JP2022513021A - 向上した酸化還元酵素モチーフを有する免疫原性ペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、T細胞エピトープ及び活性の増加した酸化還元酵素モチーフを含む免疫原性ペプチド、及び対象で免疫応答を調節することにおけるそれらの使用に関する。

Description
抗原に対する望ましくない免疫応答の生成を阻止するために、いくつかの戦略が記載されている。WO2008/017517は、所与の抗原性タンパク質のMHCクラスII抗原及び酸化還元酵素モチーフを含むペプチドを使用した新しい戦略を記載する。これらのペプチドは、CD4+ T細胞を細胞溶解性CD4+ T細胞と呼ばれる細胞溶解特性を有する細胞型に変換する。これらの細胞は、アポトーシス誘発を通して、ペプチドが由来する抗原を提示する抗原提示細胞(APC)を死滅させることが可能である。WO2008/017517は、アレルギー及び自己免疫疾患、例えばI型糖尿病のためにこの概念を実証する。ここで、インスリンは自己抗原として作用することができる。
WO2009101207及びCarlier等(2012) Plos one 7,10 e45366は、抗原特異的細胞溶解性細胞をより詳細に更に記載する。
WO2009101206は、補充療法で使用する場合にそのような抗原に対する免疫応答(例えば糖尿病患者における注射されたインスリンに対する望ましくない免疫応答)を阻止するための、酸化還元酵素モチーフ及び可溶性同種抗原のMCHクラスIIエピトープを有するペプチドの使用を記載する。
WO2016059236は、追加のヒスチジンが酸化還元酵素モチーフに近接して存在する更なる改変されたペプチドを開示する。
I型糖尿病に対するペプチドの設計では、多くの因子、例えば自己抗原のタイプ(インスリン、GAD 65、…)、自己抗原の特異的ドメイン及びエピトープ、酸化還元酵素モチーフ、酸化還元酵素モチーフとエピトープ配列の間の長さ及びアミノ酸配列を考慮することができる。
アレルゲン又は抗原のMHCクラスIIエピトープを含むペプチドに加えて、WO2012069568A2は、NKT細胞エピトープを使用し、CD1d受容体に結合し、前記特異的抗原を提示するAPCを抗原特異的な方法で排除することが示されている、細胞溶解性抗原特異的NKT細胞の活性化をもたらす可能性を更に開示した。両方の戦略は、[CST]X2C又はCX2[CST]タイプの酸化還元酵素モチーフの使用に基づく。そのような免疫原性ペプチドを使用した処置の有効性を向上させるために、より活性なペプチド及び/又はより強力な酸化還元酵素モチーフの追求が継続する。
WO2008/017517 WO2009101207 WO2009101206 WO2016059236 WO2012069568A2
Carlier等(2012) Plos one 7,10 e45366 Zhang等(2005) Nucleic Acids Res 33、W180～W183頁(PREDBALB) Salomon & Flower (2006) BMC Bioinformatics 7、501 (MHCBN) Schuler等(2007) Methods Mol. Biol.409、75～93頁(SYFPEITHI) Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res. 34、W194～W197頁(SVMHC) Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett. 276、172～174頁 Guan等(2003) Appl. Bioinformatics 2、63～66頁(MHCPred) Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17、1236～1237頁(Propred) ScanProsite De Castro E.等(2006) Nucleic Acids Res.34 (ウェブサーバー発行):W362～W365頁 Matsuda等(2008)、Curr. Opinion Immunol.、20358～368頁 Godfrey等(2010)、Nature rev. Immunol 11、197～206頁 Liebers等(1996) Clin. Exp. Allergy 26、494～516頁 Tomazzolli等(2006) Anal. Biochem.350、105～112頁 Holmgren (2000) Antioxid. Redox Signal. 2、811～820頁 Jacquot等(2002) Biochem. Pharm. 64、1065～1069頁 Fomenko等(2003) Biochemistry 42、11214～11225頁 Fomenko等(2002) Prot. Science 11、2285～2296頁 Vijayasaradhi等(1995) J. Cell. Biol. 130、807～820頁 Copier等(1996) J. lmmunol. 157、1017～1027頁 Mahnke等(2000) J. Cell Biol.151、673～683頁 Bonifacio及びTraub(2003) Annu. Rev. Biochem. 72、395～447頁 Kent(Schnelzer & Kent(1992) lnt. J. Pept. Protein Res. 40、180～193頁 Tam等(2001) Biopolymers 60、194～205頁 「McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual」(MC Publishing Crop.社、Ridgewood、New Jersey、1981) 「Tensid-Taschenbucw」、第2版(Hanser Verlag社、Vienna、1981) 「Encyclopaedia of Surfactants」(Chemical Publishing Co.社、New York、1981)
本発明は、抗原のT細胞エピトープ及び酸化還元酵素モチーフを含む新規免疫原性ペプチドを提供する。
発明者らは、伝統的に使用されるCXX[CST]又は[CST]XXC酸化還元酵素モチーフの前、その中又は後に塩基性(荷電)アミノ酸の異なる組合せを加えることの効果を試験した。
これを実行することによって、多くの場合、請求される特異的組合せを使用する場合には酸化還元酵素活性が変更されることを見出した。このことは、モチーフにおけるある特定の塩基性アミノ酸の選択は恣意的でないが、モチーフの向上した効果につながることを暗示する。特に、発明者らは、塩基性アミノ酸K(リジン)又はR(アルギニン)の使用がH(ヒスチジン)の使用に優る性能を発揮することを示した。一部の特異的位置では、更にK及びR残基は互いに優る性能を発揮し、モチーフにおける複数の塩基性アミノ酸残基の組合せはこれらの効果を更に増加させるようである。これらの効果は図に示され、実施例のセクションで説明される。モデルシステムにおける細胞レベルへの効果も試験され、本発明の免疫原性ペプチドの向上した活性を確認する。
本発明は以下の態様に関する:
態様1:
a)酸化還元酵素モチーフ、
b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
を含む免疫原性ペプチドであって、
(i)前記酸化還元酵素モチーフは、(Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(ii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(iii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
(式中、(Z1)+はHでもRでもない塩基性アミノ酸、好ましくはKであり;
Xは任意のアミノ酸である)
を含む群から選択されるか;又は
(iv)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
(式中、(Z3)+は塩基性アミノ酸であり、
好ましくはT細胞エピトープがNKT細胞エピトープである場合はHでなく、より好ましくはR又はKであり、
好ましくはT細胞エピトープがMHCクラスIIエピトープである場合はH、K又はR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、より好ましくはR又はKであり、
Xは任意のアミノ酸であり;
(B2)は任意のアミノ酸でありmは0～3の整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
を含む群から選択される、免疫原性ペプチド。
態様2:(Z1)+ は、K又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸を含む群から選択されるか、及び/又は(Z2)+及び/又は(Z3)+のいずれか1つは、K、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸を含む群から選択される、態様1による免疫原性ペプチド。
態様3:XはC、S又はT以外の任意のアミノ酸である、態様1又は2による免疫原性ペプチド。
態様4:Xは塩基性アミノ酸以外の任意のアミノ酸である、態様1～3のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様5:(Z1)+、(Z2)+及び/又は(Z3)+のいずれか1つはK又はL-オルニチンである、態様1～4のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様6:抗原性タンパク質の前記T細胞エピトープはNKT細胞エピトープ又はMHCクラスII T細胞エピトープである、態様1～5のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様7:前記エピトープは7～30アミノ酸、好ましくは7～25アミノ酸、より好ましくは7～20アミノ酸の長さを有する、態様1～6のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様8:11～50アミノ酸、好ましくは11～40アミノ酸、より好ましくは11～30アミノ酸の長さを有する、態様1～7のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様9:前記抗原性タンパク質は、自己抗原、可溶性同種因子(soluble allofactor)、移植から脱落した同種抗原、細胞内病原体の抗原、遺伝子療法又は遺伝子ワクチン接種のために使用されるウイルスベクターの抗原、腫瘍関連抗原又はアレルゲンである、態様1～8のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様10:モチーフ中の少なくとも1つのXはP又はYである、態様1～9のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様11:リンカーは0～4アミノ酸のものである、態様1～10のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様12:前記酸化還元酵素モチーフは前記抗原性タンパク質中のT細胞エピトープのN末端又はC末端の11アミノ酸の領域中に天然に存在しない、態様1～11のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様14: T細胞エピトープは、前記酸化還元酵素モチーフを天然に含まない、態様1～13のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様15:医療で使用するための、特に自己免疫性疾患、細胞内病原体による感染症、腫瘍、同種移植拒絶(allograft rejection)、又は可溶性同種因子、アレルゲン曝露若しくは遺伝子療法若しくは遺伝子ワクチン接種用のウイルスベクターへの免疫応答の処置及び/又は予防で使用するための、態様1～14のいずれか1つによる免疫原性ペプチド。
態様16:態様1～13のいずれか1つによる免疫原性ペプチドを調製する方法であって、
(a)前記抗原性タンパク質のT細胞エピトープからなるペプチド配列を提供する工程、及び
(b)前記モチーフ及び前記エピトープが互いに隣接するか又は多くても7アミノ酸のリンカーによって分離されるように、前記ペプチド配列に酸化還元酵素モチーフを連結する工程
を含む方法。
態様17:その抗原を提示するAPCに対する抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞の集団を得る方法であって、
- 末梢血細胞を提供する工程;
- 前記細胞を、特に、
a)酸化還元酵素モチーフ、
b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
を含む態様1～14のいずれか1つによる免疫原性ペプチドと接触させる工程であって、
(i)前記酸化還元酵素モチーフは、(Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(ii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(iii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
(式中、(Z1)+はHでもRでもない塩基性アミノ酸、好ましくはKであり;
Xは任意のアミノ酸である)
を含む群から選択されるか;又は
(iv)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
(式中、(Z3)+は塩基性アミノ酸であり、
好ましくはT細胞エピトープがNKT細胞エピトープである場合はHでなく、より好ましくはR又はKであり、
好ましくはT細胞エピトープがMHCクラスIIエピトープである場合はH、K又はR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、より好ましくはR又はKであり、
Xは任意のアミノ酸であり;
(B2)は任意のアミノ酸でありmは0～3の整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
を含む群から選択される、工程;並びに
- IL-2の存在下で前記細胞を増量する工程
を含む方法。
態様18:抗原特異的NKT細胞の集団を得る方法であって、
- 末梢血細胞を提供する工程;
- 前記細胞を、特に、
a)酸化還元酵素モチーフ、
b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
を含む態様1～14のいずれか1つによる免疫原性ペプチドと接触させる工程であって、
(i)前記酸化還元酵素モチーフは、(Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(ii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(iii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
(式中、(Z1)+はHでもRでもない塩基性アミノ酸、好ましくはKであり;
Xは任意のアミノ酸である)
を含む群から選択されるか;又は
(iv)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
(式中、(Z3)+は塩基性アミノ酸であり、
好ましくはT細胞エピトープがNKT細胞エピトープである場合はHでなく、より好ましくはR又はKであり、
好ましくはT細胞エピトープがMHCクラスIIエピトープである場合はH、K又はR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、より好ましくはR又はKであり、
Xは任意のアミノ酸であり;
(B2)は任意のアミノ酸でありmは0～3の整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
を含む群から選択される、工程;並びに
- IL-2の存在下で前記細胞を増量する工程
を含む方法。
態様19:その抗原を提示するAPCに対する抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞の集団を得る方法であって、
- 特に、
a)酸化還元酵素モチーフ、
b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
を含む態様1～14のいずれか1つによる免疫原性ペプチドを提供する工程であって、
(i)前記酸化還元酵素モチーフは、(Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(ii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(iii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
(式中、(Z1)+はHでもRでもない塩基性アミノ酸、好ましくはKであり;
Xは任意のアミノ酸である)
を含む群から選択されるか;又は
(iv)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
(式中、(Z3)+は塩基性アミノ酸であり、
好ましくはT細胞エピトープがNKT細胞エピトープである場合はHでなく、より好ましくはR又はKであり、
好ましくはT細胞エピトープがMHCクラスIIエピトープである場合はH、K又はR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、より好ましくはR又はKであり、
Xは任意のアミノ酸であり;
(B2)は任意のアミノ酸でありmは0～3の整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
を含む群から選択される、工程;
- 前記ペプチドを対象に投与する工程;並びに
- 抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞の前記集団を前記対象から得る工程
を含む方法。
態様20:抗原特異的NKT細胞の集団を得る方法であって、
- 特に、
a)酸化還元酵素モチーフ、
b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
を含む態様1～14のいずれか1つによる免疫原性ペプチドを提供する工程であって、
(i)前記酸化還元酵素モチーフは、(Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(ii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である)
を含む群から選択されるか;又は
(iii)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
(式中、(Z1)+はHでもRでもない塩基性アミノ酸、好ましくはKであり;
Xは任意のアミノ酸である)
を含む群から選択されるか;又は
(iv)前記酸化還元酵素モチーフは、[CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
(式中、(Z3)+は塩基性アミノ酸であり、
好ましくはT細胞エピトープがNKT細胞エピトープである場合はHでなく、より好ましくはR又はKであり、
好ましくはT細胞エピトープがMHCクラスIIエピトープである場合はH、K又はR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、より好ましくはR又はKであり、
Xは任意のアミノ酸であり;
(B2)は任意のアミノ酸でありmは0～3の整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
を含む群から選択される、工程;
- 前記ペプチドを対象に投与する工程;並びに
- 抗原特異的NKT細胞の前記集団を前記対象から得る工程
を含む方法。
態様21:自己免疫性疾患、細胞内病原体による感染症、腫瘍、同種移植拒絶、又は可溶性同種因子、アレルゲン曝露若しくは遺伝子療法若しくは遺伝子ワクチン接種用のウイルスベクターへの免疫応答の処置及び/又は予防で使用するための、態様17～20の方法によって入手できる抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞又はNKT細胞の集団。
