JP2023512670A - 同種異系、腫瘍特異的なｃｄ４＋ ｔ細胞の注射移植を用いたがん免疫療法 - Google Patents

同種異系、腫瘍特異的なｃｄ４＋ ｔ細胞の注射移植を用いたがん免疫療法 Download PDF

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Abstract

本発明は、内因性の腫瘍-応答性CD8+ T細胞のための、CD4+ T細胞ヘルプの外因性供給源として、同種異系リンパ球を投与するための、方法及び組成物、を提供する。【選択図】図１

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、2020年2月10日に出願された米国特許出願第16/786,761号の35 U.S.C§119(e)に基づく優先権の利益を主張する、米国特許出願第16/786,761号は、2018年3月28日に出願された米国特許出願第15/939,059号の一部継続出願である、米国特許出願第15/939,059号は、2014年11月3日に出願された米国特許出願第14/398,724号（現在、米国特許No. 9,931,359号として、発行されている）の継続出願である；米国特許出願第14/398,724号は、2013年3月15日に出願された国際出願第PCT/US2013/032129号の35 USC §371の国内段階出願（現在満了している）である；国際出願第PCT/US2013/032129号は、2012年5月8日に出願された米国特許出願第61/644,126号（現在満了している）に対する35 USC §119(e)に基づく利益を主張する。各先願の開示は、この出願の一部と見なされ、本出願の開示に参照により取り込まれる。
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発であることの記載］
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって与えられたCA105148及びCA015396の下で、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
［配列表の取り込み］
添付の配列表にある材料は、本出願の中に、参照により本出願に取り込まれる。添付の配列表テキスト・ファイルJHU3680_3WO_Sequence_Listing.txtは2021 年2 月8 日に作成され、12kbである。そのファイルを、Windows OSを使用するコンピュータのMicrosoft Wordを使用して、評価することがある。
［本発明の分野］
本発明は、広く、免疫学に関する、より具体的には、がんを治療するための同種異系リンパ球を含む方法及び組成物に関する。
［背景情報］
宿主の免疫システムは、病原性微生物に対する防御反応を迅速且つ特異的に開始する、及び悪性腫瘍の拒絶にも寄与する、手段を提供する。免疫応答は、分化したBリンパ球が抗原に特異的な抗体を産生する液性応答、及び様々なタイプのTリンパ球が様々な機構によって抗原を排除する細胞媒介性応答、を含むと、一般的に説明されている。例えば、特異的な抗原を認識することができるCD4(CD4+とも呼ぶ)ヘルパーT細胞は、免疫応答に関与する免疫システムの細胞を更に動員するために、サイトカインなどの可溶性メディエーター(mediator)を放出することによって、応答することがある。CD8(CD8+とも呼ぶ)細胞傷害性T細胞はまた、特異的な抗原を認識することができ、抗原を保有する細胞又は微粒子に結合し、それを破壊する又は損傷させることができる。特に、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を含む、細胞媒介性の免疫応答は、腫瘍細胞及び微生物(例えば、ウイルス、バクテリア、又は寄生虫など)に感染した細胞を排除するために重要であることがある。
がんは、広範囲の疾患を含み、世界中の約4人に1人は、がんに罹患する。CTL応答は、効果が有るがんワクチンの重要な特徴である；効果が有るCD4 T細胞のヘルプ(help)は、CD8 T細胞の細胞傷害活性を維持するのに重要な役割を果たし、それ故に、臨床的な利益を提供する。
微生物感染症に関しては、マラリア、結核、HIV-AIDS、並びにエプスタイン-バー・ウイルス(Epstein-Barr virus)、B型肝炎及びC型肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス(HSV)の感染症、並びにヒト・パピローマウイルス(HPV)などの他のウイルス感染症は、依然として、グローバルな健康上の懸念である。ウイルスは、全てのヒトがんのうち約15%を引き起こすと推定されている。発がん性血清型及び非-発がん性血清型の両方を含む、ヒト・パピローマウイルスは、世界中で最も一般的な性感染症である。免疫能があるほとんどの個人は、前記ウイルスを排除するが、健常な個人の一部は、HPVの発がん性株を排除することができず、次いで、上皮細胞における持続感染が確立し、悪性の形質転換が誘導されることがある。
新たなエビデンスによれば、がんは、前記がんがユニークに発現する抗原に特異的なリンパ球において、無応答性の状態を誘導する、ことが示唆されている。しかしながら、この無応答性を、回復させることが可能とするべきである。いくつかのヒト腫瘍は、CD8+ T細胞が浸潤している、並びにCD8+ T細胞の浸潤の程度は、しばしば、転移が無いこと及び生存性が向上することと相関する。しかしながら、これらのCD8+ T細胞は、腫瘍特異的CD4+ T細胞が機能的に麻痺しているために、がんを排除しないことがある。
イピリムマブ、ニボルマブ、及びペムブロリズマブなどの免疫学的チェックポイント阻害剤(CI)は、多様ながんの治療において、成功してきている、そして、このことにより、免疫システムのT細胞は、腫瘍を退縮させ、生存の延長及び生活の質の改善をもたらし得る、ということが、決定的に確立している。しかし、どんながん免疫療法であっても、その成功は、T細胞の疲弊（即ち、腫瘍特異的なT細胞の増殖、サイトカイン分泌、及び細胞傷害能、の障害を特徴とする現象）によって、制限を受ける。従って、抗-がん免疫療法において、T細胞を疲弊から回復させるための方策を開発することに、大きな関心が寄せられている。
最近のエビデンスによれば、前記CIは、T細胞を疲弊から回復させることができない、ことが示唆されている。対照的に、同種異系の細胞療法、特に主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)-ミスマッチのドナー(donor)に由来するCD4+T細胞を注射投与すると、そのドナー(donor)細胞は、最終的には、拒絶されるにも関わらず、免疫チェックポイント遮断に対して耐性である進行がんであっても、その退縮が誘導されることがある、ことが見出された。そのドナー(donor)のリンパ球からCD8+細胞を減少させると、前記注射投与の抗-腫瘍の有効性が損なわれることなく、ドナー(donor)細胞が持続的に生着することのリスク、及び致死的な移植片対宿主病(GVHD)のリスク、が無くなった。前記ドナー(donor)及びレシピエント(recipient)が、互いにMHC-ハプロ同一である場合(例えば、親が子供に対して、又はその逆として)、ヒト・パピローマウイルス(HPV)血清型16(HPV16)のE7抗原に対するワクチン接種を前記ドナー(donor)に行うと、E7発現肺がんであるTC-1に対する、CD8-減少、非-生着ドナー(donor)リンパ球の注射投与(non-engrafting donor lymphocyte infusion (NEDLI))の抗-腫瘍の有効性は、増強した。E7-プライミングを加えたドナー(donor)に由来するNEDLIの抗腫瘍の有効性は、注射投与する前に、前記プライミングを加えた細胞を、HPV16のE7に由来するペプチドでパルスした、宿主-又はドナーに由来する樹状細胞と一緒に培養することによって、増強させることが可能であるかもしれない、及びレシピエント(recipient)を治癒させることが可能であるかもしれない。E7-プライミングを加えたNEDLIによって、進行したTC-1腫瘍が治癒したマウスは、ドナー・キメリズム(donor chimerism)のエビデンスは無かったが、宿主由来の、E7-特異的なメモリーCD4+及びCD8+ T細胞の集団が増殖していた、このことは、NEDLIによって、抗-腫瘍の免疫が、前記レシピエント(recipient)にインプリントされた(imprinted)こと、を示す。これらの結果は、ウイルス抗原に対するワクチン接種を受けた、部分的な又は完全なHLA-マッチのドナー(donor)に由来するリンパ球を注射投与することによって、ウイルス-誘導性腫瘍を治療することができることを実証する、及び腫瘍ネオ抗原に対するワクチン接種を受けたドナー(donor)に由来するリンパ球を投与することによって、孤発性腫瘍を治療することができる可能性を示唆する。
更に、NEDLIによりTC-1が治癒したマウスは、同じ腫瘍による攻撃に抵抗し、その治癒した動物に由来する脾臓細胞は、抗-腫瘍免疫を、TC-1-を担持する、MHC-ハプロ同一のレシピエント(recipient)に移した。健常なドナー(donor)に腫瘍-特異的抗原に対するワクチン接種を行い、その後、ワクチン接種を受けたドナー(donor)のリンパ球を、腫瘍-特異的抗原由来のペプチドと一緒に培養すると、抗原-発現腫瘍を有する同種異系レシピエント(recipient)の中への非-生着ドナー(donor)リンパ球の注射投与の抗-腫瘍効果を、有意に増強させることができる。
［発明の概要］
本発明は、CD4+ T細胞を含む同種異系リンパ球を注射投与することは、そのドナー(donor)細胞がそのレシピエント(recipient)の中で長期間生着しないにも関わらず、宿主の抗-腫瘍のCD8+ T細胞におけるトレランスを破ることができること；並びに、同種異系応答性及びネオ抗原-特異的なCD4+T細胞を注射投与することは、内因性の腫瘍-特異的なCD8+ T細胞を疲弊から回復させて、腫瘍退縮をもたらすことができること、という独創的な発見に基づく。本発明は、腫瘍退縮をもたらす内因性の、腫瘍-特異的なCD8+T細胞を疲弊から回復させるための、がんを有する又は発症しやすい対象への、同種異系の、ウイルス-特異的な及び／又は腫瘍ネオ抗原(neoAg)-特異的なCD4+T細胞を注射投与することに関する、方法及び組成物、を含む。
ある実施形態では、本発明は、リンパ球組成物を製造する方法、ここで、前記方法は以下を含む、a) 末梢血細胞組成物をドナー(donor)から得る工程、ここで、前記ドナー(donor)は、任意選択的に、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するワクチン接種を受けている、並びにここで、前記末梢血組成物は、CD8+ T-細胞、CD4+ T-細胞、及びナチュラル・キラー細胞を含む；b) 末梢血細胞組成物のCD8+ T-細胞を減少させる工程、ここで、前記末梢血細胞組成物のCD8+ T-細胞を減少させることは、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T-細胞の数を、少なくとも1桁、減少させることである；並びに、c) CD4+ T細胞を前記抗原と培養することによって、前記抗原に対して特異的なCD4+ T細胞を増殖させる工程、ここで、前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)に対して、HLA-マッチ、部分的HLA-マッチ、又はHLA-ハプロ同一、であり、それによって、リンパ球組成物を製造する、を提供する。
別の実施形態では、本発明は、対象におけるがんを治療する方法、ここで、前記方法は以下を含む、a) リンパ球除去化学療法を前記対象に処方する工程；並びに、b) リンパ球細胞組成物を前記対象に処方する工程、ここで、そのリンパ球組成物を、HLA-マッチの、部分的HLA-ミスマッチの、又はHLA-ハプロ同一のドナー(donor)の末梢血細胞組成物から得る、ここで、前記ドナー(donor)は、任意選択的に、前記対象中に存在する、ウイルス抗原及び／又は腫瘍ネオ抗原に対するワクチン接種を受けている、ここで、前記組成物は、CD8+ T細胞が減少している、並びに、ここで、前記組成物は、前記対象中に存在する、ウイルスの及び／又は腫瘍ネオ抗原に対して特異的なCD4+ T細胞の、増殖した集団を含む、を提供する。ある態様では、部分的にHLA-マッチの又はHLA-ハプロ同一のドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを有する、並びに前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある。
更なる実施形態では、本発明は、ウイルス抗原、腫瘍ネオ抗原、又はそれらの組合せ、に対して特異的なCD4+ T細胞を含む細胞バンク、ここで、前記細胞バンクは、CD4+ T細胞の個別の株を含む、各株は、様々なヒト白血球抗原(HLA)型の単一ドナーから集めたものである、を提供する。ある態様では、前記ウイルス抗原は、HPV又はエプスタイン・バー・ウイルス、に由来する。
図１は、骨髄異形成症候群に対して、HLA-ハプロ同一の骨髄移植をした後に、移植片拒絶を経験した5例の患者のヘマトクリットを示し、ギザギザ部は輸血の影響を反映している(グラフ)。 図２は、非-生着DLIが抗-腫瘍免疫を誘導することを示す(グラフ)。 図３Ａは、ワクチン・プラス同種異系CD4(vaccine plus alloCD4s)が、生存期間を延長させることとして、ドナー(donor)細胞の生着を示す(グラフ)。図３Ｂは、ドナー(donor)CD4+ T細胞キメラと移植後日数のグラフを示す。 図４は、白血球アフェレシス製剤及び瀉血標本を用いて、CD8減少に関する検証の実施を示す(フロー・サイトメトリーの結果)。 図５は、一過的に生着する、MHC-ミスマッチのドナー(donor)リンパ球の注射投与の抗-腫瘍の有効性を説明するモデルを示す。 図６Ａは、図６Ｂの結果を得るために使用したプロトコルを示す。C57BL/6 x C3H(B6 x C3H; B6C3) F1マウス又はBALB/c x C57BL/6(BALB/c x B6; CB6)F1マウスに、25 μg のpcDNA-3-CRT/E7（ヒト・パピローマウイルス血清型16のE7に対する DNAワクチン）のワクチン接種を、週1回、計3回、行った。1週間後、ナイーブな又はワクチン接種を行ったマウスに由来する脾臓細胞は、CD8+ T細胞を減少させないままにした、又は減少させた。並びに、2,000万個の細胞を、B6 x C3H F1マウス（このマウスは、2週間前に、50,000個のE7-発現TC1肺がん細胞を、及び1日前に、200mg/kg IPでシクロフォスファミドを、受けた）の中に、注射投与した。腫瘍を担持しているマウスの生存を、同系B6 x C3H F1細胞のレシピエント(recipient)については左側に、及びMHC-ハプロ同一のBALB/c x B6 F1細胞のレシピエント(recipient)については右側に、示す。 図７Ａは、図７Ｂの結果を得るために使用したプロトコルを示す。図７Ｂは、腫瘍Agでプライミングを加えたドナー(donor)に由来する脾臓細胞をex vivoで培養することにより、NEDLIの抗-腫瘍の有効性が増強すること、を示すグラフである。E7-プライミングを加えたCB6 F1ドナー(donor)に由来する脾臓細胞を、HPV16由来のE7のオーバーラップするペンタデカマー(overlapping pentadecamers of E7 from HPV16)(JPT Peptide Tech.)でパルスした、CB6 F1(syn)又はB6C3 F1(haplo)樹状細胞(DC)と一緒に、培養した 図８Ａ-Ｈは、フロー・サイトメトリーによって得られたレシピエント(recipient)CD8+ T細胞の割合を示す。図８Ａは、E7の免疫優勢の、H-2Kb制限ペプチドに対して応答性であったCD8+ T細胞の割合を、ナイーブB6C3 F1マウス中での、前記ペプチドでパルスしたH-2K-b四量体での染色によって測定して、示す。図８Ｂは、E7の免疫優勢の、H-2Kb制限ペプチドに対して応答性であったCD8+ T細胞の割合を、ハプロDLIによって治癒したマウス中での、前記ペプチドでパルスしたH-2Kb四量体での染色によって測定して、示す。図８Ｃは、E7の免疫優勢の、H-2Kb制限ペプチドに対して応答性であったCD8+ T細胞の割合を、TC-1を接種した(TC-1 challenge)14日後、ハプロDLIによって治癒したマウス中での、前記ペプチドでパルスしたH-2Kb四量体での染色によって測定して、示す。図８Ｄは、E7の免疫優勢の、H-2Kb制限ペプチドに対して応答性であったCD8+ T細胞の割合を、TC-1を接種した(TC-1 challenge)60日後、ハプロDLIによって治癒したマウス中での、前記ペプチドでパルスしたH-2Kb四量体での染色によって測定して、示す。図８Ｅは、図８Ａと同じ条件下で、ゲーティングした、E7-特異的なCD8+ T細胞上での、CD127及びPD-1の細胞表面の発現を、示す。図８Ｆは、図８Ｂと同じ条件下で、ゲーティングした、E7-特異的なCD8+ T細胞上での、CD127及びPD-1の細胞表面の発現を、示す。図８Ｇは、図８Ｃと同じ条件下で、ゲーティングした、E7-特異的なCD8+ T細胞上での、CD127及びPD-1の細胞表面の発現を、示す。図８Ｈは、図８Ｄと同じ条件下で、ゲーティングした、E7-特異的なCD8+ T細胞上での、CD127及びPD-1の細胞表面の発現を、示す。 図９Ａは、非-パルスのB6 × C3H F1樹状細胞で刺激した5日後、非処置のB6 × C3H F1ナイーブ・マウスに由来するCD4+ T細胞について、細胞内のインターフェロン・ガンマ(IFNγ)及び腫瘍壊死因子α(TNFα)の染色を示す、ドット-プロットを示す。図９Ｂは、E7ペプチドでパルスしたDCで刺激した5日後、非処置のB6 × C3H F1ナイーブ・マウスに由来するCD4+ T細胞について、細胞内のインターフェロン・ガンマ(IFNγ)及び腫瘍壊死因子α(TNFα)の染色を示す。図９Ｃは、E7ペプチドでパルスしたDCで刺激した5日後、非-生着ドナー(donor)リンパ球の注射投与によって治癒したマウスに由来するCD4+ T細胞について、細胞内のインターフェロン・ガンマ(IFNγ)及び腫瘍壊死因子α(TNFα)の染色を示す。図９Ｄは、図９Ａ-Ｃに示したものと同じ細胞のIFNγ分泌に関するELISPOTアッセイにより定量した結果のグラフを示す。 図１０Ａは、図１０Ｂの結果を得るために使用したプロトコルを示す。TC1-担持B6 × C3H F1マウスを、シクロフォスファミド・プラスCD8を減少させたリンパ球（これは、E7-ワクチン接種を行ったドナー(donor)から採取して、E7ペプチドによりex vivo で増殖させた）、によって治癒させた。リンパ球の注射投与の300日後、その治癒したマウスに由来する脾臓細胞からCD8+細胞を減少させ、E7ペプチドと一緒に1週間培養し、1日前にシクロフォスファミドで処置した、TC1担持BALB/c × B6 F1マウスに、移植した（レシピエント(recipient)あたり2,000万個の細胞を培養物に入れた）。或いは、TC1担持BALB/c × B6 F1マウスは、CD8+細胞を減少させた、及び養子移植の1週間前にE7と一緒に培養した、ナイーブB6 × C3H F1ドナー(donor)に由来する脾臓細胞を、受けた。生存率を図１０Ｂに示す。 図１１Ａは、腫瘍免疫におけるAPCライセンシング(APC licensing)の必要性を判定するための、二親性の骨髄キメラの概略図を示す。図１１Ｂは、腫瘍免疫におけるAPCライセンシング(APC licensing)の必要性を判定するための、F1骨髄キメラの概略図を示す。 図１２は、CD4+T細胞ヘルプ(help)がどのようにして、ネオ抗原B、C、及びE（これらは、死につつある腫瘍細胞から放出される）に対して特異的なCD8+T細胞(eCTL)を疲弊から回復させるのか、を示す概略図を示す。
[発明の詳細な説明]
本発明は、少なくとも部分的には、がんに対する免疫応答が、患者のCD4+ T細胞の機能的欠陥によって妨げられる、という独創的な発見から生じている。同種異系リンパ球を注射投与すると、内因性の、腫瘍-応答性CD8+ T細胞のための、CD4+ T細胞ヘルプ(help)の外因性の供給源を提供することが可能になる。注射投与するドナー(donor)リンパ球からCD8+ T細胞を減少させることは、生着が持続することのリスク及び移植片対宿主病を減少させる。注射投与する集団から調節性T細胞が除かれると、非-調節性T細胞の作用能が増強し、抗-腫瘍免疫の内因性エフェクターへのヘルプを提供できるようになる。同種異系のT細胞療法は、典型的には同種異系の幹細胞移植との関連で行われ、そこでは、その患者は、免疫抑制性が高いコンディショニングを受けた後に、未選択集団の成熟T細胞を含む幹細胞移植片の注射投与を受ける。本出願に記載の治療においては、その移植片を操作することによって、ドナー(donor)細胞の生着が持続する可能性を最小限にする、及び抗-腫瘍エフェクターT細胞は、その宿主に由来する。従って、本治療は、ドナー(donor)細胞が一過的に生着している間における、宿主のリンパ球とドナー(donor)のリンパ球との、ユニークな協力関係を必要とする。
本発明の組成物及び方法が説明する前に、本発明は、記載される特定の組成物、方法、及び実験条件に限定されるものではなく、例えば、組成物、方法、及び条件は変わり得るということを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみに限定されるので、本出願で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明らかに別段の指示をしない限り、複数への言及を含む。従って、例えば、「本方法(the method)」への言及は、本出願に記載される種類に関する、複数の方法、及び／又は工程を含み、これらは、当業者にとって、本開示などを読めば、明らかになるであろう。
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個別の刊行物、特許、又は特許出願が具体的に且つ個別に示されることで参照により取り込まれるのと同じ程度に、本出願に参照により取り込まれる。
別段の規定をしない限り、本出願で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 及び Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本出願に記載される方法及び材料と類似する又は均等な任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、改変及び変形は、本発明の趣旨及び範囲内に包含されることが理解されよう。ここでは、好ましい方法及び材料について説明する。
同種異系細胞を注射投与する前に、化学療法を処方すると、移植したリンパ球のホメオスタシス増殖が促進されることによって、並びに／又は宿主の調節性T細胞及び骨髄由来サプレッサー細胞が減少することによって、一過的に生着するリンパ球の抗腫瘍作用を、増強させることができる。同種異系リンパ球を注射投与すると、内因性の、腫瘍-応答性CD8+ T細胞のための、CD4+ T細胞ヘルプの外因性の供給源を提供することが可能になる。注射投与するドナー(donor)リンパ球からCD8+ T細胞を減少させることは、生着が持続することのリスク及び移植片対宿主病を減少させる。注射投与する集団から調節性T細胞が除かれると、非-調節性T細胞の作用能が増強し、抗-腫瘍免疫の内因性エフェクターへのヘルプを提供できるようになる。
