JPH06503002A - ストレプトリシンｏ誘導体及び変異体の抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １２、骨髄腫細胞がマウス及びヒトからなる群から選ばれた動物から得られる請 求の範囲第９項に記載のハイブリドーマ細胞株。

１３、Ｂ細胞源動物がマウスであり、骨髄腫細胞源動物がマウスである請求の範 囲第９項に記載のハイブリドーマ細胞株。

１４、ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２６によって指定されるハイブリドーマ細胞 株。

１５、ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２７によって指定されるハイブリドーマ細胞 株。

１６、ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２８によって指定されるハイブリドーマ細胞 株。

１７、ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２９によって指定されるハイブリドーマ細胞 株。

１８、ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２６．ＨＢ１０８２７．ＨＢ１０８２８及び ＨＢ１０８２９によって指定されるハイブリドーマ細胞株からなる群から選ばれ たハイブリドーマ細胞株によって分泌される抗体。

１９、野生型ＳＬＯに対する抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞株 。

２０、ハイブリドーマがｒｓＬｏを含むアジュバントで免疫化された動物からの Ｂ細胞源と動物骨髄腫細胞とのハイブリッドである請求の範囲第１９項に記載の バイブリドーマ細胞株。

２１、Ｂ細胞源が動物膵臓細胞である請求の範囲第２０項に記載のハイブリドー マ細胞株。

２２、動物がマウスである請求の範囲第２１項に記載のハイブリドーマ細胞株。

２３、骨髄腫細胞がマウス及びヒトからなる群から選ばれた動物から得られる請 求の範囲第１９項に記載のハイブリドーマ細胞株。

２４、Ｂ細胞源動物がマウスであり、骨髄腫細胞源動物がマウスである請求の範 囲第１９項に記載のハイブリドーマ細胞株。

２５、ｍ５Ｌｏの抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞株。

２６、ハイブリドーマがｒｓＬｏを含むアジュバントで免疫化された動物からの Ｂ細胞源と動物骨髄腫細胞とのハイブリッドである請求の範囲第２５項に記載の ハイブリドーマ。

２７、Ｂ細胞源が動物膵臓細胞である請求の範囲第２６項に記載のハイブリドー マ。

２８、動物がマウスである請求の範囲第２７項に記載のハイブリドーマ。

２９、骨髄腫細胞がマウス及びヒトからなる群から選ばれた動物から得られる請 求の範囲第２６項に記載のハイブリドーマ。

３０．３細胞源動物がマウスであり、該骨髄腫細胞源動物がマウスである請求の 範囲第２５項に記載のハイブリドーマ。

３１、ｒｓＬｏに対する抗体。

３２、抗体がＩｇＧのアイソタイプである請求の範囲第３１項に記載の抗体。

３３、ｍ５Ｌｏに対する抗体。

３４、抗体がＩｇＧのアイソタイプである請求の範囲第３３項に記載の抗体。

３５、ａ）野生型ＳＬＯを含むソースを得る工程、ｂ）野生型ＳＬＯに特異的親 和性を有するｒｓＬｏに対する不溶化された抗体へ該ソースを導入して、該野生 型ＳＬＯを該不溶化抗体へ結合させる工程、 ｃ）ｒｓＬｏに対する該不溶化抗体から望ましくない物質を除去する工程、及び ｄ）その溶出液が精製された野生型ＳＬＯを含む溶出によって該野生型ＳＬＯを 置換する工程 を含んでなる野生型ＳＬＯの精製方法。

３６、方法が少なくとも一度繰り返される請求の範囲第３５項に記載の方法。

３７、該野生型ＳＬＯを置換できるエルチネータ（ｅｌｕｔｉｎａｔｏｒ）が脱 イオン水溶液、野生型ＳＬＯを含む該ソースのｐＨより小さいｐＨを有する溶液 、有機溶媒、カオトロピック剤、解離剤、イオン性洗剤及び高塩濃度含有緩衝液 、からなる群から選択される請求の範囲第３５項に記載の方法。

３８、ａ）野生型ＳＬＯを含むソースを得る工程、ｂ）野生型ＳＬＯに特異的親 和性を有するｍ５ＬＯに対する不溶化された抗体へ該ソースを導入して、該野生 型ＳＬＯを該不溶化抗体へ結合させる工程、 ｃ）ｍｓＬｏに対する該不溶化抗体から望ましくない物質を除去する工程、及び ｄ）その溶出液が精製された野生型ＳＬＯを含む溶出によって該野生型ＳＬＯを 置換する工程 を含んでなる野生型ＳＬＯの精製方法。