態様22:個体で自己免疫性疾患、細胞内病原体による感染症、腫瘍、同種移植拒絶、又は可溶性同種因子、アレルゲン曝露若しくは遺伝子療法若しくは遺伝子ワクチン接種用のウイルスベクターへの免疫応答を処置及び/又は予防する方法であって、態様1～13のいずれか1つによる免疫原性ペプチド又は態様17～20のいずれか1つによる細胞集団を前記個体に投与する工程を含む方法。
態様23:個体で自己免疫性疾患、細胞内病原体による感染症、腫瘍、同種移植拒絶、又は可溶性同種因子、アレルゲン曝露若しくは遺伝子療法若しくは遺伝子ワクチン接種用のウイルスベクターへの免疫応答を処置又は予防する方法であって、
- 前記個体の末梢血細胞を提供する工程、
- 前記細胞を態様1～13のいずれか1つによる抗原性ペプチドと接触させる工程、
- 前記細胞を増量する工程、及び
- 増量された前記細胞を前記個体に投与する工程
を含む方法。
上記の態様のいずれか1つの前記酸化還元酵素モチーフの好ましい実施形態では、存在する場合、B1及び/又はB2の各々はH、K又はRから独立して選択され、好ましくはHである。
この態様の特に好ましい例は、以下の酸化還元酵素モチーフの1つを含む:
KCXXC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはRCPYC、RCGHC又はRCHGCである;
KCXXC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはKCPYC、KCGHC又はKCHGCである;
KHCXXC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはRHCPYC、RHCGHC又はRHCHGCである;
KRCXXC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはKHCPYC、KHCGHC又はKHCHGCである;
CXRC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCGRC、CPRC、CHRCである;
CXKC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCGKC、CPKC、CHKCである;
CXXCK、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCHGCK、CPYCK、CGHCKである;
CXXCHK、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCHGCHK、CPYCHK、CGHCHKである;
CXXCR、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCHGCR、CPYCR、CGHCRである;
CXXCHR、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCHGCHR、CPYCHR、CGHCHRである;
KCKXC、RCKXC、KCRXC又はRCRXC、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXKC、RCXKC、KCXRC又はRCXRC、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCKXCK、RCKXCK、KCRXCK、KCKXCR、RCRXCK、RCKXCR、KCRXCR又はRCRXCR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCKXCHK、RCKXCHK、KCRXCHK、KCKXCHR、RCRXCHK、RCKXCHR、KCRXCHR又はRCRXCHR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXXCK、KCXXCR、RCXXCK又はRCXXCR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXXCHK、KCXXCHR、RCXXCHK、RCXXCHR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXKCK、RCXKCK、KCXRCK、KCXKCR、RCXRCK、RCXKCR、KCXRCR又はRCXRCR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXKCHK、RCXKCHK、KCXRCHK、KCXKCHR、RCXRCHK、RCXKCHR、KCXRCHR又はRCXRCHR、式中、Xは任意のアミノ酸である。
上記の態様のいずれか1つでは、エピトープが設計される抗原は、プロインスリン、インスリン、C-ペプチド、MOG及び破傷風毒素を含む群から選択することができる。
前記態様のいずれか1つの好ましい実施形態では、リンカーは少なくとも1つのアミノ酸、少なくとも2つのアミノ酸、少なくとも3つのアミノ酸又は少なくとも4つのアミノ酸を含む。好ましくは、前記リンカーは、1～7アミノ酸、例えば2～7アミノ酸、3～7アミノ酸又は4～7アミノ酸を含む。
前記態様、特に酸化還元酵素モチーフが[CST](Z1)+XC又はC(Z1)+X[CST]である態様のいずれか1つの好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフはCRLCでなく、及び/又は免疫原性ペプチドはCRLC-KVAPVIKAR-MMでない。
前記態様のいずれか1つの別の好ましい実施形態では、T細胞エピトープは、そのN末端に、すなわちリンカー又は酸化還元酵素モチーフの直近に、特にリンカーが不在であるか又は1つ若しくは2つのアミノ酸だけを含む場合、塩基性アミノ酸を含まない。より好ましくは、酸化還元酵素モチーフが[CST]XXC(B2)m(Z2)+又はCXX[CST](B2)m(Z2)+である全ての態様では、T細胞エピトープは、そのN末端に、すなわちリンカー又は酸化還元酵素モチーフの直近に、特にリンカーが不在であるか又は1つ若しくは2つのアミノ酸だけを含む場合、塩基性アミノ酸を含まない。
前記態様のいずれか1つの更なる実施形態では、T細胞エピトープは、そのN末端から数えて位置1、2及び/又は3に、すなわちリンカー又は酸化還元酵素モチーフの直近に、特にリンカーが不在であるか又は1つ若しくは2つのアミノ酸だけを含む場合、塩基性アミノ酸を含まない。
前記態様のいずれか1つの更なる実施形態では、X、(B1)及び/又は(B2)のいずれか1つは塩基性アミノ酸であってよい。別の実施形態では、X、(B1)及び/又は(B2)のいずれか1つは、C、S又はT以外の任意のアミノ酸である。更なる実施形態では、X、(B1)及び/又は(B2)のいずれか1つは、塩基性アミノ酸以外の任意のアミノ酸である。
本発明のペプチドは、これらのペプチドを使用して生成された細胞溶解性CD4+ T細胞が、先行技術のペプチドと比較して増加したIFN-ガンマ及びsFasL生成をもたらす利点を有する。同様に、前記CD4+ T細胞におけるグランザイムB生成も増加すると考えられている。
これらのマーカーの増加する発現レベルは、先行技術のペプチドと比較した本発明のペプチドの細胞溶解性CD4+ T細胞を生成するより大きな能力の指標である。
CHGCモチーフ及びインスリンT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元酵素モチーフのN末端に塩基性アミノ酸が挿入され、酸化還元活性の初速は10分間追跡される。いかなる荷電アミノ酸もないか又はそれらのN末端にHを有する酸化還元酵素モチーフを有するペプチドは、対照ペプチドとして使用される。詳細についてはtable 1(表1)を参照する。 CPYCモチーフ及び破傷風毒素T細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元酵素モチーフのN末端に塩基性アミノ酸が挿入され、酸化還元活性の初速は10分間追跡される。いかなる荷電アミノ酸もないか又はそれらのN末端にHを有する酸化還元酵素モチーフを有するペプチドは、対照ペプチドとして使用される。詳細についてはtable 2(表2)を参照する。 CPYCモチーフ及びMOG T細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元酵素モチーフのN末端に塩基性アミノ酸が挿入され、酸化還元活性の初速は10分間追跡される。いかなる荷電アミノ酸もないか又はそれらのN末端にHを有する酸化還元酵素モチーフを有するペプチドは、対照ペプチドとして使用される。詳細についてはtable 3(表3)を参照する。 インスリンT細胞エピトープを有し、CPYCモチーフを含み、ここでP又はYはKによって置換されている、免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元活性の初速は10分間追跡される。CPYCモチーフは、対照ペプチドとして使用される。詳細についてはtable 4(表4)を参照する。 インスリンT細胞エピトープを有し、CHGCモチーフを含み、ここでH又はGはKによって置換されている、免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元活性の初速は10分間追跡される。CHGC及びCRGCモチーフは、対照ペプチドとして使用した。詳細についてはtable 5(表5)を参照する。 インスリンT細胞エピトープを有し、CGHCモチーフを含み、ここでHはK又はRによって置換されている、免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。CHKCモチーフも試験した。酸化還元活性の初速は10分間追跡される。CGHCモチーフは、対照ペプチドとして使用した。詳細についてはtable 6(表6)を参照する。 CHGCモチーフ及びインスリンT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元酵素モチーフのC末端に塩基性アミノ酸が挿入され、酸化還元活性の初速は10分間追跡される。そのC末端にいかなる塩基性アミノ酸もないCHGCモチーフは、対照ペプチドとして使用される。詳細についてはtable 7(表7)を参照する。 CPYCモチーフ及び破傷風毒素T細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元酵素モチーフのC末端に塩基性アミノ酸が挿入され、酸化還元活性の初速は10分間追跡される。そのC末端にいかなる塩基性アミノ酸もないCPYCモチーフは、対照ペプチドとして使用される。詳細についてはtable 8(表8)を参照する。 CPYCモチーフ及びインスリンT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元酵素モチーフの中及びそのN-/C-末端に塩基性アミノ酸が挿入され、酸化還元活性の初速は10分間追跡される。CPYCSLQPLALEGSLQKRGペプチドが、対照ペプチドとして使用される。詳細についてはtable 9(表9)を参照する。 CPYCモチーフ及びMOG T細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの酸化還元活性のカイネティクスを表す図である。酸化還元酵素モチーフの中及びそのN-/C-末端に塩基性アミノ酸が挿入され、酸化還元活性の初速は10分間追跡される。CPYCGWYRSPFSRVVHLペプチドが、対照ペプチドとして使用される。詳細についてはtable 10(表10)を参照する。 MOG T細胞エピトープ及び酸化還元酵素モチーフを含む試験及び参照ペプチドの不在下及び存在下でのAPCとの16時間の共培養後のAg特異的CD4 T細胞の百分率を表す図である。点線は、全ての試験及び対照ペプチド(白色欄)と比較したHCPYCモチーフを有する参照ペプチド(黒色欄)のためのAg特異的CD4+ T細胞の百分率の差を示す。対照条件には、無ペプチド付加、又は酸化還元酵素モチーフを含むDBYからのペプチド若しくは酸化還元酵素モチーフを含むマウスPPIからのペプチドの付加が含まれる。あらゆる条件について、生物学的2反復のFACS測定のSDを示す。詳細についてはtable 11(表11)を参照する。 MOG T細胞エピトープ及び酸化還元酵素モチーフを含む試験及び参照ペプチドの不在下及び存在下でのAPCとの24時間の共培養の後に2D2全CD4 T細胞によって分泌されたsIL2を表す図である。点線は、全ての実験及び対照条件(白色欄)に対するHCPYCモチーフを有する参照ペプチド(黒色欄)のためのsIL2の量(pg/ml)の差を示す。対照条件には、ペプチドなしのAPC、T細胞なしのAPCだけ、培地だけ、又は酸化還元酵素モチーフを含むDBYからのペプチド若しくは酸化還元酵素モチーフを含むマウスPPIからのペプチドの付加が含まれる。あらゆる条件について、生物学的2反復のFACS測定のSDを示す。詳細についてはtable 11(表11)を参照する。 MOG T細胞エピトープ及び酸化還元酵素モチーフを含む試験ペプチドの不在下及び存在下でのAPCによる刺激の16時間後にグランザイムA、グランザイムB、CD107a/bを単独で又は組み合わせて発現するAg特異的CD4 T細胞の百分率を表す図である。溶解性マーカーの誘導に及ぼす酸化還元酵素モチーフの効果を鮮明にするために、いかなるチオレドックス活性もないwtペプチドの測定は、改変されたペプチドのあらゆる他の測定から取り除いた。点線は、全ての実験的改変ペプチドと比較した、HCPYCモチーフを有する参照ペプチドのためのCD4+ T細胞の上での溶解性マーカーの発現の百分率の間の差を示す。KHCPYC-MOGペプチドの結果は、技術的困難さ(十分でない数の事象)のために決定的でない。詳細についてはtable 11(表11)を参照する。
本発明は特定の実施形態に関して記載されるが、本発明はそれに限定されず、請求項によって限定されるだけである。請求項の中のいかなる参照符号も、請求範囲を限定するものと解釈されるべきでない。以下の用語又は定義は、本発明の理解を助けるためにだけ提供される。本明細書で特記されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、それらが本発明の分野の当業者にとって有するだろうものと同じ意味を有する。本明細書で提供される定義は、当業者が理解するもの未満の請求範囲を有するものと解釈されるべきでない。
別途指示されない限り、具体的に詳細に記載されない全ての方法、工程、技術及び操作は、当業者に明らかになるように、それ自体公知の様式で実行することができ、及び実行されている。例えば標準のハンドブック、上で言及した一般的な背景技術、及びその中の更なる引用文献に再び言及される。
本明細書で使用されるように、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が明らかに別途指図しない限り、単数及び複数の両方の指示を含む。用語「任意の」は、本明細書で使用される通り、態様、請求項又は実施形態に関して使用される場合、任意の単一のもの(すなわち誰か)、並びに、言及される前記態様、請求項又は実施形態の全ての組合せを指す。
本明細書で使用される用語「含んでいる(comprising)」、「含む(comprises)」及び「含む(comprised of)」は、「含んでいる(including)」、「含む(includes)」又は「含有している(containing)」、「含有する(contains)」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の列挙されていないメンバーも、要素も、方法工程も排除しない。前記用語は、実施形態「事実上からなる」及び「からなる」も包含する。
エンドポイントによる数値範囲の列挙は、それぞれの範囲の中に包含される全ての数字及び分数、並びに列挙されるエンドポイントを含む。
測定可能な値、例えばパラメータ、量、期間等を指す場合に本明細書で使用される用語「約」は、そのような変動が開示される発明で実行するのに適当である限り、指定値の及びそれから+/-10%以下、好ましくは+/-5%以下、より好ましくは+/-1%以下、更により好ましくは+/-0.1%以下の変動を包含するものである。修飾子「約」が指す値は、それ自体も具体的に、及び好ましくは開示されることを理解すべきである。
本明細書で使用されるように、「疾患の処置で使用するための組成物」で使用される用語「使用するための」は、対応する処置方法、及び疾患の処置のための医薬の製造のための調製物の対応する使用も開示するものとする。
本明細書で使用される用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結される12～200アミノ酸のアミノ酸配列を含む分子を指すが、それは非アミノ酸構造を含むことができる。
本明細書で使用される用語「免疫原性ペプチド」は、免疫原性である、すなわち、免疫応答を導き出すことが可能なT細胞エピトープを含むペプチドを指す。
本発明によるペプチドは、従来の20アミノ酸又はその改変バージョンのいずれかを含有することができるか、又は、化学的ペプチド合成によって、若しくは化学的若しくは酵素的改変によって組み込まれる天然に存在しないアミノ酸を含有することができる。
本明細書で使用される用語「抗原」は、巨大分子、一般的にはタンパク質(多糖の有無にかかわらず)の、又は1つ又は複数のハプテンを含み、T又はNKT細胞エピトープを含むタンパク質性の組成物で作製される構造を指す。
本明細書で使用される用語「抗原性タンパク質」は、1つ又は複数のT又はNKT細胞エピトープを含むタンパク質を指す。本明細書で使用される自己抗原又は自己抗原性タンパク質は、体内に存在するヒト又は動物タンパク質又はその断片を指し、それは同じヒト又は動物の体の中で免疫応答を導き出す。
用語「食品又は医薬抗原性タンパク質」は、食品又は医薬製品、例えばワクチンに存在する抗原性タンパク質を指す。
用語「エピトープ」は、抗原性タンパク質の1つ又はいくつかの部分(コンホメーション依存エピトープを規定することができる)を指し、それは、抗体又はその部分(Fab'、Fab2'等)又はB-、若しくはT-、若しくはNKT細胞の細胞表面に提示される受容体が特異的に認識、結合し、それは、前記結合によって免疫応答を誘導することができる。
本発明との関連で、用語「T細胞エピトープ」は、優勢、亜優勢又は劣勢のT細胞エピトープ、すなわち、Tリンパ球の細胞表面で受容体が特異的に認識、結合する抗原性タンパク質の部分を指す。エピトープが優勢、亜優勢又は劣勢であるかどうかは、エピトープに対して導き出される免疫反応に依存する。優勢は、タンパク質の全ての可能なT細胞エピトープの中で、そのようなエピトープがT細胞によって認識され、それらを活性化することができる頻度に依存する。
T細胞エピトープはMHCクラスII分子によって認識されるエピトープであり、それはMHC II分子の溝にフィットする+/-9アミノ酸の配列からなる。T細胞エピトープを表すペプチド配列の中で、エピトープのアミノ酸はP1～P9と番号付けされ、エピトープのN末端のアミノ酸はP-1、P-2等と番号付けされ、エピトープのC末端のアミノ酸はP+1、P+2等と番号付けされる。MHCクラスII分子によって認識され、MHCクラスI分子によって認識されないペプチドは、MHCクラスII限定T細胞エピトープと呼ばれる。
抗原性タンパク質からのT細胞エピトープの同定及び選択は、当業者に公知である。
本発明との関連で好適であるエピトープを同定するために、抗原性タンパク質の単離されたペプチド配列を、例えばT細胞生物学技術によって試験して、そのペプチド配列がT細胞応答を導き出すかどうか決定する。T細胞応答を導き出すことが見出されたそれらのペプチド配列は、T細胞刺激活性を有すると規定される。
ヒトT細胞刺激活性は、例えばT1Dを有する個体から得たT細胞をT1Dに関与する自己抗原に由来するペプチド/エピトープと培養し、T細胞の増殖が、例えばトリチウム化チミジンの細胞取り込みによって測定したときにペプチド/エピトープに応答して起こるかどうか決定することによって更に試験することができる。ペプチド/エピトープへのT細胞による応答の刺激指数は、ペプチド/エピトープに応答した最大CPMを対照CPMで割り算して計算することができる。バックグラウンドレベルの2倍以上のT細胞刺激指数(S.I.)は、「陽性」とみなされる。陽性結果は、試験したペプチド/エピトープの群の各ペプチド/エピトープの平均刺激指数を計算するために使用される。