同種異系のT細胞療法は、典型的には同種異系の幹細胞移植との関連で行われ、そこでは、その患者は、免疫抑制性が高いコンディショニングを受けた後に、未選択集団の成熟T細胞を含む幹細胞移植片の注射投与を受ける。alloSCTの目標は、ドナー(donor)細胞の生着を持続的にすることであり、移植片対宿主病による死亡率のリスクを伴う。本出願に記載の治療においては、ぞの移植片を操作することによって、ドナー(donor)細胞の生着が持続する可能性を最小限にする、及び抗-腫瘍エフェクターT細胞は、その宿主に由来する。従って、本治療は、ドナー(donor)細胞が一過的に生着している間における、宿主のリンパ球とドナー(donor)のリンパ球との、ユニークな協力関係を必要とする。
これは、任意のヒトの又は動物のがんに適用することができる治療である。本発明の変形としては、1) 同種異系リンパ球を注射投与する前に処方される化学療法レジメンの変形（シクロフォスファミド, フルダラビン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ダサチニブ、それらの組み合わせ、を含み得る）；2) ドナー(donor)リンパ球の供給源における変形（血縁関係の又は非血縁関係のドナー(donor)由来であることがある、HLAクラスI又はクラスII対立遺伝子における定義されたミスマッチを含むことがある）；3) 注射投与をするために選択した細胞の種類における変形（例えば、CD4+CD25+調節性T細胞の減少、CD8+ T細胞の減少など）、が挙げられる。ドナー(donor)を、タイプI(IFN-γ産生)又はタイプ17(IL-17産生)CD4+ T細胞を富化するために、リンパ球の注射投与の前に、規定の抗原に対して免疫化することがある、又はex vivoでサイトカイン又は薬物を使って分極化することがある。
免疫システムのCD8+T細胞は、腫瘍ネオ抗原、がん細胞における変異によって生じるアミノ酸配列を認識することによって、がん細胞を破壊することができる、がん細胞をそれらの健康で正常な対応物と区別することができる。しかしながら、がんは、CD4+T細胞の機能（CD4+ T細胞の「ヘルプ(help)」は、ネオ抗原-特異的なCD8+T細胞が疲弊してしまうことを防止するために必要とされる）を麻痺させることによって、免疫による破壊を回避することができる。本発明の同種異系の移植片を使用して、患者の腫瘍に由来するネオ抗原に対するワクチン接種を受けた健常なドナー(donor)に由来する、CD4+ヘルパーT細胞の供給源を、新たに提供することによって、ネオ抗原-特異的なCD8+T細胞を疲弊から回復させることがある、及び抗-がん免疫応答を回復させることがある。
ある実施形態では、本発明は、ヒト・レシピエントに投与するための同種異系リンパ球組成物を製造する方法、ここで、前記方法は以下を含む：前記レシピエント中に存在する抗原に対するワクチン接種をヒト・ドナーに行う工程；前記レシピエントに対して同種異系であるヒト・ドナーに由来する末梢血細胞組成物を提供する工程、前記末梢血細胞組成物は、いくつかのCD4+ T細胞、いくつかのCD8+ T細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i) 前記ドナーは、前記レシピエント中に存在する抗原に対するCD4+ T細胞免疫を有する、(ii) 前記ドナーは、前記レシピエントに対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを含む、及び前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、並びに(iii) 前記レシピエントは、前記ドナーのヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない；並びに、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T細胞の数を、少なくとも1桁、減少させることにより、前記末梢血細胞組成物に由来する前記同種異系リンパ球組成物を製造する工程、ここで、前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T細胞の数と、約50%未満異なる、及び、ここで、前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、を提供する。
本発明は、レシピエントに投与するリンパ球組成物を製造する方法、ここで、前記方法は以下を含む、a) 末梢血細胞組成物をドナー(donor)から得る工程、ここで、前記ドナー(donor)は、任意選択的に、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するワクチン接種を受けている、並びにここで、前記末梢血組成物は、CD8+ T-細胞、CD4+ T-細胞、及びナチュラル・キラー細胞を含む；b) 末梢血細胞組成物のCD8+ T-細胞を減少させる工程、ここで、前記末梢血細胞組成物のCD8+ T-細胞を減少させることは、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T-細胞の数を、少なくとも1桁、減少させることである；並びに、c) CD4+ T細胞を前記抗原と培養することによって、前記抗原に対して特異的なCD4+ T細胞を増殖させる工程、ここで、前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)に対して、HLA-マッチ、部分的HLA-マッチ、又は-ハプロ同一、であり、それによって、リンパ球組成物を製造する、を提供する。ある態様では、部分的HLA-マッチの又はHLA-ハプロ同一のドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを有する、並びに、前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及び／又はHLA-DPB1、から選択される遺伝子にある。
好ましくは、前記ドナー(donor)及びレシピエント(recipient)は、同じヒトではない。前記方法は、前記レシピエント(recipient)に対して同種異系であるヒト・ドナー(donor)に由来する末梢血細胞組成物を提供する工程、前記末梢血細胞組成物は、いくつかのCD4+ T細胞、いくつかのCD8+ T細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、いくつかのナチュラル・キラー細胞は、CD8+抗原を有する、及び「減少させる」工程によって除去されることがある；しかしながら、本発明の好ましいリンパ球組成物は、前記ドナー(donor)に由来する、少なくともいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む。ある態様では、(i) 前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)に対して、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子ミスマッチを、前記ドナー(donor)対レシピエント(recipient)の方向性で、含む(前記ドナー(donor)対レシピエント(recipient)の方向性での、「移植片対宿主の方向性(graft-versus-host direction)」での、HLAクラスII対立遺伝子ミスマッチ)、及び前記HLAクラスII対立遺伝子ミスマッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、又はHLA-DPB1、などの遺伝子にある。前記レシピエントは、前記ドナーのヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない（この文脈における「検出可能な抗体(detectable antibodies)」は、この判定を行う標準的な方法を用いて、規定される）。（例えば、前記レシピエント(recipient)は、補体-依存性の細胞傷害性によって検出可能な、ドナー(donor)のHLA分子に対する抗体を有さない、フロー・サイトメトリー・クロス-マッチ・アッセイでは、陽性結果は望ましくない、又は固相免疫アッセイで、3000以上の平均蛍光強度(MFI)は許容できない）。ある態様では、前記ドナー(donor)は、前記ドナー(donor)が抗-レシピエント(recipient)(移植片対宿主)の方向性である、前記レシピエント(recipient)に対する少なくとも1つのHLAクラスII対立遺伝子ミスマッチを有する、並びに、前記HLAクラスII対立遺伝子ミスマッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある。
「ウイルス-特異的な、又は腫瘍ネオ抗原-特異的なT細胞の細胞集団を増殖させること（”Expanding” a cell population of virus-specific or tumor neoantigen-specific T cells”）」は、ウイルス又は腫瘍ネオ抗原に対して応答性のT細胞を、前記ウイルス又は前記腫瘍ネオ抗原に曝露されたことがない健常な個体において見出されるよりも、高い頻度で含む、リンパ球集団を生成することを指す。
前記同種異系リンパ球組成物を、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T-細胞の数を、少なくとも1桁、減少させることによって、前記末梢血細胞組成物から製造する、ここで、(a) 前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる。好ましい実施形態では、前記リンパ球組成物中の、CD4+ T細胞の数/CD8+ T細胞の数の比率は、好ましくは約30以上である。いくつかの実施形態の実施例としては、限定されるものではないが、レシピエント(recipient)の理想体重1キログラム当たり、以下の用量が挙げられる：105個のCD4+細胞を含むリンパ球組成物は、典型的には、3.2 X 103個以下のCD8+細胞を有する、106 個のCD4+細胞を含むリンパ球組成物は、典型的には、3.2 X 104 個以下のCD8+細胞を有する、107個のCD4+細胞を含むリンパ球組成物は、典型的には、3.2 X 105 個以下のCD8+細胞を有する、108 個のCD4+細胞を含むリンパ球組成物は、典型的には、3.2 X 106個以下のCD8+細胞を有する、及び5 x 108 個のCD4+細胞を含むリンパ球組成物は、典型的には、1.6 X 107 個以下のCD8+細胞を有する。
前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である。1桁の大きさで、好ましくは約2桁の大きさで、より好ましくは約5桁の大きさで、減少している。ある実施形態では、CD8+細胞の数は、(例えば、磁気ビーズ細胞選別法を使用して)約2.5桁の大きさで、減少している。
「CD8+ T細胞を減少させる（depleted of CD8+ T cells）」とは、CD8+ T細胞の数が、混合細胞の集団において、CD8+に対する抗体プラス補体などの方法、又は磁気細胞分離によって減少し、その結果、減少させていない集団と比較して、CD4+ T細胞などの他の細胞に対する、CD8+ T細胞の数が、少なくとも10倍、より低くなることを指す。例えば、減少させていない末梢血集団における、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の比率が1.5:1であれば、CD8+ T細胞を減少させた集団における、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞の比率は、15:1以上である。
本出願で使用する場合、用語「ワクチン接種(vaccination)」は、投与時に、病原体又はがん細胞などの罹患細胞を認識する、及び攻撃する、ことができる免疫応答（特に、細胞性免疫応答）を誘導する、ワクチン、医薬製剤(医薬組成物)又は生成物を投与することに関する。ワクチンを使用して、疾患を予防する、又は治療する、ことがある。用語「免疫応答(immune response)」は、抗原に対する統合された身体応答を指し、好ましくは、細胞性免疫応答、又は細胞性免疫応答並びに液性免疫応答、を指す。前記免疫応答は、保護的／予防的(preventive)／予防的(prophylactic)及び／又は治療的、であることがある。「免疫応答を誘導すること（inducing an immune response）」は、誘導前には特定の抗原に対する免疫応答が無かったことを意味することがあるが、誘導前に特定の抗原に対するある程度のレベルの免疫応答があり、誘導後にその免疫応答が増強する、ことを意味することもある。従って、「免疫応答を誘導すること（inducing an immune response）」は、「免疫応答を増強すること（enhancing an immune response）」も含む。好ましくは、対象において免疫応答を誘導した後、免疫応答を誘導することによって、前記対象は、がん疾患などの疾患の発症から保護される、又は前記疾患の症状が改善する。例えば、腫瘍発現抗原に対する免疫応答は、ドナー(donor)において誘導されることがある、これは、がん疾患を有するレシピエント(recipient)対象が、前記がん疾患と戦うことを、助ける。この症例において免疫応答を誘導することは、前記対象の前記疾患の症状が改善すること、前記対象が転移を発症しないこと、又はがん疾患を発症するリスクがある対象ががん疾患を発症しないこと、を意味することがある。
本発明において、「腫瘍-抗原に対するワクチン接種（vaccination against a tumor-antigen）」は、特定のドナー(donor)対象に関する（このドナー(donor)対象は、腫瘍中に又はがんを有するレシピエント(recipient)対象中に、存在する腫瘍抗原に対して免疫化されている）。ワクチン接種は、例えば、単一のneoAg、単回用量のワクチン、又は抗-腫瘍免疫を増強するためのワクチン製剤、を用いて行うことがある。十分な免疫化が達成されない場合、mRNAペンタトープ・ワクチン（mRNA pentatope vaccines）を使って、ワクチン接種をドナー(donor)に行うことがある。
用語「対象」は、本出願に記載の方法を実施することがある、任意の個体又は患者を指す。一般に、前記対象はヒトであるが、当業者によって理解されるように、前記対象は動物であってもよい。従って、げっ歯類(例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモットなど)、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜（ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなど）、並びに霊長類(例えば、サル、チンパンジー、オランウータン及びゴリラなど)、などの哺乳動物を含む他の動物が、対象の定義に含まれる。
用語「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」、「治療(treatment)」は、本明細書で互換的に使用され、障害及び／又はそれに関連する症状(symptom)を、低減すること、又は改善すること、を意味する。排除するものではないが、障害又は症状を治療することは、前記障害、それに関連する症状(condition)又は症状(symptom)が完全に除かれることを必要としないこと、が理解されるであろう。
本出願に記載の治療を、がん若しくは疾患、障害、又はそれらの症状(symptom)、に罹患している、を有している、に罹患しやすい、又はそれらのリスクがある、対象に、特にヒトに、適切に処方することがある。「リスクがある」対象を判定することを、対象又は医療提供者による診断試験又は見解による、任意の客観的な又は主観的な判定法（例えば、遺伝子試験、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー［本出願に定義される］、家族歴など）によって、行うことがある。
ある態様では、前記ドナー(donor)及びレシピエント(recipient)は、ABO血液型不適合である、並びに前記末梢血細胞組成物は、多数の赤血球細胞を含む、そして、前記同種異系リンパ球組成物を製造することは、赤血球細胞の数を減少させることを、更に含む。「ABO血液型不適合」とは、本出願で使用する場合、前記レシピエント(recipient)が、前記ドナー(donor)に対して、主要なABO赤血球細胞不適合性を有する場合を指し、例えば、前記レシピエント(recipient)が血液型Oであり且つ前記ドナー(donor)が血液型A、B、又はABである、前記レシピエント(recipient)がA型であり且つ前記ドナー(donor)がB型又はAB型である、又は前記レシピエント(recipient)がB型であり且つ前記ドナー(donor)がA型又はAB型である。
いくつかの態様では、前記ドナー(donor)は、がんを有さないドナーである、及びここで、前記がんを有さないドナーは、がんを有する対象に対して、少なくとも1つのHLAクラスII対立遺伝子マッチを有する。
本出願で使用する場合、用語「ドナー(donor)」は、ワクチン接種を受ける、及びそこから細胞を単離して前記リンパ球組成物を作成する、対象を指す。全体を通してさらに詳述するように、前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)と少なくとも部分的にHLA-マッチである、同種異系のドナー(donor)である。がんを有さないとは、前記ドナー(donor)が、（少なくとも、前記ドナー(donor)から末梢血細胞組成物を取得する時期に、）がんを有さないこと、を意味する。
いくつかの態様では、赤血球細胞の数は、充填体積（packed volume）が約50 ml以下である、例えば、充填体積が約50 ml以下である、好ましくは、充填体積が約30 ml以下である、更には、「充填体積（packed volume）」が定義されるべきであり、例えば、前記リンパ球組成物を遠心分離すると、赤血球細胞の50ml以下の充填体積となる；前記リンパ球組成物の体積を測定したサンプルをスクリーニングして、相対的に表す体積の濃厚血液細胞（packed blood cell）を提供することもある。
いくつかの態様では、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原を、新生物抗原、新生物イディオタイプ、ウイルス抗原、バクテリア抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、非-ヒト動物抗原、腫瘍ネオ抗原、及びそれらの組合せ、からなる群より選択する。
「腫瘍ネオエピトープ（tumor neoepitopes）」又は「腫瘍ネオ抗原（tumor neoantigen）」は、同じがん患者由来の、腫瘍組織の全ゲノム又は全エクソーム配列と、非腫瘍組織の全ゲノム又は全エクソーム配列とを比較すること、発現したネオエピトープを同定するためのRNAseq、などの方法によって、及び、例えば予測アルゴリズム、タグを付けた対立遺伝子構築物を使って単一-対立遺伝子を精製すること、又はがん患者及びがんを有さないドナーが共有する、特異的なHLAクラスII対立遺伝子によって提示されるエピトープを同定するための免疫ペプチドームのディープ・モチーフ・デコンボリューション（deep motif deconvolution of immunopeptidomes）などの方法によって、同定されるエピトープである。
様々な態様では、前記抗原は新生物抗原である、及びここで、前記新生物抗原は腫瘍抗原である。
ある態様では、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原を、新生物抗原（新生物抗原は、新生物に関連する抗原であり、新生物は、任意の新規な及び異常な細胞増殖として定義され、具体的には細胞複製が制御されず、進行性であるものである）からなる群より選択する。新生物は良性、前-悪性又は悪性、であることがある、及びがんは悪性新生物である。従って、全てのがん抗原は新生物抗原であるが、全ての新生物抗原はがん抗原というわけではない。新生物イディオタイプ(Id)は、（例えば、細胞表面上にこの分子を発現するB細胞悪性腫瘍［例えば、リンパ腫又は多発性骨髄腫］における）腫瘍-特異的なターゲットである、並びにウイルス抗原、バクテリア抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、及び非-ヒト動物抗原、が挙げられる。
いくつかの態様では、前記ウイルス抗原を、ヒト・パピローマウイルス(HPV)E6抗原、HPV E7抗原、及びそれらの組合せ、からなる群より選択する。他の態様では、前記ウイルス抗原を、エプスタインバー・ウイルス(Epstein-Barr virus)潜伏感染膜タンパク質1(latent membrane protein 1 (LMP1))、潜伏感染膜タンパク質2a(latent membrane protein 2a (LMP 2a))、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択する。
ある態様では、前記腫瘍抗原は、レシピエント(recipient)の腫瘍に由来する抗原である。
多くの態様では、前記レシピエント(recipient)、前記ドナー(donor)及び複数の潜在的な同種異系のドナー(donor)、からなる群より選択される対象を、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原、肝炎ウイルス抗原、及びサイトメガロウイルス抗原からなる群より選択される感染体の抗原に対する血清学的応答性について、スクリーニングした。
いくつかの態様では、複数の選択特性についてのスクリーニングを行い、前記スクリーニングを、前記レシピエント(recipient)、前記ドナー(donor)、及び複数の潜在的な同種異系のドナー(donor)、からなる群より選択される対象に対して行う。例えば、選択特性は、感染体の抗原に対する血清学的応答性についてのスクリーニングである。感染体の抗原を、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原、肝炎ウイルス抗原、及びサイトメガロウイルス抗原、からなる群より選択する。スクリーニングするべき重要な主体としては、例えば、HIV-1抗原、HIV-2抗原、A型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎ウイルス抗原、C型肝炎ウイルス抗原、CMV抗原、感染性疾患などが挙げられる。ウイルス若しくは感染体、又はその抗原が療法のターゲットである場合、その主体に対する所望のCD4+媒介性免疫応答を有するドナー(donor)を除外しない。
ある態様では、前記感染体の抗原は、サイトメガロウイルス抗原である、前記レシピエント(recipient)及び前記ドナー(donor)をスクリーニングし、前記レシピエント(recipient)又は前記ドナー(donor)中にはサイトメガロウイルス抗原に対する血清学的応答性はない。ある態様では、前記ウイルス抗原はインフルエンザ抗原である、及びインフルエンザ抗原は、ヘマグルチニン抗原又はノイラミニダーゼ抗原である。
別の態様では、選択特性は、2つ以上のHLAクラスII対立遺伝子についてのスクリーニングである。ある特定の例では、複数のHLAクラスII対立遺伝子において、潜在的な同種異系のドナー(donor)対レシピエント(recipient)の方向性での、潜在的な同種異系のドナー(donor)とレシピエント(recipient)との間のミスマッチを最大化することに基づいて、潜在的な同種異系のドナー(donor)を、選択する、及び前記潜在的な同種異系のドナー(donor)をドナー(donor)として選択する。ある特定の例では、選択特性は、複数のHLAクラスI対立遺伝子についてのスクリーニングである。
