JPH08333262A

JPH08333262A - 免疫抑制剤

Info

Publication number: JPH08333262A
Application number: JP8083766A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Nagamuta; 雅弘永牟田
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 1996-12-17
Also published as: AU693337B2; EP0856314A4; EP0856314A1; WO1996031224A1; AU5163196A

Abstract

(57)【要約】【構成】抗原、抗原を封入若しくは付着せしめたリポ
ソーム又は抗原とＢリンパ球細胞結合性物質との結合物
或いはこれらの少なくとも二種以上の混合物とＢリンパ
球細胞とを接触処理することにより得られる抗原処理Ｂ
リンパ球細胞を含んでなる免疫抑制剤、該免疫抑制剤を
動物に移入することを特徴とする免疫抑制動物の作成方
法、該免疫抑制動物の作成方法によって作成された免疫
抑制動物、前記免疫抑制剤をヒトに投与することを特徴
とする疾患の治療方法又は予防方法、並びに前記リポソ
ーム及び結合物。【効果】本発明により、臓器移植における拒絶反応、
骨髄移植における移植片対宿主病の治療、アレルギーの
予防などに有用な免疫抑制剤が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫抑制剤、該免
疫抑制剤が移入された免疫抑制動物およびその作成方
法、並びに該免疫抑制剤を用いた疾患の治療方法又は予
防方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臓器移植においては、近年免疫抑制剤が
広く臨床で用いられている。しかしながら、これらの製
剤は、免疫系に対し非特異的に作用し、外来からの感染
のみならず、悪性腫瘍の誘発など内在性の疾患発症など
の副作用を発現する危険性をもっていることから、使用
の対象となる疾患が非常に限定される。従って、目的と
する抗原に対して特異的に抑制効果を誘導する薬剤が必
要とされている。

【０００３】抗原特異的免疫抑制の誘導方法として、脾
臓由来の細胞と抗原を、１−エチル−３−（３−ジメチ
ルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＣＤＩ）を介
して結合させ、静脈内より移植することによりＴリンパ
球の反応性を低下させる方法が報告されている（M.K.Je
nkins, J.Exp.Med.,vol.165, 302 (1987))。しかしなが
ら、この方法ではＥＣＤＩ処理時に併発する自己抗原の
変性や、ＥＣＤＩの化学的結合により自己又は外来性物
質において新たな抗原性が発揮されることで、自己免疫
疾患の発症が懸念される。また、残存するＥＣＤＩによ
る予期しない生体反応が誘導されることも予想され、こ
のような点で副作用が発現する可能性がある。また、免
疫抑制を誘導する担当細胞が明らかになっておらず、さ
らに抗体産生に与える影響について検討されていない
（M.K.Jenkins et al., J.Exp.Med.,vol.165,302-319,
(1987))。

【０００４】一方、近年Ｂリンパ球細胞が免疫抑制的作
用の誘導を担当する細胞である可能性が報告された（Ho
ri, S.S., J.Immunol. vol.143, 1447 (1989))。これま
で、Ｂリンパ球細胞は抗原を細胞内に取り込み断片化し
た後、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）抗原と共に
同細胞上に提示することで、むしろＴリンパ球細胞を活
性化し免疫系を賦活化すると考えられてきた。ところ
が、Ｂリンパ球細胞表在性抗原に結合性をもつ異種動物
で作成した抗体を投与することで、異種動物由来の抗体
に対する抗体産生能が抑制されることが報告され、Ｂリ
ンパ球細胞が抗体産生抑制作用をも合わせ持つことが間
接的に証明された（E.E.Eyron, J.Exp.Med. vol.175,13
1(1992) ; S.C.Morris, J.Immunol. vol.152, 3768 (19
94) ; S.C.Morris, J.Immunol. vol.152, 3777 (199
4))。ただし、免疫抑制を誘導できる抗原物質は異種動
物由来の抗体であり、かつ、ＩｇＤ、ＣＤ23又はＣＲ１
を認識するものに限定される。さらに、この系ではＢ細
胞が実際に免疫抑制誘導の担当細胞であるかどうかの直
接的な証明はなされていない。

【０００５】Fuchs,E.J.(Science,vol.258,1156,(199
2)) らは、Ｂリンパ球細胞が免疫抑制を誘導する担当細
胞であることを直接的に証明した。即ち、特定の抗原を
発現するマウス由来のＢリンパ球細胞を、同抗原が発現
しないマウスに移入することで、同抗原を認識する細胞
障害性Ｔ細胞の誘導が抑制されることを報告した。ただ
し、この系では、他の任意の抗原においては抗体産生抑
制作用の誘導は困難であり、あくまでもＢリンパ球細胞
表面上に存在する、一部の抗原に対してのみ抑制が誘導
できると解釈され、また特定抗原に対する抗体産生能に
ついては不明な点が多い。従って、Ｂリンパ球細胞が任
意の抗原に対し、免疫抑制作用を誘導できることは全く
知られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、抗原に対し
て免疫反応を抑制することが可能なＢリンパ球細胞を含
む免疫抑制剤を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づき、抗原特異的な免疫抑制作用を示す薬剤について
鋭意研究を重ねた結果、抗原と共に培養、又は抗原を細
胞内に取り込ませるようにする処理（以下「接触処理」
という）を施したＢリンパ球細胞をヒト又は動物に移入
することで、該Ｂリンパ球細胞が抗原特異的なＴ細胞反
応および抗体産生に対し優れた抑制作用を示すことを見
い出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち、本発明は、抗原と接触処理する
ことにより得られるＢリンパ球細胞（以下「抗原処理Ｂ
リンパ球細胞」という）を含んでなる免疫抑制剤であ
る。さらに、本発明は、抗原、抗原を封入若しくは付着
せしめたリポソーム（以下「抗原含有リポソーム」とも
いう）又は抗原とＢリンパ球細胞結合性物質との結合
物、或いはこれらのうち少なくとも二種以上の混合物を
Ｂリンパ球細胞と接触処理することにより得られる抗原
処理Ｂリンパ球細胞を含んでなる免疫抑制剤である。