非天然の(又は改変された) T細胞エピトープは、MHCクラスII分子へのそれらの結合親和性に関して必要に応じて更に試験することができる。これは、異なる方法で実行することができる。例えば、可溶性HLAクラスII分子は、所与のクラスII分子にホモ接合である細胞の溶解によって得られる。後者は、親和性クロマトグラフィーによって精製される。可溶性クラスII分子は、そのクラスII分子へのその強力な結合親和性により生成されるビオチン標識参照ペプチドとインキュベートされる。クラスII結合性について調査されるペプチドは異なる濃度で次にインキュベートされ、そのクラスII結合から参照ペプチドを置き換えるそれらの能力はニュートラアビジンの付加によって計算される。
最適なT細胞エピトープを、例えば精密マッピング技術によって決定するために、T細胞刺激活性を有し、したがってT細胞生物学技術によって決定される少なくとも1つのT細胞エピトープを含むペプチドを、ペプチドのアミノ又はカルボキシ末端でのアミノ酸残基の付加又は欠失によって改変し、改変されたペプチドへのT細胞反応性における変化を決定するために試験する。天然のタンパク質配列に重複領域を共有する2つ以上のペプチドが、T細胞生物学技術によって決定されるようなヒトT細胞刺激活性を有することが見出される場合、そのようなペプチドの全てか又は一部を含む追加のペプチドを生成することができ、これらの追加のペプチドは、類似の手順によって試験することができる。この技術に従って、ペプチドが選択され、組換えで又は合成的に生成される。T細胞エピトープ又はペプチドは、ペプチド/エピトープへのT細胞応答の強度(例えば、刺激指数)及び個体集団でのペプチドへのT細胞応答の頻度を含む様々な因子に基づいて選択される。
更に、及び/又は代わりに、抗原性タンパク質の中でT細胞エピトープ配列を同定するために、1つ又は複数のin vitroアルゴリズムを使用することができる。好適なアルゴリズムには、限定されずに、Zhang等(2005) Nucleic Acids Res 33、W180～W183頁(PREDBALB); Salomon & Flower (2006) BMC Bioinformatics 7、501 (MHCBN); Schuler等(2007) Methods Mol. Biol.409、75～93頁(SYFPEITHI); Donnes & Kohlbacher (2006) Nucleic Acids Res. 34、W194～W197頁(SVMHC); Kolaskar & Tongaonkar (1990) FEBS Lett. 276、172～174頁, Guan等(2003) Appl. Bioinformatics 2、63～66頁(MHCPred)及びSingh and Raghava (2001) Bioinformatics 17、1236～1237頁(Propred)の中に記載されるものが含まれる。特に、そのようなアルゴリズムは、MHC II分子の溝にフィットする1つ又は複数のオクタ又はノナペプチド配列の抗原性タンパク質の中での予測を、異なるHLAタイプについて可能にする。
用語「MHC」は、「主要組織適合抗原」を指す。ヒトでは、MHC遺伝子はHLA(「ヒト白血球抗原」)遺伝子として知られる。一貫して追従される規則はないが、一部の文献ではHLAタンパク質分子を指すのにHLAを使用し、HLAタンパク質をコードする遺伝子を指すのにMHCを使用する。このように、本明細書で使用する場合、用語「MHC」及び「HLA」は同等物である。ヒトのHLA系は、マウスでのその同等物、すなわちH2系を有する。最も熱心に研究されたHLA遺伝子は、9つのいわゆる古典的MHC遺伝子:HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA DQB1、HLA-DRA及びHLA-DRB1である。ヒトでは、MHCは3つの領域:クラスI、II及びIIIに分類される。A、B及びC遺伝子はMHCクラスIに属すが、6つのD遺伝子はクラスIIに属する。MHCクラスI分子は、細胞表面でベータ2ミクログロブリンと会合する、3つのドメイン(アルファ1、2及び3)を含有する単一の多形鎖で構成される。クラスII分子は、2つの鎖(アルファ1及び2、並びにベータ1及び2)を各々含有する、2つの多形鎖で構成される。
クラスI MHC分子は、事実上全ての有核細胞で発現される。
クラスI MHC分子との関連で提示されるペプチド断片は、CD8+Tリンパ球(細胞溶解性Tリンパ球又はCTL)によって認識される。CD8+ Tリンパ球は、刺激性抗原を有する細胞を溶解することができる細胞溶解性エフェクターに頻繁に成熟する。クラスII MHC分子は活性化リンパ球及び抗原提示細胞の上で主に発現される。CD4+ Tリンパ球(ヘルパーTリンパ球又はTh)は、マクロファージ又は樹状細胞のような抗原提示細胞の上で通常見出されるクラスII MHC分子によって提示される特異なペプチド断片の認識で活性化される。CD4+ Tリンパ球は増殖し、抗体媒介及び細胞媒介の応答を支持するIL-2、IFN-ガンマ及びIL-4等のサイトカインを分泌する。
機能的HLAは、内因性並びに外来の、潜在的に抗原性のペプチドが結合する深い結合溝によって特徴付けられる。溝は、明確な形状及び物理化学的性質によって更に特徴付けられる。ペプチド末端が溝の末端にピン留めされるという点で、HLAクラスI結合部位は閉鎖的である。それらは、保存されたHLA残基との水素結合のネットワークにも関与する。これらの制限を考慮すれば、結合するペプチドの長さは8、9又は10残基に限定される。しかし、最高12アミノ酸残基のペプチドもHLAクラスIに結合することが可能であることが実証された。異なるHLA複合体の構造の比較は、ペプチドが比較的直線状の伸長した立体配置を採用するか又は溝からはみ出る中央の残基を含むことができる、結合の一般様式を確認した。
HLAクラスI結合部位と対照的に、クラスII部位は両端が開放的である。これは、ペプチドが実際の結合領域から伸長し、それによって両端で「張り出す」ことを可能にする。したがって、クラスII HLAは、9から25を超えるアミノ酸残基の様々な長さのペプチドリガンドに結合することができる。HLAクラスIに類似して、クラスIIリガンドの親和性は「定常」及び「可変」構成要素によって決定される。定常部分は、HLAクラスII溝の中の保存された残基と結合したペプチドの主鎖の間で形成される水素結合のネットワークから再びもたらされる。しかし、この水素結合パターンはペプチドのN-及びC末端残基に制限されず、全鎖に分布する。後者は、それが複合型ペプチドの立体配置を厳密に直線状の様式の結合に制限するので重要である。これは、全てのクラスIIアロタイプに共通する。ペプチドの結合親和性を決定する第2の構成要素は、クラスII結合部位の中の多型のある特定の位置のために変動する。異なるアロタイプは溝の中に異なる相補的ポケットを形成し、それによって、ペプチドのサブタイプ依存性選択又は特異性を説明する。重要なことに、クラスIIポケットの中に保持されるアミノ酸残基への制約は、クラスIの場合より一般に「ソフト」である。異なるHLAクラスIIアロタイプの間に、ペプチドの大いにより多くの交差反応性がある。MHC II分子の溝にフィットするMHCクラスII T細胞エピトープの+/-9アミノ酸(すなわち8、9又は10)の配列は、通常P1～P9と番号付けされる。エピトープのN末端の追加のアミノ酸はP-1、P-2等と番号付けされ、エピトープのC末端側のアミノ酸はP+1、P+2等と番号付けされる。
用語「NKT細胞エピトープ」は、NKT細胞の細胞表面で受容体が特異的に認識、結合する抗原性タンパク質の部分を指す。特に、NKT細胞エピトープは、CD1d分子が結合するエピトープである。NKT細胞エピトープは、一般モチーフ[FWYHT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYHT]を有する。この一般モチーフの代わりのバージョンは、1位及び/又は7位に代替物[FWYH]を有し、したがって[FWYH]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYH]である。
この一般モチーフの代わりのバージョンは、1位及び/又は7位に代替物[FWYT]を有する、[FWYT]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWYT]。この一般モチーフの代わりのバージョンは、1位及び/又は7位に代替物[FWY]を有する、[FWY]-X(2)-[VILM]-X(2)-[FWY]。
1位及び/又は7位のアミノ酸に関係なく、一般モチーフの代わりのバージョンは4位に代替物[ILM]を有する、例えば[FWYH]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWYH]又は[FWYHT]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWYHT]又は[FWY]-X(2)-[ILM]-X(2)-[FWY]。
タンパク質の中のCD1d結合モチーフは、上記の配列モチーフについて、手動で、ScanProsite De Castro E.等(2006) Nucleic Acids Res.34(ウェブサーバー発行):W362～W365頁等のアルゴリズムを使用して配列をスキャニングすることによって同定することができる。
「ナチュラルキラーT」又は「NKT」細胞は、非古典的MHC複合体分子CD1dによって提示される抗原を認識する非従来のTリンパ球の異なるサブセットを構成する。NKT細胞の2つのサブセットが、直ちに記載される。不変のNKT細胞(iNKT)とも呼ばれるタイプI NKT細胞が、最も豊富である。それらは、不変のアルファ鎖、マウスではValphal4及びヒトではValpha24で構成される、アルファ-ベータT細胞受容体(TCR)の存在によって特徴付けられる。このアルファ鎖は、可変であるが限定された数のベータ鎖に会合する。タイプ2 NKT細胞はアルファ-ベータTCRを有するが、多形性アルファ鎖による。しかし、NKT細胞の他のサブセットが存在することが明らかであり、その表現型はまだ不完全にしか規定されていないが、それはCD1d分子との関連で提示される糖脂質によって活性化されるという特徴を共有する。
NKT細胞は、NKG2D及びNK1.1を含むナチュラルキラー(NK)細胞受容体の組合せを一般的に発現する。NKT細胞は先天性免疫系の一部であり、それらは、それらが完全なエフェクター能力を獲得する前に増量を必要としないという事実によって適応性免疫系から区別することができる。それらの媒介物のほとんどは予め形成され、転写を必要としない。NKT細胞は、細胞内病原体に対する免疫応答及び腫瘍拒絶における主要な当事者であることが示されている。自己免疫性疾患及び移植拒絶の制御におけるそれらの役割も、提唱される。
認識単位CD1d分子は、ベータ-2ミクログロブリンの存在を含め、MHCクラスI分子のそれに極めて似ている構造を有する。それは、2つのアルファ鎖が接し、脂質鎖を受け入れる高疎水性残基を含有する深い裂け目によって特徴付けられる。裂け目は両方の末端が開放しており、より長い鎖をそれが収容することを可能にしている。CD1dの正規のリガンドは、合成アルファガラクトシルセラミド(アルファGalCer)である。しかし、糖-及びリン脂質、ミエリンで見出される天然の脂質スルファチド、微生物ホスホイノシトールマンノシド及びアルファ-グルクロノシルセラミドを含む、多くの天然の代わりのリガンドが記載されている。当技術分野の現在のコンセンサスは(Matsuda等(2008)、Curr. Opinion Immunol.、20358～368頁; Godfrey等(2010)、Nature rev. Immunol 11、197～206頁)、まだ、CD1dが脂質鎖、又は一般的に、CD1dに埋没する脂質テール及びCD1dから突き出る糖残基頭基で構成される共通構造を含有するリガンドだけに結合するということである。
本発明との関連で使用されるエピトープに関して本明細書で使用される用語「相同体」は、天然に存在するエピトープと少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%又は少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有し、それによって抗体又はB及び/又はT細胞の細胞表面受容体に結合するエピトープの能力を維持する分子を指す。エピトープの特定の相同体は、多くても3つ、特に多くても2つ、特に1つのアミノ酸で改変される天然のエピトープに対応する。
本発明のペプチドに関して本明細書で使用される用語「誘導体」は、少なくともペプチド活性部分(すなわち、酸化還元モチーフ及び細胞溶解CD4+ T細胞活性を導き出すことが可能なMHCクラスIIエピトープ)を含有し、及び、それに加えてペプチドを安定させるか又はペプチドの薬物動態学的若しくは薬力学的特性を変更すること等の異なる目的を有することができる相補部分を含む分子を指す。
本明細書で使用される、2つの配列の「配列同一性」という用語は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を、2つの配列を整列させたときの短い方の配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸の数で割り算したものに関する。特に、配列同一性は70%～80%、81%～85%、86%～90%、91%～95%、96%～100%、又は100%である。
本明細書で使用される用語「ペプチドをコードするポリヌクレオチド(又は、核酸)」及び「ペプチドをコードするポリヌクレオチド(又は、核酸)」は、適当な環境で発現されるとき、関連するペプチド配列又はその誘導体若しくは相同体の生成をもたらすヌクレオチド配列を指す。そのようなポリヌクレオチド又は核酸には、そのペプチドをコードする正常な配列、並びに要求される活性を有するペプチドを発現することが可能であるこれらの核酸の誘導体及び断片が含まれる。本発明によるペプチド又はその断片をコードする核酸は、哺乳動物を起源とするか、又は哺乳動物、特にヒトのペプチド断片に対応するペプチド又はその断片をコードする配列である。
用語「酸化還元酵素モチーフ」、「チオール-酸化還元酵素モチーフ」、「チオレダクターゼモチーフ」、「チオレドックスモチーフ」又は「酸化還元モチーフ」は、本明細書で同義語として使用され、1つの分子(還元体、水素又は電子供与体とも呼ばれる)から別のもの(酸化体、水素又は電子受容体とも呼ばれる)への電子の移動に関与するモチーフを指す。特に、用語「酸化還元酵素モチーフ」は、配列モチーフ[CST]-X-X-C又はC-X-X-[CST]を指し、ここで、Cはシステインを、Sはセリンを、Tはトレオニンを、Xは任意のアミノ酸を表す。
用語「塩基性アミノ酸」はブレンステッド-ローリー及びルイス塩基のように作用する任意のアミノ酸を指し、天然の塩基性アミノ酸、例えばアルギニン(R)、リジン(K)又はヒスチジン(H)、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えば、限定されずに以下のものが含まれる:
・リジン変異体、例えばFmoc-β-Lys(Boc)-OH (CAS番号219967-68-7)、L-オルニチン又はオルニチンとも呼ばれるFmoc-Orn(Boc)-OH (CAS番号109425-55-0)、Fmoc-β-Homolys(Boc)-OH (CAS番号203854-47-1)、Fmoc-Dap(Boc)-OH (CAS番号162558-25-0)又はFmoc-Lys(Boc)OH(DiMe)-OH (CAS番号441020-33-3);
・チロシン/フェニルアラニン変異体、例えばFmoc-L-3Pal-OH (CAS番号175453-07-3)、Fmoc-β-HomoPhe(CN)-OH (CAS番号270065-87-7)、Fmoc-L-β-HomoAla(4-ピリジル)-OH (CAS番号270065-69-5)又はFmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH (CAS番号174132-31-1);
・プロリン変異体、例えばFmoc-Pro(4-NHBoc)-OH (CAS番号221352-74-5)又はFmoc-Hyp(tBu)-OH (CAS番号122996-47-8);
・アルギニン変異体、例えばFmoc-β-Homoarg(Pmc)-OH (CAS番号700377-76-0)。
用語「免疫障害」又は「免疫疾患」は、免疫系の反応が生物体における機能不全又は非生理的状況の責任を負うか又は維持する疾患を指す。免疫障害には、とりわけ、アレルギー性障害及び自己免疫性疾患が含まれる。
本明細書で使用される用語「アレルギー性疾患」又は「アレルギー性障害」は、アレルゲン(花粉、針、薬物又は食物等)と呼ばれる特異的物質への免疫系の過敏性反応によって特徴付けられる疾患を指す。アレルギーは、アトピー性の個々の患者が感作されたアレルゲンに遭遇するたびに観察される徴候及び症状の集合であり、それは様々な疾患、特に呼吸器の疾患及び症状、例えば気管支喘息の発生をもたらすことができる。各種の分類が存在するが、大部分、哺乳動物の体のどこでそれが起こるかによってアレルギー性障害は異なる名称を有する。「過敏症」は、それが感作された抗原への曝露により個体で発生する望ましくない(有害で、不快を引き起こす、時には致命的な)反応である;「即時過敏症」はlgE抗体の生成に依存し、したがって、アレルギーと同等物である。
用語「自己免疫性疾患」又は「自己免疫性障害」は、生物体がそれ自身の構成成分部分を「自己」として認識する(分子未満のレベルまで)ことができないことによる、それ自身の細胞及び組織に対する生物体の異常な免疫応答からもたらされる疾患を指す。疾患の群は、2つのカテゴリー(臓器特異的で全身性疾患)では分裂されうる。
「アレルゲン」は、素因のある、特に遺伝的に素因のある個体(アトピー性)患者において、lgE抗体の生成を導き出す物質、通常巨大分子又はタンパク質性組成物と規定される。類似の定義は、Liebers等(1996) Clin. Exp. Allergy 26、494～516頁で提供される。
用語「治療的有効量」は、患者で所望の治療的又は予防的効果をもたらす本発明のペプチド又はその誘導体の量を指す。例えば、疾患又は障害に関して、それは、疾患又は障害の1つ又は複数の症状をある程度低減する量、特に、疾患又は障害に関連するかそれを引き起こす生理的又は生化学的パラメータを部分的又は完全に正常に戻す量である。一般的に、治療的有効量は、正常な生理的状況の改善又は復旧へ導く、本発明のペプチド又はその誘導体の量である。例えば、免疫障害によって侵された哺乳動物を治療的に処置するために使用される場合、それは前記哺乳動物の体重1kgあたりの1日量のペプチドである。或いは、投与が遺伝子療法による場合、裸のDNA又はウイルスベクターの量は、本発明のペプチド、その誘導体又は相同体の妥当な投薬量の局所生成を確実にするように調整される。
ペプチドを指す場合の用語「天然」は、配列が天然に存在するタンパク質(野生型又は突然変異体)の断片と同一であるという事実に関する。それと対照的に、用語「人工」は、そのように天然に存在しない配列を指す。人工配列は、限定的な改変、例えば天然に存在する配列の中で1つ又は複数のアミノ酸を変更/削除/挿入することによって、又は、天然に存在する配列のN-若しくはC末端でアミノ酸を付加/除去することによって天然配列から得られる。
これに関連して、ペプチド断片は、一般的にエピトープスキャニングとの関連で抗原から生成されると理解される。偶然の一致により、そのようなペプチドは、それらの配列にT細胞エピトープ(MHCクラスIIエピトープ又はCD1d結合性エピトープ)を、及びそれらに近接して本明細書に規定される改変された酸化還元モチーフを有する配列を含むことができる。或いは、前記エピトープと前記酸化還元酵素モチーフの間に多くても11アミノ酸、多くても7アミノ酸、多くても4アミノ酸、多くても2アミノ酸のアミノ酸配列が存在してもよいか、又は、0アミノ酸であってもよい(言い換えると、エピトープ及び酸化還元酵素モチーフ配列は互いに直近している)。好ましい実施形態では、そのような天然に存在するペプチドは否定される。
本明細書では、アミノ酸はそれらのフルネーム、それらの3文字略記号又はそれらの1文字略記号で呼ばれる。