３９、方法が少な（とも一度繰り返される請求の範囲第３８項に記載の方法。

４０、該野生型ＳＬＯを置換できるエルチネーターが、脱イオン水溶液、野生型 ＳＬＯを含む該ソースのｐＨより小さいｐＨを有する溶液、有機溶媒、カオトロ ピック剤、解離剤、イオン性洗剤及び高塩濃度含有緩衝液、からなる群から選択 される請求の範囲第３９項に記載の方法。

４１、該アイソタイプがそのＦａｂ’　フラグメント部分を生じるように操作さ れている請求の範囲第２７項に記載のＩｇＧアイソタイプ。

４２、それに抱合された試剤を含んでなる請求の範囲第４１項に記載のＦａｂ’ 　フラグメント。

４３、試剤が酵素、ビオチン、フルオロクローム、ラテックス、粒子、放射性同 位元素、化学発光標識、生物発光標識及びその内部に薬剤を取り込むことができ る粒子からなる群から選択される請求の範囲第３４項に記載のＦａｂ’フラグメ ント。

４４、それに抱合された試剤を含んでなる請求の範囲第１．第２及び第３項に記 載のモノクローナル抗体。

４５、該試剤が酵素、ビオチン、フルオロクローム、ラテックス粒子、放射性同 位元素、化学発光標識、生物発光標識及びその内部に試剤を取り込むことができ る粒子からなる詳から選択される請求の範囲第４４項に記載のモノクローナル抗 体。

４６、ｒｓＬｏに特異的親和性を有するモノクローナル抗体の生産方法において 、ｒｓＬｏを高密度リポタンパク質へ複合体化し、動物をｒｓＬｏ・高密度リポ タンパク質複合体で免疫化することを含んでなる改良方法。

４７、ｍ５ＬＯに特異的親和性を有するモノクローナル抗体の生産方法において 、ｍ５Ｌｏを高密度リポタンパク質へ複合体化し、動物をｍ５Ｌｏ・高密度リポ タンパク質複合体で免疫化することを含んでなる改良方法。

４８、ｒｓＬｏに特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体の生産方法に おいて、ｒｓＬｏ及びシスティンアミノ酸残基を還元することができる試剤を含 むアジュバントで動物を免疫化することを含んでなる改良方法。

４９、ｍ５Ｌｏに特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体の生産方法に おいて、ｍ５Ｌｏ及びシスティンアミノ酸残基を還元することができる試剤を含 むアジュバントで動物を免疫化することを含んでなる改良方法。

５０、該還元剤がメルカプトエタノール、ナトリウムボロ水素化物、ナトリウム シアノボロ水素化物、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビ ン酸、尿酸、ジチオエリスレイトール及びジチオスレチオールからなる群から選 択される請求の範囲第４８項に記載の方法。

５１、該還元剤がジチオスレチオールである請求の範囲第４８項に記載の方法。

５２、該アジュバント中の該還元剤の濃度が約２．０ｍＭと約８．０ｍＭの間で ある請求の範囲第４８項に記載の方法。

５３、該アジュバント中の該還元剤の濃度が約３．０ｍＭと約７．０ｍＭの間で ある請求の範囲第４８項に記載の方法。

５４、該アジュバント中の該還元剤の濃度が約５．０ｍＭである請求の範囲第４ ８項に記載の方法。

５５、該還元剤がメルカプトエタノール、ナトリウムボロ水素化物、ナトリウム シアノボロ水素化物、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビ ン酸、尿酸、ジチオエリスレイトール及びジチオスレチオールからなる群から選 択される請求の範囲第４９項に記載の方法。

