JPH06500023A - 抗原特異性ｂおよびｔリンパ球ならびにそれから得られるモノクローナル抗体を提供する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗原特異性ＢおよびＴリンパ球並びにそれから得られるモノクローナル抗体を提 供する方法本発明は抗原特異性ＢおよびＴリンパ球を提供する方法に関するもの であり、該方法は抗原提供細胞およびリンパ球を哺乳動物の体液および／または 組織から単離し、それらを−緒にインキュベートしてそれらの特異的付着を誘発 させ、そしてそれらを慣用の方法に従って培養することからなる。

このような方法はＴ、マエダ（Ｍａｅｄａ）等、ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄ ｏｍａ）、５巻、第１号、１９８６年、３３〜４１から既知である。

この方法は主として非特異性で非抗原特異性のＢおよびＴリンパ球を生じさせる ことが現在明らかにされている。

それ故、本発明の目的は上記のことを回避できる方法を提供することである。

本発明によって、この目的は、上記方法における付着細胞を非付着細胞から分離 し、そして非付着細胞ではなくて付着細胞だけを培養することによって達成され る。

本発明によって、抗原提供細胞およびリンパ球は哺乳動物の種々の体液および／ または組織から単離される。特に、血液、リンパ液、胸膜液、腹腔液および滑膜 液並びに脳を髄液を本願明細書では体液として述べることができる。体液は健康 な哺乳動物および病気の哺乳動物から採集することができる。これはまた組織に ついても当てはまり、これら組織には特に牌艮リンパ節、骨髄、皮膚および腫瘍 が含まれる。本願明細書にいう哺乳動物は特にヒト、家畜および実験動物であり 、発現家畜も宵月な動物に含まれる。

本発明の方法に使用される体液および／または組織は１つまたはそれ以上の哺乳 動物から得ることができる。幾つかの哺乳動物が使用される場合、それら動物が 全て上記群の１つに属することは必ずしも必要ではない。更に、本発明の方法は 哺乳動物だけに限定されるのではなくむしろ動物界の全ての動物を含み、これら 動物から上記細胞を単離することができる。

既知の方法、例えばフィコール−ハイバク遠心法を抗原提供細胞とリンパ球の単 離に使用することができる。この目的では、体液は直接使用され、一方面体組織 および腫瘍は先ず、粉砕およびコラーゲナーゼーディスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ ）またはトリプシンのような慣用の酵素を３７°Ｃで１時間次いで遠心のような 条件下で消化することによって個々の細胞に分離される。抗原提供細胞およびリ ンパ球は相間に得られ、次いて生理学的緩衝液、例えばＰＢＳ、ｐＨ７，２で数 回洗浄する。

本発明によって、抗原提供細胞はリンパ球から分離される。これには既知の方法 を使用することができる。細胞は好ましくは血清不合培地、例えばＲＰＭＩ１６ ４０またはＣＧ培地を含有する培養容器中、３７℃および５％のＣＯｌのような 慣用の条件下でインキュベートする。培養容器は、抗原提供細胞およびリンパ球 が単離されたのと同じ哺乳動物（自己由来）または同じ種の哺乳動物（同種）の １つから得られる血漿または血清で被覆する。抗原提供細胞は自然に被覆物に付 着し、一方リンパ球は懸濁液に残る。１時間インキュベーションした後、リンパ 球をピペットで取り出すと抗原提供細胞が残る。

本発明によって、リンパ球は抑制された細胞から解放される。この目的のため、 リンパ球は例えば、ロイシンメチルエステル（１，２５ｍＭ）を用いて室温で３ ０分間処理し、次いで上記血清不合培地で数回洗浄する。

しかしながら、抗原提供細胞は活性化され、そしてそれらはその成熟状態に対応 して種々に処理される。固体組織から得られる抗原提供細胞はしばしば成熟して いるので、非常に活性である。これとは対照的に、体液から集めるときそれら細 胞は成熟しておらず、そしてこの理由により上記培養容器中、例えば上記ＣＧ培 地を使用して約２４時間培養する。この場合には、インターロイキン−１、イン ターロイキン−６、アデノシンまたはジブチリル−ｃＡＭＰのような誘発ファク ターを加えることが育利である。更に、骨髄から得られる抗原提供細胞は通常、 未だプリカーサ−細胞として存在しているので、上記培地の１つの中で約１週間 インキュベートする。これにはリノール酸（４μｇ／ｍｌ）、ビタミンＤ３（２ ，５Ｍ）、ビタミンＥ（０，１％）、多能コロニー形成促進因子（２Ｕ／ｍＩ） およびＭ−Ｃ３Ｆ　（３Ｕ／ｍｌ）のようなファクターを加える。