本明細書では、アミノ酸配列のモチーフは、Prositeのフォーマットに従って書かれる。モチーフは、配列の特異的部分でのある特定の配列多様性を記載するために使用される。記号X又はBは、任意のアミノ酸が受け入れられる位置のために使用される。記号(Z1)+、(Z2)+及び(Z3)+は、本明細書の他の場所で規定される通り任意の塩基性アミノ酸が受け入れられる位置のために使用される。角括弧(「[]」)の間に所与の位置のための許容されるアミノ酸を掲載することによって、代わりのアミノ酸を指示することができる。例えば、[CST]は、Cys、Ser又はThrから選択されるアミノ酸を表す。代替物として排除されるアミノ酸は、中括弧(「{}」)の間にそれらを掲載することによって指示することができる。例えば、{AM}は、Ala及びMet以外の任意のアミノ酸を表す。必要に応じてモチーフの中の異なる要素は、ハイフン(-)によって互いから分離される。アミノ酸を区別するために、酸化還元酵素モチーフの外側のものは外部アミノ酸と呼ぶことができ、酸化還元モチーフの中のものは内部アミノ酸と呼ばれる。
T細胞エピトープ、例えばMHCクラスII T細胞エピトープ又はNKT細胞エピトープ(又は、CD1d結合性ペプチドエピトープ)及び還元活性を有する改変されたペプチドモチーフ配列を含むペプチドは、抗原提示細胞への抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞、細胞溶解性NKT細胞の集団をそれぞれ生成することが可能である。
したがって、その最も広い意味で、本発明は、免疫反応を誘発する能力を有する抗原(自己又は非自己)の少なくとも1つのT細胞エピトープ(MHCクラスII T細胞エピトープ又はNKT細胞エピトープ)、及びペプチドジスルフィド結合への還元活性を有する改変されたチオレダクターゼ配列モチーフを含むペプチドに関する。T細胞エピトープ及び改変された酸化還元モチーフ配列はペプチドの中で互いに直近していることができるか、又は必要に応じて1つ又は複数のアミノ酸(いわゆる、リンカー配列)によって分離されてもよい。必要に応じて、ペプチドはエンドソーム標的配列及び/又は追加の「隣接」配列を更に含む。本発明のペプチドは、免疫反応を誘発する能力を有する抗原(自己又は非自己)のT細胞エピトープ及び改変された酸化還元モチーフを含む。ペプチドの中のモチーフ配列の還元活性は、例えばインスリンの溶解性が還元後に変更されるインスリン溶解性アッセイで、又はインスリン等の蛍光標識基質によって、スルフヒドリル基を還元するその能力について検査することができる。そのようなアッセイの例は蛍光ペプチドを使用し、Tomazzolli等(2006) Anal. Biochem.350、105～112頁に記載される。FITC標識を有する2つのペプチドは、それらがジスルフィド架橋を通して互いと共有結合するときに自己失活する。本発明によるペプチドによる還元の結果、還元された個々のペプチドは再び蛍光性になる。
改変された酸化還元モチーフは、T細胞エピトープのアミノ末端側に、又はT細胞エピトープのカルボキシ末端に配置することができる。
還元活性を有するペプチド断片は、グルタレドキシン、ヌクレオレドキシン、チオレドキシン及び他のチオール/ジスルフィド酸化還元酵素を含む小さいジスルフィド還元酵素であるチオレダクターゼで遭遇する(Holmgren (2000) Antioxid. Redox Signal. 2、811～820頁; Jacquot等(2002) Biochem. Pharm. 64、1065～1069頁)。それらは多官能価で、遍在し、多くの原核生物及び真核生物で見出される。それらは、例えばFomenko等((2003) Biochemistry 42、11214～11225頁; Fomenko等(2002) Prot. Science 11、2285～2296頁)、式中Xは任意のアミノ酸を表し、及びWO2008/017517から周知であり、1位及び/又は4位にシステインを含んでいる、保存された活性ドメインコンセンサス配列の中の酸化還元活性システインを通して、タンパク質(酵素等)の上でジスルフィド結合のための還元活性を発揮することが知られている。したがって、モチーフはCXX[CST]又は[CST]XXCである。そのよう等メインはより大きなタンパク質、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)及びホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼCでも見出される。本発明は、より多くの効力及び活性を求めて、前記モチーフを再設計した。
更に詳細に説明されるように、本発明のペプチドは、非天然アミノ酸の組込みを可能にする化学的合成によって作製することができる。したがって、上記の酸化還元改変酸化還元モチーフ中の「C」は、システイン又はチオール基を有する別のアミノ酸、例えばメルカプトバリン、ホモシステイン、又はチオール官能基を有する他の天然若しくは非天然アミノ酸を表す。還元活性を有するために、改変された酸化還元モチーフに存在するシステインは、シスチンジスルフィド架橋の一部として存在するべきでない。それにもかかわらず、酸化還元改変酸化還元モチーフは改変されたシステイン、例えばメチル化システインを含むことができ、それはin vivoで遊離のチオール基を有するシステインに変換される。
ペプチドは、安定性又は溶解性を増加させるために、N末端のNH2基又はC末端のCOOH基の改変(例えばCONH2基へのCOOHの改変)等の改変を更に含むことができる。
改変された酸化還元モチーフを含む本発明のペプチドでは、モチーフは、エピトープがMHC溝にフィットするかCD1d受容体に結合する場合、モチーフがMHC又はCD1d受容体結合溝の外側に留まるように位置する。改変された酸化還元モチーフは、ペプチドの中のエピトープ配列の直近に[言い換えると、モチーフとエピトープの間のゼロアミノ酸のリンカー配列]置かれるか、又は、7アミノ酸以下のアミノ酸配列を含むリンカーによってT細胞エピトープから分離される。特に、リンカーは1、2、3、4、5、6又は7アミノ酸を含む。具体的な実施形態は、エピトープ配列と改変された酸化還元モチーフ配列の間に0、1又は2アミノ酸のリンカーを有するペプチドである。ペプチドリンカーの他に、ペプチドの部分を互いに(例えば改変された酸化還元モチーフ配列とT細胞エピトープ配列を)連結するリンカーとして、他の有機化合物を使用することができる。
本発明のペプチドは、T細胞エピトープ及び改変された酸化還元モチーフを含む配列のN又はC末端に、追加の短いアミノ酸配列を更に含むことができる。そのようなアミノ酸配列は、本明細書では「隣接配列」と一般的に呼ばれる。隣接配列は、エピトープとエンドソーム標的配列の間に、及び/又は改変された酸化還元モチーフとエンドソーム標的配列の間に配置することができる。エンドソーム標的配列を含まないある特定のペプチドでは、ペプチド中の改変された酸化還元モチーフ及び/又はエピトープ配列のN及び/又はC末端に短いアミノ酸配列が存在してもよい。特に隣接配列は、1～7アミノ酸の配列、特に2アミノ酸の配列である。
改変された酸化還元モチーフは、エピトープのN末端側に配置することができる。或いは、改変された酸化還元モチーフは、エピトープのC末端側に配置することができる。
本発明のある特定の実施形態では、1つのエピトープ配列及び改変された酸化還元モチーフ配列を含むペプチドが提供される。更なる特定の実施形態では、改変された酸化還元モチーフは、ペプチドの中で例えば互いから1つ又は複数のアミノ酸の間隔で配置することができる改変された酸化還元モチーフの反復配列として、又は互いに直近の反復配列として、数回(1、2、3、4回又はそれ以上も)出現する。或いは、1つ又は複数の改変された酸化還元モチーフは、T細胞エピトープ配列のN及びC末端の両方で提供される。
本発明のペプチドのために想定される他の変形形態には、T細胞エピトープ配列の反復配列を含有するペプチドが含まれ、ここで、各エピトープ配列の前及び/又は後には改変された酸化還元モチーフがある(例えば「改変された酸化還元モチーフ-エピトープ」の反復配列又は「改変された酸化還元モチーフ-エピトープ-改変された酸化還元モチーフ」の反復配列)。本明細書では、改変された酸化還元モチーフは全て同じ配列を有することができるが、これは義務的でない。それ自体改変された酸化還元モチーフを含むエピトープを含むペプチドの反復配列は、「エピトープ」及び「改変された酸化還元モチーフ」の両方を含む配列をももたらすことに注意する。そのようなペプチドでは、1つのエピトープ配列の中の改変された酸化還元モチーフは、第2のエピトープ配列の外で改変された酸化還元モチーフとして機能する。
一般的に、本発明のペプチドは、1つのT細胞エピトープだけを含む。下記のように、タンパク質配列中のT細胞エピトープは、機能的アッセイ及び/又は1つ又は複数のin silica予測アッセイによって同定することができる。T細胞エピトープ配列中のアミノ酸は、MHCタンパク質の結合溝におけるそれらの位置によって番号付けされる。ペプチド中に存在するT細胞エピトープは、7～30アミノ酸、例えば8～25アミノ酸、特に8～16アミノ酸からなり、特に8、9、10、11、12、13、14、15又は16アミノ酸からなる。
より特定の実施形態では、T細胞エピトープは7、8又は9アミノ酸の配列からなる。更なる特定の実施形態では、T細胞エピトープは、MHC-クラスII分子[MHCクラスII制限T細胞エピトープ]によってT細胞に提示されるエピトープである。一般的に、T細胞エピトープ配列はMHC IIタンパク質の裂け目にフィットするオクタペプチドを、又はより具体的にはノナペプチド配列を指す。
より特定の実施形態では、T細胞エピトープは7、8又は9アミノ酸の配列からなる。更なる特定の実施形態では、T細胞エピトープはCD1d分子[NKT細胞エピトープ]によって提示されるエピトープである。一般的に、NKT細胞エピトープ配列はCD1dタンパク質に結合し、それによって提示される、7アミノ酸のペプチド配列を指す。
本発明のペプチドのT細胞エピトープは、タンパク質の天然のエピトープ配列に対応することができるか、又は、天然のT細胞エピトープ配列と同様に改変されたT細胞エピトープがMHC裂け目内で結合するか又はCD1d受容体に結合するその能力を保持する場合には、その改変バージョンであってもよい。改変されたT細胞エピトープは、MHCタンパク質又はCD1d受容体に対して天然のエピトープと同じ結合親和性を有することができるが、より低い親和性を有することもできる。特に、改変されたペプチドの結合親和性は、元のペプチドより10分の1以上、特に5分の1以上低い。本発明のペプチドは、タンパク質複合体に安定化効果を有する。したがって、ペプチド-MHC又はCD1d複合体の安定化効果は、MHC又はCD1d分子への改変されたエピトープのより低い親和性を補償する。
ペプチドの中にT細胞エピトープ及び還元性化合物を含む配列は、MHCクラスII決定因子の中でのプロセシング及び提示のために後期エンドソームへのペプチドの取り込みを促進するアミノ酸配列(又は、別の有機化合物)に更に連結することができる。後期エンドソーム標的化はタンパク質の細胞質テールに存在するシグナルによって媒介され、良好に同定されたペプチドモチーフに対応する。後期エンドソーム標的配列は、MHCクラスII分子による抗原由来のT細胞エピトープのプロセシング及び効率的な提示を可能にする。そのようなエンドソーム標的化配列は、例えば、gp75タンパク質(Vijayasaradhi等(1995) J. Cell. Biol. 130、807～820頁)、ヒトCD3ガンマタンパク質、HLA-BM 11(Copier等(1996) J. lmmunol. 157、1017～1027頁)、DEC205受容体の細胞質テール(Mahnke等(2000) J. Cell Biol.151、673～683頁)の中に含有される。エンドソームへの選別シグナルとして機能するペプチドの他の例は、Bonifacio及びTraub(2003) Annu. Rev. Biochem. 72、395～447頁のレビューの中で開示される。或いは、配列は、抗原に対するT細胞応答を克服することなく後期エンドソームでの取り込みを促進する、タンパク質からの亜優勢又は劣勢なT細胞エピトープのそれであってよい。後期エンドソーム標的化配列は、効率的な取り込み及びプロセシングのために抗原由来のペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端に位置することができ、最高10アミノ酸のペプチド配列等の隣接配列を通してカップリングさせることもできる。標的化目的のために劣勢なT細胞エピトープを使用する場合、後者は抗原由来のペプチドのアミノ末端に一般的に位置する。
或いは、本発明は、CD1d分子に結合する能力を付与する疎水性残基を含有するペプチドの生成に関する。投与の後、そのようなペプチドはAPCによって取り込まれ、後期エンドソームに誘導され、そこで、それらはCD1dにロードされ、APCの表面で提示される。前記疎水性ペプチドは一般配列[FW]-xx-[ILM]-xx[FWTH]又は[FWTH]-xx-[ILM]-xx-[FW]に対応するモチーフによって特徴付けられ、そこでは、位置P1及びP7はフェニルアラニン(F)又はトリプトファン(W)等の疎水性残基によって占有される。しかし、P7は、それがフェニルアラニン又はトリプトファンの代わりの疎水性残基、例えばトレオニン(T)又はヒスチジン(H)を受け入れるという点で許容的である。P4の位置は、イソロイシン(I)、ロイシン(L)又はメチオニン(M)等の脂肪族残基によって占有される。本発明は、CD1d結合モチーフを天然に構成する疎水性残基で構成されるペプチドに関する。一部の実施形態では、前記モチーフのアミノ酸残基は、15 CD1dに結合する能力を増加させる残基による置換によって通常改変される。具体的な実施形態では、モチーフは一般モチーフ[FW]-xx-[ILM]-xx-[FWTH]により緊密にフィットするように改変される。特に、ペプチドは7位にF又はWを含有するように生成される。
したがって、本発明は、抗原性タンパク質のペプチド及び特異的免疫反応を導き出すことにおけるそれらの使用を想定する。これらのペプチドは、それらの配列の中に、すなわち、多くても10、好ましくは7アミノ酸以下で分離されている還元性化合物及びT細胞エピトープを含む、タンパク質の断片に対応することもできる。或いは、及びほとんどの抗原性タンパク質では、本発明のペプチドは、還元性化合物、特に本明細書に記載される還元性の改変された酸化還元モチーフを、抗原性タンパク質のT細胞エピトープのN末端又はC末端に結合させることによって生成される(それの直近に、又は多くても10、特に多くても7アミノ酸のリンカーにより)。更に、タンパク質のT細胞エピトープ配列及び/又は改変された酸化還元モチーフを改変することができ、及び/又は、天然に存在する配列と比較して、1つ又は複数の隣接配列及び/又は標的配列を導入すること(又は、改変すること)ができる。したがって、本発明の特色を目的の抗原性タンパク質の配列の中で見出すことができるかどうかによって、本発明のペプチドは「人工の」又は「天然に存在する」配列を含むことができる。
本発明のペプチドは、長さがかなり異なることができる。ペプチドの長さは、すなわち8～9アミノ酸のエピトープ、それに隣接したヒスチジンを有する改変された酸化還元モチーフ5アミノ酸からなる13又は14アミノ酸から、最高20、25、30、40又は50アミノ酸まで異なることができる。例えば、ペプチドは、40アミノ酸のエンドソーム標的配列、約2アミノ酸の隣接配列、5アミノ酸の本明細書に記載されるモチーフ、4アミノ酸のリンカー及び9アミノ酸のT細胞エピトープペプチドを含むことができる。
したがって、特定の実施形態では、完全なペプチドは、13アミノ酸から最高20、25、30、40、50、75又は100アミノ酸からなる。特に、還元性化合物が本明細書に記載される改変された酸化還元モチーフである場合、エンドソーム標的化配列がない、リンカーによって必要に応じて連結されるエピトープ及び改変された酸化還元モチーフを含む(人工又は天然の)配列(本明細書では「エピトープ-改変酸化還元モチーフ」配列と呼ばれる)の長さは重大である。「エピトープ-改変酸化還元モチーフ」は、13、14、15、16、17、18又は19アミノ酸の長さを特に有する。13又は14～19アミノ酸のそのようなペプチドは、サイズがより重大でないエンドソーム標的化シグナルに必要に応じてカップリングさせることができる。
上で詳述されるように、特定の実施形態では、本発明のペプチドは、T細胞エピトープ配列に連結された本明細書に記載される還元性の改変された酸化還元モチーフを含む。
更なる特定の実施形態では、本発明のペプチドは、それらの天然の配列の中に酸化還元特性を有するアミノ酸配列を含まないT細胞エピトープを含むペプチドである。
しかし、代わりの実施形態では、T細胞エピトープは、MHC裂け目への又はCD1d分子へのエピトープの結合を確実にするアミノ酸の任意の配列を含むことができる。抗原性タンパク質の目的のエピトープがそのエピトープ配列の中に本明細書に記載されるもの等の改変された酸化還元モチーフを含む場合、本発明による免疫原性ペプチドは、本明細書に記載される改変された酸化還元モチーフの配列、及び/又は、(裂け目の中に埋没する、エピトープの中に存在する改変された酸化還元モチーフに反して)付着している改変された酸化還元モチーフが還元活性を確保することができるように、エピトープ配列のN-又はC-末端にカップリングされた別の還元性配列の配列を含む。
したがって、T細胞エピトープ及びモチーフは、互いと直近しているか又は分離して重複していない。「直近している」又は「分離している」の概念を調査するために、MHC裂け目又はCD1d分子にフィットする8又は9アミノ酸の配列を決定し、このオクタペプチド又はノナペプチドと、酸化還元モチーフテトラペプチド又はヒスチジンを含む改変された酸化還元モチーフペンタペプチドの間の距離を決定する。
一般的に、本発明のペプチドは天然でなく(したがって、そのようなタンパク質の断片がない)、T細胞エピトープに加えて本明細書に記載される改変された酸化還元モチーフを含有する人工ペプチドであり、それによって、改変された酸化還元モチーフは最高7つ、特に最高4つ又は最高2つのアミノ酸からなるリンカーによってT細胞エピトープの近くに分離される。
酸化還元酵素モチーフ及びMHCクラスII T細胞エピトープを含むペプチド(又は、そのようなペプチドを含む組成物)の哺乳動物への投与(すなわち注射)の後、ペプチドは抗原由来のT細胞エピトープを認識するT細胞の活性化を導き出し、表面受容体の還元を通してT細胞に追加のシグナルを提供することが示された。この最適以上の活性化の結果、T細胞はT細胞エピトープを提示する細胞のための細胞溶解特性並びに第三者T細胞への抑制特性を獲得する。
更に、酸化還元酵素モチーフ及びNKT細胞エピトープを含むペプチド(又は、そのようなペプチドを含む組成物)の哺乳動物への投与(すなわち注射)の後、ペプチドは抗原由来のT細胞エピトープを認識するT細胞の活性化を導き出し、CD1d表面受容体への結合を通してT細胞に追加のシグナルを提供することが示された。この活性化の結果、NKT細胞はT細胞エピトープを提示する細胞のための細胞溶解特性を獲得する。
このように、抗原由来のT細胞エピトープ及びエピトープ以外に改変された酸化還元モチーフを含有する、本発明に記載されるペプチド又はペプチドを含む組成物は、ヒトを含む哺乳動物の直接的な免疫化のために使用することができる。したがって、本発明は医薬品用として本発明のペプチド又はその誘導体を提供する。したがって、本発明は、それを必要とする患者に本発明による1つ又は複数のペプチドを投与することを含む治療方法を提供する。
本発明は、細胞溶解特性を与えられる抗原特異的T細胞を小ペプチドによる免疫化によって導き出すことができる方法を提供する。(i)抗原からのT細胞エピトープをコードする配列、及び(ii)酸化還元特性を有するコンセンサス配列を含有し、必要に応じて効率的なMHCクラスII提示又はCD1d受容体結合のために後期エンドソームへのペプチドの取り込みを促進する配列も更に含むペプチドは、細胞溶解性CD4+ T細胞又はNKT細胞をそれぞれ導き出すことが見出された。
本発明のペプチドの免疫原特性は、免疫反応の処置及び予防で特に興味がある。
本明細書に記載されるペプチドは医薬として使用され、特に哺乳動物、特にヒトにおける免疫障害の予防又は処置のための医薬の製造のために使用される。