５６、該還元剤がジチオスレチオールである請求の範囲第４９項に記載の方法。

５７、該アジュバント中の該還元剤の濃度が約２．０ｍＭと約８．０ｍＭの間で ある請求の範囲第４９項に記載の方法。

５８、該アジュバント中の該還元剤の濃度が約３．０ｍＭと約７．０ｍＭの間で ある請求の範囲第４９項に記載の方法。

５９、該アジュバント中の該還元剤の濃度が約５．０ｍＭである請求の範囲第４ ９項に記載の方法。

６０、高密度リポタンパク質分画がウシ及びヒトからなる群から選ばれる嗜乳動 物源からのものである請求の範囲第４６項に記載の方法。

６１、高密度リポタンパク質分画に対するｒｓＬｏの重量比が約１０：１と約１ ＝１の間である請求の範囲第４６項に記載の方法。

６２、高密度リポタンパク質分画に対するｒｓＬＯの重量比が約６：１と約１： １の間である請求の範囲第４６項に記載の方法。

６３、高密度リポタンパク質分画に対するｒｓＬｏの重量比が約２＝１である請 求の範囲第４６項に記載の方法。

６４、高密度リポタンパク質分画がウシ及びヒトからなる群から選択される哨乳 動物源からのものである請求の範囲第４７項に記載の方法。

６５、高密度リポタンパク質に対するｒｓＬｏの重量比が約１０：１と約１；１ の間である請求の範囲第４７項に記載の方法。

６６、高密度リポタンパク質に対するｒｓＬｏの重量比が約６：１と約１：１の 間である請求の範囲第４７項に記載の方法。

６７、高密度リポタンパク質に対するｒｓＬｏの重量比が約２＝１である請求の 範囲第４７項に記載の方法。

明細書 ストレプトリジンＯ誘導体及び変異体の抗体関連出頭 本出願はＣｒａｉｇ　Ｗ、　Ａｄａｍｓ及びＥｖａ　Ｙ、　Ｗａｎｇによる「ス トレプトリジンＯ誘導体」と題する米国特許土願第　号（ベックマン処理番号： 　１２８Ｄ−１０４）及びＣｒａｉｇ　’ｌｉ、　Ａｄａｍｓによる「ストレプ トリジン０変異体」と閉する米国特許出願第号（ベックマン処理番号：　１２８ Ｄ−１２２）に関連するものである。両出願は本願と同時に出願され、また本願 の説明のため参照されている。

発明の技術分野 本発明は、広くはストレプトリジン０、より詳細にはモノクローナル型、ポリフ ローナル型及び組換え型ＤＮＡ由来型のストレプトリジン０抗体に関する。その 最も詳細な観点において、本発明は組換え型ＤＮＡ技術によって生産されたスト レプトリジン０誘導体及び変異体への抗体に関する。

発明の背景 工、ストレプトリジンＯ ストレプトリジンｏｒＳＬＯ」は、約６５，０００と約７０．ＯｏＯダルトンの 間のおおよその分子量を宵する。ＳＬＯは４つの異なる属（ストレプトコッカス 、バチルス、クロストリジウム及びリステリア）に属するグラム陽性細菌種によ って生産される酸素感受性（チオール活性型）の細胞破壊性（細胞溶解性）毒素 （細胞毒）のクラスに属する。

ＳＬＯは膜コレステロールと相互作用し、広範囲の嗜乳動物細胞に対して細胞溶 解−細胞毒効果を及ぼす。その上、ＳＬＯは非常に強い心臓毒性を持っている。

ＳＬＯに関連する毒性及び病原性の一つはその溶血活性であり、すなわちＳＬＯ は赤血球を溶解しヘモグロビンの放出を起こす。ＳＬＯは比較的少量で実験動物 に致死的である。ＳＬＯの動物への注射は一般的にその即時の死を起こす。最も 典型的には、ＳＬＯは人間の発熱、大量発汗、炎症痛及び関節の腫脹が特徴の急 性感染症であるリウマチ熱及びしばしば心臓の内膜の炎症（心内膜炎）に関連し ている。

ＳＬＯは特定された細菌種によって産生されるため、これらの種が哨乳動物宿主 へ侵入した場合、細菌によって放出されたＳＬＯは宿主により外来性タンパク質 として取り扱われる。故にＳＬＯは抗原である。「抗原」は背椎動物の血流へ侵 入して直ぐＢ型の小リンパ細胞のリンパ芽球への転換を刺激する高分子量化合物 である。このリンパ芽球は抗原刺激物に特異的な抗体を分泌する。抗体は刺激抗 原に対する反応性又は反応部位を特異的に補う反応部位を有するタンパク質であ る。抗体は一般的に抗原粒子又は分子上の免疫的活性部位又は抗原決定基を占拠 することにより抗原を宿主組織に無害にする特性を持つ。抗ＳＬＯ抗体（ＡＳＯ ）はそれゆえ　により生産され （出願時抜け） ＳＬＯ分泌細菌による感染の決定、 比濁分析及び濁り測定のプロトコルを含む。

