改变所述细胞内源性表达的序列。所述基因疗法可以涉及使用腺病毒载体，其包含编码根据本发明的肽、其同源物或衍生物的核苷酸序列，或编码根据本发明的所述肽的裸核酸分子。另外，可以注射含有编码根据本发明的肽的核酸分子的工程化细胞。

在通过基因转运(即，确保在给药后体内表达根据本发明的肽的核酸给药)确保给予一个或多个根据本发明的肽的情况下，所述核酸的合适剂量能够基于由于所述核酸的结果(如例如，通过测定给药之后所述血液中肽的浓度)表达的肽的量进行确定。因此，在具体实施方式中，本发明的所述肽通过使用编码所述肽的多核苷酸，无论是否在表达载体中，进行给药，由此本发明也涉及基因疗法。另一个具体实施方式涉及诱导本发明的所述肽局部过表达的方法用于治疗或预防免疫病症的用途。

本发明提供了包含根据本发明的一种或多种肽的药物组合物，进一步包含药用载体。正如以上详述，本发明也涉及适合用作药物的组合物，或通过使用所述组合物治疗哺乳动物免疫病症的方法，以及涉及所述组合物用于制造预防或治疗免疫病症的医药的用途。所述药物组合物能够例如是适合治疗或预防免疫疾病，特别是空气源性(airborne)和食源性(foodborne)过敏，以及过敏源的疾病的疫苗。作为本文中进一步描述的药物组合物的实例，根据本发明的肽吸附于适合给药于哺乳动物的佐剂如氢氧化铝(明矾(alum))上。通常情况下，50μg吸附于明矾上的所述肽通过所述皮下途径以2周的间隔三次进行注射。对于本领域技术人员而言显而易见的是，其它给药途径是可能的，包括口服，鼻内或肌内。而且，注射次数和注射量能够根据要治疗的病症而变化。此外，除了明矾之外的其它佐剂都可以使用，条件是它们会促进在MHC II类呈递和T细胞活化中的肽呈递(presentation)。因此，虽然有可能单独给药所述活性成分，但它们通常会呈现为药物制剂。本发明的用于人和兽用的所述制剂包含连同一种或多种药用载体一起的如上所述的至少一种活性成分。本发明涉及药物组合物，包含作为活性成分，与药用载体混合的根据本发明的一种或多种肽。本发明的药物组合物包含如下文关于治疗或预防的所述方法指出的治疗有效量的活性成分。可选地，所述组合物进一步包含其它治疗成分。合适的其它治疗成分及其常规剂量(取决于它们所属的类别)，对于本领域技术人员而言都是众所周知的，并能够选自用于治疗免疫病症的其他已知药物。

本文中所使用的所述术语“药用载体(pharmacutically acceptable carrier)”是指与所述活性组分一起配制，例如，通过溶解、分散或扩散所述组合物而促进其应用或分散到待治疗的位点，和/或在不损害其效能的情况下促进其储存、运输或处理的任何材料或物质。它们包括任何和所有溶剂，分散介质，包衣(coating)，抗细菌剂和抗真菌剂(例如，苯酚，山梨酸，氯丁醇)，等渗剂(如糖或氯化钠)等。可以包括其它成分，从而控制所述组合物中的免疫原性肽药效的持续时间。药用载体可以是固体或液体或已被压缩形成液体的气体，即本发明的组合物能够适当地作为浓缩物，乳液，溶液，颗粒剂，粉剂(dust)，喷雾剂，气溶胶(aerosol)，混悬剂，软膏剂(ointment)，乳膏剂(cream)，片剂，丸剂(pellet)或粉末剂(powder)进行使用。适用于药物组合物及其制剂中的合适药物载体在本技术领域中是公知的，以及在本发明内对其选择没有特别的限制。它们也可以包括添加剂如润湿剂，分散剂，粘着剂(sticker)，粘合剂(adhesive)，乳化剂，溶剂，包衣剂(coating)，抗细菌剂和抗真菌剂(例如，苯酚，山梨酸，氯丁醇)，等渗剂(如糖或氯化钠)等，条件是其与制药实践一致，即不会对哺乳动物造成永久性损伤的载体和添加剂。本发明的药物组合物可以以任何已知的方式制备，例如，通过均匀混合，涂层和/或研磨所述活性成分，在单步骤或多个步骤的工序中，采用所选择的载体材料和在适当情况下其他添加剂如表面活性剂。它们也可以通过微粉化进行制备，例如，为了获得它们以直径一般为约1-10μm的微球形式，即用于制造控释或缓释所述活性成分的微胶囊。