【０００９】上記免疫抑制剤は、動物体内から取り出し
て免疫抑制作用を誘導させたＢリンパ球を該動物体内に
移入して該動物の免疫を抑制させるために使用すること
ができる。本発明において「接触処理」とは、例えば抗
原又は抗原とＢリンパ球細胞結合性物質との結合物（以
下「抗原−Ｂリンパ球細胞結合性物質結合物」ともい
う）を、Ｂリンパ球細胞とともに適当な培養液中で培養
するか、抗原含有リポソームとＢリンパ球細胞とを細胞
融合処理するか、マイクロインジェクション等により抗
原をＢリンパ球細胞中に注入するといった処理等をい
う。

【００１０】ここで、抗原としては、例えば組織適合抗
原などの細胞および組織由来抗原、アレルギーの原因抗
原又は自己免疫疾患の原因抗原（食品由来抗原、抗原性
を示すことが予想される薬剤若しくは製剤中に共存する
物質、又は人工臓器関連物質）等が挙げられる。Ｂリン
パ球細胞結合性物質としては、例えば抗体、抗体の一部
又は架橋剤が挙げられる。

【００１１】抗原−Ｂリンパ球細胞結合性物質として
は、前記抗原と前記Ｂリンパ球細胞結合性物質との化合
物等のほか、遺伝子工学的手法により、抗原遺伝子とＢ
リンパ球細胞結合性物質の遺伝子とを含む遺伝子を発現
させて得られたものなどが挙げられる。

【００１２】さらに、本発明は、前記免疫抑制剤を動物
に移入することを特徴とする免疫抑制動物の作成方法で
ある。さらに、本発明は、前記免疫抑制動物の作成方法
により作成された免疫抑制動物である。動物としては、
例えば、実験動物が挙げられる。

【００１３】さらに、本発明は、前記免疫抑制剤をヒト
に投与することを特徴とする疾患の治療方法又は予防方
法である。本発明の免疫抑制剤は、移植拒絶、アレルギ
ー、自己免疫疾患又は移植片対宿主病などに対して使用
される。さらに、本発明は、抗原を封入又は付着せしめ
た該抗原含有リポソーム又は抗原とＢリンパ球細胞結合
性物質との結合物である。かかるリポソーム若しくは結
合物は、それぞれ単独で又は両者を混合して形成された
組成物であってもよい。

【００１４】なお、本発明において、抗原とＢリンパ球
細胞結合性物質との結合物の１つとして、抗原遺伝子と
Ｂリンパ球細胞結合性物質の遺伝子とを含む遺伝子を発
現させて得られたものも含まれる。また、前記の抗原含
有リポソーム、抗原−Ｂリンパ球細胞結合性物質結合物
及び抗原遺伝子とＢリンパ球細胞結合性物質の遺伝子と
を含む遺伝子の発現産物等は、本発明の抗原処理Ｂリン
パ球細胞を作製するための抗原（後出の「広義の抗
原」）として使用できるものである。

【００１５】さらに、本発明は、Ｂリンパ球細胞と接触
処理することにより該Ｂリンパ球細胞に免疫抑制作用を
誘導することができる抗原である。Ｂリンパ球細胞とし
ては、動物体内より得られたものが挙げられる。

【００１６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
免疫抑制剤は、抗原そのもの、抗原含有リポソーム、抗
原−Ｂリンパ球細胞結合性物質結合物、或いはこれらの
うちの少なくとも二種以上の混合物を、Ｂリンパ球細胞
と接触処理することにより作製することができる。

【００１７】（１）Ｂリンパ球細胞の単離Ｂリンパ球細胞（以下「Ｂ細胞」ともいう）は、ヒト又
は動物の、骨髄などの一次リンパ器官、血液、脾臓若し
くは腸間膜などを含むリンパ節などの二次リンパ器官又
は各種臓器若しくは組織に存在する。そこで、これらの
組織中から以下の方法によりＢ細胞を単離する。

【００１８】すなわち、ヒト若しくは動物から採取した
血液、又は動物を開腹して採取された脾臓若しくは腸間
膜を適当な細胞培養液、例えばＭＥＭ、又はウシ胎児血
清（ＦＣＳ）若しくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を
含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁する。腸間膜リンパ
節を含む各所属リンパ節についてはハサミで細切後、脾
臓については摘出したままの状態で、また、各種臓器、
組織についてはコラゲナーゼやＤＮａｓｅなどの酵素処
理又はＥＤＴＡなどのキレート剤で処理した後に、それ
ぞれ金属メッシュにのせ、上から軽く圧迫することで内
部のリンパ球細胞を組織外に追い出す。細胞の生存率を
高めるために酵素処理はできるだけ緩やかな条件で行う
のが好ましい。金属メッシュを通過した細胞を軽くピペ
ッティングした後、約100×Ｇで遠心し上清を得、沈渣
の組織断片や細胞の会合体を除くことで単細胞化したリ
ンパ球を得る。