これら免疫診断的検定技術の利用のため、その混合物へ加える十分なＳＬＯの入 手が必要である。ＳＬＯの入手源の一つは細菌ストレプトコッカス・ビョージー ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓ、　ｐｙＯｇｅｎ ｅｓ）であり、ＳＬＯはＳ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓから培養ブロス中へ分泌される 。経験的に自然の宿主からのＳＬＯの精製は困難かつ高価であることが示されて いる。

モノクローナル抗体は、単一の免疫グロブリンアイソタイプ（免疫グロブリンと 称される抗体活性を有するタンパク質分画）と同様、単一の抗体特異性及び親和 性を有する。他方ポリクローナル抗体は目的の抗原と反応しない抗体と同様に、 目的の抗原を指向する多種の抗体分子を含む。モノクローナル抗体のもつ特異性 及び親和性故に、例えば精製プロトコルでかかる特異性が必要とされる場合、ポ リクローナル抗体以上に一般的に好まれる。モノクローナル抗体の特異性は、目 的の特異的結合特性をもつモノクローナル抗体を同定しスクリーニングすること を可能とする。例えば、同一の抗原の異なる部位へ結合する二種のモノクローナ ル抗体を選抜できる。かかる抗体は、例えばサンドイッチベースの（ｓａｎｄｗ ｉｃｈ−ｂａｓｅｄ）免疫検定において重要な価値を有する。

簡単には、モノクローナル抗体の生産は免疫化；雑種形成；増殖；スクリーニン グ：及びクローニングの工程を含んでなる。

以前全く遭遇したことのない抗原を注射されたマウス等の嗜乳動物の免疫反応は 一次反応（即ち動物の免疫系が抗原に対して少量の抗体を生じる）を引き出す。

もしある期間後、動物をその抗原で再接種すると免疫系は反応がより速（より強 く（より多量の抗体が産生される）かつ−次反応と質的に異なる（抗原と高い親 和性をもって結合する抗体）二次反応を引き出す。一般的に、多数の不要な抗体 が生産されるのを減じるため純粋な抗原が使用されることが好ましい。可溶性抗 原については、抗原とアジュバントの混合液で動物を免疫化することが好ましい 。アジュバントは注射部位に乳化した抗原のプールを与え、これは抗原が長期間 に亘って徐々に放出されることを可能とする。免疫化は腹腔内、静脈、皮下又は 筋肉内ルートによって行える。

雑種形成は骨髄腫細胞株の作製、牌臓細胞及びこれらの細胞株の融合過程から成 る。骨髄腫細胞株は抗体へ「永続性」を与え、この細胞株は無期限に増殖する能 力をもち免疫グロブリンを分泌する。

牌臓細胞は免疫化された動物の膵臓から得られる。融合過程は本質的に永久増殖 骨髄腫細胞を抗体を含んだ膵臓細胞とともに抗原へ溶しづ込ませる。融合過程の 結果物は一般的に「ハイブリッド」　（雑種）又は「ハイブリドーマ」　（融合 細胞腫）と呼ばれる。

増殖段階は本質的にハイブリドーマコロニーの成長を促進する。

典型的にはハイブリドーマだけが成長し、未融合の骨髄腫細胞及び膵臓細胞は増 殖できない。ハイブリドーマコロニーは、成長刺激培地へ入れ十分なコロニーが 増殖するまで培養される。

スクリーニング段階においては、抗原に対して抗体を産生するハイブリドーマコ ロニーが識別される。一般的に抗原に対する抗体の検定法をスクリーニングに使 用できるゆ例えば標識抗免疫グロブリンを免疫グロブリンの存在を検出するため に使用できる。

クローニングは、抗体を産生ずる細胞がモノクローナル集団から成ることを確保 する。即ち、スクリーニング段階において選抜されたハイブリドーマは必要なモ ノクローナル性を欠（抗体を含む。本質的にはクローニングは各細胞が同一細胞 のコロニーへ成長するサンプル細胞培養の確立を含んでいる。三つの異なるアプ ローチ、即ち限界希釈、半固形寒天培養、及びフロー選別による選択分離が用い られる。限界希釈が一般的に好まれる。この方法は特定のウェル中の細胞数が統 計的にＯから１０細胞となる希釈でハイブリドーマ細胞の懸濁液を個々の培養ウ ェル中へ植えつけることから構成される。再クローニング（即ち前記のくり返し ）が一般的にすすめられる。クローンすべてが同一の特異性の抗体を産生ずるこ とを確保するため、抗体は電気泳動又は速度比濁測定等によって分析される。