在本发明的药物组合物中使用的合适表面活性剂，也称为利泄剂(emulgent)或乳化剂(emulsifier)，是具有良好乳化、分散和/或润湿性的非离子的、阳离子的和/或阴离子物质。合适的阴离子表面活性剂包括水溶性皂和水溶性合成表面活性剂。合适的皂(soap)是碱或碱土金属盐，未取代的或取代的高级脂肪酸(C10-C22)的铵盐，例如，油酸或硬脂酸，或可获自椰子油或牛油的天然脂肪酸混合物的钠或钾盐。合成的表面活性剂包括聚丙烯酸的钠盐或钙盐；脂肪磺酸盐和硫酸盐；磺化的苯并咪唑衍生物和烷基芳基磺酸盐。脂肪磺酸盐或硫酸盐通常以碱或碱土金属盐，未取代的铵盐或用具有8-22个碳原子烷基或酰基取代的铵盐的形式，例如，木素磺酸或十二烷基磺酸的钠盐或钙盐，或由天然脂肪酸获得的脂肪醇磺酸盐、硫酸或磺酸酯的碱或碱土金属盐(如十二烷基硫酸钠)和脂肪醇/环氧乙烷加成物的磺酸的混合物。合适的磺化苯并咪唑衍生物通常包含8-22个碳原子。烷基芳基磺酸盐的实例是十二烷基苯磺酸或二丁基萘磺酸或萘磺酸/甲醛缩合产物的钠、钙或烷醇胺盐。对应的磷酸盐，例如，磷酸酯的盐和对壬基酚与环氧乙烷和/或环氧丙烷的加成物，或磷脂也是合适的。用于此目的的合适的磷脂是天然(源自动物或植物细胞)或脑磷脂或卵磷脂型的合成磷脂，如例如，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，溶血卵磷脂，心磷脂，二辛基磷脂酰胆碱，二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dipalmitoylphoshatidylcholine)和它们的混合物。

合适的非离子表面活性剂包括分子中含至少12个碳原子的烷基苯酚、脂肪醇、脂肪酸、脂族胺或酰胺的聚乙氧基化和聚丙氧基化的衍生物，烷基芳烃磺酸盐和二烷基磺基琥珀酸盐，如脂族和脂环族醇的聚乙二醇醚衍生物，饱和的和不饱和的脂肪酸和烷基酚，通常烷基酚中含有3-10个二醇醚基团和(脂族)烃部分中8-20个碳原子和烷基部分中6-18个碳原子的衍生物。进一步合适的非离子表面活性剂是聚环氧乙烷与聚丙二醇、烷基链中含1-10个碳原子的乙二氨基-聚丙二醇的水溶性加合物，所述加合物含有20-250个乙二醇醚基团和/或10-100个丙二醇醚基团。这种化合物一般含有1-5个乙二醇单元/丙二醇单元。非离子表面活性剂的代表性实例是壬基酚-聚乙氧基乙醇，蓖麻油聚乙二醇醚(glycolicether)，聚环氧丙烷/聚环氧乙烷加成物，三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇，聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。聚乙烯山梨聚糖(如聚氧乙烯山梨聚糖三油酸酯)、甘油、山梨聚糖、蔗糖和季戊四醇的脂肪酸酯也是合适的非离子表面活性剂。合适的阳离子表面活性剂包括具有4个可选地被卤素、苯基、取代苯基或羟基取代的烃基的季铵盐，特别是卤化物；例如，含有作为N-取代基的至少一个C8-C22烷基(例如，鲸蜡基，月桂基，棕榈基，肉豆蔻基，油烯基等)和，作为进一步的取代基，未取代的或卤代的低级烷基、苄基和/或羟基-低级烷基的季铵盐。

适用于该目的的表面活性剂的更详细描述可以例如查阅“McCutcheon'sDetergents and Emulsifiers Annual”(MC Publishing Crop.，Ridgewood，New Jersey，1981)，“Tensid-Taschenbucw”，第二版(Hanser Verlag，Vienna，1981)和“Encyclopaediaof Surfactants”，(Chemical Publishing Co.，New York，1981)。根据本发明的肽、其同源物或衍生物(及其生理学可接受的盐或药物组合物，都包括在所述术语“活性成分”中)可以通过适合于要治疗的病症和适于有待给予的所述化合物，本文中是蛋白和片段的任何途径进行给药。可能的途径包括区域，全身，口服(固体形式或吸入)，直肠，鼻，局部(包括眼，颊和舌下)，阴道和肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内，皮内，动脉内，鞘内和硬膜外)。优选的给药途径可以随例如接受者的状况或要治疗的疾病而变化。正如本文所述，载体(carrier)优选地是在与所述制剂的其它成分相容并且不损害其接受者的意义上是“可接受的”。所述制剂包括适合于口服，直肠，鼻，局部(包括颊和舌下)，阴道或肠胃外(包括皮下，肌内，静脉内，皮内，动脉内，鞘内和硬膜外)给药的那些。所述制剂可以方便地以单位剂量形式呈现并可以通过任何药学领域熟知的方法制备。这种方法包括使所述活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般而言，所述制剂通过均匀地和紧密地将所述活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或两者结合，并随后，如果必要，成形产品而进行制备。适合于口服给药的本发明的制剂可以呈现为离散单位如各自包含预定剂量的活性成分的胶囊剂，扁囊剂(cachet)或片剂；作为粉末或颗粒剂；作为在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油型液体乳剂或油包水型液体乳液。所述活性成分也可以呈现为大丸剂(bolus)，药糖剂(electuary)或糊剂。片剂可以通过，可选地与一种或多种辅助成分一起压缩或模制而制成。压制片剂可以通过在合适的机器中将自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒进行压制而制备，可选地与粘合剂，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，表面活性或分散剂混合。模制片剂可以通过在合适的机器上将用惰性液体稀释剂润湿的粉化化合物的混合物模制而制备。所述片剂可以可选地进行包衣涂层(coat)或刻痕(score)，并可以经过配制从而提供缓释或控释其中的所述活性成分。