【００１９】次に、上記血液又は単細胞化した細胞懸濁
液からの通常のリンパ球分離方法、例えば、Ficoll密度
勾配遠心分離法等により、リンパ球分画を得る。但し、
このリンパ球分離操作は必ずしも必要としない。得られ
たリンパ球含有懸濁液から、通常のネガティブセレクシ
ョン若しくはポジティブセレクション又はこれらの組み
合わせなどによるＢ細胞分離方法によりＢ細胞を得る。

【００２０】例えば、ネガティブセレクションにおいて
は、リンパ球含有懸濁液に抗Thy-１抗体、抗ＣＤ４＋Ｃ
Ｄ８抗体などの抗Ｔ細胞抗体を加え低温で結合させ、そ
の後細胞毒性の低い補体を添加して37℃で反応させてＴ
細胞を除去する。補体添加後の培養時間は通常30〜40分
間で行い得るが、必要最小限の時間で行うことが望まし
い。又は、リンパ球含有懸濁液にマグネチックビーズに
結合させた抗Ｔ細胞抗体を加え反応させた後、磁石によ
りＴ細胞を除去する。又は、リンパ球含有懸濁液に蛍光
標識した抗Ｔ細胞抗体を加え反応させた後、フローサイ
トメーターによりＴ細胞を除去する。一方、ポジティブ
セレクションにおいては、リンパ球含有懸濁液にマグネ
チックビーズに結合させた、若しくは蛍光標識した抗Ｂ
細胞抗体を用い、上述のようにそれぞれ磁石又はフロー
サイトメーターによりＢ細胞を分離する。

【００２１】いずれの手法においても、必要な場合を除
いて低温処理を行い、細胞をより良い状態に保つことが
好ましい。このようにして得られた残りの懸濁液（Ｂ細
胞分画）中には少数の樹枝状細胞が存在することが予想
される。樹枝状細胞が抗原に対する抗体産生を増強させ
る作用があることから、樹枝状細胞の混在が免疫抑制作
用に大きく影響を及ぼすと考えられる。従って、できる
限り樹枝状細胞を取り除く作業を行うことが好ましい。
例えば、Ｂ細胞を含む懸濁液をSephadex G-10カラムに
２度かけることで、樹枝状細胞やマクロファージを除く
ことができる。Ｂ細胞はカラムに吸着せずに流出するの
で、溶出した非付着性の細胞をＢ細胞として得る。尚、
動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスタ
ー、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル等の実験動物が挙
げられる。

【００２２】（２）抗原 1) 本発明において、「抗原」とは、生体に免疫応答を
引き起こす活性（抗原性）の有無を問わず、免疫抑制の
目的となる任意の抗原をいう。好ましくはＢリンパ球と
直接接触処理することにより、該細胞に免疫抑制作用を
誘導することができる抗原が使用できる。具体的には、
例えば組織適合抗原など細胞及び組織由来抗原、アレル
ギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原（食品由来
抗原、抗原性を示すことが予想される薬剤若しくは製剤
中に共存する物質、又は人工臓器関連物質、又はそれら
の変性物（例えば熱変性物等）；以下「原因抗原」を
「原因物質」ともいう）などが挙げられる。

【００２３】細胞及び組織由来抗原とは、宿主の持って
いない対立遺伝子の産物全般をいう。特に、主要組織適
合抗原（ＭＨＣ抗原）や非主要組織適合抗原が中心的な
対象となる。ＭＨＣ抗原とは、移植片拒絶反応はもとよ
り、生体の免疫反応に関係した機能を営む抗原系であ
る。該抗原系には、ＨＬＡ抗原、Ｈ−２抗原、ＲＴ１抗
原、Ｈｍ−１抗原、ＧＰＬＡ抗原、ＲＬＡ抗原、ＤＬＡ
抗原、ＦＬＡ抗原、ＳＬＡ抗原、ＣｙＬＡ抗原、ＲｈＬ
Ａ抗原などが含まれ、それぞれヒト、マウス、ラット、
シシリアンハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネ
コ、ブタ、カニクイザル、アカゲザルのＭＨＣ抗原など
を意味する。

【００２４】アレルギーの原因物質には環境・花粉抗
原、真菌抗原、食物抗原、人工抗原等が含まれ、例え
ば、環境・花粉抗原としてはダニ、ハウスダスト、スギ
花粉、ブタクサ等、真菌抗原としてはカンジダ、アルテ
ルナリア、アスペルギルス、クラドスポリウム、ペニシ
リウム等、食物抗原としては卵白、牛乳、大豆、小麦
粉、ソバ粉、サバ、イワシ、アジ、エビ、カニ、ブタ
肉、牛肉、トリ肉等、人工抗原としては薬剤、人工臓器
等が挙げられる。また、自己免疫疾患の原因物質として
は以下の表１に記載のとおり、疾患の原因となる自己抗
体の対応抗原が挙げられる。