ポリクローナル抗体の生産は以下の免疫化及び精製の工程から構成される。免疫 化は実質的にはモノクローナル抗体の免疫化と同じである。精製は免疫化された 動物体液サンプルの除去及び適当なアフィニティーゲル上で抗原を不溶化し該ゲ ル上に前記体液を注ぐことによる体液の精製を必要とし、結合した抗体は溶離ク ロマトグラフィー又は置換クロマトグラフィー等によって除去できる。ヒツジ、 ウサギ又はマウスが動物として使用できるが、ウサギが好ましい。

抗体はまた前記概説した組換え型ＤＮＡ技術によって得ることができる。即ち、 抗原に対して免疫化された細胞の遺伝子又は遺伝子の関連部位を取り除き、適当 なりローニングベクター中へ挿入する。組換え型ベクターは次に組換え型抗体が 分泌される条件下で適当な宿主へトランスフェクションすることができる。

これまで、ＳＬＯに対する抗体の意識的な生産は（つまり、ＳＬＯ分泌細菌によ る感染に対する反応として宿主によって産生されるもの以外のもの）、実験動物 に対する野生型ＳＬＯの致死効果によって妨げられてきた。ここで使用されてい る用語「野生型５ＬＯＪは、例えばＳ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ等の細胞によって自 然に分泌されるＳＬＯを示すものである。それゆえ、野生型、誘導体又は変異体 ＳＬＯの精製、免疫診断的検定、治療目的及び同定目的のために使用できる抗体 の必要性が存在する。

発明の要約 、本発明は前記必要性を満足する。モノクローナル、ポリクローナル及び組換え 体由来抗体は、前記引用の同時係属出願中に開示されたＳＬＯ誘導体及び変異体 を用いて生成できる。このような抗体は少なくとも以下の分野で特に利用するこ とができる：抗体が抗原性物質が生成された溶液からのＳＬＯを結合するために 使用される組換え型ＤＮＡ技術によって得たＳＬＯと同様に細菌源から得た両野 生型ＳＬＯの精製、ＳＬＯの存在を調べる競争検定、二部位又はサンドイッチ測 定、及び非競争検定を含む免疫反応診断検定、ＳＬＯ相互作用の個所を決定する ためＳＬＯによって感染を受けた宿主への標識された抗体の導入によるＳＬＯ感 染個所の識別及び局部化；ＳＬＯの生じた分泌を中和するためＳ、　ｐｙｏｇｅ ｎｅｓの感染を受けた宿玄へ適当な医薬用のキャリアを介して抗体を導入するこ とによる治療分野等である。さらに開示されるように、このようなモノクローナ ル抗体の生成における改善が、免疫化工程前にｒｓＬｏ又はｍ５Ｌ０が高密度の りボタンバク質と錯体を形成し、又はシスティンアミノ酸残基を減少することが できる１種の物質へ導入されることによって為される。

理想的には、ポリクローナル抗体はＳ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓによって分泌される ＳＬＯ以外の抗原性物質に実質的に交差反応性がな（、ｒｓＬ。

及びｍ５Ｌｏ以外の抗原性物質に実質的に交差反応性がないことが最も好ましい 。理想的には、モノクローナル抗体は約１０−６以上、好ましくは約１０−７以 上、より好ましくは約１０−８以上の野生型ＳＬＯ１ｍｓＬｏ及びｒｓＬｏに対 して親和性を有する。

これらの及び他の使用及び利点は、本開示が進むにつれて明らかとなるであろう 。

好ましい実施態様の詳細な説明 精製、診断的又は治療的方法論における使用のためのストレプトリジン０に対す る抗体の生産は、これまでこれら抗体が最初に得られた動物（マウス、ウサギ他 ）へ少量注射した場合ＳＬＯが致死的であるために制限されてきた。それゆえ野 生型ＳＬＯを用いてかかる抗体を得ようとする試みは実際的な選択ではない。