本発明は、本発明のペプチド、その相同体又は誘導体の使用による、そのような処置又は予防を必要とする哺乳動物の免疫障害の処置又は予防の方法であって、免疫障害を患っているかその危険がある前記哺乳動物に、例えば免疫障害の症状を低減するために、本発明のペプチド、その相同体又は誘導体の治療的有効量を投与する工程を含む方法を記載する。ヒト及び動物、例えばペット及び畜産動物の両方の処置が想定される。一実施形態では、処置される哺乳動物はヒトである。上で言及される免疫障害は、特定の実施形態では、アレルギー性疾患及び自己免疫性疾患から選択される。
本明細書に規定される本発明のペプチド又はそれを含む医薬組成物は、好ましくは皮下又は筋肉内投与を通して投与される。好ましくは、ペプチド又はそれを含む医薬組成物は、肘と肩の中間の上腕の側部の領域で皮下に注射する(SC)ことができる。2回以上の別個の注射が必要な場合、それらは両腕に同時投与することができる。
本発明によるペプチド又はそれを含む医薬組成物は、治療的有効用量で投与される。例示的であるが非限定的な投薬レジメンは、50～1500μg、好ましくは100～1200μgである。より具体的な投薬スキームは、患者の状態及び疾患の重症度によって50～250μg、250～450μg又は850～1300μgであってよい。投薬レジメンは、単回投与又は2、3、4、5若しくはそれより多い回数の同時又は連続投与での投与を含むことができる。例示的な非限定的投薬スキームは、以下の通りである:
- 各々25μg(各々100μL)の2回の別個の注射による50μgのペプチドのSC投与と、続く各々12.5μg(各々50μL)の2回の別個の注射による25μgのペプチドの3回の連続注射を含む低用量スキーム。
- 各々75μg(各々300μL)の2回の別個の注射による150μgのペプチドのSC投与と、続く各々37.5μg(各々150μL)の2回の別個の注射による75μgのペプチドの3回の連続投与を含む中間用量スキーム。
- 各々225μg(各々900μL)の2回の別個の注射による450μgのペプチドのSC投与と、続く各々112.5μg(各々450μL)の2回の別個の注射による225μgのペプチドの3回の連続投与を含む高用量スキーム。
公知の酸化還元酵素モチーフ及びT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの例示的な用量スキームは、ClinicalTrials.govにおいて識別子NCT03272269の下で見出すことができる。
本発明は、必要に応じて0～7アミノ酸のリンカーによって分離される、向上した酸化還元酵素モチーフ及び抗原性タンパク質のT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドを提供する。
前記向上した酸化還元酵素モチーフは:
(i)[CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
(式中、(Z1)+はHでもRでもない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である);
(ii)[CST]X(Z2)+C; CX(Z2)+[CST];(Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
(式中、(Z2)+はHでない塩基性アミノ酸であり;
Xは任意のアミノ酸であり;
(B1)は任意のアミノ酸であり、nは0～3の整数である);又は
(iii)[CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
(式中、(Z3)+は塩基性アミノ酸であり、
Xは任意のアミノ酸であり;
(B2)は任意のアミノ酸でありmは0～3の整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
を含む群から選択される。
好ましくは、前記Xは以下からなる群から選択される: G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K及びR、H又は以下からなる群から選択される非天然の塩基性アミノ酸:
・リジン変異体、例えばFmoc-β-Lys(Boc)-OH (CAS番号219967-68-7)、L-オルニチン又はオルニチンとも呼ばれるFmoc-Orn(Boc)-OH (CAS番号109425-55-0)、Fmoc-β-Homolys(Boc)-OH (CAS番号203854-47-1)、Fmoc-Dap(Boc)-OH (CAS番号162558-25-0)又はFmoc-Lys(Boc)OH(DiMe)-OH (CAS番号441020-33-3);
・チロシン/フェニルアラニン変異体、例えばFmoc-L-3Pal-OH (CAS番号175453-07-3)、Fmoc-β-HomoPhe(CN)-OH (CAS番号270065-87-7)、Fmoc-L-β-HomoAla(4-ピリジル)-OH (CAS番号270065-69-5)又はFmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH (CAS番号174132-31-1);
・プロリン変異体、例えばFmoc-Pro(4-NHBoc)-OH (CAS番号221352-74-5)又はFmoc-Hyp(tBu)-OH (CAS番号122996-47-8);
・アルギニン変異体、例えばFmoc-β-Homoarg(Pmc)-OH (CAS番号700377-76-0)。
好ましい実施形態では、(Z1)+は、K、R又は非天然の塩基性アミノ酸を含む群から選択され、並びに/又は(Z2)+及び/又は(Z3)+は、以下を含む群から各々個々に選択される: K、H、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸。好ましい実施形態では、(Z1)+、(Z2)+及び/又は(Z3)+は、各々個々にK又はL-オルニチンであってよい。
好ましい実施形態では、XはC、S又はT以外の任意のアミノ酸である。
一部の実施形態では、B1及び/又はB2はHである。
一部の実施形態では、Xは塩基性アミノ酸以外の任意のアミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST](Z1)+XC又はC(Z1)+X[CST](式中、Xはチロシン(Y)である)であり、例えば、C(Z1)+YC、S(Z1)+YC、T(Z1)+YC、C(Z1)+YC、C(Z1)+YS、C(Z1)+YTである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z1)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z1)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST](式中、Xはプロリン(P)である)であり、例えば、CP(Z2)+C、SP(Z2)+C、TP(Z2)+C、CP(Z2)+C、CP(Z2)+S、CP(Z2)+Tである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST](Z1)+XC又はC(Z1)+X[CST](式中、Xはグリシン(G)である)であり、例えば、C(Z1)+GC、S(Z1)+GC、T(Z1)+GC、C(Z1)+GC、C(Z1)+GS、C(Z1)+GTである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z1)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z1)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST](式中、Xはヒスチジン(H)である)であり、例えば、CH(Z2)+C、SH(Z2)+C、Th(Z2)+C、CH(Z2)+C、CH(Z2)+S、CH(Z2)+Tである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST](Z1)+XC又はC(Z1)+X[CST](式中、Xはプロリン(P)である)であり、例えば、C(Z1)+PC、S(Z1)+PC、T(Z1)+PC、C(Z1)+PC、C(Z1)+PS、C(Z1)+PTである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z1)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z1)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST](式中、Xはグリシン(G)である)であり、例えば、CG(Z2)+C、SG(Z2)+C、TG(Z2)+C、CG(Z2)+C、CG(Z2)+S、CG(Z2)+Tである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST](Z1)+XC又はC(Z1)+X[CST](式中、Xはプロリン(P)である)であり、例えば、C(Z1)+PC、S(Z1)+PC、T(Z1)+PC、C(Z1)+PC、C(Z1)+PS、C(Z1)+PTである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z1)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z1)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST](Z1)+XC又はC(Z1)+X[CST](式中、Xはフェニルアラニン(F)である)であり、例えば、C(Z1)+FC、S(Z1)+FC、T(Z1)+FC、C(Z1)+FC、C(Z1)+FS、C(Z1)+FTである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z1)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z1)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST](Z1)+XC又はC(Z1)+X[CST](式中、Xはヒスチジン(H)である)であり、例えば、C(Z1)+HC、S(Z1)+HC、T(Z1)+HC、C(Z1)+HC、C(Z1)+HS、C(Z1)+HTである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z1)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z1)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST](式中、Xはアルギニン(R)である)であり、例えば、CR(Z2)+C、Sr(Z2)+C、TR(Z2)+C、CR(Z2)+C、CR(Z2)+S、CR(Z2)+Tである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST](Z1)+XC又はC(Z1)+X[CST](式中、Xはロイシン(L)である)であり、例えば、C(Z1)+LC、S(Z1)+LC、T(Z1)+LC、C(Z1)+LC、C(Z1)+LS、C(Z1)+LTである。前記モチーフのいずれか一つでは、(Z1)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでなく、及び/又は好ましくはRでない。具体例では、(Z1)+はK又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは(Z2)+(B1)n[CST]PYC又は(Z2)+(B1)nCPY[CST]、例えば(Z2)+(B1)nCPYC、(Z2)+(B1)nSPYC、(Z2)+(B1)nTPYC、(Z2)+(B1)nCPYC(Z2)+(B1)nCPYS又は(Z2)+(B1)nCPYTである。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B1)は任意のアミノ酸、好ましくはHであってよく、或いは塩基性アミノ酸でなく、nは0～3までの整数である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは(Z2)+(B1)n[CST]HGC又は(Z2)+(B1)nCHG[CST]、例えば(Z2)+(B1)nCHGC、(Z2)+(B1)nSHGC、(Z2)+(B1)nTHGC、(Z2)+(B1)nCHGC(Z2)+(B1)nCHGS又は(Z2)+(B1)nCHGTである。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B1)は任意のアミノ酸、好ましくはHであってよく、或いは塩基性アミノ酸でなく、nは0～3までの整数である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは(Z2)+(B1)n[CST]GPC又は(Z2)+(B1)nCGP[CST]、例えば(Z2)+(B1)nCGPC、(Z2)+(B1)nSGPC、(Z2)+(B1)nTGPC、(Z2)+(B1)nCGPC、(Z2)+(B1)nCGPS又は(Z2)+(B1)nCGPTである。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B1)は任意のアミノ酸、好ましくはHであってよく、或いは塩基性アミノ酸でなく、nは0～3までの整数である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは(Z2)+(B1)n[CST]GHC又は(Z2)+(B1)nCGH[CST]、例えば(Z2)+(B1)nCGHC、(Z2)+(B1)nSGHC、(Z2)+(B1)nTGHC、(Z2)+(B1)nCGHC、(Z2)+(B1)nCGHS又は(Z2)+(B1)nCGHTである。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B1)は任意のアミノ酸、好ましくはHであってよく、或いは塩基性アミノ酸でなく、nは0～3までの整数である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは(Z2)+(B1)n[CST]GFC又は(Z2)+(B1)nCGF[CST]、例えば(Z2)+(B1)nCGFC、(Z2)+(B1)nSGFC、(Z2)+(B1)nTGFC、(Z2)+(B1)nCGFC、(Z2)+(B1)nCGFS又は(Z2)+(B1)nCGFTである。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B1)は任意のアミノ酸、好ましくはHであってよく、或いは塩基性アミノ酸でなく、nは0～3までの整数である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは(Z2)+(B1)n[CST]RLC又は(Z2)+(B1)nCRL[CST]、例えば(Z2)+(B1)nCRLC、(Z2)+(B1)nSRLC、(Z2)+(B1)nTRLC、(Z2)+(B1)nCRLC、(Z2)+(B1)nCRLS又は(Z2)+(B1)nCRLTである。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B1)は任意のアミノ酸、好ましくはHであってよく、或いは塩基性アミノ酸でなく、nは0～3までの整数である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは(Z2)+(B1)n[CST]HPC又は(Z2)+(B1)nCHP[CST]、例えば(Z2)+(B1)nCHPC、(Z2)+(B1)nSHPC、(Z2)+(B1)nTHPC、(Z2)+(B1)nCHPC、(Z2)+(B1)nCHPS又は(Z2)+(B1)nCHPTである。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B1)は任意のアミノ酸、好ましくはHであってよく、或いは塩基性アミノ酸でなく、nは0～3までの整数である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは(Z2)+(B1)n[CST]HGC又は(Z2)+(B1)nCHG[CST]、例えば(Z2)+(B1)nCHGC、(Z2)+(B1)nSHGC、(Z2)+(B1)nTHGC、(Z2)+(B1)nCHGCS、(Z2)+(B1)nCHGS又は(Z2)+(B1)nCHGTである。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z2)+は任意の塩基性アミノ酸であってよく、好ましくはHでない。具体例では、(Z2)+はK、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B1)は任意のアミノ酸、好ましくはHであってよく、或いは塩基性アミノ酸でなく、nは0～3までの整数である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]PYC(B2)m(Z3)+又はCPY[CST](B2)m(Z3)+、例えばCPYC(B2)m(Z3)+、SPYC(B2)m(Z3)+、TPYC(B2)m(Z3)+、CPYC(B2)m(Z3)+、CPYS(B2)m(Z3)+又はCPYT(B2)m(Z3)+である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z3)+は任意の塩基性アミノ酸であってよい。具体例では、(Z3)+はH、K、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B2)は任意のアミノ酸、好ましくはHであり、或いは塩基性アミノ酸でなく、mは0～3までの整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]HGC(B2)m(Z3)+又はCHG[CST](B2)m(Z3)+、例えばCHGC(B2)m(Z3) 、SHGC(B2)m(Z3)+、THGC(B2)m(Z3)+、CHGCS(B2)m(Z3)+、CHG(B2)m(Z3)+又はCHGT(B2)m(Z3)+である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z3)+は任意の塩基性アミノ酸であってよい。具体例では、(Z3)+はH、K、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B2)は任意のアミノ酸、好ましくはHであり、或いは塩基性アミノ酸でなく、mは0～3までの整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]GPC(B2)m(Z3)+又はCGP[CST](B2)m(Z3)+、例えばCGPC(B2)m(Z3)+、SGPC(B2)m(Z3)+、TGPC(B2)m(Z3)+、CGPC(B2)m(Z3)+、CGPS(B2)m(Z3)+又はCGPT(B2)m(Z3)+である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z3)+は任意の塩基性アミノ酸であってよい。具体例では、(Z3)+はH、K、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B2)は任意のアミノ酸、好ましくはHであり、或いは塩基性アミノ酸でなく、mは0～3までの整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]GHC(B2)m(Z3)+又はCGH[CST](B2)m(Z3)+、例えばCGHC(B2)m(Z3)+、SGHC(B2)m(Z3)+、TGHC(B2)m(Z3)+、CGHC(B2)m(Z3)+、CGHS(B2)m(Z3)+又はCGHT(B2)m(Z3)+である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z3)+は任意の塩基性アミノ酸であってよい。具体例では、(Z3)+はH、K、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B2)は任意のアミノ酸、好ましくはHであり、或いは塩基性アミノ酸でなく、mは0～3までの整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]GFC(B2)m(Z3)+又はCGF[CST](B2)m(Z3)+、例えばCGFC(B2)m(Z3)+、SGFC(B2)m(Z3)+、TGFC(B2)m(Z3)+、CGFC(B2)m(Z3)+、CGFS(B2)m(Z3)+又はCGFT(B2)m(Z3)+である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z3)+は任意の塩基性アミノ酸であってよい。具体例では、(Z3)+はH、K、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B2)は任意のアミノ酸、好ましくはHであり、或いは塩基性アミノ酸でなく、mは0～3までの整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]RLC(B2)m(Z3)+又はCRL[CST](B2)m(Z3)+、例えばCRLC(B2)m(Z3)+、SRLC(B2)m(Z3)+、TRLC(B2)m(Z3)+、CRLC(B2)m(Z3)+、CRLS(B2)m(Z3)+又はCRLT(B2)m(Z3)+である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z3)+は任意の塩基性アミノ酸であってよい。具体例では、(Z3)+はH、K、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B2)は任意のアミノ酸、好ましくはHであり、或いは塩基性アミノ酸でなく、mは0～3までの整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である。