【００２５】

【表１】

【００２６】但し、「抗原」とは上記した通りであるが
（狭義の抗原を意味する）、上記抗原をリポソーム表面
に付着させたもの若しくはリポソーム内に封入したも
の、又は上記抗原をＢ細胞結合性物質に結合させた結合
物なども抗原を含んだものであり、広義には抗原の意味
である。したがって、以下本発明では特に示さない限
り、「抗原」には抗原そのものの他、抗原含有リポソー
ム又は抗原−Ｂリンパ球細胞結合性物質結合物のそれぞ
れ単独のものに限定されるものではなく、これらのうち
の少なくとも二種類以上の混合物も含まれる。従って、
本発明では、上記抗原、抗原含有リポソーム又は抗原−
Ｂリンパ球細胞結合性物質結合物をそれぞれ単独で用い
る場合に限定されるものではなく、これらのうちの少な
くとも二種類以上の混合物をも用いることができる。

【００２７】2) 本発明では、上記抗原含有リポソーム
を使用することができる。リポソームとは、一般には脂
質人工膜の一種であり、多くのリン脂質、グリセロ糖脂
質を少なくとも50％以上の水に、その脂質固有のゲル−
液晶相転移温度以上で懸濁すると自動的に脂質二重層か
ら成る閉鎖小胞が形成される。リポソームは、生物的に
分解可能な素材を含む閉鎖小胞で、内部の水層や脂質二
分子層に種々の物質を保持させることが可能であること
より、マイクロカプセルとしてリポソームを利用しよう
とする試みも盛んである。

【００２８】本発明においてリポソームは上述した如き
抗原含有リポソームの作製に利用され、作製された抗原
含有リポソームはＢ細胞と接触処理することにより本発
明の抗原処理Ｂリンパ球とすることができる。本発明で
は、リポソームに抗原を封入又は付着させる方法につい
ては従来の公知技術を用いることができ、例えば、Ｃａ
−ＥＤＴＡ法等が挙げられる。リポソームに付着又は封
入された抗原をＢ細胞と接触させるための方法について
は後述する。

【００２９】3) さらに、本発明では、本発明の抗原処
理Ｂ細胞を作製するにあたり、抗原−Ｂ細胞結合性物質
結合物を使用することができる。抗原−Ｂ細胞結合性物
質結合物としては、例えば、上記抗原に、Ｂ細胞に結合
性の物質を結合させた物質、または、抗原遺伝子とＢリ
ンパ球細胞結合性物質の遺伝子とを含む遺伝子を発現さ
せて得られたもの（遺伝子工学的手法により発現させて
得られる物質）が挙げられる。

【００３０】Ｂ細胞結合性の物質としては、例えば、抗
ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＤ抗体、抗ＣＤ23抗体、抗ＣＲ１抗
体等若しくはこれら抗体の一部（Ｆａｂ，Ｆｃ等）また
は架橋剤が挙げられる。架橋剤とは、その両端のうちの
一方の端がＢ細胞、他方の端が抗原に結合することがで
きる物質であれば特に限定はなく、例えば、スクシンイ
ミジル 4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-1-カ
ルボキシレート(SMCC)、スルホスクシンイミジル 4-(N-
マレイミドメチル) シクロヘキサン-1-カルボキシレー
ト(Sulfo-SMCC)、N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジ
チオ) プロピオネート(SPDP)などの二官能性の化合物が
挙げられる。抗原とＢ細胞結合性物質との結合物（抗原
−Ｂ細胞結合性物質結合物）の例として、例えば、抗原
と抗ＩｇＭ抗体との結合物、抗原と抗ＩｇＤ抗体との結
合物、抗原とＳＭＣＣとの結合物、抗原とＳＰＤＰとの
結合物などのように、上記抗原から選ばれる群と、上記
Ｂ細胞結合性物質から選ばれる群とを任意に組み合わせ
ることができる。

【００３１】上記抗原と上記Ｂ細胞結合性物質とを結合
させるための方法としては、例えば上記抗原又は上記Ｂ
細胞結合性物質に、S-acetylmercaptosuccinic anhydri
de等のＳＨ基導入剤を用いてＳＨ基を導入し、更に上記
の架橋剤（例えばＳＭＣＣ）等を用いて両者を結合させ
る、といった一般によく知られた方法が利用可能であ
る。

【００３２】遺伝子工学的手法により発現させて得られ
る物質とは、目的の抗原遺伝子とＢ細胞に結合性の物質
の遺伝子との連結遺伝子（天然または合成のいずれによ
っても得ることができる）を発現ベクターにつなぎ、宿
主菌内で大量に発現させ精製して得られるものをいう。
例えば、抗原の遺伝子の上流に、Ｂ細胞表面抗原抗体遺
伝子を導入して、それを発現させて得られるタンパク質
などが挙げられる。その作製方法は以下の通りである。

【００３３】即ち、抗原遺伝子とＢ細胞結合性物質の遺
伝子（例えばＢ細胞表面抗原抗体遺伝子）との連結遺伝
子（天然又は合成により、両者とも従来からの公知技術
を用いて得ることができる）を発現ベクターに挿入し、
発現プラスミドを構築する。次に、前記連結遺伝子を含
むＤＮＡの全部又は一部を適当な制限酵素によって切り
出し、これを適当なプロモーターの下流につないだ後、
これを形質転換可能な宿主に導入することにより形質転
換させる。ここで使用されるベクターＤＮＡとしては、
プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられ、
宿主としては、酵母、大腸菌、動物細胞、昆虫細胞等が
挙げられる。そして、前記形質転換体を一般に使用され
ている培地で培養し、その培養物（培養液、培養菌体若
しくは培養細胞又は培養上清液）を集め、通常行われて
いる方法によって精製すればよい。