本発明によって、抗原は抗原提供細胞に加えられる。その量は例えばｌｐｇから ｌＯμｇ／培地ｍｌの範囲である。抗原は２，３分から２４時間添加する。抗　 原には全細胞、病原体および／または生体分子またはそのフラクションか含まれ る。これに関連して、細胞の用語は正常細胞並びにウィルス修正および病原細胞 の両者を意味するように理解される。病原体はウィルス、細菌およびアレルゲン からなり、そして生体分子には抗体、調停器、酵素および神経伝達物質が含まれ る。

抗原はそれ自体で使用するかまたは慣用の担体分子と組み合わせて使用すること ができ、両者はまた通常のアジュバントと混合しても使用される。

場合によっては、特に抗原提供細胞が生物内で抗原と既に十分接触しているとき 、抗原を添加しないで行うことが有利なことがある。このことは特に腫瘍および リューマチ性組織から単離された細胞に当てはまる。更に、抗原提供細胞とリン パ球の上記単離を全く行わないでフィコール−ハイバク遠心法で得られる相間を 直接使用することが上記の場合に、そして他の場合にも有利であることがある。

本発明によって、抗原提供細胞とリンパ球は一緒にインキュベートしてそれらの 特異的付着を誘発させる。この目的のために、細胞は上記培養容器に入れ、その 際リンパ球は１０から１０００倍過剰で存在し、そして上記培地の１つを用いて 培養する。培養期間は３７°Ｃで１５分から２日または４℃で最大２４時間であ る。

本発明によって、非付着細胞は付着細胞から分離される。この目的では、非付着 細胞は注意深くすすぐことによって被覆培養容器に付着している細胞から除去さ れる。更に、お互いに付着している浮遊細胞が存在しているときには、非付着細 胞は１乃至１５００ｇで２．３分間継続する速度沈降法によって分離する。

本発明によって、付着細胞は慣用の方法を使用して更に培養する。付着細胞は上 記培養容器中でインキュベートする。使用される培地は上記した培地の１つであ り、これにはインターロイキン−２、−４または−６のような増殖促進因子を加 えることができる。例えば永久細胞培養から得られる暫定培地を添加することも できる。インキュベーションによって抗原特異性Ｂおよび１９２３球の増殖がも たらされる。極く少量の非特異性リンパ球か形成される。インキュベーション４ 日後に抗体が上溝液中に得られ、その量は更にインキュベーションすることによ って増加させることができる。増殖促進因子を育する新鮮な培地を１週間毎に加 えることも有利である。任意に、抗原提供細胞を加えることもできる。しかしな がら、抗原提供細胞は最初に使用したものに相当しなければならない。

本発明によって得られる抗体は、特にクローニングの後では使用された抗原に非 常に特異的である。モノクローナルイディオタイプの抗体は、しかし抗イデイオ タイプの抗体も、使用された抗原が抗体であるときには関係がある。

本発明によって得られる抗原特異性Ｂおよび１９２３球はそれら自体非常に均質 である。特にクローニング後には、これらは特異的核酸プリカーサ−１例えばｍ ＲＮＡ０単離に適しており、これらは次いで遺伝子クローニングおよび既知の技 術、例えばＰＣＲ法を使用する特異的核酸配列の増殖の目的に使用することがで きる。本発明によって調製されるＢおよび１９２３球はまた養子免疫療法にも適 する。更に、これらはハイブリドーマ細胞との融合のような慣用の方法で固定す ることもできる。本発明によって得られる８９２３球はまた更に培養しそして抗 ＣＤ４０抗体を添加して膨張させることもできる。

以下の実施例は本発明を説明するために使用する。

上記したように、抗原提供細胞とリンパ球は破傷風抗原を使用して免疫化した健 康な提供者からフィコール−ハイバク遠心法によって単離し、そして自己由来血 漿被覆を有する培養容器中でお互いに分離した。リンパ球はロイシンメチルエス テルで処理することによって抑制された細胞から解放され、一方抗原提供細胞は ０．１および１０ｎＨの破傷風トキソイド／培地ｍｌで上記したようにして２４ 時間インキュベートした。次いで、抗原を洗い出した。

抗原提供細胞とリンパ球を上記培養容器中ＣＧ培地で一緒にインキュベートした 。リンパ球は２００倍過剰で存在していた。２４時間インキュベーションした後 、非付着細胞をピペットで注意深く取り出して除去した。暫定培地を補充した新 鮮な培地を付着細胞に加えた。細胞数、総抗体量および特異的抗体量は６日間イ ンキュベーションした後に測定した。特異的抗体の合成はプラスチックに結合し た破傷風トキソイドを抗原として使用してエリザ法で測定した。非特異的抗体の 合成もヒトＩｇに対するマウス抗体を使用してエリザ法で測定した。