好ましい実施形態では、前記酸化還元酵素モチーフは[CST]HPC(B2)m(Z3)+又はCHP[CST](B2)m(Z3)+、例えばCHPC(B2)m(Z3)+、SHPC(B2)m(Z3)+、THPC(B2)m(Z3)+、CHPC(B2)m(Z3)+、CHPS(B2)m(Z3)+又はCHPT(B2)m(Z3)+である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(Z3)+は任意の塩基性アミノ酸であってよい。具体例では、(Z3)+はH、K、R又は本明細書に規定される非天然の塩基性アミノ酸である。これらのモチーフのいずれか一つでは、(B2)は任意のアミノ酸、好ましくはHであり、或いは塩基性アミノ酸でなく、mは0～3までの整数であるが、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である。
上で開示される前記例示的な酸化還元酵素モチーフの好ましい実施形態では、B1及び/又はB2はHである。
この態様の特に好ましい例は、以下の酸化還元酵素モチーフの1つを含む:
KCXXC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはRCPYC、RCGHC又はRCHGCである;
KCXXC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはKCPYC、KCGHC又はKCHGCである;
KHCXXC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはRHCPYC、RHCGHC又はRHCHGCである;
KRCXXC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはKHCPYC、KHCGHC又はKHCHGCである;
CXRC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCGRC、CPRC、CHRCである;
CXKC、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCGKC、CPKC、CHKCである;
CXXCK、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCHGCK、CPYCK、CGHCKである;
CXXCHK、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCHGCHK、CPYCHK、CGHCHKである;
CXXCR、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCHGCR、CPYCR、CGHCRである;
CXXCHR、式中、Xは任意のアミノ酸、好ましくはCHGCHR、CPYCHR、CGHCHRである;
KCKXC、RCKXC、KCRXC又はRCRXC、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXKC、RCXKC、KCXRC又はRCXRC、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCKXCK、RCKXCK、KCRXCK、KCKXCR、RCRXCK、RCKXCR、KCRXCR又はRCRXCR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCKXCHK、RCKXCHK、KCRXCHK、KCKXCHR、RCRXCHK、RCKXCHR、KCRXCHR又はRCRXCHR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXXCK、KCXXCR、RCXXCK又はRCXXCR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXXCHK、KCXXCHR、RCXXCHK、RCXXCHR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXKCK、RCXKCK、KCXRCK、KCXKCR、RCXRCK、RCXKCR、KCXRCR又はRCXRCR、式中、Xは任意のアミノ酸である
KCXKCHK、RCXKCHK、KCXRCHK、KCXKCHR、RCXRCHK、RCXKCHR、KCXRCHR又はRCXRCHR、式中、Xは任意のアミノ酸である。
本発明のペプチドは、試料中のクラスII制限CD4+ T細胞を検出するためのin vitro診断方法で使用することもできる。この方法では、試料をMHCクラスII分子及び本発明によるペプチドの複合体と接触させる。CD4+ T細胞は、試料中の細胞と複合体の結合を測定することによって検出され、ここで、細胞への複合体の結合は試料中のCD4+ T細胞の存在の指標となる。複合体は、ペプチド及びMHCクラスII分子の融合タンパク質であってよい。或いは、複合体中のMHC分子は四量体である。複合体は可溶性分子として提供することができるか、又は担体に付着していてもよい。
本発明のペプチドは、試料中のNKT細胞を検出するためのin vitro診断方法で使用することもできる。この方法では、試料をCD1d分子及び本発明によるペプチドの複合体と接触させる。NKT細胞は、試料中の細胞と複合体の結合を測定することによって検出され、ここで、細胞への複合体の結合は試料中のNKT細胞の存在の指標となる。複合体は、ペプチド及びCD1d分子の融合タンパク質であってよい。
したがって、特定の実施形態では、本発明の処置及び予防の方法は、本明細書に記載される免疫原性ペプチドの投与を含み、ペプチドは、処置される疾患(例えば上記のもの等)で役割を果たす抗原性タンパク質のT細胞エピトープを含む。更なる特定の実施形態では、使用されるエピトープは、優勢なエピトープである。
本発明によるペプチドは、T細胞エピトープ及び改変された酸化還元モチーフが0～5アミノ酸離れているペプチドを合成することによって調製される。ある特定の実施形態では、改変された酸化還元モチーフは、タンパク質で起こるような配列状況を保存するために、エピトープ配列の外側に1つ、2つ又は3つの突然変異を導入して得ることができる。一般的に、天然配列の一部であるノナペプチドに関してP-2及びP-1、並びにP+10及びP+11のアミノ酸は、ペプチド配列で保存される。これらの隣接残基は、MHCクラスII又はCD1d分子への結合を一般的に安定させる。他の実施形態では、エピトープのN末端又はC末端の配列は、T細胞エピトープ配列を含有する抗原性タンパク質の配列に無関係である。
したがってペプチドを設計する上記の方法に基づいて、ペプチドは化学的ペプチド合成、組換え発現方法、又はより例外的な場合はタンパク分解性若しくはタンパク質の化学的断片化によって生成される。
上記の方法で生成されるペプチドは、in vitro及びin vivo方法でT細胞エピトープの存在について試験することができ、また、in vitroアッセイでそれらの還元活性について試験することができる。最終品質管理として、改変された酸化還元モチーフと一緒にペプチドの中に同様に存在するエピトープ配列を含有する、抗原を提示する抗原提示細胞のために、ペプチドがアポトーシス経路を通して細胞溶解性であるCD4+ T又はNKT細胞を生成することができるかどうか検証するin vitroアッセイで、ペプチドを試験することができる。
本発明のペプチドは、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞中で、組換えDNA技術を使用して生成することができる。ペプチドの限られた長さを考慮すれば、それらは、異なるアミノ酸を互いとカップリングさせることによってペプチドが調製される化学的ペプチド合成によって調製することができる。例えばD-アミノ酸、天然に存在しない側鎖を有するアミノ酸又はメチル化システイン等の改変された側鎖を有する天然アミノ酸を包含させるために、化学的合成が特に好適である。
化学的ペプチド合成方法はかなり記載されており、ペプチドはApplied Biosystems社等の会社及び他の会社に注文することができる。
ペプチド合成は、固相ペプチド合成(SPPS)又は反対に液相ペプチド合成として実行することができる。最も周知のSPPS方法は、t-Boc及びFmoc固相化学である。
ペプチド合成の間、いくつかの保護基が使用される。例えば、ヒドロキシル及びカルボキシル官能性はt-ブチル基によって保護され、リジン及びトリプトファンはt-Boc基によって保護され、アスパラギン、グルタミン、システイン及びヒスチジンはトリチル基によって保護され、アルギニンはpbf基によって保護される。適当である場合、そのような保護基は合成の後にペプチドの上に残されてもよい。本来Kent(Schnelzer & Kent(1992) lnt. J. Pept. Protein Res. 40、180～193頁)によって記載され、例えばTam等(2001) Biopolymers 60、194～205頁でレビューされている通り、ライゲーション戦略(2つの非保護ペプチド断片の化学選択的カップリング)を使用してペプチドを互いに連結してより長いペプチドを形成することができ、それは、SPPSの範囲を超えるタンパク質合成を達成するためのおびただしい潜在能力を提供する。100～300残基のサイズを有する多くのタンパク質は、この方法によって首尾よく合成されている。合成ペプチドは、SPPSにおける膨大な進歩のために、生化学、薬理学、神経生物学、酵素学及び分子生物学の研究分野で更に増加する重要な役割を演じ続けている。
或いは、ペプチドは、コードするヌクレオチド配列を含む適当な発現ベクターの中のこの本発明のペプチドをコードする核酸分子を使用して合成することができる。そのようなDNA分子は、自動DNAシンセサイザー及び遺伝子コードの周知のコドン-アミノ酸関係を使用して容易に調製することができる。そのようなDNA分子は、オリゴヌクレオチドプローブ及び従来のハイブリダイゼーション方法を使用して、ゲノムDNA又はcDNAとして得ることもできる。そのようなDNA分子は、DNAの発現及び細菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)、酵母細胞、動物細胞又は植物細胞等の好適な宿主でのポリペプチドの生成のために適合させた、プラスミドを含む発現ベクターに組み込むことができる。
ペプチドが治療組成物で使用するのに好適である/であるだろうかどうか決定するために、目的のペプチドの物理的及び化学的特性(例えば、溶解性、安定性)が検査される。一般的に、これは、ペプチドの配列を調整することによって最適化される。必要に応じて、当技術分野で公知である技術を使用して、合成の後にペプチドを改変する(化学的改変、例えば官能基を付加/削除する)ことができる。
標準の酸化還元酵素モチーフ及びMHCクラスII T細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの作用機構は、上で引用されたPCT出願WO2008/017517及び本発明者の刊行物で開示される実験データで立証される。標準の酸化還元酵素モチーフ及びCD1d結合性NKT細胞エピトープを含む免疫原性ペプチドの作用機構は、上で引用されたPCT出願WO2012/069568及び本発明者の刊行物で開示される実験データで立証される。
本発明は、抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞(MHCクラスIIエピトープを含む本明細書に開示される免疫原性ペプチドを使用する場合)、又は抗原特異的細胞溶解性NKT細胞(CD1d分子に結合するNKT細胞エピトープを含む本明細書に開示される免疫原性ペプチドを使用する場合)をin vivo又はin vitroで生成する方法を提供する。
本発明は、抗原特異的CD4+ T細胞又はNKT細胞の生成のためのin vivo方法を記載する。特定の実施形態は、本明細書に記載される本発明のペプチドで動物(ヒトを含む)を免疫化し、次に、免疫化された動物からCD4+ T細胞又はNKT細胞を単離することによってCD4+ T細胞又はNKT細胞を生成又は単離する方法に関する。本発明は、APCに向けた抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞又はNKT細胞の生成のためのin vitro方法を記載する。本発明は、APCに向けた抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞及びNKT細胞を生成する方法を提供する。
一実施形態では、末梢血細胞の単離、本発明による免疫原性ペプチドによるin vitroでの細胞集団の刺激、及び刺激された細胞集団の、特にIL-2の存在下での増量を含む方法が提供される。本発明による方法は、多数のCD4+ T細胞が生成され、抗原性タンパク質に特異的であるCD4+ T細胞を生成することができる(抗原特異的エピトープを含むペプチドを使用することによって)という利点を有する。
代わりの実施形態では、CD4+ T細胞はin vivoで、すなわち本明細書に記載される免疫原性ペプチドの対象への注射、及びin vivoで生成される細胞溶解性CD4+ T細胞の収集によって生成することができる。
本発明の方法によって入手できる、APCに向けた抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞は、免疫療法のための哺乳動物への投与に関して、アレルギー反応の予防及び自己免疫疾患の処置において特に興味がある。同種異系及び自原性細胞の両方の使用が想定される。
細胞溶解性CD4+ T細胞集団は、本明細書で下に記載される通りに得られる。
一実施形態では、本発明は、結果として以下を限定されずに含む活性の増加をもたらす、特異的NKT細胞を増量する方法を提供する:
(i)サイトカイン生成の増加
(ii)抗原提示細胞の接触-及び可溶性因子依存性の排除の増加。したがって、結果は、細胞内病原体、自己抗原、同種因子、アレルゲン、腫瘍細胞へのより効率的な応答、並びに移植及び遺伝子療法/遺伝子ワクチン接種で使用されるウイルスタンパク質に対する免疫応答のより効率的な抑制である。
本発明は、体液又は臓器における必要な特性を有するNKT細胞の同定にも関する。本方法は、NK1.1、CD4、NKG2D及びCD244の発現を含むそれらの表面表現型による、NKT細胞の同定を含む。細胞は次に、CD1d分子が提示することができるペプチドと規定されるNKT細胞エピトープと接触させる。細胞は次に、IL-2又はIL-15又はIL-7の存在下でin vitroで増量される。
本明細書に記載される抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞又はNKT細胞は、特に養子細胞療法で使用するための、特に急性アレルギー反応及び多発性硬化症等の自己免疫性疾患の再発の処置で使用するための医薬として使用することができる。記載される通りに生成した単離された細胞溶解性CD4+ T細胞又はNKT細胞又は細胞集団、特に抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞又はNKT細胞集団は、免疫障害の予防又は処置のための医薬の製造のために使用される。単離又は生成された細胞溶解性CD4+ T細胞又はNKT細胞を使用した処置の方法が、開示される。
WO2008/017517で説明される通り、APCに向けた細胞溶解性CD4+ T細胞は、細胞の発現特性に基づいて天然のTreg細胞から区別することができる。特に、細胞溶解性CD4 + T細胞集団は、天然のTreg細胞集団と比較して以下の特徴の1つ又は複数を実証する:
活性化の後のCD103、CTLA-4、Fasl及びICOSを含む表面マーカーの発現の増加、CD25の中間的発現、CD4、ICOS、CTLA-4、GITRの発現、及びCD127(IL7-R)の低い発現か無発現、CD27の無発現、転写リプレッサーFoxp3のではなく、転写因子T-bet及びegr-2 (Krox-20)の発現、IFN-ガンマの高い生成、及びIL-10、IL-4、IL-5、IL-13又はTGF-ベータの無又は極微量の生成。
更に、細胞溶解性T細胞はCD45RO及び/又はCD45RAを発現し、CCR7、CD27を発現せず、高レベルのグランザイムB及び他のグランザイム並びにFasリガンドを提示する。
WO2008/017517で説明される通り、APCに向けた細胞溶解性NKT細胞は、細胞の発現特性に基づいて非細胞溶解性のNKT細胞から区別することができる。特に、細胞溶解性CD4+ NKT細胞集団は、非細胞溶解性のNKT細胞集団と比較して以下の特徴: NK1.I、CD4、NKG2D及びCD244の発現の1つ又は複数を実証する。
本発明のペプチドは、生きている動物、一般的にヒトへの投与の後に、第三者T細胞に抑制性活性を発揮する特異的T細胞を導き出す。
具体的な実施形態では、本発明の細胞溶解性細胞集団は、FasL及び/又はインターフェロンガンマの発現によって特徴付けられる。具体的な実施形態では、本発明の細胞溶解性細胞集団は、グランザイムBの発現によって更に特徴付けられる。
この機構は、本発明のペプチドは、ある特定の抗原の特異的T細胞エピトープを含むが、本発明のペプチドによって活性化されるT細胞の近くのMHCクラスII分子又はCD1d分子によって同じ機構を通してそれらが提示されるならば、同じ抗原の他のT細胞エピトープに対する免疫反応によって導き出される障害の予防若しくは処置のために、又はある特定の状況では、他の異なる抗原の他のT細胞エピトープに対する免疫反応によって導き出される障害の処置のためにも使用することができることも暗示し、また実験結果は示す。
抗原特異的でもある、すなわち抗原特異的免疫応答を抑制することが可能である、上記の特徴を有する細胞型の単離された細胞集団が開示される。