对于例如皮肤上，如关节上的皮肤的局部治疗，所述制剂可以可选地，作为含有，例如，0.075％～20％w/w(包括以增量0.1％w/w如0.6％w/w，0.7％w/w等的0.1％～20％w/w的范围的活性成分)，特别是0.2％～15％w/w，更具体而言0.5％～10％w/w的量的所述活性成分的局部软膏或乳膏进行施用。当配制于软膏中时，所述活性成分可以与石蜡烃或水混溶性软膏基质(base)一起使用。可替代地，所述活性成分可以以与水包油乳膏基质一起配制于乳膏中。如果需要，所述乳膏基质的水相可以包括，例如，至少30％w/w的多元醇，即具有两个羟基或更多个羟基的醇，如丙二醇，丁烷-1,3-二醇，甘露醇，山梨醇，甘油和聚乙二醇(包括PEG 400)及它们的混合物。所述局部制剂可以合乎需要地包括增强所述活性成分吸收或渗透通过皮肤或其它染病区域的化合物。这种皮肤渗透增强剂的实例包括二甲基亚砜和相关的类似物。本发明的乳剂的油相可以以已知的方式由已知成分构成。尽管所述相可以仅包含乳化剂(也另外称为利泄剂)，它合乎需要地包含至少一种乳化剂与脂肪或油或与脂肪和油二者的混合物。可选地，包括亲水性乳化剂与起到稳定剂作用的亲脂性乳化剂，典型地通过包括油和脂肪二者。共同地，具有或不具有稳定剂的所述乳化剂构成所谓的乳化蜡，所述蜡与所述油和脂肪一起构成了所谓乳化软膏基质，其形成所述乳膏制剂的油性分散相。

所述制剂的合适油或脂肪的选择基于实现所需的化妆品性质，因为所述活性化合物在可能用于药物乳液制剂的大多数油中的溶解度非常低。因此，所述乳膏应该可选地是非油脂的，无污染和可洗涤的产品，具有避免从管或其他容器中泄漏的合适稠度(consistency)。直链或支链的一元或二元(dibasic)烷基酯，如二异己二酸酯，硬脂酸异鲸蜡酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，肉豆蔻酸异丙酯，油酸癸酯，棕榈酸异丙酯，特别是硬脂酸丁酯，棕榈酸2-乙基己酯或已知为Crodamol CAP的支链酯的共混物都可以使用。这些可以单独使用或组合使用，这取决于所需的性质。可替代地，高熔点脂质如白色软石蜡和/或液体石蜡或其他矿物油都能够使用。适合于局部给药于眼睛的制剂还包括滴眼剂，其中所述活性成分溶解或悬浮于合适的载体中，特别是用于所述活性成分的水性溶剂。所述活性成分可选地以0.5％～20％，有利地0.5％～10％，特别是约1.5％w/w的浓度存在于这种制剂中。适用于口中局部给药的制剂包括包含处于调味基质(flavoured basis)，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的所述活性成分的糖锭(lozenge)；包含处于惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶中的所述活性成分的锭剂(pastille)；和包含处于合适的液体载体中所述活性成分的漱口水。用于直肠给药的制剂可以以具有含有例如可可脂或水杨酸盐的合适基质的栓剂提供。其中所述载体是固体的适用于鼻给药的制剂，包括具有例如范围为20-500微米的粒度(包括范围为20-500微米，以5微米，如30微米，35微米等的增量的粒度)的粗粉，其以鼻吸剂(snuff)摄取的方式给药，即从靠近鼻子的所述粉末的容器中通过鼻子通道快速吸入。其中所述载体为液体的合适制剂(用作例如鼻喷雾剂或作为滴鼻剂给药)，包括所述活性成分的水性或油性溶液。适合气溶胶给药的制剂可以根据常规方法制备，并可以与其它治疗剂一起递送。适于阴道给药的制剂可以作为含有除了活性成分之外的本领域已知的合适载体的阴道栓剂、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂提供。适用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和使所述制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及可以包括悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌悬浮液。所述制剂可以以单位剂量或多剂量容器，例如，密封的安瓿瓶和小药瓶提供，并可以储存于使用前仅需要加入无菌液体载体，例如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下。临时注射溶液和悬浮液可以由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

典型的单位剂量制剂是含有如上引述的日剂量或单位每日亚剂量，或其合适部分的所述活性成分的那些。应当理解的是，除了上述特别提及的所述成分之外，本发明的制剂可以包括关于所讨论的制剂类型的技术领域内常规的其它试剂，例如，适合于口服给药的那些可以包括调味剂。根据本发明的肽、其同源物或衍生物能够用于提供含有作为活性成分的本发明的一种或多种化合物的控释药物制剂(“控释制剂(controlled releaseformulation)”)，其中所述活性成分的释放能够经过控制和调节而允许更少的频率剂量给予给定的本发明化合物或改进其药代动力学或毒性曲线。适于口服给药的控释制剂(其中离散单位包含本发明的一种或多种化合物)，可以根据常规方法制备。可以包括附加成分以控制所述活性成分在所述组合物中药效的持续时间。因此，通过选择合适的聚合物载体如例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白等可以实现控释组合物。药物释放速率和药效持续时间(duration ofaction)也可以通过将所述活性成分引入颗粒，例如，如水凝胶、聚乳酸、羟甲基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯(polyniethyl methacrylate)和其它上述聚合物的聚合物质的微胶囊中而进行控制。这种方法包括胶体药物递送系统，比如脂质体，微球，微乳液，纳米颗粒，纳米胶囊等。根据给药途径，所述药物组合物可能需要保护性包衣。适合注射的药物形式包括无菌水溶液或分散体，以及用于其临时制备的无菌粉末。因此，用于此目的的典型载体包括生物相容性水性缓冲液，乙醇，甘油，丙二醇，聚乙二醇等及其混合物。考虑到当组合使用多种活性成分时它们不一定在待治疗的哺乳动物中同时直接产生其联合治疗效果的事实，所述相应的组合物也可以是以包含所述两种成分于单独的但相邻的储存器(repository)或隔间的医学试剂盒或包装的形式。因此，在后一种情况下，每种活性成分因而可以以适合与另一种成分不同的给药途径的方式进行配制，例如，它们中一种可以是口服或肠胃外制剂的形式，而另一种是以用于静脉注射的安瓿瓶或气溶胶的形式。