複数のHLAクラスI対立遺伝子において、潜在的な同種異系のドナー(donor)とレシピエント(recipient)との間のミスマッチを最小化することに基づいて、潜在的な同種異系のドナー(donor)を、選択することがある、及び前記潜在的な同種異系のドナー(donor)をドナー(donor)として選択する。
ある態様では、前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約20%未満異なる。いくつかの実施形態では、前記CD4+ T-細胞は、約50%未満、約40%未満、好ましくは約20%未満、より好ましくは約10%未満である。いくつかの実施形態では、CD4+ T-細胞をex vivo増殖させることを実施することがある、そのような実施形態では、CD4+ T-細胞の数は、その元の数を大幅に超えることがある。そのように増殖させることは、代替の実施形態である。更に、「前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる（differs from the number of CD4+ T-cells in the peripheral blood cell composition by less than about 50%）」とは、プラスの又はマイナスの前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数の50%未満、を意味する。例えば、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数が1X105個のCD4+細胞である場合、「前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる（differs from the number of CD4+ T-cells in the peripheral blood cell composition by less than about 50%）」とは、CD4+ T-細胞の数が1.5 X 105個と0.5 X 105との間であること、を意味する。
様々な態様では、前記ドナー(donor)から得られたCD4+ T-細胞を、ex vivoで、意図的に増殖させない、又は意図的に分化させない。意図的に増殖させる、又は意図的に分化させる、とは、本方法の単なる副次的効果（意図的ではない、うっかり）である、CD4+ T-細胞の増殖又は分化と区別される、例えば、CD4+ T-細胞は、時々、プラスチックと接触するようになる（そのようなうっかりのイベントの他の例）ことで、分化するようになることがある。別の実施形態では、前記レシピエント(recipient)に対して同種異系である、末梢血細胞組成物のドナー(donor)において、幹細胞が動員されたことがない、という条件が更にある。
いくつかの態様では、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T-細胞を減少させることは、磁性微粒子に結合した抗-CD8+抗体、又は抗-CD8+抗体プラス補体、を使用することを含む。前記末梢血細胞組成物は、例えば、全血製剤又はアフェレシス製剤、であることがある。更に、前記ドナー(donor)対前記レシピエント(recipient)の方向性でのHLAクラスII対立遺伝子ミスマッチは、HLA-DRB1のミスマッチであることがある。前記ドナー(donor)対レシピエント(recipient)の方向性でのHLAクラスII対立遺伝子ミスマッチは、例えば、「移植片対宿主の方向性（graft-versus-host direction）」である、ここで、同種異系ドナー(donor)対前記レシピエント(recipient)の方向性での、少なくとも1つのHLAクラスII対立遺伝子ミスマッチは、前記同種異系ドナー(donor)と前記レシピエント(recipient)の複数の第一度血縁者(first degree relatives)との間の、同じHLAクラスII対立遺伝子ミスマッチ、を更に含む、このことは、前記第一度血縁者(first degree relatives)から前記レシピエント(recipient)への骨髄移植の機会を維持するために望ましい；理想的には、ドナー(donor)とレシピエント(recipient)との間のミスマッチの全ては、潜在的な家族の骨髄ドナー(donor)と前記レシピエント(recipient)との間に、存在しない。
ある態様では、キログラム(kg)として前記レシピエント(recipient)の理想体重に基づくドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、約1×105個のCD4+T-細胞/kgと約1×109個のCD4+T-細胞/kgとの間である。前記組成物中では、理想体重（ideal body weight (IBW)）に基づくドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、身長に基づく。男性では、5フィート以上での、IBW = 50 + 2.3kg/インチ。女性の場合、キログラム(kg)として前記レシピエント(recipient)の、5フィート以上での、IBW = 45.5 + 2.3kg/インチは、約1×105個のCD4+T-細胞/kgと約1×109個のCD4+T-細胞/kgとの間である（好ましい実施形態では、約1×106個のCD4+T-細胞/kgと約5×108個のCD4+T-細胞/kgとの間である）；前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、及び前記同種異系リンパ球組成物は、前記末梢血細胞組成物と比較して、少なくとも1桁少ないCD8+ T-細胞を有する。
他の態様では、前記同種異系リンパ球組成物は、前記末梢血細胞組成物と比較して、少なくとも1桁少ないCD8+ T細胞を有する。
いくつかの態様では、前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)中に存在しない抗原に対するCD4+ T-細胞免疫を有する。
多くの態様では、ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するCD4+ T-細胞免疫を有する。本出願で使用する場合、「CD4+ T-細胞免疫を有する（having CD4+ T-cell immunity）」とは、ワクチン接種のために使用された特異的抗原に対して向けられた、前記ドナー(donor)における免疫応答を誘導するワクチン接種の有効性（このことは、CD4+ T-細胞の新しいクローンのドナー(donor)における増殖に言い換えられる）、を指す。
他の態様では、前記レシピエント(recipient)は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない。
別の実施形態では、本発明は、対象におけるがんを治療する方法、前記方法は、リンパ球除去化学療法を前記対象に処方する工程；並びにリンパ球組成物を前記対象に投与する工程、を含む、ここで、前記リンパ球組成物を、前記対象中に存在する、ウイルス抗原及び／又は腫瘍ネオ抗原に対するワクチン接種を受けた、HLA-マッチの、又はHLA-ハプロ同一のドナー(donor)の末梢血細胞組成物から取得する、ここで、前記組成物は、CD8+ T細胞が減少している、並びにここで、前記組成物は、前記対象中に存在する、前記ウイルス及び／又は腫瘍ネオ抗原に対して特異的なCD4+ T細胞の、増殖した集団を含む、を提供する。
本発明の組成物及び方法を、広範囲のがん及び腫瘍の種類（例えば、限定されるものではないが、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、胃腸管がん、泌尿生殖器がん、頭頸部がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、腎臓がん(renal cancer)、皮膚がん、及び精巣がん、など）に対して使用することがある。より具体的には、本出願に記載される組成物及び方法によって治療することがあるがんとしては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：心臓がん、例えば、肉腫、例えば、血管肉腫(angiosarcoma)、線維肉腫、横紋筋肉腫(rhabdomyosarcoma)、及び、脂肪肉腫；粘液腫；横紋筋腫；線維腫；脂肪腫、及び奇形腫；肺がん、例えば、気管支原性がん腫(bronchogenic carcinoma)、例えば、扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、及び腺がん腫；肺胞および細気管支がん腫(alveolar and bronchiolar carcinoma)；気管支腺腫；肉腫；リンパ腫；軟骨性過誤腫；及び、中皮腫；胃腸管がん、例えば、食道がん、例えば、扁平上皮がん(squamous cell carcinoma)、腺がん腫、平滑筋肉腫、及び、リンパ腫；胃がん、例えば、がん腫(carcinoma)、リンパ腫、及び平滑筋肉腫；膵がん、例えば、導管腺がん腫、膵島細胞腫、グルカゴノーマ(glucagonoma)、ガストリノーマ(gastrinoma)、カルチノイド腫瘍、及びビポーマ(vipoma)；小腸がん、例えば、腺がん腫、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫(Kaposi's Sarcoma)、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、及び線維腫；大腸がん、例えば、腺がん腫、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、及び、平滑筋腫；尿生殖路がん、例えば、腎臓がん、例えば、腺がん腫、ウィルムス腫瘍(Wilm's tumor)(腎芽細胞腫)、リンパ腫、及び、白血病；膀胱と尿道がん、例えば、扁平上皮がん(squamous cell carcinoma)、移行細胞がん腫(transitional cell carcinoma)、及び腺がん腫；前立腺がん、例えば、腺がん腫、及び、肉腫；精巣がん、例えば、精上皮腫、奇形腫、胎児性がん腫(embryonal carcinoma)、奇形がん腫、絨毛がん(choriocarcinoma)、肉腫、間質性細胞がん腫(interstitial cell carcinoma)、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、及び、リンパ腫(limphoma)；肝臓がん、例えば、肝がん、例えば、肝細胞がん腫(hepatocellular carcinoma)；胆管がん腫；肝芽腫；血管肉腫(angiosarcoma)；肝細胞腺腫；及び、血管腫；骨がん、例えば、骨肉腫(骨肉腫)、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫(Ewing's Sarcoma)、悪性リンパ腫(細網肉腫)、多発性骨髄腫、悪性巨大細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫(osteochrondroma)（骨軟骨性外骨症(osteocartilaginous exostoses)）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫(chondromyxofibroma)、類骨骨腫、及び、巨大細胞腫瘍；神経系がん、例えば、頭蓋骨がん、例えば、骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、及び、消化性骨炎；髄膜がん、例えば、髄膜腫、髄膜肉腫、及び、神経膠腫症；脳内がん、例えば、星状膠細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性膠芽腫、オリゴデンドログリオーマ、神経鞘腫、網膜芽腫、及び、先天性腫瘍；並びに、脊髄がん、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、及び、肉腫；婦人科がん、例えば、子宮がん、例えば、子宮内膜がん腫；子宮頸部がん、例えば、子宮頸がん腫(cervical carcinoma)、及び、前腫瘍子宮頸部異形成；卵巣がん、例えば、卵巣がん腫(ovarian carcinoma)、例えば、漿液性嚢胞腺がん腫、ムチン性嚢胞腺がん腫、未分類がん腫(unclassified carcinoma)、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫（Sertoli Leydig cell tumors）、未分化胚細胞腫、及び、悪性奇形腫；外陰部がん、例えば、扁平上皮がん(squamous cell carcinoma)、上皮内がん腫(intraepithelial carcinoma)、腺がん腫、線維肉腫、及び、メラノーマ；膣がん、例えば、明細胞がん腫(clear cell carcinoma)、扁平上皮がん(squamous cell carcinoma)、ブドウ状肉腫、及び、胎児性横紋筋肉腫；並びに、卵管がん、例えば、がん腫(carcinoma)；血液がん(hematologic cancers)、例えば、血液がん(cancers of the blood)、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、及び、骨髄異形成症候群、ホジキン・リンパ腫、非-ホジキン・リンパ腫(non-Hodgkin's lymphoma)（悪性リンパ腫）、及び、ヴァルデンストレーム・マクログロブリン血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)；皮膚がん、例えば、悪性メラノーマ、基底細胞がん(basal cell carcinoma)、扁平上皮がん(squamous cell carcinoma)、カポジ肉腫(Kaposi's Sarcoma)、異形成母斑(moles dysplastic nevi)、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；並びに、副腎がん、及び、神経芽細胞腫。ある特定の実施形態では、前記疾患ががんである場合、前記疾患としては、例えば、肺がん腫瘍、乳がん腫瘍、前立腺がん腫瘍、脳がん腫瘍、又は、皮膚がん腫瘍、が挙げられる。
本発明の組成物を、様々な経路（例えば、経口、局所、非経口、膣内、全身、筋肉内、直腸又は静脈内）で、個体に投与することがある。ある特定の実施形態では、前記組成物は、薬学的な担体と一緒に製剤化されている。好ましくは、前記組成物を静脈内に投与する。
いくつかの実施形態では、前記組成物を、他の抗-ウイルス療法又は抗がん療法、例えば、抗-ウイルス薬剤又は抗-がん薬剤を投与すること、照射療法、光療法又は免疫療法、と併用する。前記抗-ウイルス薬剤又は前記抗-がん薬剤を、同一の製剤として、又は別々の製剤として、発明の組成物と一緒に投与し、治療を増強することがある。これらの実施形態では、前記組成物及び他の療法を、同じ時間に（同時に）、又は別々の時間に(連続して)、処方することがある（但し、所望の効果を有するように、そのような様式で、及び十分に近い時間で、それらを処方するという条件において）。
本発明の組成物を、がんを治療する既存の方法（例えば、化学療法、照射又は外科手術）と併用して、投与することもある。従って、有効量の発明組成物を個体に投与することを含む、がんを治療する方法（前記個体はそのような治療を必要とする）、ここで、有効量の少なくとも1つの更なるがん化学療法剤を、前記個体に投与する、が更に提供される。好適な化学療法剤の例としては、以下のうちの任意が挙げられる：アバレリクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ(bortezombi)、ボルテゾミブ(bortezomib)、ブスルファン静注、ブスルファン経口、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダルテパリン・ナトリウム、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキン、デニロイキン・ジフチトクス、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エクリズマブ、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシド、エキセメスタン、クエン酸フェンタニル、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ・オゾガミシン、ゴセレリン酢酸塩、ヒストレリン酢酸塩、イブリツモマブ・チウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン・アルファ2a、イリノテカン、ラパチニブ・ジトシル酸塩、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド酢酸塩、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン(meclorethamine)、メゲストロール酢酸塩、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンC、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン・フェンプロピオン酸エステル、ネララビン(nelarabine)、ノフェツモマブ(nofetumomab)、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、パニツムマブ、ペグアスパラガーゼ、ペグフィルグラスチム(pegfilgrastim)、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、マレイン酸スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシル・マスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ボリノスタット、及び、ゾレドロネート。
ある態様では、前記対象に投与するための同種異系リンパ球組成物を製造することは以下を含む：レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するワクチン接種をヒト・ドナー(donor)に行う工程、ここで、前記レシピエント(recipient)は、前記対象である；前記レシピエント(recipient)に対して同種異系であるヒト・ドナー(donor)に由来する末梢血細胞組成物を提供する工程、前記末梢血細胞組成物は、いくつかのCD4+ T-細胞、いくつかのCD8+ T-細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i)前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するCD4+ T-細胞免疫を有する、(ii)前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)に対する少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを含む、及び前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、並びに(iii)前記レシピエント(recipient)は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない；並びに、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T-細胞の数を、少なくとも1桁、減少させることにより、前記末梢血細胞組成物に由来する前記同種異系リンパ球組成物を製造する工程、ここで、前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる、及びここで、前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である。
様々な態様では、前記対象に同種異系リンパ球組成物を投与する前に、前記方法は、リンパ球-減少・非-リンパ球-破壊の治療を前記対象に処方して、前記対象において一過的なリンパ球減少症を誘導する工程；骨髄-由来サプレッサー細胞を、減少させる、若しくは阻害する、ための治療を処方する工程；腫瘍関連マクロファージ細胞を、減少させる、若しくは阻害するための治療を処方する工程、又は調節性T細胞を減少させるための治療を処方する工程；を更に含む、又はここで、前記対象に前記同種異系リンパ球組成物を投与することに続いて、前記方法は、同種異系応答性のT-細胞を選択的に減少させることを誘発するための薬物を投与すること、を更に含む。
ある態様では、前記リンパ球-減少・非-リンパ球-破壊の治療は、前記対象を、アルキル化剤、アルキル・スルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、代謝拮抗剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、ビンカ・アルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質、ジブロモマンニトール、デオキシスペルグアリン、ジメチル・ミレラン、及びチオテパ、からなる群より選択される1つ又は複数の細胞-減少性の薬剤で、治療することを含む。ある態様では、前記リンパ球-減少・非-リンパ球-破壊の治療は、前記対象を、アルキル化剤で治療することを含む、及び前記アルキル化剤はシクロフォスファミドである。ある態様では、第1の同種異系リンパ球組成物を前記対象に投与した後、前記方法は、抗-腫瘍モノクローナル抗体又は抗-腫瘍モノクローナル抗体／薬物コンジュゲートを前記対象に投与すること、を更に含む。
「リンパ球-減少療法(lympho-depleting therapy)」、「リンパ球-減少療法(lympho-reductive therapy)」などは、末梢血中のリンパ球の濃度を減少させる、化学療法剤などの、薬物又は他の薬剤、を指すことを意味する。「減少させる(reduce)」とは、少なくとも10%、25%、50%、75%、又は100%の負の変化を意味する。
ある態様では、方法は、抗-腫瘍モノクローナル抗体を投与することを更に含む、並びに前記抗-腫瘍モノクローナル抗体を、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、及びペルツズマブ、からなる群より選択する。ある態様では、本発明は、抗-腫瘍モノクローナル抗体／薬物コンジュゲートを投与することを更に含む、並びに前記抗-腫瘍モノクローナル抗体／薬物コンジュゲートを、ブレンツキシマブベドチン、ゲムツズマブ・オゾガミシン、トラスツズマブ・エムタンシン、イノツズマブ・オゾガミシン、グレンバツムマブ・ベドチン、ロルボツズマブ・メルタンシン、カンツズマブ・メルタンシン、及びミラツズマブ-ドキソルビシン、からなる群より選択する。いくつかの態様では、投与は、最初に、同種異系リンパ球組成物である、次いで、化学療法剤を前記対象に投与する。例えば、前記化学療法剤を、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、及びビスモデギブ、からなる群より選択する。
他の態様では、前記対象に前記同種異系リンパ球組成物を投与する前に、前記治療は、ダサチニブ、5-フルオロウラシル、タキソテール、クロドロネート、ゲムシタビン、シクロフォスファミド、フルダラビン、デニロイキン・ジフチトクス、及びダクリズマブ、からなる群より選択される薬物を投与することを含む。