本発明は、本発明による1つ又は複数のペプチドを含み、薬学的に許容される担体を更に含む医薬組成物を提供する。上で詳述されるように、本発明は、医薬として使用するための組成物、又は組成物を使用して免疫障害の哺乳動物を処置する方法、及び、免疫障害の予防又は処置のための医薬の製造のための組成物の使用にも関する。医薬組成物は、例えば免疫障害、特に風媒性及び食物媒介性のアレルギー、並びにアレルギー起源の疾患を処置又は予防するのに好適なワクチンであってもよい。本明細書で更に記載される医薬組成物の一例として、本発明によるペプチドは、水酸化アルミニウム(ミョウバン)等の、哺乳動物への投与に好適なアジュバントの上に吸着される。一般的に、ミョウバンの上に吸着されるペプチドの50μgが、2週間隔の3つの機会に皮下経路によって注射される。経口、鼻腔内又は筋肉内を含めて他の投与経路が可能であることは、当業者に明らかなはずである。更に、注射の回数及び注射する量は、処置する状態によって異なることができる。更に、それらがMHC-クラスII提示及びT細胞活性化においてペプチド提示を促進するならば、ミョウバン以外の他のアジュバントを使用することができる。したがって、有効成分を単独で投与することが可能であるが、それらは医薬製剤として一般的に提示される。獣医及びヒト使用のための本発明の製剤は、上記の少なくとも1つの有効成分を、1つ又は複数の薬学的に許容される担体と一緒に含む。本発明は、有効成分としての本発明による1つ又は複数のペプチドを、薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、処置又は予防の方法に関して以降指示されるもの等の有効成分の治療的有効量を含むべきである。必要に応じて、組成物は他の治療成分を更に含む。好適な他の治療成分、並びにそれらが属するクラスに依存するそれらの通常の投薬量は当業者に周知であり、免疫障害を処置するために使用される他の公知の薬物から選択することができる。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」は、例えば組成物を溶解、分散若しくは拡散することによって処置する部位へのその適用若しくは伝播を容易にするために、及び/又はその有効性を損なうことなくその保存、輸送若しくは取扱いを容易にするために、それと一緒に有効成分が製剤化される任意の材料又は物質を意味する。それらには、全溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌及び抗真菌剤(例えばフェノール、ソルビン酸、クロロブタノール)、等張剤(糖又は塩化ナトリウム等)等が含まれる。組成物中の免疫原性ペプチドの作用期間を制御するために、追加の成分が含まれてもよい。薬学的に許容される担体は、固体又は液体又は液体を形成するために圧縮される気体であってよく、すなわち、この発明の組成物は濃縮液、乳剤、溶液、粒状体、粉剤、噴霧剤、エアゾール、懸濁液、軟膏、クリーム、錠剤、ペレット又は粉末として好適に使用することができる。医薬組成物及びそれらの製剤で使用するための好適な医薬担体は当業者に周知であり、本発明の中でのそれらの選択に特に制限はない。それらには、添加剤、例えば湿潤剤、分散剤、展着剤、接着剤、乳化剤、溶媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤(例えば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール)、等張剤(糖又は塩化ナトリウム等)等が含まれてもよいが、それらが製薬慣行と一貫している場合に限られ、すなわち哺乳動物に恒久的な傷害を与えない担体及び添加剤に限る。本発明の医薬組成物は、任意の公知の方法で、例えば有効成分を選択された担体材料及び適当な場合には界面活性剤等の他の添加剤と一緒に、一段階又は多段階手順で均一に混合し、コーティングし、及び/又は磨砕することによって調製することができる。それらは、例えば通常約1～10μmの直径を有するマイクロスフェアの形でそれらを得る目的で、すなわち、有効成分の制御されたか又は持続的放出のためのマイクロカプセルの製造のために、微粉化によって調製することもできる。
本発明の医薬組成物で使用するのに好適である、搾出剤(emulgent)又は乳化剤としても知られる界面活性剤は、優れた乳化、分散及び/又は湿潤特性を有する非イオン性、カチオン性及び/又はアニオン性の材料である。好適なアニオン性界面活性剤には、水溶性石鹸及び水溶性の合成界面活性剤の両方が含まれる。好適な石鹸は、アルカリ若しくはアルカリ土類金属塩、高級脂肪酸(C10～C22)の非置換の若しくは置換されたアンモニウム塩、例えばオレイン酸若しくはステアリン酸のナトリウム若しくはカリウム塩、又はヤシ油若しくは獣脂オイルから入手できる天然脂肪酸混合物のものである。合成界面活性剤には、ポリアクリル酸のナトリウム又はカルシウム塩;脂肪スルホン酸塩及び硫酸塩;スルホン化されたベンズイミダゾール誘導体及びアルキルアリールスルホン酸塩が含まれる。脂肪スルホン酸塩又は硫酸塩は通常アルカリ又はアルカリ土類金属塩、非置換のアンモニウム塩又は8～22の炭素原子を有するアルキル若しくはアシル基で置換されるアンモニウム塩、例えば、リグニンスルホン酸又はドデシルスルホン酸のナトリウム又はカルシウム塩、又は天然脂肪酸から得られる脂肪アルコール硫酸塩の混合物、硫酸又はスルホン酸エステル(ラウリル硫酸ナトリウム等)及び脂肪アルコール/エチレンオキシド付加物のスルホン酸のアルカリ又はアルカリ土類金属塩の形である。好適なスルホン化されたベンズイミダゾール誘導体は、8～22の炭素原子を一般的に含有する。アルキルアリールスルホン酸の例は、ドデシルベンゼンスルホン酸又はジブチル-ナフタレンスルホン酸又はナフタレン-スルホン酸/ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウム又はアルカノールアミン塩である。対応するリン酸塩、例えばリン酸エステルの塩、及びp-ノニルフェノールとエチレン及び/又はプロピレンオキシドの付加物、又はリン脂質も好適である。例えば、この目的のための好適なリン脂質は、ケファリン又はレシチンタイプの天然(動物又は植物細胞を起源とする)又は合成リン脂質、例えば、ホスファチジル-エタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、リゾレシチン、カルジオリピン、ジオクタニルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びそれらの混合物である。
好適な非イオン性界面活性剤には、分子中に少なくとも12の炭素原子を含有するアルキルフェノール、脂肪アルコール、脂肪酸、脂肪族アミン又はアミドのポリエトキシル化及びポリプロポキシル化誘導体、アルキルアレーンスルホン酸塩及びジアルキルスルホコハク酸塩、例えば、脂肪族及び脂環式アルコールのポリグリコールエーテル誘導体、飽和及び不飽和脂肪酸及びアルキルフェノールが含まれ、誘導体は、(脂肪族)炭化水素部分に3～10のグリコールエーテル基及び8～20の炭素原子を、アルキルフェノールのアルキル部分に6～18の炭素原子を一般的に含有する。更なる好適な非イオン性界面活性剤は、アルキル鎖に1～10の炭素原子を含有するポリプロピレングリコール、エチレンジアミノポリプロピレングリコールとのポリエチレンオキシドの水溶性付加物であり、その付加物は20～250のエチレングリコールエーテル基及び/又は10～100のプロピレングリコールエーテル基を含有する。そのような化合物は、プロピレングリコール単位につき1～5のエチレングリコール単位を通常含有する。非イオン性界面活性剤の代表的な例は、ノニルフェノール-ポリエトキシエタノール、ヒマシ油ポリグリコールエーテル、ポリプロピレン/ポリエチレンオキシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコール及びオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである。ポリエチレンソルビタン(ポリオキシエチレントリオレイン酸ソルビタン等)、グリセロール、ソルビタン、スクロース及びペンタエリスリトールの脂肪酸エステルも、好適な非イオン性界面活性剤でもある。好適なカチオン性界面活性剤には、ハロ、フェニル、置換されたフェニル又はヒドロキシで必要に応じて置換される4炭化水素基を有する四級アンモニウム塩、特にハライドが含まれる;例えば、N置換基として少なくとも1つのC8C22アルキル基(例えば、セチル、ラウリル、パルミチル、ミリスチル、オレイル等)及び、更なる置換基として、非置換であるかハロゲン化された低級アルキル、ベンジル及び/又はヒドロキシ-低級アルキル基を含有する四級アンモニウム塩。
この目的のために好適な界面活性剤のより詳細な記載は、例えば、「McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual」(MC Publishing Crop.社、Ridgewood、New Jersey、1981)、「Tensid-Taschenbucw」、第2版(Hanser Verlag社、Vienna、1981)及び「Encyclopaedia of Surfactants」(Chemical Publishing Co.社、New York、1981)に見出すことができる。本発明によるペプチド、その相同体又は誘導体(並びに、用語「有効成分」に全て含まれるそれらの生理的に許容される塩又は医薬組成物)は、処置される状態に適当であり、化合物、ここでは投与されるタンパク質及び断片、に適当である任意の経路によって投与することができる。可能な経路には、領域性、全身性、経口(固体の形又は吸入)、直腸、経鼻、局所(目、口内及び舌下を含む)、経膣及び非経口(皮下、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、クモ膜下及び硬膜外を含む)が含まれる。好ましい投与経路は、例えばレシピエントの状態で、又は処置される疾患で異なることができる。本明細書で記載されるように、担体は、製剤の他の成分に適合し、レシピエントに有害でないという意味において、最適には「許容される」。製剤には、経口、直腸、経鼻、局所(口内及び舌下を含む)、経膣又は非経口(皮下、筋肉内、静脈内、皮内、動脈内、クモ膜下及び硬膜外を含む)投与に適するものが含まれる。
非経口投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及びその製剤を予定レシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性及び非水性の無菌注射溶液;並びに懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量又は多回用量容器、例えば密封アンプル及びバイアルで提示することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用水を付加するだけでよい、フリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存することができる。即時使用の注射溶液及び懸濁液は、前に記載した種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。
一般的な単位薬量製剤は、本明細書で上に挙げたような有効成分の日用量又は単位下位日用量、又はその適当な分数を含有するものである。上で特に指摘した成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤タイプに関係する技術分野で慣用される他の薬剤を含むことができることを理解すべきであり、例えば、経口投与に適するものは着香料を含むことができる。本発明によるペプチド、その相同体又は誘導体は、より低い頻度の投薬を可能にするために、又は所与の発明化合物の薬物動態学的若しくは毒性プロファイルを改善するために有効成分の放出を制御及び調節することができる、有効成分として1つ又は複数の本発明の化合物を含有する制御放出医薬製剤(「制御放出製剤」)を提供するために使用することができる。個別の単位が1つ又は複数の本発明の化合物を含む経口投与のために適合させた制御放出製剤は、従来の方法によって調製することができる。組成物中の有効成分の作用期間を制御するために、追加の成分が含まれてもよい。したがって、制御放出組成物は、適当なポリマー担体、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン-酢酸ビニルコポリマー、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン等を選択することによって達成することができる。薬物放出の速度及び作用期間は、有効成分をポリマー物質、例えばヒドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリニエチルメタクリレート及び他の上記のポリマーの粒子、例えばマイクロカプセル、に組み込むことによって制御することもできる。そのような方法には、リポソーム、マイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル等のようなコロイド薬物送達系が含まれる。投与経路によっては、医薬組成物は、保護コーティングを必要とすることがある。注射のために好適な医薬形態には、無菌の水性溶液又は分散液、及びその即時使用の調製のための無菌の粉末が含まれる。したがって、この目的のための一般的な担体には、生体適合性の水性緩衝液、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等及びそれらの混合物が含まれる。いくつかの有効成分を組合せて使用する場合、それらは処置される哺乳動物において必ずしも共同の治療効果を同時に直接的にもたらすとは限らないという事実を考慮して、対応する組成物は、2つの成分を別々であるが隣接したリポジトリ又はコンパートメントに含有する医療用のキット又はパッケージの形であってもよい。後者との関連で、各有効成分は、したがって、他の成分のそれと異なる投与経路に好適な方法で製剤化することができ、例えば、それらのうちの1つは経口又は非経口製剤の形であってよく、他は静脈内注射又はエアゾールのためのアンプルの形である。
本発明で得られるような細胞溶解性CD4+T細胞は、in vitro及びin vivoで実証されるようにMHC-クラスII依存性同族活性化の後にAPCアポトーシスを誘導し、樹状細胞及びB細胞の両方に影響し、(2)IL-10及び/又はTGF-ベータの不在下で接触依存性機構によって第三者T細胞を抑制する。WO2008/017517で詳細に議論されるように、細胞溶解性CD4+ T細胞は天然及び適応性のTregsから区別することができる。
CD1d分子に結合する能力を付与する疎水性残基を含有する本発明の免疫原性ペプチドは、投与の後、APCによって取り込まれ、後期エンドソームに誘導され、そこで、それらはCD1dにロードされ、APCの表面で提示される。CD1d分子によって提示されると、ペプチドの中のチオレダクターゼモチーフはNKT細胞を活性化する能力を増強し、細胞溶解性NKT細胞になる。前記免疫原性ペプチドはlFN-ガンマ等のサイトカインの生成を活性化し、それは、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞を含む他のエフェクター細胞を活性化する。CD4+及びCD8+ T細胞は、WO2012/069568で詳細に議論されるように、抗原を提示する細胞の排除に加わることができる。
インターフェロンガンマは、細胞溶解性CD4+ T細胞を特徴付ける重要なマーカーである。T1D患者(T1D07)からのナイーブなCD4+ T細胞を免疫原性ペプチドでプライミングし、刺激することによって、特異的CD4+ T細胞系を得ることができる。複数回、(例えば)12回の刺激の後、細胞を前記免疫原性ペプチドをロード(2μM)した自家LCL B細胞と共培養することができる。24時間後に上清を収集し、IFN-ガンマを多重アッセイによって測定する。
更に、本発明の免疫原性ペプチドの効果を調査するために、細胞溶解性CD4+ T細胞系によるFasL放出を試験することができる。上で説明される免疫原性ペプチドで本来生成されるT細胞系を分け、APCとして自家LCL B細胞系を使用した連続4回のin vitro刺激によって前記免疫原性ペプチドで刺激することができる。あらゆる刺激(合計4回)の11日目に、自家B細胞によって提示されるそれらの対応するペプチドによる再刺激の後に、細胞をFasLについて試験する。共培養の24時間後(刺激1及び2)又は72時間後(刺激3及び4)に、上清を収集する。
本発明は、限定する意図のない以下の実施例によってここから例示される。更に、本明細書に記載される全ての参考文献は、参照により本明細書に明示的に含まれる。
(実施例1)
免疫原性ペプチドの還元活性を調査する方法。
免疫原性ペプチドの酸化還元酵素活性は、Tomazzolli等(2006) Anal. Biochem. 350、105～112頁に記載される蛍光アッセイを使用して決定した。FITC標識を有する2つのペプチドは、それらがジスルフィド架橋を通して互いと共有結合するときに自己失活する。本発明によるペプチドによる還元の結果、還元された個々のペプチドは再び蛍光性になる。対照実験は、ジチオトレイトール(100%還元活性)及び水(0%還元活性)で実行することができる。
(実施例2)
免疫原性ペプチドの還元活性に及ぼす酸化還元酵素モチーフのN末端の塩基性アミノ酸の付加の効果。
以下のtable 1(表1)～table 3(表3)は、T細胞エピトープを含む様々な免疫原性ペプチドの酸化還元酵素モチーフのN末端での塩基性アミノ酸内分泌の影響を試験するために使用したペプチド配列を表す。これらのペプチドによる全ての試験は繰り返し実行し、各試験は2回実行した。図1、図2及び図3は、1反復の初速を表す。活性は、2反復の平均で表す。結果は、相対蛍光単位(RFU)で表す。インスリンT細胞エピトープに連結されるCHGC酸化還元酵素モチーフのN末端にK、KH、R又はRHアミノ酸を含むペプチドは、Hを有するか又はいかなる追加のN末端アミノ酸もない対照ペプチドより高い酸化還元酵素活性を示した(table 1(表1)及び図1を参照する)。同様に、破傷風毒素T細胞エピトープに連結されるCPYC酸化還元酵素モチーフのN末端にK又はKHアミノ酸を含むペプチドは、Hを有するか又はいかなる追加のN末端アミノ酸もない対照ペプチドより高い酸化還元酵素活性を示した(table 2(表2)及び図2を参照する)。MOG T細胞エピトープに連結されるCPYC酸化還元酵素モチーフのN末端にK又はKHアミノ酸を含むペプチドは、Hを有するか又はいかなる追加のN末端アミノ酸もない対照ペプチドより高い酸化還元酵素活性を示した(table 3(表3)及び図3を参照する)。
Figure 2022513021000001
Figure 2022513021000002
Figure 2022513021000003
(実施例3)
免疫原性ペプチドの還元活性に及ぼす酸化還元酵素モチーフの中の塩基性アミノ酸の付加の効果。
以下のtable 4(表4)～table 6(表6)は、T細胞エピトープを含む様々な免疫原性ペプチドの酸化還元酵素モチーフの中の塩基性アミノ酸の付加の影響を試験するために使用したペプチド配列を表す。これらのペプチドによる全ての試験は繰り返し実行し、各試験は2回実行した。図4、図5及び図6は、1反復の初速を表す。活性は、2反復の平均で表す。結果は、相対蛍光単位(RFU)で表す。インスリンT細胞エピトープを有し、モチーフの中にKを有する酸化還元酵素モチーフを含むペプチドは、古典的CPYC酸化還元酵素モチーフを有する対照ペプチドより高い酸化還元酵素活性を示した(table 4(表4)及び図4を参照する)。同様に、インスリンT細胞エピトープを有し、モチーフの中にKを有する酸化還元酵素モチーフを含むペプチドは、CHGC又はCRGC古典的酸化還元酵素モチーフを有する対照ペプチドより高い酸化還元酵素活性を示した(table 5(表5)及び図5を参照する)。CGHC酸化還元酵素モチーフを使用して同一の結果が得られた(table 6(表6)及び図6を参照する)。
Figure 2022513021000004
Figure 2022513021000005
Figure 2022513021000006
(実施例4)
免疫原性ペプチドの還元活性に及ぼす酸化還元酵素モチーフのC末端の塩基性アミノ酸の付加の効果。
以下のtable 7(表7)及びtable 8(表8)は、T細胞エピトープを含む様々な免疫原性ペプチドの酸化還元酵素モチーフのC末端での塩基性アミノ酸内分泌の影響を試験するために使用したペプチド配列を表す。これらのペプチドによる全ての試験は繰り返し実行し、各試験は2回実行した。図7及び図8は、1反復の初速を表す。活性は、2反復の平均で表す。結果は、相対蛍光単位(RFU)で表す。インスリンT細胞エピトープに連結されるCHGC酸化還元酵素モチーフのC末端にK又はHKアミノ酸を含むペプチドは、いかなる追加の塩基性C末端アミノ酸もない対照ペプチドより高い酸化還元酵素活性を示した(table 7(表7)及び図7を参照する)。破傷風毒素T細胞エピトープに連結されるCPYC酸化還元酵素モチーフのC末端にK又はHKアミノ酸を含むペプチドは、いかなる追加の塩基性C末端アミノ酸もない対照ペプチドより高い酸化還元酵素活性を示した(table 8(表8)及び図8を参照する)。