如本发明中获得的细胞溶解性CD4+T细胞在MHC-II类依赖性同源物激活后会诱导APC凋亡，影响树突状细胞和B细胞两者，正如在体外和体内证明的那样，和(2)通过接触-依赖性机制在不存在IL-10和/或TGF-β的情况下抑制旁观者T细胞。正如WO2008/017517中的详细讨论，细胞溶解性CD4+T细胞能够与天然和适应性Treg区分开。

现在将通过以下没有任何限制的意图提供的实施例举例说明本发明。此外，本文所述的所有参考文献通过明确地包括在本文中作为参考。

实施例

实施例1：评价肽还原活性的方法

使用文献Tomazzolli et al.(2006)Anal.Biochem.350，105–112中描述的荧光测定所述肽的还原酶活性。具有FITC标记的两种肽在它们通过二硫键共价相互连接时而自淬灭(self-quenching)。在通过根据本发明的肽还原时，所述还原的各个肽再次出现荧光。

采用具有“正常”还原肽的肽，即具有氧化还原基序但不含其它组氨酸的肽和不含氧化还原基序的肽进行对照实验。

实施例2：细胞活化的测定

通过本发明的所述肽获得的抗原特异性细胞溶解性细胞能够驱使抗原呈递细胞凋亡。为了评价所述激活作用并防止将使其自身凋亡的细胞溶解性细胞最终过度活化，Akt和Shp的磷酰化状态允许在细胞(能够凋亡)的活化和细胞(自凋亡)的过度活化之间产生相关性。

实施例3：MOG衍生肽的设计

本发明的所述肽的实例是具有序列HCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:1]的所述肽。这种肽包含所述人MOG蛋白的所述SRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:2]片段(髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein))(uniprot Q16653登录号)，其自身含有所述VVHLYRNGK九肽MHC II类T细胞表位序列[SEQ ID NO:3]。根据本申请中提及的所述定义，这种17AA肽包含：

-修饰的氧化还原基序H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:80]，其中Pro和Tyr作为x，

-所述基序和所述T细胞表位序列之间2个氨基酸(Ser，Arg)的连接子(linker)，

-具有序列VVHLYRNGK[SEQ ID NO:3]的9氨基酸MHC类T细胞表位，

-所述表位C端的单氨基酸侧翼序列(flanking sequence)(Asp)。

与所述MOG肽片段YRPPFSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:4]的所述序列相比，所述序列中的YRPPF[SEQ ID NO:5]已被所述序列HCPYC[SEQ ID NO:6]置换。

对照肽是：

YRPPFSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:4]，即MOG的上述片段。

CPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:7]，具有C(X)2C基序[SEQ ID NO:71]但缺少所述附加组氨酸。

SRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:2]，缺乏还有的所述C(X)2C基序[SEQ ID NO:71]。

肽已经通过肽合成制备而具有CONH₂修饰的羧基端，并通过质谱和HPLC测试纯度。

实施例4：细胞系的体外扩增

原始的(naive)人CD4+T细胞系对具有MOG的T细胞表位和不具有(图1右侧条棒)[SEQ ID NO:7]和具有附加组氨酸(图1左侧条棒)[SEQ ID NO:1]的氧化还原基序的肽的应答(response)。

将等量的两种肽加入到不同的原始的人CD4+T细胞系中。所述结果表示在临床规模过程结束时导致具有细胞溶解性质的分化T细胞产生的细胞数(作为初始接种细胞的％)。

当加入所述添加的组氨酸时，由此获得体外细胞转化的显著增加，但这仅对于呈递DR2单倍型(haploptye)的人的细胞系，而不是对于其他单倍型。

因此，对于所述DR2+群体(再次是70％的MS群体)这种肽的使用是特别感兴趣的，这看起来使用含his的肽存在明确的(和意想不到的)优点。

实施例5：在多发性硬化症的体内模型中使用MOG蛋白的T细胞表位

通过采用具有T细胞表位的髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽进行免疫能够在实验模型中诱导多发性硬化症。