いくつかの態様では、前記末梢血細胞組成物は、全血製剤又はアフェレシス製剤である。
様々な態様では、前記対象は、腫瘍の中に、ナノ粒子組成物の注射投与を受けたことがある、ここで、前記ナノ粒子組成物は、前記対象中に存在しない抗原を含むナノ粒子を含む。多くの態様では、前記ナノ粒子は、サイトカインを更に含む、ここで、前記サイトカインは、インターロイキンである、並びにIL-2、IL-7、IL-12、及びIL-15からなる群より選択される；又は前記サイトカインは、インターフェロンである、並びにインターフェロン・ガンマ、インターフェロン・ベータ、インターフェロン・アルファ、インターフェロン、タウ、インターフェロン・オメガ、及びコンセンサス・インターフェロン、からなる群より選択される。
更なる実施形態では、本発明は、ウイルス抗原、腫瘍ネオ抗原、又はそれらの組合せ、に特異的であるCD4+ T細胞を含む細胞バンク、ここで、前記細胞バンクは、様々なヒト白血球抗原(HLA)タイプのドナー(donor)から収集したCD4+ T細胞を含む、を提供する。
様々な態様では、前記ウイルス抗原はHPV抗原である。
ある実施形態では、本発明は、本出願に記載の本発明の方法によって得られる、ヒト・レシピエント(recipient)への投与のための、同種異系リンパ球組成物、を提供する。
もし、前記レシピエント(recipient)がCMV抗原に対して血清陽性である場合、前記ドナー(donor)の状況は重要ではない。前記ドナー(donor)が、前記レシピエント(recipient)中に存在する、又は前記レシピエント(recipient)に送達されるのであろう、抗原に対して免疫化されていない、ある特定の実施形態では、CD4+ T-細胞へルプを送達することは、前記レシピエント(recipient)の細胞上の同種異系HLAクラスII分子をドナー(donor)CD4+ T-細胞が認識すること、に付随する。本発明のこれらの実施形態を例示する目的のための「理想的なドナー(ideal donor)」の例は、HLAクラスII対立遺伝子(特に、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1)において、完全にミスマッチである、並びにクラスI対立遺伝子について、完全にマッチである(その結果、前記レシピエント(recipient)におけるドナー(donor)細胞の生存が最大化し、クラスI分子に対する同種異系の抗体が生成されることが最小化する)。更に、前記理想的なドナー(ideal donor)は、同種異系の幹細胞移植の潜在的なドナー(donor)である、前記レシピエント(recipient)の第一度血縁者(first degree relatives)の、非共有HLAと完全にミスマッチである。
ある実施形態では、ヒト・レシピエント(recipient)に投与するための、ヒト、同種異系ドナーに由来する末梢血細胞組成物に由来する同種異系リンパ球組成物、前記同種異系リンパ球組成物は、前記ドナーの前記末梢血細胞組成物に由来する、いくつかのCD4+ T-細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i) 前記ドナーは、前記ドナー対前記レシピエントの方向性での、前記レシピエントに対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子ミスマッチを含む、及び前記HLAクラスII対立遺伝子ミスマッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、(ii) 前記レシピエント(recipient)は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない、(iii) 前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる（例えば、限定されるものではないが、約50%未満、約40%未満、好ましくは約20%未満、より好ましくは約10%未満）、がある。
また、ヒト対象における疾患又は症状を治療する方法、前記方法は、リンパ球-減少（本発明のこの態様のいくつかの実施形態では、リンパ球-減少・非-リンパ球-破壊の治療を提供して、投与したリンパ球のホメオスタシス増殖及び分化を促進することが望ましい；他の実施形態では、前記治療はまた、骨髄-減少［即ち、骨髄-由来サプレッサー細胞、腫瘍関連マクロファージ、及び又はN2好中球、などを含む抑制性の骨髄集団を阻害すること、又は減少させること］であることも望ましい）非-リンパ球-破壊の治療を前記対象に処方して、前記対象におけるリンパ球減少を一過的に誘導すること；並びに続いて、前記対象に、ヒト、同種異系ドナーに由来する末梢血細胞組成物に由来する第1の同種異系リンパ球組成物を投与する、前記第1の同種異系リンパ球組成物は、前記ドナーの前記末梢血細胞組成物に由来する、いくつかのCD4+ T-細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i) 前記ドナーは、前記ドナー対前記対象の方向性での、前記対象に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子ミスマッチを含む、及び前記HLAクラスII対立遺伝子ミスマッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、(ii) 前記対象は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない、(iii) 前記第1の同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる、キログラム(kg)として前記対象の理想体重に基づくドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、約1×105個のCD4+T-細胞/kgと約1×109個のCD4+T-細胞/kgとの間である、(v) 前記第1の同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、並びに(vi) 第1の同種異系リンパ球組成物は、前記末梢血細胞組成物と比較して、少なくとも1桁少ないCD8＋ T細胞を有する、も提供される。
特定の理論に拘束されることを望まないが、注射投与したCD4+細胞は、他の細胞型、主に、前記対象のCD8+、マクロファージ、及び／又は抗原提示細胞、に、前記対象中のこれらの細胞（対象の寛容化されたCD4+／対象の疲弊したCD8+）の細胞傷害性機能を増強するシグナルを提供する；この方法による疾患又は症状の治療の実施例を、少なくとも骨髄異形成症候群の治療で例示する。
ある態様では、対象における疾患又は症状を治療する際に使用するためのキット、前記キットは、以下を含む：本出願に記載のリンパ球組成物、ここで、前記対象は、ヒト・レシピエント(recipient)である；及び、前記ヒト・レシピエント(recipient)中に存在しない抗原を含む、ナノ粒子を含む、ナノ粒子組成物、が提供される。ある態様では、前記ナノ粒子は、更に、サイトカイン、例えば、インターロイキン又はインターフェロン、を含む。前記サイトカインは、インターロイキンであることがある、並びに、IL-2、IL-7、IL-12、及びIL-15からなる群より選択される。前記サイトカインは、インターフェロン、例えば、インターフェロン・ガンマ、インターフェロン・ベータ、インターフェロン・アルファ、インターフェロン、タウ、インターフェロン・オメガ、及びコンセンサス・インターフェロン、であることがある。
前記ナノ粒子は、ケモカイン、イメージング薬剤、光アンテナ分子、熱アンテナ分子、及びToll様レセプター・リガンド、I型(例えば、IFN-γ産生)CD4+メモリーT-細胞へのCD4+ T-細胞の分化を促進するリガンド、抗原提示細胞の活性化を誘導するレセプターのためのリガンド(例えば、抗-CD40抗体又はアプタマー)、からなる群より選択される化合物、を更に含むことがある。更に、前記ナノ粒子は、前記ナノ粒子が、腫瘍細胞又は抗原提示細胞を、ターゲットとするようにする薬剤、を含むことがある。
ある態様では、前記第1の同種異系リンパ球組成物を前記対象に投与する工程に続いて、前記方法は、モノクローナル抗体／CD4+ T-細胞エピトープ・コンジュゲートを前記対象に投与する工程を更に含む。ある態様では、前記第1の同種異系リンパ球組成物を前記対象に投与する工程に続いて、前記方法は、次なるリンパ球-減少・非-リンパ球-破壊の治療を前記対象に処方して、前記対象において一過的なリンパ球減少症を誘導する工程；並びに続いて、更なるヒト、同種異系ドナーに由来する更なる末梢血細胞組成物に由来する、次なる同種異系リンパ球組成物を前記対象に投与する工程、前記次なる同種異系リンパ球組成物は、前記更なるドナーの前記更なる末梢血細胞組成物に由来する、いくつかのCD4+ T-細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i) 前記更なるドナーは、前記更なるドナー対前記対象の方向性での、前記対象に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子ミスマッチを含む、及び前記HLAクラスII対立遺伝子ミスマッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、(ii) 前記対象は、前記更なるドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない、(iii) 前記次なる同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記更なる末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる、(iv) キログラム(kg)として前記対象の理想体重に基づく更なるドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、約1×105個のCD4+T-細胞/kgと約1×109個のCD4+T-細胞/kgとの間である、(v) 前記次なる同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記更なる末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、並びに(vi) 前記次なる同種異系リンパ球組成物は、前記更なる末梢血細胞組成物と比較して、少なくとも1桁少ないCD8＋ T細胞を有する、を更に含む。前記第1の同種異系リンパ球組成物を前記対象に投与する工程に続いて、前記方法は、T-細胞における負のシグナル伝達を遮断する薬剤を投与する工程を、更に含む。T-細胞における負のシグナル伝達を遮断する薬剤は、抗-PD-1抗体、イピリムマブ、抗-PD-L2抗体、及びPD-1融合タンパク質、からなる群より選択される。前記疾患又は症状を、がん、自己免疫障害、臓器移植、同種異系移植片拒絶、及びウイルス感染、からなる群より選択する。例えば、前記疾患又は症状はがんである、及び前記がんは骨髄異形成症候群である。
ある実施形態では、本発明は、ヒト・レシピエント(recipient)に投与するための同種異系リンパ球組成物を製造する方法、ここで前記方法は、前記レシピエントに対して同種異系であるヒト・ドナーに由来する末梢血細胞組成物を提供する工程、を含む、ここで前記末梢血細胞組成物は、いくつかのCD4+ T細胞、いくつかのCD8+ T細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i)前記ドナーは、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するCD4+ T細胞免疫を有する、(ii)前記ドナーは、前記レシピエント(recipient)に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを含む、並びに前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、並びに(iii) 前記レシピエント(recipient)は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない；並びに、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T-細胞の数を、少なくとも1桁、減少させることによって、前記末梢血細胞組成物から前記同種異系リンパ球組成物を製造する工程、ここで、(a)前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる、及び(b)前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、を提供する。
ある態様では、潜在的な同種異系のドナー(donor)を、複数のHLAクラスII対立遺伝子において、前記潜在的な同種異系のドナー(donor)と前記レシピエント(recipient)との間のミスマッチを最小化することに基づいて、複数の潜在的な同種異系のドナー(donor)から選択する、及び前記潜在的な同種異系のドナー(donor)を前記ドナー(donor)として選択する。潜在的な同種異系のドナー(donor)を、複数のHLAクラスI対立遺伝子において、前記潜在的な同種異系のドナー(donor)と前記レシピエント(recipient)との間のミスマッチを最小化することに基づいて、複数の潜在的な同種異系のドナー(donor)から選択する、及び前記潜在的な同種異系のドナー(donor)を前記ドナー(donor)として選択する。
ある態様では、ドナー(donor)が免疫を有する、前記レシピエント中に存在する抗原は、ウイルス抗原である、並びに前記ウイルス抗原を、ヒト・パピローマウイルス抗原、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、カポジ肉腫(Kaposi's sarcoma)関連ヘルペスウイルス(KSHV)抗原、A型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎ウイルス抗原、及びC型肝炎ウイルス抗原、からなる群より選択する。例えば、前記ウイルス抗原は、ヒト・パピローマウイルス抗原である、及び前記ヒト・パピローマウイルス抗原は、E6又はE7抗原性ペプチドである。ある態様では、前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約20%未満異なる。
ある実施形態では、ヒト・レシピエント(recipient)に投与するための、ヒト、同種異系ドナーに由来する末梢血細胞組成物に由来する同種異系リンパ球組成物、ここで、前記同種異系リンパ球組成物は、前記ドナーの前記末梢血細胞組成物に由来する、いくつかのCD4+ T-細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i)前記ドナーは、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するCD4+ T細胞免疫を有する、(ii)前記ドナーは、前記レシピエント(recipient)に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを含む、並びに前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、(iii) 前記レシピエント(recipient)は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない、(iv) 前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる、キログラム(kg)として前記レシピエントの理想体重に基づくドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、約1×105個のCD4+T-細胞/kgと約1×109個のCD4+T-細胞/kgとの間である、前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、並びに、前記同種異系リンパ球組成物は、前記末梢血細胞組成物と比較して、少なくとも1桁少ないCD8+ T-細胞を有する、が提供される。
本発明は、ヒト・レシピエント(recipient)に投与するための、ヒト、同種異系ドナーに由来する末梢血細胞組成物に由来する同種異系リンパ球組成物、ここで、前記同種異系リンパ球組成物は、前記ドナーの前記末梢血細胞組成物に由来する、いくつかのCD4+ T-細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i)前記ドナーは、前記レシピエント(recipient)中に存在しない抗原に対するCD4+ T細胞免疫を有する、(ii)前記ドナーは、前記レシピエント(recipient)に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを含む、並びに前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、(iii) 前記レシピエント(recipient)は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない、(iv) 前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる、キログラム(kg)として前記レシピエントの理想体重に基づくドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、約1×105個のCD4+T-細胞/kgと約1×109個のCD4+T-細胞/kgとの間である、(vi) 前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、並びに、(vii) 前記同種異系リンパ球組成物は、前記末梢血細胞組成物と比較して、少なくとも1桁少ないCD8+ T-細胞を有する、を提供する。
本発明は、ヒト対象における疾患又は症状を治療する方法、前記方法は、前記対象に、ヒト、同種異系ドナーに由来する末梢血細胞組成物に由来する同種異系リンパ球組成物を投与する工程を含む、前記同種異系リンパ球組成物は、前記ドナーの前記末梢血細胞組成物に由来する、いくつかのCD4+ T-細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i)前記ドナーは、前記対象中に存在する抗原に対するCD4+ T細胞免疫を有する、(ii)前記ドナーは、前記対象に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを含む、並びに前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、(iii) 前記対象は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない、(iv) 前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる、(v) キログラム(kg)として前記対象の理想体重に基づくドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、約1×105個のCD4+T-細胞/kgと約1×109個のCD4+T-細胞/kgとの間である、(vi) 前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、並びに、(vii) 前記同種異系リンパ球組成物は、前記末梢血細胞組成物と比較して、少なくとも1桁少ないCD8+ T-細胞を有する、を提供する。
本出願に記載の方法では、任意選択的に、前記対象に前記同種異系リンパ球組成物を投与する工程の前に、前記方法は、骨髄-由来サプレッサー細胞を、減少させる、又は阻害する、ための治療を処方するする工程を、更に含む。骨髄-由来サプレッサー細胞を、減少させる、又は阻害する、ための治療は、例えば、ダサチニブ、5-フルオロウラシル、タキソテール、クロドロネート、及びゲムシタビン、からなる群より選択される薬物を投与することを含む。任意選択的に、前記対象に前記同種異系リンパ球組成物を投与する工程の前に、前記方法は、腫瘍関連マクロファージ細胞を、減少させる、又は阻害する、ための治療を処方するする工程を、更に含む。任意選択的に、前記対象に前記同種異系リンパ球組成物を投与する工程の前に、前記方法は、調節性T細胞を、減少させるための治療を処方するする工程を、更に含む。調節性T細胞を減少させるための前記治療は、シクロフォスファミド、イデラリシブ、デニロイキン・ジフチトクス、及びダクリズマブ、からなる群より選択される薬物を投与することを含むことがある。
別の実施形態では、本発明は、腫瘍の中に、ナノ粒子組成物を注射投与することを含む、ヒト対象における疾患又は症状を治療する方法（ナノ粒子を、前記対象に注射投与することがある、又は点滴投与することがある、ここで、前記ナノ粒子は、ターゲティング薬剤を更に含む、及び前記ターゲティング薬剤は、広がった／非-局在化した新生物などのターゲット細胞［例えば、リンパ腫又は白血病］に結合する［この場合、全ての可能性のある部位に、直接的に注射投与することが、実際的ではない、又は実現可能ではない］、ここで、前記ナノ粒子組成物は、前記対象中に存在しない抗原を含むナノ粒子を含む、そうして、前記抗原を、前記対象の中に導入する；前記対象に、ヒト、同種異系ドナーに由来する末梢血細胞組成物に由来する同種異系リンパ球組成物を投与する工程、前記同種異系リンパ球組成物は、前記ドナーの前記末梢血細胞組成物に由来する、いくつかのCD4+ T-細胞、及びいくつかのナチュラル・キラー細胞を含む、ここで、(i)前記ドナーは、前記抗原に対するCD4+ T細胞免疫を有する、(ii)前記ドナーは、前記対象に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを含む、並びに前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある、(iii) 前記対象は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない、(iv) 前記同種異系リンパ球組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満異なる、(v) キログラム(kg)として前記対象の理想体重に基づくドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、約1×105個のCD4+T-細胞/kgと約1×109個のCD4+T-細胞/kgとの間である、(vi) 前記同種異系リンパ球組成物中のナチュラル・キラー細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のナチュラル・キラー細胞の数以下である、並びに、(vii) 前記同種異系リンパ球組成物は、前記末梢血細胞組成物と比較して、少なくとも1桁少ないCD8+ T-細胞を有する、を提供する。ある態様では、前記抗原は、非-ヒト動物抗原である、及び前記非-ヒト動物抗原は、キーホール・リンペット・ヘモシアニン抗原(keyhole limpet hemocyanin antigen)である。別の態様では、前記抗原は、ウイルス抗原である、前記ウイルス抗原を、ヒト・パピローマウイルス抗原、エプスタイン・バー・ウイルス抗原、カポジ肉腫(Kaposi's sarcoma)関連ヘルペスウイルス(KSHV)抗原、A型肝炎ウイルス抗原、B型肝炎ウイルス抗原、及びC型肝炎ウイルス抗原、からなる群より選択する。