Figure 2022513021000007
Figure 2022513021000008
(実施例5)
免疫原性ペプチドの還元活性に及ぼす酸化還元酵素モチーフの中への及び/又はそれに隣接した複数の塩基性アミノ酸の挿入の効果。
以下のtable 9(表9)及びtable 10(表10)は、免疫原性ペプチドの還元活性に及ぼす、酸化還元酵素モチーフの中の及びそのN/C末端での複数の塩基性アミノ酸(K)挿入の影響を試験するために使用したペプチド配列を表す。これらのペプチドによる全ての試験は繰り返し実行し、各試験は2回実行した。図9及び図10は、1反復の初速を表す。活性は、2反復の平均で表す。結果は、相対蛍光単位(RFU)で表す。複数の塩基性アミノ酸を有する酸化還元酵素モチーフを含むペプチドは、インスリンT細胞エピトープを含むCPYCSLQPLALEGSLQKRG対照ペプチドより高い酸化還元酵素活性を示した(table 9(表9)及び図9を参照する)。MOG T細胞エピトープを含むCPYCGWYRSPFSRVVHLペプチドの変異体を使用して、同じ結果が得られた(table 10(表10)、図10を参照する)。
Figure 2022513021000009
Figure 2022513021000010
(実施例6)
塩基性アミノ酸を有する酸化還元酵素モチーフを含む免疫原性ペプチドの生物学的効果。
塩基性アミノ酸を有する酸化還元酵素モチーフを含む免疫原性ペプチドの生物学的効果を調査するために、マウスMOG T細胞エピトープ及びCPYC酸化還元酵素モチーフを含む配列CPYCGWYRSPFSRVVHLYRを有するペプチドの異なる変異体を設計し、合成した(table 11(表11))。各ペプチドの酸化還元酵素活性を次に測定し、塩基性アミノ酸によって改変されたペプチドの最も高い酸化還元酵素活性が確認された(データは示さず)。
Figure 2022513021000011
table 11(表11)に示されるペプチドの生物学的効果を比較するために、2D2トランスジェニックマウス(Jackson Laboratory社)をCD4+細胞の供与源として使用した。これらのマウスは、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)特異的自己反応性T細胞レパートリーを含有することが示され、そのことは、それらをtable 11(表11)のペプチドへのCD4+の均一集団の反応性を研究するための適当な候補にする。この研究では、製造使用説明書(Miltenyi Biotec社、130-104-454)を使用して2D2全CD4+細胞を精製し、抗原提示細胞はC57BL6マウス(2D2トランスジェニックマウスに適合する)からのT細胞レパートリー(CD90.2欠失、Miltenyi Biotec社、130-104-454)のために欠失させた。
各研究の対照条件は、ペプチド無付加、又は酸化還元酵素モチーフを含むDBY(ヒトの雄染色体)からのペプチド若しくは酸化還元酵素モチーフを含むマウスPPI(プレプロインスリン)からのペプチドの付加であり、2つは後にC57BL6-APCからのMHCIIに効率的に結合することができるが、2D2トランスジェニックCD4+ T細胞からのTCRを活性化することができない。
酸化還元酵素モチーフの中及びそのN-/C-末端への塩基性アミノ酸の挿入によるペプチドの酸化還元酵素モチーフの改変が、CD4+ T細胞を活性化するこれらのペプチドの能力に影響するかどうかについて、CD154+マーカー(CD40L)を使用してAg特異的T細胞の関与を測定することによって先ず調査した。この目標を達成するために、2D2全CD4+及びC57BL6 APC(比1:1)の共培養を、CD40ブロッキング抗体の存在下で各試験及び対照ペプチドの5μMの最終濃度に16時間曝露させた。インキュベーション時間の後、全ての実験及び対照条件についてAg特異的細胞の頻度をフローサイトメトリーによって決定した(Pro-19-004-v00)(図11)。
結果は、塩基性アミノ酸を含む酸化還元酵素モチーフを有するペプチド変異体は、CPYC又はHCPYCモチーフを有する対照と比較してより高い百分率のAg特異的細胞(CD4+CD154+)の関与を誘導することができたことを示唆する(図11;点線)。
塩基性アミノ酸のためにより高い酸化還元酵素活性を有することが、活性化Ag特異的CD4 T細胞によるIL-2の誘導の増加につながるかどうか決定しようと次に試みた。この目的のために、2D2全CD4+及びマイトマイシンC処理C57BL6 APC(比1:1)の共培養を、各試験及び対照ペプチドの5μMの最終濃度に24時間曝露させた。インキュベーション時間の後、停止プロテアーゼ阻害剤カクテル(Thermo scientific社; 78430)の付加によって上清(SN)を収集し、全ての実験及び対照条件について分泌されたIL2(sIL2)の量をフローサイトメトリー(LEGENDplexマウスThサイトカインパネル(13-プレックス);カタログ番号740005;Pro-19-007-v00)を使用して測定するまで-80フリーザーで保存した。FACS結果は、塩基性アミノ酸を含む酸化還元酵素モチーフを有するペプチド変異体は、CPYC又はHCPYCモチーフを有する対照と比較してより高い量のsIL2を誘導することができたことを示唆する(図12;点線)。
当技術分野から、T細胞エピトープ及び酸化還元酵素モチーフを含む改変されたペプチドは、CD4+細胞が溶解マーカーを獲得して細胞溶解性CD4+ T細胞に分化することを可能にする経路を誘導することができることが知られている。
したがって、塩基性アミノ酸のためにより高い酸化還元酵素活性を有する免疫原性ペプチドが、活性化Ag特異的CD4 T細胞におけるより早期の及び/又はより強力な(百分率又は強度)溶解特性につながるかどうか決定しようと試みた。この実験セットでは、2D2全CD4+をマイトマイシンC処理C57BL6 APC(比1:1)と各試験及び対照ペプチドの5μMの最終濃度で刺激した(刺激1)。10～14日の区間の後、全ての試験及び対照条件からのあらゆる細胞培養を、関係するペプチドの不在下及び存在下で再び刺激した(刺激2、0日目)。第2の刺激の16時間後(S2D1)に、細胞内(IC)溶解マーカー測定(グランザイムA及びB、CD107a及びb)のためにフローサイトメトリー(Pro-19-014-v00)により細胞を収集し、染色した。予想通り、対照ペプチド条件はS2での測定に培養が含まれることに失敗したことは注目に値する。次に全てのペプチド変異体のためにFACS結果を決定し、溶解特性の誘導に及ぼすあらゆる改変された酸化還元酵素モチーフの効果を純粋に決定するために、いかなるチオレドックス活性のないMOG T細胞エピトープを含む野生型ペプチドの測定を全ての他の測定から除いた。これまでのところ、この結果は、塩基性アミノ酸を含む酸化還元酵素モチーフを有する改変されたペプチドは、CPYC又はHCPYCモチーフを有する対照と比較してより高い百分率の溶解性マーカーを誘導することができたことを示唆する(図13;点線)が、KHCPYCペプチドは例外であり、その理由は、技術的困難さ(1000未満の事象を有する)がこの特定のペプチドの結果を達成させなくさせたからである。

Claims (19)

  1. a)酸化還元酵素モチーフ、
    b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
    c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
    を含む免疫原性ペプチドであって、
    (i)前記酸化還元酵素モチーフは、
    (Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (ii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
    (式中、(Z1)+は、HでもRでもない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iv)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
    (式中、(Z3)+は、塩基性アミノ酸、好ましくはK若しくはR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B2)は、任意のアミノ酸であり、mは、0～3の整数であるが、ただし、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
    を含む群から選択される、免疫原性ペプチド。
  2. (Z1)+が、K若しくは非天然の塩基性アミノ酸を含む群から選択され、並びに/又は、(Z2)+及び/若しくは(Z3)+のいずれか1つが、K、R若しくは非天然の塩基性アミノ酸を含む群から各々個々に選択される、請求項1に記載の免疫原性ペプチド。
  3. (Z1)+、(Z2)+及び/又は(Z3)+のいずれか1つが、K又はL-オルニチンである、請求項1又は2に記載の免疫原性ペプチド。
  4. 抗原性タンパク質の前記T細胞エピトープが、NKT細胞エピトープ又はMHCクラスII T細胞エピトープである、請求項1～3のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  5. 前記エピトープが、7～30アミノ酸、好ましくは7～25アミノ酸、より好ましくは7～20アミノ酸の長さを有する、請求項1～4のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  6. 11～50アミノ酸、好ましくは11～40アミノ酸、より好ましくは11～30アミノ酸の長さを有する、請求項1～5のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  7. 前記抗原性タンパク質が、自己抗原、可溶性同種因子、移植から脱落した同種抗原、細胞内病原体の抗原、遺伝子療法若しくは遺伝子ワクチン接種のために使用されるウイルスベクターの抗原、腫瘍関連抗原又はアレルゲンである、請求項1～6のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  8. 医療における使用のための、請求項1～7のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  9. 自己免疫性疾患、細胞内病原体による感染症、腫瘍、同種移植拒絶、又は可溶性同種因子への、アレルゲン曝露への、若しくは遺伝子療法若しくは遺伝子ワクチン接種のために使用されるウイルスベクターへの免疫応答の処置及び/又は予防における使用のための、請求項1～8のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  10. 前記モチーフ中の少なくとも1つのXが、P又はYである、請求項1～9のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  11. 前記リンカーが、0～4アミノ酸のものである、請求項1～10のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  12. 前記酸化還元酵素モチーフが、前記抗原性タンパク質中のT細胞エピトープのN末端又はC末端の11アミノ酸の領域中に天然に存在しない、請求項1～11のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  13. 前記T細胞エピトープが、前記酸化還元酵素モチーフを天然に含まない、請求項1～12のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチド。
  14. 請求項1～13のいずれか一項に記載の免疫原性ペプチドを調製する方法であって、
    (a)前記抗原性タンパク質のT細胞エピトープからなるペプチド配列を提供する工程、並びに
    (b)前記モチーフ及び前記エピトープが、互いに隣接するか又は多くても7アミノ酸のリンカーによって分離されるように、前記ペプチド配列に前記酸化還元酵素モチーフを連結する工程
    を含む、方法。
  15. その抗原を提示するAPCに対する抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞の集団を得る方法であって、前記方法が、
    - 末梢血細胞を提供する工程、
    - 前記細胞を、
    a)酸化還元酵素モチーフ、
    b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
    c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
    を含む免疫原性ペプチドと接触させる工程であって、
    (i)前記酸化還元酵素モチーフは、
    (Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (ii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
    (式中、(Z1)+は、HでもRでもない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iv)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
    (式中、(Z3)+は、塩基性アミノ酸、好ましくはK若しくはR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B2)は、任意のアミノ酸であり、mは、0～3の整数であるが、ただし、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
    を含む群から選択される、接触させる工程、並びに
    - IL-2の存在下で前記細胞を増量する工程
    を含む、方法。
  16. 抗原特異的NKT細胞の集団を得る方法であって、前記方法が、
    - 末梢血細胞を提供する工程、
    - 前記細胞を、
    a)酸化還元酵素モチーフ、
    b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
    c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
    を含む免疫原性ペプチドと接触させる工程であって、
    (i)前記酸化還元酵素モチーフは、
    (Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (ii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
    (式中、(Z1)+は、HでもRでもない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iv)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
    (式中、(Z3)+は、塩基性アミノ酸、好ましくはK若しくはR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B2)は、任意のアミノ酸であり、mは、0～3の整数であるが、ただし、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
    を含む群から選択される、接触させる工程、並びに
    - IL-2の存在下で前記細胞を増量する工程
    を含む、方法。
  17. その抗原を提示するAPCに対する抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞の集団を得る方法であって、前記方法が、
    - a)酸化還元酵素モチーフ、
    b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
    c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
    を含む免疫原性ペプチドを提供する工程であって、
    (i)前記酸化還元酵素モチーフは、
    (Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (ii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
    (式中、(Z1)+は、HでもRでもない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iv)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
    (式中、(Z3)+は、塩基性アミノ酸、好ましくはK若しくはR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B2)は、任意のアミノ酸であり、mは、0～3の整数であるが、ただし、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
    を含む群から選択される、提供する工程、
    - 前記ペプチドを対象に投与する工程、並びに
    - 抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞の前記集団を前記対象から得る工程
    を含む、方法。
  18. 抗原特異的NKT細胞の集団を得る方法であって、前記方法が、
    - a)酸化還元酵素モチーフ、
    b)抗原性タンパク質のT細胞エピトープ、及び
    c)a)とb)との間の0～7アミノ酸のリンカー
    を含む免疫原性ペプチドを提供する工程であって、
    (i)前記酸化還元酵素モチーフは、
    (Z2)+(B1)n[CST]XXC又は(Z2)+(B1)nCXX[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (ii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]X(Z2)+C又はCX(Z2)+[CST]
    (式中、(Z2)+は、Hでない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B1)は、任意のアミノ酸であり、nは、0～3の整数である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iii)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST](Z1)+XC;又はC(Z1)+X[CST]
    (式中、(Z1)+は、HでもRでもない塩基性アミノ酸であり;
    Xは、任意のアミノ酸である)
    を含む群から選択されるか;又は
    (iv)前記酸化還元酵素モチーフは、
    [CST]XXC(B2)m(Z3)+又はCXX[CST](B2)m(Z3)+
    (式中、(Z3)+は、塩基性アミノ酸、好ましくはK若しくはR、又は非天然の塩基性アミノ酸、例えばL-オルニチンであり、
    Xは、任意のアミノ酸であり;
    (B2)は、任意のアミノ酸であり、mは、0～3の整数であるが、ただし、(Z3)+がRである場合にはmは0であり、(Z3)+がHである場合にはmは0又は1である)
    を含む群から選択される、提供する工程、
    - 前記ペプチドを対象に投与する工程、並びに
    - 抗原特異的NKT細胞の前記集団を前記対象から得る工程
    を含む、方法。
  19. 自己免疫性疾患、細胞内病原体による感染症、腫瘍、同種移植拒絶、又は可溶性同種因子への、アレルゲン曝露への、若しくは遺伝子療法若しくは遺伝子ワクチン接種のために使用されるウイルスベクターへの免疫応答の処置及び/又は予防における使用のための、請求項15～18のいずれか一項に記載の方法によって入手できる抗原特異的細胞溶解性CD4+ T細胞又はNKT細胞の集団。
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