一组C57BL/6小鼠按照旨在诱导多发性硬化样综合征的方案，用CD4+MOG特异性效应子T细胞克隆进行过继性转移(adoptively transfer)。这包括给予处于完全弗氏(Freund)佐剂中的MOG肽并2次注射百日咳毒素(Pertussis toxin)。这种方案引起所述效应子T细胞克隆的扩增，其在所述MOG肽给药后12天内导致与多发性硬化相容的症状(sign)发展。第二组C57BL/6小鼠首先用MOG特异性细胞溶解性T细胞克隆(使用具有[SEQ ID NO:1]的肽获得)进行过继性转移，然后在1天后进行疾病诱导的所述完整方案。

使用具有SEQ ID NO:2，4和7的肽作为对照。

实施例6：多发性硬化症的预防和抑制

用实施例1包含吸附于氢氧化铝上的所述修饰的序列基序[SEQ ID NO:1]或对照肽[SEQ ID NO:2，4或7]的所述肽皮下(20μg)免疫C57BL/6小鼠的组。以两周的间隔进行三次注射。最后一次免疫后10天，处死小鼠，并使用磁珠从所述脾脏制备CD4+T细胞(2×10⁶个细胞)。然后CD4+T细胞通过贴壁(adherent)脾细胞(2×10⁶个细胞)表达的所述MOG T细胞表位(20μg/mL)进行体外刺激。

在四次再刺激之后，在旁观者抑制分析测定中(bystander suppression assay)，采用从EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎)有效的动物中获得的多克隆CD4⁺CD25^-细胞作为靶细胞，测试T细胞系。与存在于来自EAE动物的效应子CD4⁺CD25^-的对照相比，只有从使用具有含有所述HC(X)2C[SEQ ID NO:80]或C(X)2C[SEQ ID NO:71]序列基序的SEQ ID NO:1和7的所述肽进行免疫的动物中获得的所述细胞具有在靶细胞中诱导死亡的能力。

一组C57BL/6小鼠用CD4+MOG特异性CD4+T细胞克隆进行过继性转移，随后在1天后实施旨在诱导多发性硬化样综合征的方案。这包括给予处于完全弗氏佐剂中所述MOG肽并2次注射百日咳毒素。这种方案引起效应子T细胞克隆的扩增，这在所述MOG肽给药后12天内导致与多发性硬化相容的症状发展。用细胞溶解性T细胞克隆预处理的小鼠发展的所述临床评分与仅接受疾病诱导的完整方案的小鼠进行比较。

实施例7：通过肽免疫预防多发性硬化症

在所述模型组中，C57BL6小鼠在第0天接受在CFA中的100μg MOG肽/400μg乳酪分支杆菌(Mycobacterium butyricum)的SC注射和在NaCl中的300ng百日咳博德特氏菌(Bortetella pertussis)的ip注射。在第+2天时，提供第二次百日咳博德特氏菌注射。

在所述预防组中，如在所述模型组中在疾病诱导之前以14天的间隔，通过5次注射在IFA中的20μg具有SEQ ID NO:1的所述肽(含有所述序列基序HC(X)2C[SEQ ID NO:80])对C57BL/6小鼠进行免疫。使用具有SEQ ID NO:2，4和7的所述肽进行对照实验。

计分为0：无疾病，1：跛行尾(limp tail)，2：跛行尾和体重减轻(loss of weight)高于10％，3：后肢部分麻痹。

实施例9

关于合成肽的还原酶活性评价

合成FITC-NH-Gly-Cys-Asp-COOH肽(Eurogentec，比利时)并通过在DMSO中溶解而自淬灭((FITC-Gly-Cys-Asp)_ox)。用如附表所示肽(25μM)，或用2mM二硫苏糖醇(DTT)在PBS中孵育之后在96孔板上还原2.5μM(FITC-Gly-Cys-Asp)_ox 40分钟(25℃)。使用

酶标仪(multiplate reader)(Applied Biosystems)，在494nm激发后，在530nm下作为荧光读数增加的函数测定还原。结果显示于实施例10的表格在所述标题“还原酶活性”之下。

实施例10

人重组CD4的聚合

将人重组CD4(300ng)在Hepes缓冲液中(具有50μM所述表中所列的肽)在68℃下孵育15分钟。在相同条件下使用50μM DTT作为阳性对照。然后将LDS样品缓冲液(7.5μL；非还原)加入到15μL肽/CD4混合物中。然后将所述混合物进行非还原PAGE。在考马斯蓝(Coomassie Blue)染色后，分析蛋白条带是否存在单体、二聚体或多聚体的recCD4，如通过迁移进入凝胶能力降低确定的。所述表显示了是否发生聚合(+)。

该表提供了在人胰岛素原的II类限制性表位的氨基端端末添加的氨基酸序列的各种组合。这些序列由含硫还原酶(thioreductase)的基序的第一个半胱氨酸之前的氨基端序列(N-端)，基序本身，连接子，表位和C-端末端(C-端)构成。正如实施例1所述，还原酶活性以％表示。根据实施例2测定人重组CD4的聚合。

本申请中公开的肽

在以下序列1-70中，在x出现的情况下，x不是半胱氨酸或不是组氨酸。

公开的肽序列总览。

序列表

<110> 易姆赛斯股份公司

Saint-Remy, Jean-Marie

Vander Elst, Luc

Carlier, Vincent

Burkhart, David J.