【００３４】なお、培養後の培養上清液については、遠
心分離等を行って形質転換体を除くことにより、又は、
集めた形質転換体を例えば緩衝液に懸濁させた後、凍
結、融解処理、煮沸処理等を行い、遠心分離することに
より、得ることができる。得られた培養物から抗原とＢ
細胞結合性物質との結合物（遺伝子組換え型）を分離、
精製するには、通常知られている蛋白質の精製方法に従
えばよい。例えば、塩析法、遠心分離法、各種クロマト
グラフィー、電気泳動等を適当に組み合わせて精製が行
われる。

【００３５】各種クロマトグラフィーとしては、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラ
フィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げら
れる。また、精製品の純度及びおよその分子量の確認は
ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法、ウエスタンブロット法等を用いて行わ
れる。

【００３６】4) なお、組織適合抗原などの細胞および
組織由来抗原に対する免疫抑制を行うことは、例えば臓
器移植時の拒絶反応や骨髄移植時の移植片対宿主病（Ｇ
ＶＨＤ；Graft vs. host disease）を治療又は予防する
のに有用であり、アレルギー原因物質（スギ花粉等）に
対する免疫抑制を行うことは、例えば花粉によるアレル
ギー性鼻炎を治療又は予防するのに有用であり、食品タ
ンパク質抗原（卵白アルブミン等）に対する免疫抑制を
行うことは、食品アレルギーを治療又は予防するのに有
用である。また、人工抗原（薬剤等）に対する免疫抑制
を行うことは、薬剤アレルギー、薬剤性自己免疫疾患な
どを治療又は予防するのに有用である。

【００３７】（３）Ｂ細胞と抗原の接触処理本発明の免疫抑制剤は、抗原とＢ細胞を接触処理するこ
とにより得ることができる。本発明においてＢ細胞と抗
原の接触処理とは、例えば、Ｂ細胞と抗原を適当な培
養液中で培養したのちＢ細胞を回収すること、細胞融
合法、例えば抗原を付着又は内包するリポソーム（抗原
含有リポソーム）とＢ細胞を接触させて細胞融合させた
のち融合細胞を回収すること、或いはマイクロインジ
ェクションによりＢ細胞内に抗原を注入し抗原が注入さ
れたＢ細胞を回収すること、を意味する。及びのご
とく処理されたものは、抗原がＢ細胞表面に付着したの
ち細胞内に取り込まれるか、或いは直接的に取り込まれ
る等して、いずれも結果的には抗原が細胞内に取り込ま
れるものと考えられる。

【００３８】この接触処理のうち、抗原そのものをＢ細
胞と接触処理する場合、又は抗原−Ｂリンパ球細胞結合
性物質結合物をＢ細胞と接触処理する場合は、一般に行
われている細胞培養法により行うことができ、抗原が付
着若しくは封入されたリポソーム（抗原含有リポソー
ム）とＢ細胞とを接触処理する場合は、該リポソームと
Ｂ細胞とを一般に行われている細胞融合法により行うこ
とができる。

【００３９】以下に具体的な手法を説明する。 1) 培養による方法上記(1)により調製されたＢ細胞を、上記(2)に記載の抗
原とともに培養し、Ｂ細胞に抗原を接触させて、抗原の
Ｂ細胞への付着又は取り込みを行う。

【００４０】培養は、以下のとおり行う。Ｂ細胞を培地
（例えば10％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地）中
に懸濁し、抗原を添加して培養する。Ｂ細胞と抗原との
混合比率は特に限定されず、適宜定めることができる。
培養時間（Ｂ細胞に抗原を感作させる時間）は90分〜18
時間であるが、抗原の種類やその性状に応じて適宜時間
を調節することができる。また、培養は、通常行われて
いる条件で行うことができ、例えば５％CO₂ 濃度、37℃
で行うことができる。具体的には、例えば、１×10⁷個
／４ml（10％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地）の
細胞浮遊液を調製し、これに抗原である卵白アルブミン
（ＯＶＡ）50μg/ml を添加し、90分培養する（５％CO₂
，37℃）。

【００４１】一定時間培養した後、Ｂ細胞及び抗原が含
まれた培養液を洗浄し、抗原を除去する。洗浄は、300
〜400×Ｇで５〜10分間遠心分離を行い、上清を除き、
抗原を含まないＭＥＭ培地などに再浮遊する。このよう
に処理することにより、抗原はＢ細胞に付着したのちＢ
細胞に取り込まれるなどして本発明の抗原処理Ｂ細胞と
なる。

【００４２】2) 細胞融合による方法細胞融合による方法の一例としては、専らリポソームを
用いる場合の接触処理手段である。すなわち、上記(1)
により調製されたＢ細胞と、上記(2)に記載の抗原を付
着又は封入させて得られるリポソームとを融合させて、
抗原のＢ細胞への付着又は取り込みを行う。あるいは、
抗原を封入又は付着させたリポソーム若しくは赤血球と
細胞とを融合させる方法又は抗原抗体反応を利用する方
法が挙げられる。