以下の実施例は、本発明を説明することを意図したものであって、本発明を限定することを意図したものではない。
骨髄異形成症候群(MDS)は、血液細胞の異形成及び血液細胞の骨髄産生が機能しなくなること、並びに急性白血病への形質転換の可変的なリスクを特徴とする、悪性の幹細胞障害の多様な群である。これらの障害は、新たに発症する、又は変異原性である可能性のある化学療法に曝露されてから数年後に生じる、ことがある。
米国では、今年、約12,000-20,000例のMDSの新規症例が診断され、発症年齢の中央値は60-72歳である。骨髄異形成症候群の現行の治療成績は期待外れのものである。年齢、全身状態、及び疾患リスク・カテゴリー（通常、インターナショナル・プログノスティック・スコアリング・システム（International Prognostic Scoring System (IPSS)）によって決定される）は、治療モダリティ(treatment modality)の選択肢を決定する。60歳未満の患者で、良好又は優れた全身状態を有し、IPSS中程度-2又は高リスク・カテゴリーにある患者は、これらのIPSSカテゴリーとして、それぞれ、1.2年及び0.4年の生存期間中央値とされるので、主に高強度療法が考慮されるであろう。高強度療法は、集中的な併用化学療法及び造血細胞移植を含む、入院を必要とする治療として定義される。
低又は中程度-1カテゴリーの患者に対しては、低強度療法が一般的に考慮される。これらには、造血増殖因子、分化誘導薬剤、生物学的反応調節剤、及び低強度化学療法などの、外来診療所で投与することができる治療が含まれる。全身状態が不良な患者に対しては、サポート的なケア(supportive care)又は低強度療法が考慮される。
実施例１－IDEデバイス
この試験で使用される治験薬剤は、CliniMACS(登録商標)CD8試薬を用いたCliniMACSシステムであり、ヒト血液製剤から、CD8+ T細胞を富化させる、又は減少させるために使用される、医療デバイスである。CD8+細胞を選別することを意図したCliniMACS(登録商標)システムは、以下の4つの主要な構成要素を含む：1)CliniMACS(登録商標)CD8試薬－ヒトCD8に対するマウス抗体に結合した、コロイド状態の超常磁性鉄-デキストラン・ビーズ；2)CliniMACSplus 機器（Instrument）－血液サンプル(細胞製剤)を処理する、ソフトウェア制御の機器；3)CliniMACS(登録商標)チュービング・セット(Tubing Set)、(標準又はLS) －2つの独自の細胞選別カラムを有する、単回使用、滅菌済み、使い捨ての、チュービング・セット；並びに、4)CliniMACS(登録商標)PBS/EDTAバッファー－血液細胞をin vitro で調製するための、外部洗浄及び移送流体、として使用する、滅菌済み、等張性の、リン酸緩衝化、1 mM EDTA、生理食塩水溶液。前記システムは、多くの細胞タイプを単離するための強力なツールである、磁気細胞選別(MACS(登録商標))を利用して、目的の細胞集団を、選択的に、富化させる、又は減少させる。この場合では、CD8+ T細胞を、超常磁性粒子に結合したモノクローナル抗体で標識し、次いで、CliniMACSシステム（これは、強い永久磁石及び強磁性マトリクスを有する分離カラムを組み込み、その標識した細胞を除去する）を通過させることによって、前記血液製剤からCD8+ T細胞を減少させる。前記治療薬剤（CD8+ T細胞を減少させた血液の細胞）は、そのデバイスから出てきて、前記デバイスの構成要素を含有することを意図しない。
実施例２－一過的に生着したドナー(donor)リンパ球は、臨床的な腫瘍応答を誘導する
今日まで、MDSを有する患者の生存を延長することができる治療法は２つのみである。第１は、同種異系BMTであり、これは、疾患進行の遅延と同様に、ある程度長期的な治癒を達成させた。この治療は、年齢、ドナー(donor)の利用可能性、及び併存疾患のために、罹患者のごく一部に対してのみに、適用可能である。第２は、メチルトランスフェラーゼ阻害剤である5-アザシチジンである。この療法は、サポート的なケア単独と比較して、生存期間の中央値を7カ月延長することが示されている。MDSを有する患者には、シクロスポリン、抗胸腺細胞グロブリン(antithymocyte globulin (ATG))、又はステロイドなどの、免疫抑制的なレジメンに応答し、血球数が持続的に上昇する、患者がいる。この知見は、免疫抑制によって、血球減少症をもたらす自己免疫性構成要素を治療する、再生不良性貧血と同様である。その免疫システムを特異的にターゲットとする薬剤で得られた良好な結果によれば、MDSは、免疫調節に感受性のある疾患であることが示唆される。ATG、シクロスポリン、及びステロイドによる恩恵についての1つの可能な説明としては、これらの薬物は、抗-腫瘍免疫を抑制するリンパ球を、選択的に、阻害する又は傷害する、ことによって、内因性の抗-腫瘍免疫応答の活性を顕在化させる、ということである。更に、非-骨髄-破壊的な、部分的なHLA-ミスマッチ(ハプロ同一)の同種異系骨髄移植の試験において、5例の患者が、移植片拒絶にも関わらず疾患に対する応答を経験したことが見られたことは、MDSに対する、隠れた、内因性の免疫応答が存在することについての、証拠となる可能性がある。5例の患者は全員、骨髄芽球の割合が少なくとも一過的に減少した、そして、5例の患者のうちの3例は（それぞれ、移植前には赤血球細胞+/-血小板(platelet)輸血に依存していた）、輸血に依存しないようになった。表１は、BMT後30日目に、ドナー(donor)細胞の生着が認められなかったにも関わらず、5例中少なくとも3例で、BMT後少なくとも6カ月間、骨髄芽球の減少が続いたことを示している。
Figure 2023512670000002
図１は、輸血の影響を反映するギザギザ部を有する、骨髄移植後の、同じ5例の患者のヘマトクリットを示す。5例の患者のうち3例が輸血に依存しないようになった、患者番号1では、少なくとも3年間、形態学的寛解及び血液学的寛解が維持された。より興味深いことに、患者番号2は、血液学的応答を遅れて示し、BMTの4ヶ月後、及び移植片拒絶が表れて(documentation)3ヶ月後、に、輸血に依存しないようになった。免疫療法に対するMDSの感受性を考慮すると、一過的に生着するドナー(donor)リンパ球が提供する免疫学的な摂動によって、内因性(即ち、宿主由来)抗-腫瘍免疫応答が再覚醒することがある、ということが考えられた。この仮定されたメカニズム（移植片拒絶の後に、内因性の抗-腫瘍応答が覚醒される）によれば、コンディショニング無し、又は僅か100cGyの全身照射法(total body irradiation)、の後に、白血球細胞輸血を受けた患者において、白血病寛解が誘導されること、が説明されるかもしれない。ドナー(donor)リンパ球の注射投与物(donor lymphocyte infusions (DLI))が一過的に生着すると、宿主T細胞から抗-腫瘍免疫応答が誘導される、との仮説を、マウス・モデルにおいて、検討した。BALB/c × C57BL/6 F1マウスを、-1日目にCyで処置し、0日目に、106個のA20リンパ腫細胞(BALB/c起源)を、何も無し、ハプロ同一のDLI単独、自己腫瘍細胞ワクチン単独、又はDLI + ワクチン、と一緒に、IV投与した。Cyコンディショニング後に、無処置、又はワクチン単独、のいずれかを受けた動物と比較して、Cyでコンディショニングをして、次いで、DLI単独、又はDLI + ワクチン、で処置した動物は、有意に長く生存し、それぞれ、5匹及び4匹の動物が、明らかに治癒した(図２)。9匹の治癒した動物のいずれも、DLI後100日間を超えて試験した場合、検出可能なドナー・キメリズム(donor chimerism)を全く有していなかった、このことは、そのドナー(donor)T細胞が拒絶されたこと、を示唆する。
これらの結果により、Cyとそれに続いて、部分的MHC-ミスマッチのDLIを併用すると、有意な抗-腫瘍効果が誘導されること、が実証された。抗腫瘍作用における、ドナー(donor)CD4+対CD8+ T細胞の役割について特性評価をするために、Cy + ワクチン + 5,000万個のミスマッチ脾臓細胞（脾臓細胞は、非処置、又はCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、又はその両方、を減少させた）のレシピエント(recipient)において、この実験を、繰り返した。この実験では、全脾臓DLIのレシピエント(recipient)は全て、20日目以前に、GVHDによって、死亡した(図３Ａ)。対照的に、ワクチン・プラスCD8+T細胞を減少させた脾臓細胞、を受けたマウスは、ワクチン・プラス汎-T細胞減少の脾臓細胞、を投与したマウスよりも、有意に長く生存し(p=.04)、このことは、CD8+ T細胞を減少させると、抗-腫瘍免疫が無くなることは無しに、致死的なGVHDが無くなった、ことを示す。なぜ同種異系DLIからCD8+ T細胞を減少させるとGVHDが無くなるのか、を理解するために、Cyを使ってコンディショニングをして、次いで、非処置の、又はT細胞サブセットのどちらかを若しくは両方を減少させたの、どちらかの、ミスマッチの脾臓細胞を注射投与した、マウスにおける、ドナー(donor)細胞の生存性について研究を行った。興味深いことに、CD8+ T細胞を減少させた脾臓細胞は、一過的にのみ生着し、ドナー(donor)CD4+ T細胞キメリズムは、DLI後7日目にピークに達し、21日目までに検出不可能なレベルにまで低下した(図３Ｂ)。対照的に、ドナー(donor)細胞の持続的な生着は、CD8+ T細胞を含むDLIを投与された全てのマウスで見られ、これらの動物の大部分は、最終的にGVHDで死亡した。以上を合わせると、本動物試験により、Cy後のCD8+ T細胞を減少させたDLIは、急性GVHDを誘発することなく、ドナー(donor)細胞の一過的な生着、及び有意な抗-腫瘍効果、を誘導すること、が示された。つい最近では、「Cy + DLI」の前に、宿主CD8+ T細胞を減少させると、本治療効果は有意に減少し、宿主CD8+ T細胞が抗-腫瘍効果の重要なメディエーター(mediator)であることを強く示唆すること、が見出された。
実施例３－CD8+ T細胞を減少させた同種異系幹細胞又はリンパ球の注射投与に係る臨床的な経験
Cyとそれに続いて、ハプロ同一のドナー(donor)に由来するCD8+ T細胞を減少させたPBCs、を使って治療した患者に関する報告は無い。それ故、予備的な安全性データを提供することは不可能である。しかしながら、CD8+ T細胞を減少させた移植片を受けた同種異系BMTを受けた患者、又はCD8+ T細胞を減少させたPBMCの注射投与を受けた同種異系BMT後に再発した患者、に関する報告はある。CD8+ T細胞を減少させることの目標は、本注射投与の抗-白血病効果を維持しながら、GVHDの発生率を低下させること、であった。GVHDに関しては、それらの研究は、決定的な答えをもたらさず、いくつかは、有益であることの可能性を示し、他の研究は何も示さなかった。興味深いことに、CD8+ T細胞を減少させたDLIを注射投与すると、内因性CD8+ T細胞の活性化が誘導された、これは、CD8+ T細胞を減少させたDLIは、がんに対する宿主CD8+ T細胞応答を、効果的に覚醒させることができるという仮説と一致する、発見である。
他の2つの試験の結果は、提案された臨床試験の安全性を考察するのに適切である。第1の研究では、様々な血液悪性腫瘍を有する患者は、1つのHLA-DR対立遺伝子、又は1つのHLAクラスI(HLA-A又はHLA-B)抗原、のいずれかについてミスマッチであった非血縁ドナー(donor)から、骨髄を受けた。患者に、力価測定がなされた用量のCD8+ T細胞を含む、CD4+ T細胞を減少させた移植片を投与した。主な発見は、骨髄-破壊的なコンディショニングにも関わらず、移植片拒絶反応は、< 3.1 x 106 個のCD8+ T細胞/kgのレシピエント(recipient)体重、を含む移植片を投与した患者10例中6例で、発生したが、> 3.1 x 106 個のCD8+ T細胞/kgを投与した患者15例では、全く発生しなかった、ことであった。従って、骨髄-破壊的なコンディショニング後であったとしても、CD8+ T細胞を減少させると、移植片拒絶のリスクは有意に増大し、これによって、移植片が誘発する形成不全及びGVHDのリスクが無効化される。
第2の研究では、それぞれ、平均2.7 × 104個又は3.5 × 104個のCD3+ T細胞/kgを含む（これは、CD8+のT細胞の用量が約1-1.5 × 104/kgであること、に換算される）、T細胞を減少させた、ハプロ同一の末梢血幹細胞(peripheral blood stem cell (PBSC); n = 15)又はPBSCプラス骨髄移植片(n = 28)を、患者に投与した。T細胞の減少に直面した場合の生着を促進するために、患者を、強くコンディショニングした、及びPBSCプラス骨髄に対してPBSC単独のレシピエント(recipient)について、それぞれ平均14.0×106個の又は10.6×106個のCD34+細胞/kgを含む、「メガ-用量(mega-dose)」の幹細胞移植片を、患者に投与した。T細胞含量が低いことを考慮して、GVHDの予防剤を投与しなかった。生着は全43例の患者において発生し、本移植手技の結果としての急性又は慢性GVHDを経験した患者はいなかった。これらのデータにより、骨髄-破壊的なコンディショニングを受けた患者において持続的な生着が発生したとしても、< 104個のCD8+ T細胞/kgを含む、ハプロ同一の移植片がGVHDを引き起こす可能性は低いこと、が示された。本デバイスによって、通常、>2ログ(log)のCD8+ T細胞の減少が達成されるので、本試験におけるCD8+ T細胞を減少させたPBCの開始用量は、おそらく、104個未満のCD8+ T細胞/kgを含む。従って、この投与量を受けた患者は、生着しない、又は、たとえ持続的な生着が発生したとしてもGVHDを発症しない、可能性が高い。
実施例４－CliniMACS-CD8試薬を備えたCliniMACSシステムを用いることによるCD8の減少
この試験では、CliniMACS_CD8試薬(Miltenyi Biotec, Woburn, MA)を備えたCliniMACS_システムを用いて、CD8+ T細胞を減少させる。3回の検証を実施し、最初は白血球アフェレシス製剤を使用し、最後の2回は瀉血標本を使用した。最後に減少させてからのフロー・サイトメトリーの結果を図4に示し、これは、CD8+ T細胞が良好に減少していること（全細胞の8.40%から0.03%に）、並びに対応して、CD4+ T細胞及びCD16+又はCD56+ NK細胞が富化していること、を実証する。下記の表は、3つの製剤全てが、CD8+ T細胞数がCD4+ T細胞数の<3.2%である、というプロトコル判定基準を満たすこと、を実証する。製剤#2及び#3を、仮に、70kgの理想体重であるレシピエント(recipient)に、106個のCD4+ T細胞/kgの用量を送達するために使用したならば、それらは、それぞれ、2.6×103個及び7.7×102個のCD8+ T細胞/kg IBW（生着又はGVHD誘導の閾値を十分に下回る用量）を含んでいたことになる。比較として、移植片拒絶にも関わらず、応答した5例の患者には、中央値として、1.43×107個のCD4+ T細胞/kg(範囲0.84-3.14×107/kg)及び1.86×107個のCD8+ T細胞/kg(範囲0.43-2.16×107/kg)、を含む骨髄を投与した。従って、MDSの患者は、この多くのT細胞を含む、ハプロ同一細胞の注射投与を拒絶することができる。
Figure 2023512670000003
実施例５－治療に対する応答性を予測するための実験室での相関研究
MDS患者において、抗胸腺細胞グロブリンなどの免疫抑制療法には毒性がある可能性を考慮して、多くの研究者が、治療に対する応答性と相関する患者の特徴を同定することに努力を払ってきた。疾患応答性を予測するそのような特徴としては、低細胞性骨髄、スペクトラタイプ解析（spectratype analysis）によるT細胞レセプター・ベータ鎖可変領域CDR3の大きさでの異常なT細胞レセプター・レパートリー、発作性夜間ヘモグロビン尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH))の特徴的な表現型を有する細胞の存在、HLADR15の発現、トリソミー8、より若い年齢、及びより短い輸血歴、が挙げられる。従って、1つの目標は、免疫抑制療法に対する応答性を予測する特性によって、Cy + CD8+ T細胞を減少させたハプロ同一DLI、に対する応答性も予測できるかどうか、を判定することであった。この試験に組み入れる患者は、療法の前及び後の両方で、T細胞レセプター・ベータ鎖可変領域の多様性について、検査を受けた。細胞遺伝学及びHLAタイピングを、全ての患者に対して、規定通りに実施する。
最近の研究によって、ハプロ同一幹細胞移植後に、急性白血病が再発することを予防する際での、ドナー(donor)ナチュラル・キラー細胞の同種異系応答性の役割が明らかになった。より最近では、ドナー(donor)起源の同種異系応答性のナチュラル・キラー細胞によって、HLA-同一の幹細胞を移植した後の、AML及びMDSの再発が予防されることが、見出されてきている。これらの結果は、キラー免疫グロブリン様レセプター（又は、KIRs）（これらのHLAリガンドは、レシピエント(recipient)細胞上で欠損している）を発現するドナー(donor)を同定するために、分子的な、及びフロー・サイトメトリーの方法の両方を用いて、ドナー(donor)NK細胞上の、KIRsの発現レパートリーを特徴付けることの必要性を、強調する。
実施例６－提案された試験デザインの根拠
これは、本試験の第I相部分において、シクロフォスファミド(Cy)後に注射投与した場合の、CD8+ T細胞を減少させたハプロ同一の末梢血細胞(CD8- PBC)の最大忍容量(maximally tolerated dose (MTD))を決定すること、次いで、本試験の第II相部分において、CyプラスCD8- PBCのMTDによる治療の有効性を推定すること、を目的とする、標準的な第I/II相試験デザインである。高用量のCy(> 100 mg/kg)は、血液悪性腫瘍を有する患者に対する移植コンディショニングの一部として、広く使用されてきている、及びその安全性は、骨髄異形成症候群を有する高齢患者(55-66歳)を含む、この集団において、十分に実証されている。死亡を引き起こす可能性があるために治療の最も深刻なリスクは、持続性の形成不全及び移植片対宿主病であり、その両方とも、前記ドナー(donor)細胞が持続的に生着することを必要とする。初回細胞量の選択（105個のCD4+ T細胞/kg及び<3.2×103 個のCD8+ T細胞/kg）は、安全性のみを考慮してのものであった。具体的には、<104個ののCD8+ T細胞/kgを含む移植片は、致死的なコンディショニングを受け、且つ移植後に薬理学的な免疫抑制を受けていない患者においてであっても、重度のGVHDを引き起こさない。更に、標準的な骨髄移植片からCD8+ T細胞を部分的に減少させると、移植片拒絶のリスクが有意に増大する33（これは、この試験における治療の望ましいアウトカムである）。これらの理由から、<104個のCD8+ T細胞/kgを含むDLI製剤は、重篤な有害事象を引き起こす可能性が低いと考えられる。
CD8+ T-細胞の減少を伴わない、ハプロ同一のDLIでの経験が最近発表された。第I/II相試験では、再発性の／難治性の悪性腫瘍の41例の患者が、100cGyの全身照射法(total body irradiation)による非-破壊的なコンディショニングを受け、そして続いて1×106-2×108個のハプロ同一なCD3+ 細胞/kgの注射投与を受け、29例の患者には、最高用量が投与された。より高い用量レベルでは、目的の応答が達成された。特に、1×108個のCD3+ 細胞／用量は、応答性（25%の奏効率、又は8例中2例）を伴った最少の用量あり、2×108個のCD3+ 細胞／用量(最高評価)は、最大の応答率（ほぼ50%、21例中10例）に関連した。原理の証明として、全ての応答は、持続的なドナー・キメリズム(donor chimerism)が無い場合に起こった。最高用量のコホートでは、一過的なドナー・キメリズム(donor chimerism)が認められたが、ほとんどの患者で2週間で消失し、完全なドナー・キメリズム(donor chimerism)に転換した2例の患者のうち1例は、重度の急性GVHD(ステロイド応答性であり、その後、致死性敗血症が発症した)を発症した。高用量では、サイトカイン・フラックス（cytokine flux）に起因すると思われる、「ハプロ免疫ストーム(haplo immunostorm)」と名付けられた、急性の臨床的な症候群（発熱、倦怠感、LFT異常、発疹、及び下痢のうち1つ以上を特徴とする）がよく見られ、ステロイドに対して見事に応答した。この研究によって、このアプローチに関する生物学的な活性及び管理することが可能な安全性プロファイルが実証された。この試験での応答性に必要な、最小のCD3+ T-細胞用量(CD8+ 減少無し)は、1×108個の細胞/kgであった。
実施例７－患者の選択(Patent selection)
患者は、以下のことが病理学的に確認されていなければならない：骨髄異形成症候群(MDS)、Int-2又は高いIPSSスコア (IPSSスコアリング・システム(IPSS scoring system)を使用)。患者は、5-アザシチジンによる治療に失敗した、又は不適格若しくは不忍容でなければならない。
実施例８－治療計画
全ての患者は、詳細な病歴及び身体的な診察、並びに心臓、肝臓及び腎臓の機能に関する標準的な評価、に関する記録作成を必要とする。全ての患者は、プロトコル登録の1カ月前までに、標準的な疾患評価（例：胸部、腹部、骨盤のCT)と併せて、形態学的な、細胞遺伝学的な（適用可能な場合）及びフローサイトメトリー（適用可能な場合）の評価を行うために、骨髄穿刺及び生検を受ける。
治療前評価
シクロフォスファミドを、-2日目及び-1日目に、(容量に依存して)1-2時間かけて、iv点滴投与として、投与する。シクロフォスファミドの用量は、50 mg/kg/日である。用量を、調節した理想体重又は実際の体重のいずれか少ない方に基づいて、計算する。体重及び身長を直接的に測定する。身長に対する近似的な重量を、理想的な「値」を反映する、基準表又は方程式、から計算することがある。
シクロフォスファミド及びDLI前レジメン
シクロフォスファミド投与に先立ち、患者を指導して、一晩、体液を増加させる。3 cc/kg/時間のivで、生理食塩水による水分補給を、シクロフォスファミドの2時間前に開始し、次いで、その速度を2 cc/kg/時に、シクロフォスファミドの1時間前に減らし、シクロフォスファミドの8時間後まで、継続する。メスナを、シクロフォスファミドの30分前、及び3、6、及び8時間後に、分割した用量で、iv投与する。
メスナ用量は、投与するシクロフォスファミド用量に基づく。メスナの合計1日用量は、シクロフォスファミドの合計1日用量の80%に等しい。
予防的な抗-菌療法を、0日目に開始し、及び施設での実務に従う。
抗真菌の予防薬剤を以下のように投与する：フルコナゾール400mg、経口又は静注、1日1回、0日目から開始し、ANCが、3日間連続して（又は、3日間にわたっての2回連続の測定で）>500になるまで継続する。別の適切な予防的な抗真菌剤で代用してもよい。ニューモシスチス・カリニ肺炎（Pneumocystis carinii pneumonia (PCP)）の予防薬剤を、0日目に開始し、60日目まで継続すべきである。トリメトプリム／スルファメトキサゾール(Bactrim)に不忍容の患者には、PCP予防薬剤として、ダプソン又はペンタミジンのいずれかを投与する。ウイルスの予防薬剤は、0日目から60日目まで、バラシクロビル又はアシクロビルからなる。経口キノロン(例えば、モキシフロキサシン又はノルフロキサシン)を、DLI後、ANCが3日間連続して（又は、3日間にわたっての2回連続の測定で）>500になるまで、施設の選好に従って、投与する。