<120> 新型免疫原性肽

<130> IMC2637PCT

<150> GB1418433.7

<151> 2014-10-17

<160> 116

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

His Cys Pro Tyr Cys Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys

1 5

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Tyr Arg Pro Pro Phe

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

His Cys Pro Tyr Cys

1 5

<210> 7

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Cys Pro Tyr Cys Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys Asp

1 5 10 15

<210> 8

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

His Cys Pro Tyr Cys Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly Lys

1 5 10 15

<210> 9

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

Cys Gly Phe Ser Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala Asn

1 5 10 15

Lys Ile Arg

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

His Cys Gly Phe Ser Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala

1 5 10 15

Asn Lys Ile Arg

20

<210> 11

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

His Cys Gly Phe Cys Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Ala

1 5 10 15

Asn Lys Ile Arg

20

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

1 5 10 15

<210> 13

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

His Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

1 5 10 15

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

His Cys His Gly Cys Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

1 5 10 15

<210> 15

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 变体

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<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(3)

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<220>

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<220>

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<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

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<223> 合成肽

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 21

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<223> 合成肽

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

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<223> 合成肽

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<400> 25

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<223> 合成肽

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<220>

<223> 合成肽

<400> 27

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

His Cys Gly Pro Cys Gly Gly Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Cys Gly His Cys Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 30

His Cys Gly His Cys Asp Lys His Ile Glu Gln Tyr Leu Lys

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 变体

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<400> 31

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<211> 13

<212> PRT

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<220>

<223> 合成肽

<400> 32

Cys Gly His Cys Glu Lys Lys Ile Cys Lys Met Glu Lys

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<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 33

His Cys Gly His Cys Glu Lys Lys Ile Cys Lys Met Glu Lys

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

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His Cys Gly Xaa Cys Glu Lys Lys Ile Cys Lys Met Glu Lys

1 5 10

<210> 35

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 35

Cys Gly His Cys Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 36

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

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<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 38

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<212> PRT

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<220>

<223> 合成肽

<400> 39

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<220>

<223> 合成肽

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<210> 42

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 42

His Cys Gly His Cys Arg Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ala

1 5 10

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

<400> 43

His Cys Gly Xaa Cys Arg Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ala

1 5 10

<210> 44

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 44

Cys His Gly Cys Tyr Cys Ala Val Pro Asp Asp Pro Asp Ala

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<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 45

His Cys His Gly Cys Tyr Cys Ala Val Pro Asp Asp Pro Asp Ala

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<210> 46

<211> 15

<212> PRT

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<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

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<220>

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Arg

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 48

His Cys Gly His Cys Gly Gly Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser

1 5 10 15

Ile Arg

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

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His Cys Gly Xaa Cys Gly Gly Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser

1 5 10 15

Ile Arg

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 50

Cys His Gly Cys Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro

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<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 51

His Cys His Gly Cys Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro

1 5 10

<210> 52

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

<400> 52

His Cys Xaa Gly Cys Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 53

Cys His Gly Cys Phe Val Ala Leu Cys Ala Thr Asp Val

1 5 10

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 54

His Cys His Gly Cys Phe Val Ala Leu Cys Ala Thr Asp Val

1 5 10

<210> 55

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

<400> 55

His Cys Xaa Gly Cys Phe Val Ala Leu Cys Ala Thr Asp Val

1 5 10

<210> 56

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 56

Cys His Gly Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 57

His Cys His Gly Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro

1 5 10

<210> 58

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

<400> 58

His Cys Xaa Gly Cys Phe Lys Glu Leu Glu Gly Trp Glu Pro

1 5 10

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 59

Cys His Gly Cys Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln

1 5 10

<210> 60

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 60

His Cys His Gly Cys Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln

1 5 10

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

<400> 61

His Cys Xaa Gly Cys Val Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gln

1 5 10

<210> 62

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 62

Cys His Gly Cys Phe Asn Ser Asn Arg Ala Asn Ser Ser

1 5 10

<210> 63

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 63

His Cys His Gly Cys Phe Asn Ser Asn Arg Ala Asn Ser Ser

1 5 10

<210> 64

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

<400> 64

His Cys Xaa Gly Cys Phe Asn Ser Asn Arg Ala Asn Ser Ser

1 5 10

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 65

Cys Gly His Cys Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu

1 5 10

<210> 66

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 66

His Cys Gly His Cys Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu

1 5 10

<210> 67

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 不是 His 或 Cys

<400> 67

His Cys Gly Xaa Cys Leu Val Leu Ala Pro Thr Arg Glu Leu

1 5 10

<210> 68

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 68

Cys Gly His Cys Pro Glu Phe Leu Glu Gln Lys Arg Ala

1 5 10

<210> 69

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 69

His Cys Gly His Cys Pro Glu Phe Leu Glu Gln Lys Arg Ala

1 5 10

<210> 70

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 70

His Cys Gly Xaa Cys Pro Glu Phe Leu Glu Gln Lys Arg Ala

1 5 10

<210> 71

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> xaa 可以是任何氨基酸

<400> 71

Cys Xaa Xaa Cys

1

<210> 72

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 72

Cys Xaa Xaa Ser

1

<210> 73

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 73

Cys Xaa Xaa Thr

1

<210> 74

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 74

Ser Xaa Xaa Cys

1

<210> 75

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 75

Thr Xaa Xaa Cys

1

<210> 76

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 可以是 Cys, Ser 或 Thr

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 76

Xaa Xaa Xaa Cys

1

<210> 77

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 可以是 Cys, Ser 或 Thr

<400> 77

Cys Xaa Xaa Xaa

1

<210> 78

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(4)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> Xaa 可以是 Cys, Ser 或 Thr