【００４３】例えば、Ｃａ−ＥＤＴＡ法によるリポソー
ムへの抗原の封入又は付着を行った後、これをグリセロ
ール処理によりＢ細胞と融合させる。すなわち、ホスフ
ァチジルセリン５μＭ、コレステロール５μＭをＰＢＳ
１mlに懸濁し、超音波処理を60分間行う。終濃度２mＭ
となるようにCaCl₂ を加え、37℃に60分間保温する。生
じたシリンダー（白沈）を、遠心（2500×Ｇ，10分）で
集める。抗原を含む溶液0.5 mlを加え、攪拌する。ＥＤ
ＴＡ−Ｎａ（NaOHを加え、pH7.4 とする）15mＭを加え
攪拌する。37℃に30分保温することでリポソームが形成
される。これをＰＢＳにて２回洗浄（48,000×Ｇ，20
分）し、ＰＢＳなどに懸濁する。ＭＥＭ培地に浮遊さ
せ、37℃に保温したＢ細胞に直接リポソーム懸濁液を加
え、37℃にて30分保温する。培地を25％グリセロールと
なるように調製し、４分間処理する。その後、ＭＥＭ培
地で２回洗浄し、新しい培地に移す。このように抗原が
リポソーム内に封入されるか、リポソーム上に付着する
ことなどにより、抗原含有リポソームが作成される。

【００４４】3) マイクロインジェクションによる方法マイクロインジェクションによる方法は、専ら抗原をＢ
細胞内に取り込ませるために行われる手段である。すな
わち、公知の方法により直接Ｂ細胞内に抗原を導入す
る。

【００４５】（４）免疫抑制方法上記のように処理して得られたＢ細胞（抗原処理Ｂリン
パ球細胞）を、ヒト又は動物に移入することによりヒト
又は動物の免疫抑制を行う。「移入」とは、抗原との培
養後洗浄により該抗原を除去して得られたＢ細胞（抗原
処理Ｂリンパ球細胞）を、静脈注射、点滴静注等により
静脈から注入すること、又は組織内に直接移植すること
などをいう。移入には、１回の移入に限らず、複数回の
移入、即ち再移入も含まれる。尚、本発明では、「移
植」と「移入」を同義で用いることもある。

【００４６】「ヒト又は動物」は、上記(1)でＢ細胞を
採取したヒト又は動物と同一であっても異なっていても
よく、自己であると、同種同系であると、同種異系であ
るとを問わない。このように免疫抑制されたヒト又は動
物は、上記(3)で用いられた抗原に対してのみ免疫抑制
効果を発揮する。従って、免疫抑制を行った免疫機能以
外の免疫機能は抑制６れないので、従来の免疫抑制剤の
ように、アレルギーの治癒には貢献するが感染症を引き
起こしてしまう等の不都合は生じない。例えば、本発明
の免疫抑制剤が花粉と共に培養して得られたＢ細胞を含
む場合は、花粉に対してのみ免疫応答を抑制していわゆ
る花粉症の予防、治療に有効である一方、その他の免疫
機能を抑制しないので感染症等の合併症を予防すること
ができる。

【００４７】ここで、免疫抑制が行われたか否かの確認
は、抗体産生量又はＴ細胞などのリンパ球機能を測定す
ることにより行うことができる。抗体量の測定は、通常
の方法、例えばＥＬＩＳＡ法により行うことができる。
Ｔ細胞機能の測定は、通常の方法、例えばＴ細胞の増殖
能をアイソトープの取り込み法で、また、Ｔ細胞からの
サイトカイン産生量を専用キット又はバイオアッセイに
より行うことができる。

【００４８】（５）免疫抑制剤本発明の免疫抑制剤は、主として臓器移植後の拒絶反応
若しくはＧＶＨＤ、アレルギー又は上記表１に記載した
免疫疾患等の治療又は予防に有効である。本発明の免疫
抑制剤を投与する方法としては非経口投与が挙げられ、
非経口投与には、注射、例えば静脈注射、点滴静注、組
織内注射等を含む。また、その投与量は、投与対象の年
齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合、本発明の免疫抑制剤の有効量
と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合
せとして投与される有効量（有効Ｂ細胞数）は、10〜10
¹⁰細胞／kg体重／日であり、１日１回から数回に分けて
１日以上投与される。本発明の免疫抑制剤を非経口投与
する場合には、安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の
添加剤を含有し、要時調製する。

【００４９】

【発明の実施の形態】以下、実施例により本発明をさら
に具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限
定されない。〔実施例１〕Ｂ細胞の調製５〜11週齢のC57/BL6 雌性マウスの脾臓を取り出し、培
養液（ＭＥＭ培地）の入ったプラスチックシャーレ内で
圧迫することで脾臓内リンパ球を追い出す。ピペットに
より軽くサスペンドした後、金属メッシュを通過させ、
約100×Ｇで遠心分離を行い、沈渣を除くことで単細胞
化させた細胞浮遊液を調製した。約300×Ｇで遠心分離
を行い、上清を取り除くことで細胞の洗浄を２〜３回繰
り返して行った。最終的に単細胞化された細胞を、１％
ＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した。該細胞浮
遊液に抗Thy-１抗体（ICN immunoBiologicals 社製）を
加え30分間４℃で反応させ、次に補体（Cedarlane 社
製）を添加し37℃にて30〜40分間培養し、Ｔリンパ球細
胞を除去した。次に、得られた細胞溶液をSephadex G-1
0 （Pharmacia 社製）カラムに２度かけた。カラムに付
着する細胞を取り除き、カラムから溶出する非付着性の
細胞をＢ細胞として得た。