全ての患者に、CliniMACS(登録商標)CD8試薬を備えたCliniMACS(登録商標)システムを用いて、CD8+ T細胞を減少させたハプロ同一のPBCsを注射投与する。用量レベルの番号付けは、最低から最高の細胞投与量まで、とする。第1コホートの患者(用量レベル1)に、CyプラスCD8+ T細胞を減少させたハプロ同一のPBCs(CD8- PBCs)（1×105 CD4+ T細胞/kgのレシピエント(recipient)IBW、の用量を意図して含む）、を投与する。用量漸増の基準が満たされる場合、用量レベル2、2b、3、又は4の患者に、それぞれ、1×106、3×106、1×107、又は5×107のCD4+ T細胞/kg、の用量を意図して含むCD8- PBCsを、投与する。
DLI用量計算
意図した用量のCD4+ T細胞を送達する、最終(CD8-減少させた)生成物の体積を計算するための公式は、以下の通りである：意図した体積(ml)=意図したCD4+ T細胞の用量(細胞/kg)×レシピエント(Recipient)IBW*(kg) / CD4+ T細胞の濃度(細胞/ml)。
*注 - 実際の体重<理想体重 であれば、実際の体重を使用する。
しかしながら、注射投与するCD8+ T細胞の総数は、注射投与するべきCD4+ T細胞の意図した数（上記の式の分子）の3.2%を超えてはならない。減少させた生成物中のCD4+/CD8+細胞の比が31.25(=1/.032)未満である場合、注射投与するべき生成物の体積は、以下の式によって決定される：最終生成物のCD4/CD8比が31.25未満である場合、注射投与する体積(ml)=意図した体積 x (CD4/CD8比)/31.25、減少させた生成物中のCD4+/CD8+細胞の比が31.25以上である場合、注射投与するべき生成物の体積は、意図した体積(式1)である：最終生成物のCD4/CD8比が31.25を超える場合、注射投与する体積(ml)=意図した体積。
輸血サポート
血小板(Platelet)及び濃厚赤血球輸血（packed red cell transfusion）を、現行の施設の提案に従って、実施する。
実施例９－治療期間
患者は、1回だけのリンパ球の注射投与に適格である。注射投与したリンパ球の拒絶は、前記ドナー(donor)の細胞又は他の近しい血縁者に対する既往免疫（anamnestic immunity）を誘導することが予想されるため、この制約は適切である。60日目に患者の末梢血を入手し、ヒト抗-マウス抗体(human anti-mouse antibody (HAMA))の存在について、及びドナー(donor)細胞に対する細胞傷害性抗体について、試験する。
追跡期間
患者を、DLI後少なくとも60日間、追跡し、その後、死亡又は疾患進行のいずれかが最初に起こるまで、追跡する。許容できない有害事象のために試験から除外された患者、又は治療に関連した有害事象を発現した患者を、前記有害事象が消失する又は安定化するまで追跡する。
DLI後モニタリング:
試験に残っている患者は、DLI後の14、28、及び60日目、並びに6ヶ月目に、採血を行う。これらの採血では、手動で分画したCBCが得られる。CD4又はCD8を発現する細胞の割合を含むリンパ球サブセットを、フロー・サイトメトリーによって解析する。60日目以降、前記患者は、疾患進行が確認されない限り、白血球細胞分画を伴う完全な血球カウントを、DLI後6カ月まで、月1回行う。
疾患評価
上記に詳述した疾患評価に加えて、標準ケアとして実施される追加的な疾患評価の結果を、死亡又は疾患進行のいずれかが最初に起こるまで、研究目的のために、収集する。
実施例１０－投与を遅らすこと／用量変更
シクロフォスファミド用量は、変更しない。CD8+ T細胞の含有量が過剰である場合には、DLI用量を変更する。
有害事象： リスト化及び報告の要件
急性GVHDの患者全員について、以下の情報を収集する：
発症の日(GVHDを確認する、最初の生検の日と定義される)発症時のGVHD評価フォーム、GVHDが解消するまで週1回、及び60日目初回総合臨床グレード、最大総合臨床グレード、グレードIII-IV急性GVHDの発症の日、もしあれば。
60日目以降の急性及び慢性GVHDの発生及び重症度を、前記患者の6ヵ月評価時に、把握する。
グレードII-IVの急性GVHDの全ての例を、有害事象として捕捉する。グレードIII-IVのGVHDは、重篤な有害事象として、報告される。
DLI-誘導の形成不全は、好中球減少症(好中球絶対数<500/ml)として定義され、60日目以降にドナー・キメリズム(donor chimerism)に関する任意のエビデンスが認められる。DLI-誘導の形成不全の全ての症例は、重篤な有害事象として、報告される。
実施例１１-医薬品情報
シクロフォスファミド(シトキサン 登録商標 )
シクロフォスファミドは市販されている。シクロフォスファミドは、主に、DNA鎖を架橋することによって、細胞分裂を妨げるアルキル化剤である。シクロフォスファミドは、細胞周期に非-特異的である。注射投与用のシクロフォスファミドは、2000mgバイアルで入手可能である、これを、注射投与用の滅菌水100 mlを使って再構成する。再構成した生成物の濃度は、20 mg/mlである。計算された用量を、250-500ml の5%デキストロース水溶液中で、更に希釈する。各用量を、1~2時間かけて点滴投与する（総容量に応じて）。
シクロフォスファミドの臨床上の毒性としては、脱毛症、吐き気及び嘔吐、頭痛及びめまい、出血性膀胱炎、心毒性、免疫抑制、骨髄抑制、肺線維症、肝酵素の増加、及び不適切な抗-利尿ホルモン症候群(syndrome of inappropriate anti-diuretic hormone (SIADH))、が挙げられる。シクロフォスファミドは、オンコロジー薬局（Oncology Pharmacy）によって調剤され、ミード・ジョンソン製薬（Mead Johnson Pharmaceuticals）が製造している。
メスナ(ナトリウム-2-メルカプト・エタン・スルホネート)
メスナは、オキサソホスホリン(シクロフォスファミド及びイホスファミド)によって誘発される出血性膀胱炎を予防するために用いられる予防薬剤である。それは、固有の毒性を有さない、及び化学療法に対する拮抗作用を有さない。メスナは、オキサソホスホリンが産生する尿毒性代謝産物であるアクロレインと結合して、非-毒性のチオエーテルを産生する、及びオキサソホスホリンの4-ヒドロキシ代謝産物と結合することによって、アクロレインが生成される速度を遅くする。
メスナは、100 mg/mlの溶液を含む200 mg、400 mg及び1000 mgのバイアルで入手可能である。メスナのそれぞれの用量を、50 mlの生理食塩水で更に希釈し、15分間かけて点滴投与する。メスナの用量は、投与するシクロフォスファミドの用量に基づく。メスナの合計1日用量は、シクロフォスファミドの合計1日用量の80%に等しい。尿路保護のために使用される用量では、メスナは、実質的に非-毒性である。しかしながら、メスナに起因し得る有害な影響としては、吐き気及び嘔吐、下痢、腹痛、味覚変化、発疹、蕁麻疹、頭痛、関節又は四肢痛、低血圧及び疲労、が挙げられる。
CBER IDEデバイス
末梢全血採取(CPDA-1の中に450 ml)、又は定常状態(動員なし)で末梢白血球を採取するための白血球アフェレシス法を介して、ドナー(donor)から、それらの血液を採取する。各々の白血球アフェレシス回収を、リンパ球回収のための、施設での標準的な操作法を用いて、連続流細胞セパレータ(continuous flow cell separator)(COBE Spectra, Gambro)で実施する。献血の方法（瀉血対白血球アフェレシス）を、献血の30日間前に、末梢血のCD4+ T細胞の絶対数を得ることによって、及びターゲット化したCD4+ T細胞の用量を得るために必要とされる血液量を推定することによって、決定する。末梢血CD4+ T細胞数の正常な範囲は、0.5-1.5 × 106/mlであるため、用量レベル1-2に対しては、単純な瀉血は十分である、レベル2bに対しては、アフェレシスが必要であるが、用量レベル3及び4に対しては、白血球アフェレシスが必要である。
広範な過去の経験に基づくと、4時間の白血球アフェレシス手順は、5×107個のCD4+ T細胞/kgのレシピエント(recipient)IBW、を得るのに充分であろう。減少させるプロセスの間に細胞が失われてしまうことに適応するために、所望の用量よりも少なくとも30%多くすることを目標に収集する。
この生成物を、移植片工学研究所（Graft Engineering Laboratory）において、CD8を減少させる工程に供する。標準的な操作手順の全ては以下の通りである。前記生成物を、有核細胞の数、CD3、CD4、CD8、CD16、及びCD56、について解析する。前記生成物を一晩保存する、及びCD8を減少させることを、CliniMACS(登録商標)選択システム（CliniMACS Selection System）(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)で行う。CD8を減少させる前に、全血製剤を最初に処理して、軟膜濃縮物（buffy coat concentrate）を調製する、及び、主要なABO不適合ドナー(donor)/レシピエント(recipient)対について、前記軟膜濃縮物（buffy coat concentrate）を、リンパ球分離培地を使用して更に処理して、混入している赤血球細胞を除去する。次いで、処理した全血製剤又はアフェレシス製剤を濃縮し、0.5%ヒト血清アルブミンを添加したPBS/EDTAに再懸濁する。
鉄-デキストラン超-常磁性粒子にコンジュゲートした、マウス・モノクローナルCD8抗体を添加し、室温で30分間インキュベートする。1バイアルの抗体を使用して、全白血球細胞が40×109個になるまで、及びCD8+細胞が4×109個になるまで、処理する。余分な抗体を、1回洗浄することによって除去する、及び前記生成物の体積を、アルブミンを添加したPBS/EDTAで、100 mlに調節する。その後、それを、滅菌済みの使い捨てチュービング・セット（tubing set）を使用して、CliniMACS選択システム（CliniMACS Selection System）に接続する。その実施を、 (i) 抗体-処理した細胞を流すこと、(ii) 残っている結合していない細胞を除去する洗浄、(iii) カラムの周りの磁場を除去して、選択した細胞を放出させること、及び(iv) 袋の中に、CD8を減少させた細胞を最終的に回収すること、をコントロールする、予め設定されたコンピュータ・プログラムによって、開始する。全体のプロセスは、生成物を最初に濃縮し終わってから、約2-6時間かかる。その後の生成物を、細胞数、生存率、CD3、CD4、CD8、CD16、及びCD56含有量について、解析する。そのCD4の濃度を使用して、患者の用量を計算する。算出された体積を取り、施設の標準的な操作手順に従って、注射投与のために準備する。
相関／特殊試験
表現型の免疫再構成
CD4+及びCD8+ T細胞などのリンパ球サブセットの末梢血濃度を、DLI後14、28、60日目、及び6ヶ月目に、リンパ球絶対数計数及びフロー・サイトメトリーを用いて、決定する。
スペクトラタイプ解析（spectratype analysis）による宿主CD8+ T細胞レパートリー多様性の解析。最近の研究によれば、T細胞レパートリーの多様性を、所与のV_遺伝子を発現する細胞のCDR3/多様性/結合領域(Vf3D- -D-J--Cf3)を評価する、T細胞レセプターV_領域スペクトラタイピング（spectratyping）によって、評価することができることが、示されている。この領域は、T細胞レセプターの特異性を与える。免疫スコーピング（immunoscoping）又はV_スペクトラタイピング（spectratyping）は、治療後の抗腫瘍免疫応答及び骨髄移植後の免疫再構築、を評価するのに非常に有用である49。更に、免疫抑制療法前後のMDS患者のスペクトラタイプ解析（spectratype analysis）から、治療に対する応答によって正常化するT細胞レパートリーの偏りが明らかになった。従って、我々は、MDSの患者及びCMMLの可能性がある患者は、治療前にT細胞レパートリーが偏っていること、前記DLIは最初に同種異系応答性のT細胞の集団を誘導すること、及びレスポンダー(responders)は、スペクトラタイプ解析によって明らかにされるように、最終的に正常なT細胞レパートリーを獲得すること、を仮定する。治療前のCD8+ T細胞を、患者の末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cells (PBMCs))から得る。患者の抗-ドナー(donor)応答性T細胞を同定するために、前記患者に由来する治療前PBMCを、細胞選別をする前に、照射したドナー(donor)PBMCと共に7日間培養する。その培養期間によって、患者の抗-ドナー(donor)T細胞は、クローン増殖することが可能になる。PBMCを回収し、CD8+ T細胞を、14日目、28日目、60日目、及び6ヶ月目に、精製する。
実施例１２－抗-腫瘍効果を高めるためのNEDLIモデル
neoAg-特異的なCD8+T細胞の疲弊は、ヒトにおけるがんの免疫療法の成功に対する主要な障壁である。この障壁を克服するための現行の取り組みは、免疫チェックポイント阻害剤(CI)を、単独で、又は腫瘍免疫微小環境を変化させるように設計された薬剤と併用して、使用することに向けられてきている。これまでのところ、これらの取り組みは、わずかな成果しか得られておらず、ほとんどのがん患者は、免疫療法の方策から利益を得ることができていない。CD4+T細胞は、CD8+ T細胞の疲弊を予防することができるだけでなく、確立した疲弊から回復させ、それによって抗-がん免疫応答を回復させることができる。CD4+T細胞は、抗原-提示細胞（APCs）上のCD40分子を介して、前記抗原-提示細胞（APCs）をライセンシング(licensing)することによって、CD8+T細胞に対して、ヘルプを提供する。CD4+ T細胞のヘルプは、CD8+ T細胞メモリーを生成するために、及びCD8+T細胞の疲弊を予防するために、必要である。重要なことに、送達されるべきヘルプのために、前記CD4+及びCD8+T細胞は、同じ抗原を見ている必要はないが、それらは、同じAPC上に提示される抗原を見ていなければならない。CD4のヘルプは、確立された疲弊から回復させることがあるが、増殖しつつあるがんは、腫瘍-特異的なCD4+T細胞においてトレランス(tolerance)を誘導する、というエビデンスが出現し始めてきている、及び、今日まで、CD8+T細胞のヘルパー機能を回復させるために、CD4+ T細胞におけるトレランスを回復させるための既知の方策は存在しない。CD27分子に対するアゴニスト抗体は、CD4+T細胞ヘルプのいくつかの態様を再現することができる、そのため、特にCIと併用して、抗-腫瘍免疫を刺激することができる、しかし、それらによって、十分に進行したがんに対しては、T細胞を確立された疲弊から回復させることができる可能性は低い。
がんにおいて、T細胞を疲弊から回復させるために、健常なドナー(donor)に由来するMHC-同種異系応答性のCD4+T細胞を注射投与すると、その注射投与した細胞は、最終的には、拒絶されるにも関わらず、レシピエント(recipient)CD8+T細胞を必要とするメカニズムによって、確立されたがんの退縮が促進されることがある。ウイルス抗原を用いて健常な同種異系ドナー(donor)にワクチン接種を行うと、前記抗原を発現する腫瘍に対する、非-生着ドナー(donor)リンパ球の注射投与(non-engrafting donor lymphocyte infusion (NEDLI))の治療有効性が増強し、従って、腫瘍ネオ抗原に対するワクチン接種を受けた健常なドナー(donor)に由来するCD4+T細胞を使って、孤発性のヒトがんを治療することができる。
CD4+T細胞は、APCsをライセンシングする(licensing)ことにより、CD8+ T細胞を、疲弊から回復させる。CD4+T細胞は、APCsをライセンシングする(licensing)ことにより、CD8+ T細胞にヘルプを提供する、及びCD4+T細胞のヘルプは、CD8 T細胞を疲弊から回復させる、しかし、CD4+ T細胞が、APCをライセンシングする(licensing)ことによって、疲弊から回復させることがあるかどうかは、明確ではない。CD4ネオエピトープに対するワクチン接種をドナー(donor)に行うことにより、NEDLIの抗腫瘍作用を増強することができるであろう。ワクチン接種をドナー(Donor)に行うと、同種異系BMTの抗-腫瘍効果を増強することができる、及び健常なドナー(Donor)CD8+T細胞は、ネオ抗原に激しく応答する、しかし、CD4ネオエピトープを同定することは困難である。既に検証済みのCD4ネオエピトープである、M30を使用して、CD4ネオエピトープを同定するための技術が進歩する一方で、原理の証明を実証する。
がんに関する現在利用可能な細胞療法（同種異系の血液又は骨髄移植、CAR T細胞又はT細胞レセプターを改変したT細胞、腫瘍-浸潤リンパ球）は、がん細胞に直接的に傷害を加えるリンパ球を注射投与することを用いる。対照的に、NEDLIの目的は、レシピエント(recipient)の抗原提示細胞(APC)を介して、ヘルパー・シグナル(helper signals)を提供することによって、内因性の抗-腫瘍免疫を復活させることである。CD4+ T細胞を一過的に生着させると、neoAg-特異的なCD8+T細胞を、疲弊から回復させることができるという仮説は、全く画期的である。米国特許第9,931,359 B2は、内因性の抗-腫瘍免疫を復活させるために、CD8を減少させた非-生着ドナー(donor)リンパ球の注射投与をするために、HLAクラスIIミスマッチのドナー(donor)を選択する方法を記載する。本出願では、前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)との、少なくとも1つのHLAクラスII対立遺伝子マッチを有する、前記ドナー(donor)は、腫瘍又はウイルス・ネオ抗原に対するワクチン接種を受けており、次いで、ウイルス-特異的な又は腫瘍-特異的なT細胞を、ex vivoで更に増殖させる。
前記治療法の抗-腫瘍効果は、移植片対宿主の方向性でのMHCクラスIIミスマッチによって増強され、同種異系応答性のドナー(donor)メモリーCD4+T細胞が高頻度になることを確実にする(異種免疫を介して、ナイーブではなく、メモリーCD4+ T細胞は、腫瘍が誘導した免疫抑制を克服することがある、及び適切なヘルパー・シグナルを送達するので)。外因性CD4+T細胞ヘルプは、ターゲット化した抗原が、全てのがん細胞で発現している必要がないように、エピトープ拡大(図１２を参照)を介して、複数のネオエピトープに対するCD8+T細胞を復活させることができるだろう。
リンパ球を一過的に生着させることによって誘発される疾患の応答は、「短命のドナー(donor)細胞によって開始されるが、宿主の細胞が完了するまで担う、間接的なプロセスによって、最もよく説明される」だろう。本発明の発見は、シクロフォスファミド、それに続くCD8+細胞を減少させたMHC-ミスマッチのドナー(donor)リンパ球の注射投与(Cy + CD8-DLI)によりマウスを処置すると、そのドナー(donor)細胞は、最終的には、宿主の免疫システムによって拒絶されるにも関わらず、血液がん及び固形がんの両方のモデルにおいて、最小限の毒性で、確立した腫瘍の退縮が誘導される、ということである。Cy + CD8-DLIの最適な抗腫瘍効果は、ドナー(donor)CD4+ T細胞の存在、宿主CD8+ T細胞、及び腫瘍組織ではなく正常宿主による同種異系抗原の発現、を必要とした。重要なことに、前記DLIに由来するCD8+細胞を減少させると、ドナー(donor)細胞が持続的に生着することのリスク、及び致死性GVHDのリスク、が無くなったが、抗腫瘍の有効性は損なわれなかった。これらの結果に基づいて、同種異系応答性ドナー(donor)CD4+T細胞が、腫瘍抗原を交差-提示（cross-present）するAPCを介してシグナルを送達することによって、腫瘍特異的なレシピエント(recipient)のCD8+T細胞を、疲弊から回復させるモデル(図５)を提案した。図５に示したように、注射投与した、同種異系応答性のタイプ1(Th1)CD4+T細胞により、疲弊を回復させるための、提案されたメカニズム。レシピエント(recipient)の抗原提示細胞(APC)の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)クラスII同種異系抗原が認識されると、同種異系応答性ドナー(donor)CD4+ T細胞の活性化をもたらされ、その後、前記APC上のCD40のリガンドであるCD154を含む、活性化リガンドがアップレギュレーションする。CD40のライゲーションにより、CD8+ T細胞上のCD27のリガンドであるCD70を含む、APC表面上の分子のアップレギュレーションが誘導される。このシグナル伝達カスケードは、CD8+ T細胞メモリーの誘導に必要であることが示されてきている；同じ相互作用が、CD8+ T細胞を疲弊から回復させること、及びCD8+メモリーT細胞に復帰すること、に関与すること、が提案されている。CD4+ T細胞が分泌する、インターフェロン・ガンマ及び／又はインターロイキン21もまた、T細胞を疲弊から回復させることに関与することがある。
NEDLIは、血液悪性腫瘍に対して、強力な抗-腫瘍効果を誘導することができるが、固形腫瘍に対するその効果は、一般的により弱く、非-治癒的である。腫瘍-特異的抗原に対してドナー(donors)をプライミングすると、NEDLIの抗-腫瘍効果を増強することが可能かもしれない。この仮説を検証するために、ヒト・パピローマウイルスのE7抗原に対するワクチン接種を、健常な同系の、又はMHC-ハプロ同一なドナー(donor)に行い、そのプライミングを加えたドナー(donor)に由来する脾臓細胞を、減少させていない、又はCD8を減少させた、のいずれかで、TC1（E7発現の肺がん）を14日前に接種済みのマウスの中に、注射投与した(図６Ａ)。
腫瘍を担持しているレシピエント(recipient)は、E7-プライミングを加えた同系ドナー(donor)に由来する、減少させていないDLIにより治癒した(図６Ｂ、左側)、そして、その治療効果は、CD8-減少により、無くなった。
興味深いことに、ハプロ同一のドナー(donor)を使用し、そのドナー(donor)細胞が拒絶された場合、プライミングを加えたドナー(donor)に由来する、CD8を減少させた（減少させていない、ではない）DLIによって、有益な効果が得られた（図６Ｂ、右側）。CD8を減少させた同系DLIは、生存を延長しなかったので、我々は、同種異系応答性の及びE7-特異的なCD4+T細胞が、協同して、非-生着状態において、抗-腫瘍免疫を誘導する、並びに、同種異系応答性のCD8+T細胞は、恐らく、内因性の、腫瘍特異的な-CD8+ T細胞を疲弊から回復させるシグナルを提供する(レシピエント)APCに傷害を与えることによって、抗-腫瘍免疫を損なう、と結論付ける。
次いで、E7-ペプチドでパルスした樹状細胞を用いて、ex vivoで、プライミングを加えたT細胞を刺激することによって、NEDLIの抗腫瘍の有効性を増強できるかどうかを、試験した。E7でプライミングを加えたCB6 F1ドナー(donor)に由来する脾臓細胞を、減少させないままにした、又は、CD8を減少させた、その後、HPV16の全長E7タンパク質をカバーする、オーバーラップするペンタデカマー(overlapping pentadecamers)でパルスした、同系であるCB6 F1の又はハプロ同一なB6C3 F1の樹状細胞と一緒に、1週間、 ex vivo で培養した。培養後、細胞を回収した、及び、Cyで処置した、TC1を担持するB6C3 F1マウスの中に、細胞を注射投与した。図７は、E7ペプチドを使って、E7-プライミングを加えたドナー(donor)細胞を、ex vivoで培養すると、前記DLIの抗-腫瘍の有効性が増強すること、を示す。更に、ex vivoで培養したドナー(donor)のCD8+T細胞は、致死的なGVHDを引き起こさなかった。