図面の結果は次のことを示している：抗原提供細胞（ｍ−ＡＣ）の不存在下では 、すすいだバッチ中に特異的抗体は殆と合成されておらず、一方ｍ−ＡＣの存在 下ではすすいだバッチ中で顕著に合成された（斜線柱）。抗原をＩＯｎｇ／ｍｌ 添加するとき、最高収量が得られる。ｌｎｇ／ｍｌを添加するとき収量はやはり 高く、そして抗原を添加しなくても特異的抗体の顕著な生成が見られるであろう 。総抗体量（右縦軸）はこれらのバッチ中で非常に低い（）。かなりの量の特異 的抗体か、付着および非付着細胞が存在している非すすぎ対照中に見られるか、 非常に大量の非特異的抗体も同様に見られる。同時に、非すすぎ対照中の細胞数 はすすぎバッチに比較して約１０倍増加している。

このことによって、抗原特異性Ｂおよび１９２３球が本発明の方法によって好都 合に提供され、一方非抗原特異性Ｂおよび１９２３球は大部分除去されることか 強調される。

図面 Ｔｈｉｓｍｗｚ＆−富１１ｗｐ−−賞−ｈｍｌｙ會−刺一−ｗｌｊ−鯵一騎筺鴬 −―噸−−−曙一−・ｉ−一−−１−−―−−−シ噛−−自|１−−篩一■ｉ１ −−１１−−ｅａ＊ｎｑ＊−電。

η−−−−四罰雌〜噛−−１１−−坤一峻Ｐ−０−印Ｐ−・−勧−Ｐｍ−−ｋｍ ＝ａｓ＊ｑ−ｍｓｂｒ−ｐｍｔｗｗｗｔ−ｗｅ−−ｈｅ−−ｇ−−０２１０９／ ９２フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０６ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、Ｃ Ｈ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＣＡ、 ＪＰ、　ＵＳ Ｉ （７２）発明者　ショールテス　ウヴエドイツ連邦共和国　ゲッティンゲン　デ ー−３４００スプリンクシュトラーセ　４９（７２）発明者　ヴアツエク　カー ル ドイツ連邦共和国　ヴアイルハイム　デー−８１２０ヴッヒエルンシュトラーセ 　１１

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原提供細胞およびリンパ球を哺乳動物の体液および／または組織から単難 し、それらを一緒にインキュベートしてそれらの特異的付着を誘発させそしてそ れらを慣用の方法に従って培養することからなる抗原特異性ＢおよびＴリンパ球 を提供する方法であって、該方法は付着細胞を非付着細胞から分離しそして非付 着細胞は培養しないで付着細胞だけを培養することを特徴とする。
2. ２．上記体液が血液、リンパ液、胸膜液、腹腔液および滑膜液並びに脳脊髄液か らなることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．上記組織が脾臓、リンパ節、骨髄、皮膚および腫瘍からなることを特徴とす る請求の範囲１に記載の方法。
4. ４．上記哺乳動物がヒト、家畜および実験用動物からなることを特徴とする請求 の範囲１から３のいずれか１に記載の方法。
5. ５．上記体液および／または組織が１つまたはそれ以上の哺乳動物から得られる ことを特徴とする請求の範囲１から４のいずれか１に記載の方法。
6. ６．付着を目的とするインキュベーション前に抗原提供細胞を活性化させそして リンパ球を抑制された細胞から解放させることを特徴とする請求の範囲１から５ のいずれか１に記載の方法。
7. ７．抗原提供細胞の活性化が抗原を添加することからなることを特徴とする請求 の範囲６に記載の方法。
8. ８．全細胞、病原体および／または生体分子若しくはそれらのフラクションが抗 原として添加されることを特徴とする請求の範囲７に記載の方法。
9. ９．上記細胞が正常細胞、ウイルス感染細胞および病原細胞からなり、病原体が ウイルス、細菌およびアレルゲンを含み、そして生体分子が抗体、調停器、酵素 および神経伝達物質からなることを特徴とする請求の範囲８に記載の方法。
10. １０．付着を目的とするインキュベーションが血漿または血清で被覆した培養容 器中で行われることを特徴とする請求の範囲１から９のいずれか１に記載の方法 であって、その際血漿または血清は抗原提供細胞およびリンパ球を単離するため に使用された哺乳動物の少なくとも１つから得られる。
11. １１．慣用の培養方法がクローニングおよびミエローマ細胞との融合からなるこ とを特徴とする請求の範囲１から１０のいずれか１に記載の方法。
12. １２．上記Ｂリンパ球の慣用の培養方法がクローニングおよび抗ＣＤ４０抗体の 添加からなることを特徴とする請求の範囲１から１０のいずれか１に記載の方法 。
13. １３．請求の範囲１から１２のいずれか１に記載の方法によって得られる抗体。