<400> 78

His Cys Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 79

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 可以是 Cys, Ser 或 Thr

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 79

Xaa Xaa Xaa Cys His

1 5

<210> 80

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(4)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 80

His Cys Xaa Xaa Cys

1 5

<210> 81

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(4)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 81

His Cys Xaa Xaa Ser

1 5

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(4)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 82

His Cys Xaa Xaa Thr

1 5

<210> 83

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 83

Cys Xaa Xaa Cys His

1 5

<210> 84

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 84

Ser Xaa Xaa Cys His

1 5

<210> 85

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 85

Thr Xaa Xaa Cys His

1 5

<210> 86

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(4)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 86

His Cys Xaa Xaa Cys His

1 5

<210> 87

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 晚期内体靶向序列

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 可以是 Asp 或 Glu

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(4)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (6)..(6)

<223> Xaa 可以是 Ile 或 Leu

<400> 87

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa

1 5

<210> 88

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 晚期内体靶向序列

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 88

Asp Xaa Xaa Leu Leu

1 5

<210> 89

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 晚期内体靶向基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 可以是 Phe, Tyr 或 Trp

<400> 89

Tyr Xaa Xaa Xaa

1

<210> 90

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(5)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (6)..(6)

<223> Xaa 可以是Cys, Ser 或 Thr

<400> 90

His Xaa Cys Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 91

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(6)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (7)..(7)

<223> Xaa 可以是 Cys, Ser 或 Thr

<400> 91

His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 92

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 可以是 Cys, Ser 或 Thr

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 92

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa His

1 5

<210> 93

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (1)..(1)

<223> Xaa 可以是 Cys, Ser 或 Thre

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(6)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 93

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa His

1 5

<210> 94

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 94

Cys Xaa Xaa Cys Xaa His

1 5

<210> 95

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(6)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 95

Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa His

1 5

<210> 96

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(5)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 96

His Xaa Cys Xaa Xaa Cys

1 5

<210> 97

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(6)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<400> 97

His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Cys

1 5

<210> 98

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> Xaa 可以是任何氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 98

His Xaa Cys Xaa Xaa Ser

1 5

<210> 99

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(6)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 99

His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Ser

1 5

<210> 100

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 100

His Xaa Xaa Cys Xaa Thr

1 5

<210> 101

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(6)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 101

His Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Thr

1 5

<210> 102

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 102

Ser Xaa Xaa Cys Xaa His

1 5

<210> 103

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(6)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 103

Ser Xaa Xaa Cys Xaa Xaa His

1 5

<210> 104

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 104

Thr Xaa Xaa Cys Xaa His

1 5

<210> 105

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(6)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 105

Thr Xaa Xaa Cys Xaa Xaa His

1 5

<210> 106

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 106

His Cys His Xaa Cys

1 5

<210> 107

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的氧化还原基序

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 107

Cys Xaa Xaa His Cys His

1 5

<210> 108

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰岛素原

<400> 108

His Cys Pro Tyr Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly

1 5 10 15

Ser Leu Gln Lys Arg Gly

20

<210> 109

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰岛素原

<400> 109

His Ala Ala Cys Pro Tyr Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly

20

<210> 110

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰岛素原

<400> 110

Ala His Ala Cys Pro Tyr Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly

20

<210> 111

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰岛素原

<400> 111

Ala Ala Ala Cys Pro Tyr Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly

20

<210> 112

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰岛素原

<400> 112

Ala Ala Ala Cys His Pro Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly

20

<210> 113

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰岛素原

<400> 113

Ala Ala His Cys His Pro Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly

20

<210> 114

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰岛素原

<400> 114

Ala Ala Ala Cys His Gly Cys Val Arg Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly

20

<210> 115

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mog 肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 115

His Xaa Cys Pro Tyr Cys Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn Gly

1 5 10 15

Lys Asp

<210> 116

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mog 肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa 可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 116

His Xaa Xaa Cys Pro Tyr Cys Ser Arg Val Val His Leu Tyr Arg Asn

1 5 10 15

Gly Lys Asp

Claims (38)

1.一种13至30个氨基酸的分离的免疫原性肽在制备药物中的用途，所述分离的免疫原性肽包含抗原的MHC II类T细胞表位，以及与所述MHC II类T细胞表位紧邻或相隔至多7个氨基酸的H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78]、[SEQ ID NO:90]或[SEQ ID NO:91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79]、[SEQ ID NO:92]或[SEQ ID NO:93]氧化还原基序序列。

2.根据权利要求1所述的用途，其条件是所述抗原在其序列中不包含在所述MHC II类T细胞表位的10个氨基酸的距离内的所述氧化还原基序序列。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其条件是所述抗原在其序列中不含有所述氧化还原基序序列。