【００５０】〔試験例１〕ここで、以下の通り本発明の
免疫抑制剤の試験例を挙げ、その薬理効果（免疫抑制活
性）について説明する。上記実施例１で得られたＢ細胞
約１×10⁷個／匹を遠心分離により洗浄した後、10％Ｆ
ＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊させ、抗原で
あるＯＶＡを最終濃度50μg/mlとなるように添加し、37
℃で90分間培養した。300〜400×Ｇで５〜10分間遠心分
離を行い、上清を除き、新たな培地（ＭＥＭ）を加えて
細胞を再浮遊させた後、再び遠心分離を行った。この遠
心分離操作を２〜３回繰り返し、洗浄を行った。この洗
浄操作によりＯＶＡを除去した。

【００５１】得られたＢ細胞３×10⁶個をＭＥＭ培地に
懸濁し、これをマウスに静脈より移植した。移植４日お
よび約18日後、同抗原200μg、100μg をそれぞれ静脈
内投与により一次感作、二次感作を行なった。各感作後
１〜２週間目に血中抗ＯＶＡ抗体量を測定した。抗体量
は、波長492nm における吸光度（Ａ₄₉₂）を指標とし
た。尚、抗体産生抑制率は以下の式により算定した。

【００５２】抗体産生抑制率（％）＝〔（Ａ₄₉₂陽性対
照群−Ａ₄₉₂試験群）／（Ａ₄₉₂ 陽性対照群−Ａ₄₉₂陰
性対照群）〕×100

【００５３】陽性対照群には、抗原感作されたＢ細胞
（抗原と接触処理したＢ細胞）を移植せずＯＶＡ（solu
ble)のみを免疫したマウスの血清希釈液を用いた。ま
た、陰性対照には無処置マウスの血清希釈液を使用し
た。その結果、一次、二次免疫いずれの反応において
も、Ｂ細胞を移植せずに抗原感作した陽性対照マウスで
は、非常に高い抗ＯＶＡ抗体の産生が認められたのに対
し、予め抗原処理したＢ細胞（抗原処理Ｂ細胞、即ち本
発明の免疫抑制剤）を移植したマウスでは、抗ＯＶＡ抗
体産生が抑制された。特に、二次免疫反応においては約
95％の抑制率が認められた。結果を表２に示す。

【００５４】

【表２】

【００５５】〔試験例２〕上記実施例１により得られた
Ｂ細胞を遠心分離により洗浄した後、10％ＦＣＳを含む
ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊させ、抗原であるＯＶＡ
（異なる２ロット（No.P89301, No.P91501) を使用；生
化学工業（株）製）を最終濃度50μg/mlとなるように添
加し、37℃で約18時間培養した。300〜400×Ｇで５〜10
分間遠心分離を行い、上清を除き、新たな培地（ＭＥ
Ｍ）を加えて細胞を再浮遊させた後、再び遠心分離を行
った。この遠心分離操作を２〜３回繰り返し、洗浄を行
った。この洗浄操作によりＯＶＡを除去した。

【００５６】得られたＢ細胞６×10⁵個をＭＥＭ培地に
懸濁し、これをマウスに静脈より移植した。移植４日お
よび約19日後、同抗原200μg、100μg をそれぞれ静脈
内投与により一次感作、二次感作を行なった。各感作後
１〜２週間目に血中抗ＯＶＡ抗体量を測定した。抗体量
は、波長492nm における吸光度（Ａ₄₉₂ ）を指標とし
た。陽性対照及び陰性対照については、前記と同様であ
る。

【００５７】結果を図１に示す。一次、二次免疫いずれ
の反応においても、Ｂ細胞を移植せずに抗原感作した陽
性対照マウスでは、高い抗ＯＶＡ抗体の産生が認められ
た（図１の＃７〜９）。これに対し、予め抗原処理した
Ｂ細胞（本発明の免疫抑制剤）を移植したマウスでは、
半数例（６匹中３匹）で抗ＯＶＡ抗体産生が抑制された
（図１の＃１〜６）。なお、図中、＃１〜３及び＃４〜
６は、異なるロットのＯＶＡ（それぞれ生化学工業
（株）lot No.P89301 , No.P91501 ）でＢ細胞を処理し
ており、＃10は陰性対照（無処置マウスの血清希釈液を
使用したもの）である。

【００５８】〔試験例３〕ＯＶＡ（Egg albumin, 5×cr
ystalized; 生化学工業 lot no.P89301) を低温下でPB
S(-)に１mg/ml となるように溶解し、0.22μm のポアサ
イズのミリポアフィルターで濾過滅菌した後、静置した
まま18時間70℃にてインキュベートすることでＯＶＡ重
合体を作成した。ただし、この条件下では、非重合体
（分子量的に未変化体）も共存していることがSDS-PAGE
による解析で確認されているが、特に分離操作は行って
いない。得られた重合体を培地にて希釈した後、Ｂ細胞
浮遊液に最終濃度が50μg/mlに相当するように添加し、
in vitroで37℃、90分間インキュベートすることでパル
スラベルを行った。300〜400×Ｇで５〜10分間遠心分離
を行い、上清を除き、新たな培地（ＭＥＭ）を加えて細
胞を再浮遊させた後、再び遠心分離を行った。この遠心
分離操作を２〜３回繰り返し、洗浄を行った。この洗浄
操作によりＯＶＡを除去した。