図7中の治癒したマウスは、ドナー(donor)(H-2d+)キメリズムに関する証拠を有してはいなかったが、E7の免疫優勢なKb-結合ペプチドでパルスした、蛍光色素がコンジュゲートしたH-2KbMHC分子の四量体を使って染色を行うことによって、実証されるように、E7-特異的なCD8+ T細胞が増殖した集団を含んでいた（図８Ｂ）。E7-特異的なCD8+ T細胞が増殖した集団は、メモリー(CD127+PD-1-)表現型を示した（図８F）。治癒した動物は、再接種（re-challenge）したTC1（これは、E7-特異的なCD8+T細胞が、更にクローン増殖すること［図８Ｃ、Ｄ］、及びそれらが、PD-1発現をアップレギュレーションすること［図８Ｇ、Ｈ］、を引き起こした）への抵抗性を示した。
図８に示されるように、E7の免疫優勢なH-2Kb-制限のペプチド、に対して応答性である、レシピエント(recipient)のCD8+ T細胞の割合を、前記ペプチドでパルスしたH-2K-b四量体を使った染色をすることによって、決定した(上列)。下の列は、ゲーティングした、E7-特異的なCD8+ T細胞上の、CD127及びPD-1の細胞表面発現を示す。メモリーCD8+ T細胞は、CD127+及びPD-1lowである；活性化したT細胞は、CD127+PD-1highである、並びに疲弊したT細胞は、CD127-及びPD-1highである。
治癒した動物に由来する、CD8を減少させたリンパ球（図７の白抜き三角）を、E7ペプチドと一緒に培養すると、IFN-γ分泌CD4+ T細胞の集団が増殖することが明らかになった(図９Ａ及び９Ｂ)。IFN-γはまた、ナイーブCD4+ T細胞をE7ペプチドと一緒に培養することによっても産生され(図９Ａ及び０Ｂ)、このことは、がんの養子免疫療法のためのneoAg-特異的なTh1細胞を、健常な、ワクチン未接種ドナー(donor)から、ex vivoで、増殖させることができ、それによって、ドナー(donor)の安全性に対する懸念が改善されるかもしれない、という可能性を生じさせる。
図９に示すように、非処置のB6 x C3H F1マウス(ナイーブ(naive)；a、b)の、又は非-生着ドナー(donor)リンパ球の注射投与によって治癒したマウス(c)由来のCD4+T細胞の、細胞内インターフェロン・ガンマ(IFNγ)及び腫瘍壊死因子αについて染色を、非-パルスのB6x C3H F1樹状細胞(a)、又はE7ペプチドでパルスしたDC(b、c)、よる刺激の5日間後に、測定した。パネルdは、ELISPOTアッセイによる、同じ細胞のIFNγ分泌を示す。
図１０に示すように、TC1-担持のB6 x C3H F1マウスは、シクロフォスファミド・プラスCD8を減少させたリンパ球（E7-ワクチン接種をしたドナー(donor)から採取した、及びE7ペプチドと一緒にex vivoで増殖させた）、によって、治癒した。リンパ球の注射投与の300日後、その治癒したマウスに由来する脾臓細胞は、CD8+細胞を減少させた、E7ペプチドと一緒に1週間培養した、及び、1日前にシクロフォスファミドで処置した、TC1-担持のBALB/c×B6 F1マウスに移植した（レシピエント(recipient)あたり2,000万個の細胞を培養物に入れた）。或いは、TC1-担持のBALB/c×B6 F1マウスに、CD8+細胞を減少させた、及び養子移入の1週間前にE7ペプチドと一緒に培養した、ナイーブB6 × C3H F1ドナー(donor)に由来する脾臓細胞を、投与した。生存率を図１０Ｂに示す。
NEDLIによって治癒したB6C3マウスに由来する、ex vivo-培養の、CD8を減少させた脾臓細胞は、ここでも腫瘍-担持CB6 F1レシピエント(recipient)によって拒絶されるにも関わらず、マウスの生存を延長することができた(図１０Ｂ)。従って、非-生着ドナー(donor)リンパ球の注射投与によって治癒したマウスは、NEDLIとして投与した場合に、抗-腫瘍免疫を連続的に伝達することができるCD4+ T細胞、を含む。
ヒト・パピローマウイルス(HPV)は、口腔咽頭の、子宮頸部の、陰茎の、及び肛門のがんなどの、いくつかのヒトがんに関連している。前記ウイルスは、2種のウイルス抗原（E6及びE7）が細胞内で発現することによって、上皮細胞を形質転換することができる、ということが見出されている。E6は、p53腫瘍サプレッサー・タンパク質を不活性化する、及びE7は、網膜芽腫タンパク質を不活性化する、両タンパク質は、細胞周期の制御に密接に関与している。形質転換した細胞は、もはや増殖制御を受けない、並びに前記E6及びE7タンパク質は、悪性腫瘍への進行に必須である。
免疫システムは、HPVに対して応答し、それを排除することができる。発がん性の株(通常、HPV16又はHPV18)に曝露された個体が、ウイルスを排除するかどうか、又は慢性的に感染するかどうか、の重要な決定因子は、HPVに対するT細胞の応答、より正確には、HPVに対するCD4+ T細胞の応答である。IFN-γの産生などの、I型CD4+ T細胞応答を起こす個体は、典型的には、前記ウイルスを排除するが、そのようなI型応答を起こすことができない個体は、慢性的に感染し、悪性形質転換に感受性になることがある。現在、HPV16及びHPV18のE6及びE7抗原に対する応答を生成するために、研究用のワクチンが利用可能である。
動物モデルにおいて、ドナー(donor)とレシピエント(recipient)を主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)の全ての遺伝子に対してマッチさせると、HPV E7に対するワクチン接種をドナー(donor)に行い、ワクチン接種を受けたドナー(donor)のCD4+T細胞及びCD8+ T細胞をレシピエント(recipient)に移植することによって、抗-腫瘍免疫を移植することができること、がわかった(図６Ｂ、左側パネル)。その一方で、ドナー(donor)とレシピエント(recipient)がMHC-ハプロ同一である場合には、HPV E7に対するワクチン接種をドナー(donor)に行い、ワクチン接種したCD8+T細胞ではなく、ワクチン接種したCD4+ T細胞を、レシピエント(recipient)に移植することによって、抗-腫瘍免疫を移植することができること(図６Ｂ、右側パネル)、がわかった。腫瘍-特異的な抗原に対するワクチン接種を受けたドナー(donor)に由来するNEDLIの抗-腫瘍の有効性を、前記レシピエント(recipient)に注射投与する前に、ワクチン接種したT細胞を、in vitroで、腫瘍ペプチドと一緒に培養することによって、増強することができる(図７Ｂ)。ワクチン接種をした、及びex vivoで刺激したドナー(donor)のCD4+T細胞を注射投与すると、レシピエント(recipient)の免疫応答は回復し、治癒した動物は、今や、CD8+ T細胞(図８Ｂ～Ｄ)及びCD4+T細胞(図９Ｃ、Ｄ)を有し、これらは、ドナー(donor)細胞が排除されたにも関わらず、腫瘍抗原に応答し、腫瘍細胞を拒絶する。このことは、HPVに対する免疫は、ドナー(donor)からレシピエント(recipient)に、効果的に伝達された、ということを意味する。
本発明は、腫瘍-特異的な抗原(ウイルス抗原又は腫瘍ネオ抗原)に対するワクチン接種を受けたドナー(donor)由来の、及びウイルス由来のペプチドと又はネオ抗原と一緒に培養した、CD8を減少させた細胞の注射投与を企図する。或いは、本発明は、ウイルス-特異的な又はネオ抗原特異的なCD4+ T細胞を刺激するために、ペプチド-パルスした樹状細胞で、ex vivoにおいて刺激した、非免疫化ドナー(donor)のCD8を減少させた細胞の注射投与を企図する。本発明はまた、種々のヒト白血球抗原(HLA)型のドナー(donor)に由来する、HPVでプライミングを加えた、CD4+ T細胞を含む細胞バンクを作製することも企図する。例えば、以下の表は、10種の細胞株（それぞれの細胞株は、10種のごくありふれたHLAクラスIIアレルのうちの1種を独自に発現する）のバンクが、95.7%の米国白人集団に対して治療薬を提供するのに充分であることを示す。HLAクラスII分子としては、例として、HLA-DRB1、HLA-DPB1、及びHLA-DQB1、が挙げられる。
Figure 2023512670000004
NEDLIの抗-腫瘍の有効性を、注射投与におけるneoAg-特異的なCD4+T細胞の頻度を増加させることによって、増強され得るかどうかは、本研究の重要な点である。予備的なデータでは、NEDLI後に抗-腫瘍免疫を媒介することにおいて、同種異系応答性のCD4+T細胞と腫瘍-特異的なCD4+ T細胞との間に、明らかな相乗効果があることが示されたことから、ドナー(donor)のneoAgワクチン接種のモデルにおける、MHCミスマッチの影響も、同様に試験する。ドナー(donor)株とレシピエント(recipient)株をうまく選択することにより、抗-腫瘍効果に対する同種異系応答性対neoAgプライミングの相対的役割を容易に分析することができるはずである。
実施例１３－NEDLIの抗-腫瘍効果に対する、健常ドナー(donor)のneoAgワクチン接種の効果の特性評価
in vivoのドナー(donor)ワクチン接種対ex vivoのT細胞増殖の利益の比較、並びに同種異系応答性のT細胞とneoAg-特異的T細胞との間の相互作用。
この実験の目的は、腫瘍neoAgに対するCD4+T細胞ヘルプを増強させて、「孤発性」腫瘍に対するCD8- NEDLIの抗-腫瘍の有効性を増大させる、2つの方法を試験すること、であった：1) CD4+T細胞ネオエピトープによるin vivoのワクチン接種（続いての、ex vivoでのネオエピトープ刺激の有無に関わらず）、；又は2)ネオペプチド+ DCによる、CD4+T細胞の連続的な刺激を用いた、in vitro「プライミング」。本実験のデザインを、以下の表３に示す。C57BL/6(B6; H-2b)起源のB16-F10メラノーマは、F1ハイブリッド中で増殖する；免疫原性CD4+ neo-エピトープは同定されている。
1) B6 × C3H(B6C3; H-2bxk)F1又はMHC-ハプロ同一のBALB/C×B6(CB6; H-2bxd)F1マウスに、キネシン・ファミリー・メンバー18b遺伝子(Kif18b)によってコードされる変異体neo-エピトープM30(群2,6)、又は対応する野生型ペプチド(群1,5)のいずれかをワクチン接種する、前記ワクチンは、100 jtgの合成ペプチド及び50 jtgのポリ(I:C)を含み、200 jtlのリン酸緩衝生理食塩水の体積として、側腹部に注射する。ワクチン接種の有効性を、及び応答細胞の表現型(CD4対CD8)を、インターフェロン・ガンマ(IFNγ)又は腫瘍壊死因子アルファ(TNFa)についての、フロー・サイトメトリーによって、及び細胞内サイトカイン染色(ICS)によって、試験する。ワクチン接種をした2週間後、ドナー(donor)マウスを安楽死させ、脾臓細胞はCD8+細胞を減少させ、注射投与する前日に、シクロフォスファミド(Cy)で処置した、B16-F10担持のB6C3マウスに注射投与する。或いは、免疫化したドナー(donor)に由来するCD8を減少させた細胞を、注射投与する前に5日間、M30-パルスした、ドナー(donor)のDCと一緒に、5日間培養する(群3,7)；
2) ナイーブなB6C3マウス又はCB6 F1マウスに由来する脾臓細胞を、M30-パルスした自己の樹状細胞 + 20 U/ml IL-2で、週2回刺激する(群4、8)。M30-特異的なIFN'y+ CD4+ T細胞の頻度を、ex vivo刺激の前後に、ICSによって測定する。NeoAg-特異的なCD4+T細胞を、IFN'y捕捉アッセイ(ミルテニー・バイオテック社(Miltenyi Biotec))を用いて精製し、抗-CD3及び抗-CD28でコーティングしたビーズを更に用いて、増殖させることがある。
Figure 2023512670000005
Figure 2023512670000006
類似の処置群における過去のデータに基づいて、2つの処置群を比較するためのノン-パラメトリックMann-Whitney検定をシミュレートした。80%の検出力で、両側タイプ-Iエラーが0.05である場合、処置群当たり14のサンプル・サイズで充分であると推定された。
奏功したことに対するベンチマークは、(ワクチン接種又はex vivo培養によって)増殖させたM30-特異的なCD4+T細胞の集団を含むCD8を減少させた細胞のレシピエント(recipient)において、生存延長が有意であることである(群6、7、又は8を5と比較)、これは、腫瘍微小環境へのCD4+T細胞ヘルプを得ることのベネフィット、を反映している、腫瘍微小環境では、それらによって、骨髄性細胞はリプログラムを受けて、より免疫刺激性になり、CD8+T細胞に対してヘルプを提供する。ドナー(donor)集団の同種異系応答性によって、プライミングを加えたNEDLIの抗-腫瘍の有効性は、増大する可能性が高い(例えば、群6と2、7と3、及び8と4を比較する)。単一のneoAg、単回用量のワクチン、又はワクチン製剤では、抗-腫瘍免疫を増強するには不十分である可能性がある。もし生存延長が達成されないならば、ドナー(donor)に、mRNAペンタトープ・ワクチンを用いて、ワクチン接種を行う。ドナー(Donor)のワクチン接種は、GVHD又はサイトカイン放出症候群(cytokine release syndrome)を悪化させる可能性があり；これを、ドナー(Donor)細胞の用量を減らすことによって、軽減することがある。
neoAg-プライミングを加えたNEDLIと免疫チェックポイント遮断薬(ICB)の抗-腫瘍効果を、単独で、又は併用して、比較する。最近の報告によれば、皮下のB16-F10に対して、CD4+T細胞ヘルプを送達することに関与しているキー分子である（図５）CD40リガンドをコードする組換えアデノウイルスの腫瘍内デリバリーは、抗PD-1抗体+抗CTLA4抗体の組み合わせたICBよりも優れており、且つ相乗効果があること、が示された。我々は、neoAg-プライミングを加えたNEDLIは、ICBよりも優れており、且つICBと相乗的であろう、と予測する。65匹のB6C3 F1マウスに、それぞれ、5×105個のB16-F10メラノーマ細胞を、-8日目に、側腹部の皮下に接種し、0日目に、Cy 200 mg/kg をIP投与する。1日目に、それぞれ13匹のマウス群は、1)何も処置を受けない；2)プライミングをしていないCB6 F1ドナー(donor)に由来する、2,000万個のCD8を減少させた脾臓細胞で処置する（これは、中程度ではあるが有意な生存利益をもたらす）；3)M30ペプチド-(実験１を参照)ワクチン接種したCB6 F1ドナー(donor) に由来する、2,000万個のCD8を減少させた脾臓細胞で処置する；4) 200 jtg の、それぞれ、マウスPD-1に対するモノクローナル抗体(クローンRMP1-14)及びCTLA-4に対するモノクローナル抗体(クローン9H10、両方ともBio X Cellより)を有するICBを、4回の用量に対して、3日毎に腹腔内投与する、；又は、5)M30-プライミングを加えた、CD8を減少させたCB6 F1脾臓細胞プラスICBで処置する、の何れかとする。腫瘍の増殖を、群あたり7匹のマウスで、週3回測定する。内因性の、腫瘍-特異的なCD8+T細胞に対するNEDLIの効果を検討するために、B16-F10では発現しているが、C57BL/6マウスの正常組織では発現していない、レトロウイルス・タンパク質gp70のp15Eペプチド(KSPWFTTL)に対して特異的な、H-2Kb-制限CD8+T細胞の表現型及び機能について特性評価をする。7日目及び14日目の各処置において、群あたり3匹のマウスを屠殺し、脾臓、腫瘍排出リンパ節（tumor-draining lymph node）、及び脱凝集した腫瘍、に由来する単一細胞の懸濁液を、p15Eペプチド(MBL International, Woburn, MA)並びにCD62L、Tbet、CD127、CD27、及びKLRG-1に対する抗体を搭載した、蛍光色素-コンジュゲートしたH-2Kbの四量体で染色する。腫瘍環境は、CD80、CD86、及びPD-L1について、CD11c+ 骨髄細胞での発現を評価することによって、特徴付けられ、総CD4+ T細胞に対するFoxp3+Tregの比、及びCD8/Treg比を測定する。TILs並びにリンパ節及び脾臓の細胞を、p15Eペプチド及びIFN-γ、TNF-αで刺激する、そして、細胞内サイトカインによるグランザイムB産生を、染色及びフロー・サイトメトリーによって、測定する。NeoAgプライミングは、より遅いsc腫瘍増殖及び腫瘍特異的CD8+T細胞の活性化の増強によって示されるように、NEDLIの抗-腫瘍の有効性を増強することが期待される。CD4+ T細胞ヘルプは、CD8+T細胞の疲弊を回復させるがICIは回復させない、というエビデンスがあるので、我々は、neoAg-プライミングを加えたNEDLIは、ICIよりも優れた抗-腫瘍有効性を有するのであろう、と予測する。
post hocテストを調整して、興味深い比較のみに限定する、SAS（Cary、NC）のMIXED手順を用いた混合効果モデル解析、及びGlinmix手順を用いたWestfallとYoungのパラメトリック残差再サンプリング法。フローサイトメトリー・データを、陽性細胞の平均％、又は平均蛍光強度（MFI）、として、信頼区間とともに表現する。群の平均値を、Mann-Whitney U 検定を使用して比較する。
実施例１４－ウイルス-抗原又はneoAg-プライミングを加えたドナー(donor)に由来するNEDLIが、どのようにして腫瘍免疫を誘導するか、についての特性評価
レシピエント(recipient)のAPCを介して、腫瘍特異的な、レシピエント(recipient)のCD8+T細胞に、シグナルを提供することによって、同種異系応答性ドナー(donor)CD4+ T細胞が、抗-腫瘍免疫を増強するかどうかを、判定する。
以前の研究によれば、MHC-ミスマッチの、CD8を減少させたドナー(donor)リンパ球の注射投与の治療効果は、ドナー(donor)CD4+T細胞、レシピエント(recipient)CD8+ T細胞、及び正常な宿主組織細胞上での同種異系抗原の発現、を必要とすることが示された。これらの結果に基づくと、同種異系応答性のCD4+T細胞は、APCsをライセンシング(licensing)することによって、腫瘍-特異的なCD8+T細胞の疲弊を回復させると仮定される。もしそうであれば、CD4+ T細胞及びCD8+ T細胞が認識する抗原は、同じAPC上に提示されなければならない。
この実験の鍵は、CD4+T細胞とCD8+ T細胞とがコミュニ―ケーションをしないように、異なるAPC上での、同種異系抗原及び腫瘍抗原の提示を分離することである。これは、一方の親株であるB6（H-2b）が、腫瘍-特異的なH-2b制限CD8＋ T細胞に、腫瘍抗原を提示でき、一方で、他方の株であるC3Hが、非-生着ドナーCD4＋T細胞にMHCクラスII同種異系抗原（H-2 I-Ak又はI-Ek）を提示する、二親骨髄キメラ（図１１Ａ；及び以下の表４中の群3、4に記載）を作ることによってなされる。この実験に対するポジティブ・コントロールは、F1-親キメラを作ることである（図１１Ｂ；並びに以下の群5及び6）、F1-親キメラでは、前記APCが、CD4+ T細胞及びネオ抗原-特異的なCD8+T細胞に両方の同種異系抗原を提示することができ、その結果、これらT細胞がコミュニ―ケーションをするための橋としての役割をする。
方法：照射した(950 cGy)B6マウスに、107個の、T細胞を減少させた(T-)B6C3 F1骨髄(BM)細胞(群3及び4)、又は5×106 個のT- B6と5×106 個のT- C3H(H-2k)BM細胞の混合物、を移植する。2ヶ月後、キメラに、5×104個のE7-発現TC1(H-2b)肺がん細胞をIV投与する。2週間後、腫瘍-担持レシピエント(recipient)を、Cy 200 mg/kg IPで処置し、翌日、何も処置しない、又はE7-免疫化したドナー(donor)由来の、ex vivoE7-ペプチド刺激した、CD8-脾臓+LN細胞(図7では白抜き三角)を用いて、処置する。生存を、異なる群で、Log Rank検定によって、比較する。
B6 APCは、腫瘍抗原を交差-提示（cross-present）するが、ドナー(donor)CD4+T細胞ヘルプを刺激する同種異系抗原は存在しないので、群1及び群2は、この試験についてのネガティブ・コントロールである。MHCクラスII同種異系抗原及び腫瘍抗原は、群3及び4では、異なるAPC上に提示されるが、群5及び6では、同じAPC上に提示される。もし同種異系応答性ドナー(donor)CD4+T細胞が、APCをライセンシング(licensing)することによって、内因性の抗-腫瘍免疫を増強する場合、第6群のマウスは、第4群のマウスよりも、有意に長く生存するであろう。もし同種異系応答性ドナー(donor)CD4+T細胞が、同種異系を認識後にサイトカインを分泌することによってのみ、生存を延長する場合、群4及び6におけるマウスの生存は、群2におけるマウスの生存とほぼ同等ではあるが、それより優れているはずである。
Figure 2023512670000007
外因性のヘルプが、APCライセンシング(APC licensing)を通して疲弊を回復させる場合、群4は、同系のCD8を減少させたDLI（これは効果がなかった）まで減少する(図６、左側のパネル、白抜きの赤い四角)。Cyのみ(図７、黒い菱形)を、ペプチド-パルスしたハプロDCでex vivoで刺激したCD8-DLI(白抜きの赤い三角；群６に類似)と比較すると、15の危険率が得られる。両側タイプIエラーが0.05で、サンプルの大きさが各群で10である場合、検出力=0.999であり、従って、10／群は、主仮説を検定するのに充分である。
NEDLIのエピトープ拡大(epitope spreading)の誘導能の評価。
腫瘍内クローンの不均一性、及びHLA又はneoAg喪失によって、単一の腫瘍抗原に対する免疫療法(例えば、CAR T細胞, 抗-腫瘍モノクローナル抗体、腫瘍ワクチン)の有効性は制限を受ける。エピトープ拡大は、前記療法が直接的に標的としない抗原にまで、応答性を広げることによって、腫瘍免疫回避(tumor evasion)に対抗する。CD4+ T細胞ヘルプは、neoAg-特異的なCD8+ T細胞における疲弊を回復させることによって、エピトープ拡大を促進することが仮定される(図１２)。図１２は、一過的に生着する、腫瘍-特異的なCD4+T細胞を注射投与した後の、エピトープ拡大についての仮定されたメカニズムを示す。抗原「A」に特異的なCD8+細胞傷害性T細胞(CTL)によって腫瘍細胞が傷害を受けると、腫瘍微小環境において、抗原-提示細胞が抗原A-Eを放出するようになる、及び交差-提示（cross-presentation）をするようになる。注射投与した、タイプI(Th1)CD4+ T細胞は、MHCクラスII分子によって提示される抗原Aを認識する、並びに、同じ抗原提示細胞上のMHCクラスI分子によって提示される抗原B、C、及びEを認識するCD8+ T細胞(eCTL)の疲弊を回復させるシグナルを提供する。
この仮説を検証するために、以下の実験をデザインする。