4.根据权利要求1、2或3中任一项所述的用途，其中所述氧化还原基序序列是H-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:90]或[CST]-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:92]氧化还原基序序列。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述氧化还原基序序列是H-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78]或[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:79]氧化还原基序序列。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述氧化还原基序序列是H-X(0,2)-C-X(2)-C[SEQ ID NO:80]、[SEQ ID NO:96]或[SEQ ID NO:97]或C-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQID NO:83]、[SEQ ID NO:94]或[SEQ ID NO:95]。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的用途，其中所述氧化还原基序序列是H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:80]或C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:83]。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途，其中所述MHC II类T细胞表位与所述氧化还原基序序列相隔至多4个氨基酸的序列。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的用途，其中所述MHC II类T细胞表位与所述氧化还原基序序列相隔2个氨基酸的序列。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述氧化还原基序序列内的X是Gly或Pro。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的用途，其中所述氧化还原基序序列内的X不是Cys。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的用途，其中所述氧化还原基序序列外的X不是Cys、Ser或Thr。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的用途，用于预防或治疗多发性硬化症。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述抗原是参与多发性硬化症的自身抗原。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述自身抗原是MOG。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的用途，其中所述分离的免疫原性肽包含MHCII类T细胞表位序列VVHLYRNGK[SEQ ID NO:3]。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的用途，其中所述分离的免疫原性肽具有序列HCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:1]、HxCPYCSRVVLYRNGKD[SEQ ID NO:115]、或HxxCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:116]。

18.根据权利要求1至12中任一项所述的用途，用于制备预防或治疗糖尿病的药物。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述抗原是胰岛素原。

20.一种13至30个氨基酸的分离的免疫原性肽，包含抗原的MHC II类T细胞表位，以及与所述MHC II类T细胞表位紧邻或相隔至多7个氨基酸的H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ IDNO:78]或[SEQ ID NO:90]或[SEQ ID NO:91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79]、[SEQ ID NO:92]或[SEQ ID NO:93]氧化还原基序序列，其条件是所述抗原在其序列中不包含在所述MHC II类T细胞表位的10个氨基酸距离内的所述氧化还原基序序列。

21.根据权利要求20所述的分离的免疫原性肽，条件是所述抗原在其序列中不含所述氧化还原基序序列。

22.根据权利要求20或21的分离的免疫原性肽，其中所述氧化还原基序序列是H-X-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:90]或[CST]-X(2)-C-X-H[SEQ ID NO:92]氧化还原基序序列。

23.根据权利要求20或21中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述氧化还原基序序列是H-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78]或[CST]-X(2)-C-H[SEQ ID NO:79]氧化还原基序序列。

24.根据权利要求20或21中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中：

-如果所述氧化还原基序序列是H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78]、[SEQ IDNO:90]或[SEQ ID NO:91]，则所述氧化还原基序序列位于所述分离的免疫原性肽内的MHCII类T细胞表位的N端，

-如果所述氧化还原基序序列是[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79]、[SEQ IDNO:92]或[SEQ ID NO:93]，则所述氧化还原基序序列位于所述MHC II类T细胞表位C端。

25.根据权利要求20或21中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述氧化还原基序序列是H-X(0,2)-C-X(2)-C[SEQ ID NO:80]、[SEQ ID NO:96]或[SEQ ID NO:NO:97]或C-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:83]、[SEQ ID NO:94]或[SEQ ID NO:95]。

26.根据权利要求20或21中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述氧化还原基序序列是H-C-X(2)-C[SEQ ID NO:80]或C-X(2)-C-H[SEQ ID NO:83]。

27.根据权利要求20至26中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述氧化还原基序序列位于所述MHC II类T细胞表位N端。

28.根据权利要求20至27中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述MHC II类T细胞表位与所述氧化还原基序序列相隔至多4个氨基酸的序列。

29.根据权利要求20至28中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述MHC II类T细胞表位与所述氧化还原基序序列相隔2个氨基酸的序列。

30.根据权利要求20至29中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述氧化还原基序序列内的X是Gly或Pro。

31.根据权利要求20至30中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述氧化还原基序序列内的X不是Cys。

32.根据权利要求20至31中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中所述氧化还原基序序列外的X不是Cys、Ser或Thr。

33.根据权利要求20至32中任一项所述的分离的免疫原性肽，其中自身抗原是MOG或胰岛素原。

34.根据权利要求33所述的分离的免疫原性肽，其中所述分离的免疫原性肽包含MHCII类T细胞表位序列VVHLYRNGK[SEQ ID NO:3]。

35.根据权利要求33的分离的免疫原性肽，其中所述分离的免疫原性肽具有序列HCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:1]、HxCPYCSRVVLYRNGKD[SEQ ID NO:115]、或HxxCPYCSRVVHLYRNGKD[SEQ ID NO:116]。

36.根据权利要求20至35中任一项所述的分离的免疫原性肽用于产生抗原特异性CD4+细胞溶解性T细胞的体外用途。

37.一种获得CD4+T细胞群体的方法，所述CD4+T细胞群体是针对细胞抗原的细胞溶解性的，所述方法包括以下步骤：

-提供外周血细胞；

-使所述外周血细胞在体外与13至30个氨基酸的免疫原性肽接触，所述免疫原性肽包含抗原的MHC II类T细胞表位，以及与所述MHC II类T细胞表位紧邻或相隔至多7个氨基酸的H-X(0,2)-C-X(2)-[CST][SEQ ID NO:78]、[SEQ ID NO:90]或[SEQ ID NO:91]或[CST]-X(2)-C-X(0,2)-H[SEQ ID NO:79]、[SEQ ID NO:92]或[SEQ ID NO:93]氧化还原基序序列；以及

-在IL-2存在下扩增所述外周血细胞。

38.通过权利要求37所述的方法能够获得的细胞群体在制备药物中的用途。

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