【００５９】以下、試験例２と同様に、波長492nm にお
ける吸光度（Ａ₄₉₂）を指標として抗体量を測定した。
陽性対照及び陰性対照については、前記と同様である。
結果を図２に示す。図２より、熱変性させた抗原（ＯＶ
Ａ重合体；図２の「□」）により処理されたＢ細胞にお
いても、無処理のＢ細胞（図２の「◇」）と比較して抗
体の産生が抑制されることが示された。

【００６０】

【発明の効果】本発明により、特定の抗原に対して免疫
反応を起こさない免疫抑制剤が提供される。本発明の免
疫抑制剤は、臓器移植における拒絶反応、骨髄移植にお
ける移植片対宿主病（ＧＶＨＤ) を抑制する治療や、ア
レルギーの予防などに使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗ＯＶＡ抗体の産生量の低下を示す図である。

【図２】抗ＯＶＡ抗体の産生量の低下を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/00 ＺＧ 39/35 39/35 39/385 39/385 Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＥＣ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ 15/00 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】抗原と接触処理することにより得られる
抗原処理Ｂリンパ球細胞を含んでなる免疫抑制剤。
【請求項２】抗原、抗原を封入若しくは付着せしめた
リポソーム又は抗原とＢリンパ球細胞結合性物質との結
合物、或いはこれらのうち少なくとも二種以上の混合物
をＢリンパ球細胞と接触処理することにより得られる抗
原処理Ｂリンパ球細胞を含んでなる免疫抑制剤。
【請求項３】抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレル
ギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請求
項１記載の免疫抑制剤。
【請求項４】抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレル
ギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請求
項２記載の免疫抑制剤。
【請求項５】Ｂリンパ球細胞結合性物質が、抗体、抗
体の一部又は架橋剤である請求項２又は４記載の免疫抑
制剤。
【請求項６】抗原とＢリンパ球細胞結合性物質との結
合物が、抗原遺伝子とＢリンパ球細胞結合性物質の遺伝
子とを含む遺伝子を発現させて得られたものである請求
項２又は４記載の免疫抑制剤。
【請求項７】Ｂリンパ球細胞結合性物質が、抗体又は
抗体の一部である請求項６記載の免疫抑制剤。
【請求項８】請求項１〜７のいずれかに記載の免疫抑
制剤を動物に移入することを特徴とする免疫抑制動物の
作成方法。
【請求項９】動物が実験動物である請求項８記載の免
疫抑制動物の作成方法。
【請求項１０】請求項８又は９記載の免疫抑制動物の
作成方法によって作成された免疫抑制動物。
【請求項１１】請求項１〜７のいずれかに記載の免疫
抑制剤をヒトに投与することを特徴とする疾患の治療方
法。
【請求項１２】請求項１〜７のいずれかに記載の免疫
抑制剤をヒトに投与することを特徴とする疾患の予防方
法。
【請求項１３】疾患が、移植拒絶、アレルギー、自己
免疫疾患又は移植片対宿主病である請求項１１記載の治
療方法。
【請求項１４】疾患が、移植拒絶、アレルギー、自己
免疫疾患又は移植片対宿主病である請求項１２記載の予
防方法。
【請求項１５】抗原を封入又は付着せしめた該抗原含
有リポソーム。
【請求項１６】抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレ
ルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請
求項１５記載のリポソーム。
【請求項１７】抗原とＢリンパ球細胞結合性物質との
結合物。
【請求項１８】抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレ
ルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請
求項１７記載の結合物。
【請求項１９】Ｂリンパ球細胞結合性物質が、抗体、
抗体の一部又は架橋剤である請求項１７記載の結合物。
【請求項２０】抗原遺伝子とＢリンパ球細胞結合性物
質の遺伝子とを含む遺伝子を発現させて得られた、抗原
とＢリンパ球細胞結合性物質との結合物。
【請求項２１】抗原が、細胞及び組織由来抗原、アレ
ルギーの原因抗原又は自己免疫疾患の原因抗原である請
求項２０記載の結合物
【請求項２２】Ｂリンパ球細胞結合性物質が、抗体又
は抗体の一部である請求項２０又は２１記載の結合物。
【請求項２３】請求項１５若しくは１６記載のリポソ
ームおよび／又は請求項１７〜２２のいずれかに記載の
結合物を含む組成物。
【請求項２４】Ｂリンパ球細胞と接触処理することに
より該Ｂリンパ球細胞に免疫抑制作用を誘導することが
できる抗原。
【請求項２５】Ｂリンパ球細胞が、動物体内より取り
出されたものである請求項２４記載の抗原。
【請求項２６】免疫抑制剤が、動物体内から取り出し
て免疫抑制作用を誘導させたＢリンパ球を該動物体内に
移入して該動物の免疫を抑制させるために使用するもの
である、請求項１〜７のいずれかに記載の免疫抑制剤。