OT-Iトランスジェニック・マウス(Jackson Labs)は、H-2 Kb MHCクラスI分子によって提示される、ニワトリ・オボアルブミン(OVA)ペプチド257-264(SIINFEKL、配列番号(SEQ ID NO): 3)に対するトランスジェニックT細胞レセプターをコードする、CD8+ T細胞を含み、一方、OT-IIマウス(Jackson Labs)は、H-2 I-Abによって提示されるOVAペプチド323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR、配列番号(SEQ ID NO): 4)に対して特異的なCD4+ T細胞を含む。B16-OVAは、ニワトリ・オボアルブミンを発現するように操作されたMHCクラスII-陰性B16-F10メラノーマ株であり、OT-I T細胞によって認識される。対応する近交系を繁殖させることによって、B6.SJL x C3H (H-2kxb, CD45.1+), OT-I x C3H (H-2kxb, CD45.1-), 及び OT-II x BALB/c (H-2dxb) F1 マウスを作成する。81匹のB6.SJL x C3H F1マウスに、それぞれOT-I x C3H F1マウスに由来する200万個のCD8+T細胞をIV投与し、2日間後、5 x 105 個のB16-F10メラノーマ細胞を片方の側腹に、5 x 105 個のB16-OVA細胞を反対側の側腹に、皮下接種する。各々の側で、腫瘍が約5 mmまで増殖した場合、以下の研究のために、3匹のマウスを安楽死させる、及び1群あたり13匹のマウスに、Cy 200 mg/kg をIP投与し、1日後、以下の何れかを投与した：
1) 何も無し；
2) 2週間前に、Kif18-コードの野生型ペプチド
Figure 2023512670000008
 （ワクチン接種の詳細については実験１を参照）
でプライミングを加えた、CB6 F1; H-2dxb) マウスに由来する、2,000万個のCD8を減少させた脾臓細胞；
3) 2週間前に、M30ネオエピトープ
Figure 2023512670000009
 でプライミングを加えた、CB6 F1マウスに由来する、2,000万個のCD8を減少させた脾臓細胞；
4) 免疫化していないOT-II x BALB/c F1 マウスに由来する、100万個のCD4+ T細胞を含むCD8を減少させた脾臓細胞；
5) OT-II×BALB/cマウスから採取した、並びに、IL-2、GM-CSF、及び1 tMイブルチニブ（Th1分化を促進するため）を添加したOVA323-339-パルスした樹状細胞と共に5日間培養した、CD8を減少させた脾臓細胞；並びに、
6)群5に由来する、選別されたCD4+T細胞。
両方の腹の腫瘍の大きさを、生存する全てのマウスについて、週3回、測定する。1群あたり3匹のマウスを、NEDLI後、3日目に及び7日目に(又は、腫瘍が退縮し始める場合は、それより早く)に屠殺する。脾臓、排出LNs(draining LNs)及び腫瘍、由来の細胞を、以下について解析をする：
1) 腫瘍-特異的なCD8+T細胞： p15E特異的なCD8 T細胞、及びOVA特異的なT細胞(H-2k+)上の、CD27、CD127、PD-1、KLRG1の発現；
2) 機能：細胞を、M30、p15Eペプチド、又はクラスI及びII OVAペプチドで、別々に、5時間、刺激する。IFN'y-、TNFa-、グランザイムB-、IL-4-及びIL-2-産生細胞の頻度を、ICS及びフロー・サイトメトリーによって、解析する；
3) 免疫組織化学：腫瘍フラグメントを、液体窒素中で、急速凍結する。7 tmの腫瘍切片を、KLRG-1、PD-1、CD127又はIFN'yとともに、CD4、CD8、p15E四量体又はOVA四量体で、染色する；
4) DC活性化：腫瘍、排出リンパ節(draining lymph nodes)、及び脾臓、由来の細胞を、CD11b、CD11c、クラスII、CD70、CD80、及びCD86、で染色する。
実施例１５－材料と方法
実施例１３～１５の全ての実験は、Jackson Laboratoriesから購入した、近交系又は遺伝子導入マウス、又は商業的に購入されたか、若しくは自家繁殖によって生成したF1雑種マウス、を使用した。マウスは、6~8週齢で購入し、実験の開始時に、約8~10週齢とした。ほぼ全ての実験で、ドナー(donor)系統由来の細胞を、担がんレシピエント(recipient)中に注射投与した。処置するマウスのそれぞれの群において、同数のオス及びメスをレシピエント(recipient)として使用した。以下の手順を行う：
a)養子細胞療法。レシピエント(Recipient)マウスを、シクロフォスファミド200 mg/kgの腹腔内投与、又は950 cGyの全身照射法(total body irradiation)(TBI)、の何れかによってコンディショニングし、1日後に、尾静脈を介して、リンパ球を静脈(IV)注射投与した。TBIでコンディショニングした動物には、T細胞を減少させた骨髄細胞も静脈内投与して、造血をレスキューした（rescue）。
b)マウス腫瘍モデル－レシピエント(recipients)に、B16-F10メラノーマ細胞、1x105個をIV又は5x105 個を皮下(sc)の何れか、5x 105 個B16-OVA(ニワトリ・オボアルブミン遺伝子をトランスフェクトしたB16-F10)をsc、又は5x104個TC1肺がん細胞をIV、投与し、2週間後に処置を開始した。
c)ワクチン接種－免疫化する前に、イソフルランを使って、滴下方法により、マウスを全身麻酔した。マウスを、合成ペプチド及び50 μgのポリ(I: C)を、側腹部に、約200 μl/マウスのエマルジョンで、注射投与して、免疫化する。E7 cDNAワクチンについては、マウスに、cDNA(25 μg)を、筋肉内のエレクトロポレーション(106V、20-msのパルスを200-ms間隔で8回のパルスとした)によって投与した。マウスが痛みを感じていないかどうかを、免疫化した後、毎日チェックし、示すように、ブプレノルフィンSR 0.05~.1 mg/kg sc又はip q 48-72時間、投薬した。
ワクチン接種。C57BL/6 x C3H(B6C3)F1又はBALB/c x C57BL/6(CB6)F1マウスに、25 μgのpcDNA-3-CRT/E71（HPV16血清型のE7抗原をコードするDNAワクチンである）を、週1回、計3用量、ワクチン接種した。前記ワクチンを、106 Vの電流の8回のパルス（各パルスは、20 ms持続し、200 msのパルス間の間隔である）を用いたエレクトロポレーションによって、筋肉内に送達した。
養子免疫療法用の細胞の調製。最後のワクチン接種の1週間後、ワクチン接種をした、又はワクチン接種をしていないドナー(donor)由来の脾臓細胞を、非処置のままにした、又は磁気細胞分離法(MACS；Miltenyi Biotec)によって、CD8+細胞を減少させた。培養していない脾臓細胞を用いる実験では、2,000万個の減少させていない細胞、2,000万個の減少させていない細胞中に存在するCD4+ T細胞を含むCD8を減少させた細胞、の何れかを動物に投与した。一部の実験では、ワクチン接種したCB6 F1ドナー(donor)由来の全脾臓細胞又はCD8を減少させた脾臓細胞を、HPV16のE7タンパク質のアミノ酸配列
(ペプチド配列：MHGDTPTLHE YMLDLQPETT DLYCYEQLND SSEEEDEIDG PAGQAEPDRA HYNIVTFCCK CDSTLRLCVQ STHVDIRTLE DLLMGTLGIV CPICSQKP；配列番号(SEQ ID NO): 7)（JPT Technologies;）
からの、22種のオーバーラップする15merのそれぞれ1 μg/mlでパルスした、同系CB6 F1の又はMHC-ハプロ同一のB6C3 F1の樹状細胞と共に、培養した。E7配列の中で互いに隣接するペンタデカペプチドは、C-末端の11アミノ酸がオーバーラップするものとした。22種のペプチドのうち、最初の4種は、以下の通りである；残りは、上記の配列から推定することができる：
MHGDTPTLHEYMLDL (配列番号(SEQ ID NO): 8)
TPTLHEYMLDLQPET (配列番号(SEQ ID NO): 9)
HEYMLDLQPETTDLY (配列番号(SEQ ID NO): 10)
LDLQPETTDLYCYEQ (配列番号(SEQ ID NO): 11)
樹状細胞を、汎-DC磁気細胞分離(MACS; Miltenyi Biotec)により調製した。2,000万個のドナー(donor)の脾臓細胞を、10%ウシ胎児血清、2-ME、25 U/mlの組換えマウスIL-2及び20 ng/mlの組換えマウスGM-CSFを添加した10 mlのRPMI培地中で、2,000個のペプチド-パルスした樹状細胞と共に、5日間、培養した。5日間の最後に、細胞を洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。2,000万個の減少させていない脾臓細胞に含まれるCD4+ T細胞のインプットに対応する、ex vivoで培養した細胞の一用量を、マウスに投与した。
治療プロトコル。養子細胞療法の抗-腫瘍の有効性を評価する実験では、0日目に、レシピエント(recipient)マウスに、5x104 個のTC1腫瘍細胞を、尾静脈から静脈内(IV)投与し、続いて13日目にシクロフォスファミド200 mg/kgを腹腔内投与し、14日目にドナー(donor)細胞を投与した。未刺激の、減少させていないドナー(donor)細胞の用量を、1レシピエント(recipient)あたり2,000万個の脾臓細胞とした。未培養の、CD8を減少させた脾臓細胞の用量を標準化して、2,000万個の減少させていない脾臓細胞に含まれるのと同数のCD4+細胞を含むようにした。ex vivoで培養した細胞の用量を、培養物に入れたCD4+細胞の個数に対して標準化した。例えば、マウス脾臓が1億個の総細胞、及び2,000万個のCD4+細胞を含有する場合で、CD8を減少させた集団が8,800万個の細胞及び1,800万個のCD4+細胞を含有する場合に、並びにペプチド刺激のために8,800万個のCD8を減少させた脾臓を培養に入れると、1,000万個の細胞及び400万個のCD4+細胞を含有する刺激を受けた集団が生じる場合に、DLI用量は、2,000万個の全脾臓(400万個のCD4+細胞を含有する)、1,956万個のCD8を減少させた脾臓(400万個のCD4+細胞を含有する)、又は220万個のペプチド-刺激した細胞、となる。
様々な処置群におけるマウスの生存を、Log-Rank検定によって比較した；0.05未満のp値を有意とみなした。
提案した実験としては、移植片対宿主病(GVHD)、抗-腫瘍効果、及び治療用ワクチン接種に対するリンパ球応答などの現象をもたらす、複数の同時に起こる細胞相互作用が挙げられる。これらの複雑な生物学的現象は、リンパ球をin vitroで研究することによって、単純にモデル化することはできない、又は再現することはできない。近交系、トランスジェニック、及びF1雑種系を広範に利用できることにより、臨床的に関連する様式で、GVHD及びがんの養子免疫療法をモデル化することが可能になるであろう。HLA-マッチの同胞又はHLA-ハプロ同一の、非-生着ドナー(donor)リンパ球の注射投与(non-engrafting donor lymphocyte infusion (NEDLI))のヒト状態をモデル化するために、特定の系統を選択した。T細胞レセプターのトランスジェニック・マウスは、担がん動物において、内因性の、腫瘍-特異的なT細胞を追跡することを容易にする。また、化学療法耐性をもたらすように規定した遺伝子異常、又は規定した「腫瘍抗原」を発現するように規定した遺伝子異常、を有するマウス腫瘍も、広く利用可能である。これらの実験は、近交系及びF1系統が広く利用可能なマウス又はラットなどの種においてのみ、行うことができる。
後尾静脈を介したIV注射投与によってNEDLI及び腫瘍移植を行った後、マウスを、GVHD(体重喪失、丸まった姿勢、荒れた毛並み、下痢、紅斑、動きが少なくなること)又はサイトカイン放出症候群(cytokine release syndrome)(発熱、下痢、体重喪失、不動性)などの、任意の、腫瘍に関連した病的状態又は細胞注射投与の毒性、について、詳細にモニターする。静脈内注射投与は、一時的に痛みを伴うだけであり、麻酔なしで行うことができる。各群の無-腫瘍生存が、2週間の観察期間にわたって変化していない場合、研究を終了する。この目的のためには、通常、腫瘍接種後100日間の観察で十分である。これは、米国獣医学会（American Veterinary Medical Association(AVMA)）によってなされた勧告に合致する。動物を、同種異系GVHD又は進行性がんによる病的状態の兆候が何かないかどうかを、腫瘍及び／又は同種異系リンパ球を注射投与した後、週に少なくとも3回、モニターする。腫瘍-関連の病的状態が診断されるとすぐに、担-腫瘍動物を安楽死させて、過度の苦痛を防止する。GVHDに苦しむ動物も安楽死させる。
マウスが腫瘍の皮下注射を受ける実験では、前記腫瘍の最大二次元計測が100 mm2を超える場合、又は前記腫瘍が広範な潰瘍形成を発症する場合、いずれかが最初に起こるときに、一般に、マウスを安楽死させる。いずれの実験においても、苦しんでいると思われる動物を安楽死させる。苦痛をもたらす可能性のある実験条件としては、分娩呼吸を生じる広範な肺転移、有意な体重喪失、下痢、及び不動性を伴う移植片対宿主病、又は腫瘍-誘発性麻痺、が挙げられる。
細胞株：B16-F10メラノーマ(ATCC)、B16-OVAメラノーマ、及びTC-1肺がん(Johns Hopkins University, TC Wuから供与された)
マウス細胞株は、短いタンデム・リピート・プロファイリング(Short Tandem Repeat profiling (National Institute of Standards and Technology Mouse Cell Line Authentication Consortium/American Type Culture Collaboration))によって認証される。マイコプラズマ汚染についても、細胞を試験する(Genetica Cell Line Testing, Burlington, NC)。
TC-1において、E7がん遺伝子が継続的に発現していることは、HPV16 E7オープン・リーディング・フレームに対するプライマーを用いたPCRによって確認される。
ATCCからB16-F10を得ると、細胞を増殖させ、次いで、それぞれ100万個の細胞で、100本分注し、各々を凍結保存する。継続的な継代を介して細胞株を維持するのではなく、1バイアルの凍結細胞を、それぞれの新しい実験のために、解凍する。
フロー・サイトメトリーのための全ての抗体は、商業的なベンダー(例えば、BDバイオサイエンス)から購入する。マウスへの投与のためのPD-1及びCTLA-4に対する抗体は、Bio X Cellによって提供される。抗体特異性は、ターゲット・タンパク質を過剰発現させた細胞抽出物の免疫ブロット解析によって、確認する。
イブルチニブは、Pharmacyclicsから提供されている。Johns Hopkins Drug Discovery Coreが行う液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析によって、同一性を確認する。
脊椎動物：C57BL/6、B6.SJL、BALB/c、C3H、B6xC3H F1、BALB/c x B6 F1、OT-I、及びOT-IIマウス系統は全て、Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)から購入する。そのベンダーは、認証証明書を提供する。
当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、同様の結果を依然として得ることを理解すべきである。本発明は、本発明の個々の態様の単一の例示として意図される、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではなく、機能的に等価な方法及び構成要素は、本発明の範囲内である。実際、本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の種々の変形が、前の記載から当業者に明らかになるのであろう。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
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Claims (22)

  1. レシピエント(recipient)に投与するためのリンパ球組成物を製造する方法、ここで、前記方法は以下を含む：
    a) 末梢血細胞組成物をドナー(donor)から得る工程、ここで、前記ドナー(donor)は、任意選択的に、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するワクチン接種を受けている、並びにここで、前記末梢血組成物は、CD8+ T-細胞、CD4+ T-細胞、及びナチュラル・キラー細胞を含む；
    b) 末梢血細胞組成物のCD8+ T-細胞を減少させる工程、ここで、前記末梢血細胞組成物のCD8+ T-細胞を減少させることは、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T-細胞の数を、少なくとも1桁、減少させることである；並びに、
    c) CD4+ T細胞を前記抗原と培養することによって、前記抗原に対して特異的なCD4+ T細胞を増殖させる工程、ここで、前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)に対して、HLA-マッチ、部分的HLA-マッチ、又は-ハプロ同一、であり、それによって、リンパ球組成物を製造する。
  2. 請求項１に記載の方法、ここで、前記抗原を、新生物抗原、新生物イディオタイプ、ウイルス抗原、バクテリア抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、非-ヒト動物抗原、腫瘍ネオ抗原、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択する。
  3. 請求項２に記載の方法、ここで、前記ウイルス抗原を、ヒト・パピローマウイルス(HPV)E6抗原、HPV E7抗原、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択する。
  4. 請求項２に記載の方法、ここで、前記ウイルス抗原を、エプスタイン-バー・ウイルス(Epstein-Barr virus)潜伏感染膜タンパク質1(LMP1)、潜伏感染膜タンパク質2a(LMP 2a)、及びそれらの組み合わせ、からなる群より選択する。
  5. 請求項２に記載の方法、ここで、前記抗原は、新生物抗原又は腫瘍ネオ抗原である。
  6. 請求項５に記載の方法、ここで、前記腫瘍ネオ抗原は、レシピエント(recipient)の腫瘍に由来する抗原である。
  7. 請求項１に記載の方法、ここで、前記ドナー(donor)は、がんを有さないドナーである。
  8. 請求項１に記載の方法、ここで、前記部分的HLA-マッチの又はHLA-ハプロ同一のドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)に対する、少なくとも1つのヒト白血球抗原(HLA)クラスII対立遺伝子マッチを有する、並びに、前記HLAクラスII対立遺伝子マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある。
  9. 請求項８に記載の方法、ここで、前記ドナー(donor)は、前記ドナー(donor)が抗-レシピエント(recipient)(移植片-対-宿主の方向性)である、前記レシピエント(recipient)に対する、少なくとも1つのHLAクラスII対立遺伝子ミス-マッチを有する、並びに、前記HLAクラスII対立遺伝子ミス-マッチは、HLA-DRB1、HLA-DQB1、及びHLA-DPB1、からなる群より選択される遺伝子にある。
  10. 請求項１に記載の方法、ここで、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するワクチン接種を受けた前記ドナー(donor)は、前記レシピエント(recipient)中に存在する抗原に対するCD4+ T-細胞免疫を有するドナー(donor)である。
  11. 請求項１に記載の方法、ここで、前記レシピエント(recipient)は、前記ドナー(donor)のヒト白血球抗原に対して反応性である、検出可能な抗体を有さない。
  12. 請求項１に記載の方法、ここで、前記末梢血細胞組成物中のCD8+ T-細胞を減少させることは、磁性粒子に結合した抗-CD8+抗体、又は抗-CD8+抗体プラス補体、を使用することを含む。
  13. 請求項１に記載の方法、ここで、前記レシピエント(recipient)、前記ドナー(donor)、及び複数の潜在的な同種異系のドナー(donor(s))、からなる群より選択される対象を、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原、肝炎ウイルス抗原、エプスタイン-バー・ウイルス(Epstein-Barr virus)抗原及びサイトメガロウイルス抗原、からなる群より選択される感染体の抗原、に対する血清学的応答性について、スクリーニングした。
  14. 請求項１に記載の方法、ここで、前記同種異系リンパ球組成物組成物中のCD4+ T-細胞の数は、前記末梢血細胞組成物中のCD4+ T-細胞の数と、約50%未満、異なる。
  15. 請求項１に記載の方法、ここで、キログラム(kg)での前記レシピエント(recipient)の理想体重に基づいた、ドナー(donor)CD4+ T-細胞の数は、約1×105 個のCD4+ T-細胞/kgと約1×109 個のCD4+T-細胞/kgとの間である。
  16. 対象におけるがんを治療する方法、ここで、前記方法は以下を含む：
    a) リンパ球除去化学療法を前記対象に処方する工程；並びに、
    b) リンパ球細胞組成物を前記対象に処方する工程、ここで、そのリンパ球組成物を、HLA-マッチの、部分的HLA-ミスマッチの、又はHLA-ハプロ同一のドナー(donor)の末梢血細胞組成物から得る、ここで、前記ドナー(donor)は、任意選択的に、前記対象中に存在する、ウイルス抗原及び／又は腫瘍ネオ抗原に対するワクチン接種を受けている、
    ここで、前記組成物は、CD8+ T細胞が減少している、並びに、
    ここで、前記組成物は、前記対象中に存在する、ウイルスの及び／又は腫瘍ネオ抗原に対して特異的なCD4+ T細胞の、増殖した集団を含む。
  17. 請求項１６に記載の方法、ここで、前記リンパ球除去化学療法は、リンパ球-減少・非-リンパ球-破壊の治療；一過的なリンパ球減少症を誘導する治療；骨髄由来サプレッサー細胞を減少させる若しくは阻害する治療；腫瘍関連マクロファージ細胞を減少させる若しくは阻害する治療、又は調節性T細胞を減少させる治療、である。
  18. 請求項１６に記載の方法、ここで、リンパ球除去化学療法を、ダサチニブ、5-フルオロウラシル、タキソテール、クロドロネート、ゲムシタビン、シクロフォスファミド、フルダラビン、デニロイキン・ジフチトクス、及びダクリズマブ、からなる群より選択する。
  19. 請求項１又は１６に記載の方法、ここで、前記末梢血細胞組成物は、全血製剤又はアフェレシス製剤、である。
  20. 複数の異なった細胞株を含む細胞バンク、各株は、単一のドナー(donor)に由来する、及びウイルス抗原、腫瘍ネオ抗原、又はそれらの組合せ、に対して特異的なCD4+ T細胞の、増殖した集団を含む。
  21. 請求項２０に記載の細胞バンク、ここで、前記ウイルス抗原は、HPV抗原である。
  22. 請求項２０に記載の細胞バンク、ここで、前記ウイルス抗原は、前記エプスタイン-バー・ウイルス(Epstein-Barr virus)の抗原である。
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