前記引用の同時係属出願において、溶血活性を有し野生型ＳＬＯに対するＡＳＯ 抗体によって認識され及び組換え型ＤＮＡ技術を介して得られた可溶性誘導体（ 以下ｒＳＬ○と称する）、及び溶血活性がな（野生型ＳＬＯに対するＡＳＯ抗体 によって認識され及び組換え型ＤＮＡ技術を介して得られた可溶性ＳＬＯ変異体 が開示されている。ここで開示されたこれらの抗体はｒｓＬｏ及びｍ５Ｌｏに基 礎を置いている。

本開示中で使用されるように、ｒｓＬｏは前記定義されたとおりのＳＬＯ誘導体 であり、及び野生型ＳＬ○１ｍｇ当たり４Ｘ１０５溶血ユニツトの野生型ＳＬＯ 特異活性をベースとして約７５％以下の、より好ましくは約５％と５０％との間 及び最も好ましくは約９％のＳＬＯ野生型特異活性パーセントを有することを示 している。

本開示中で使用されるように、ｍ５Ｌｏは前記定義した通りのＳＬＯ変異体であ り、そして野生型ＳＬ０１ｍｇ当たり４Ｘ１０’溶血ユニツトの野生型ＳＬ○特 異活性をベースとして約１．５％以下の、より好ましくは約０．５％以下の、ま た最も好ましくは約０．１１％以下の野生型ＳＬ○特異活性を有することを示し ている。これらの値は相対的なものであり、もし野生型ＳＬＯ特異活性パーセン トがＩ　Ｘ　１０’溶血ユニット／ｍｇの野生型ＳＬＯ特異活性をベースとして いるならば、上記値は２．５の因子（即ち７５％が３０％となり、９％が３．６ ％となる等）によって減少される。

商業的に入手可能な野生型ＳＬＯは本質的に純粋でないために野生型ＳＬＯの実 際の「特異活性」が不明であるので前記で詳述した。再言すれば、野生型ＳＬＯ の特異活性は分析される物質が正確な特異活性を確立するために十分な純度であ ることを前提しているが、野生型ＳＬＯが本質的に純粋でないために、単一の「 正しい」特異活性を確立することはできない。

野生型ＳＬＯの特異活性は、４Ｘ１０’溶血ユニット／ｍｇの特異活性もまた記 載されているけれども、Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’溶血ユニット、／ｍｇ程度に高いもの として記載されている。Ａｌｏｕｆ、Ｊ、Ｅ、　ｒストレプトコッカス毒素（ス トレプトリジンＯ、ストレプトリジンＳ、エリトロゲン毒）Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃ 、Ｔｈｅｒ、：６６１−７１７　（１９８０年）が引用文献として本明細書に含 まれている。我々の同時係属出願中に記されているように、特異型ｒｓＬＯ及び ｍ５Ｌｏ　（ｒｓＬｏ、３及びｍ５ＬＯ２３／６）の特異活性及び溶血活性パー セントは、以下のように野生型ＳＬＯの特異活性をベースとした。

第１表 野生型ＳＬＯｒＳＬ　Ｏ，３ｍｓＬ　Ｏ，３／６特異活性　ａ）　ｌＸｌ０’ （溶血活性、　ｂ）　４Ｘ１０ゝ　３．６Ｘ　１０’　１４溶血ユニット／ｍｇ ） 野生型ＳＬＯの溶血活性％　ａｌ　１００　３．６　１．４Ｘ１０−”ｂ）　１ ００　９　３．５Ｘ１０−３ 変異体ｍ５Ｌ０．３／６は誘導体ｒｓＬ０．３と１個のアミノ酸で相違する。こ のことは精製ｒｓＬ０．３は野生型ＳＬＯより約３．６％溶血活性が低く、生成 ｍ５Ｌ０．３／６は野生型ＳＬＯより約１．４Ｘ１０−”％溶血活性が低いこと を示している。

例１ ｒｓＬｏ及びｍ５ＬＯの生体内毒性効果ｒｓＬ０．３及びｍ５Ｌ０．３／６の生 体内毒性効果を評価するため、Ｂａ１ｂ／ｃマウスへｒｓＬｏ、３及びｍ５Ｌ０ ．３／６の無希釈及び希釈静脈注射を行った。無希釈及び希釈の対照懸濁液緩衝 液を同数のマウスへ投与した。静脈注射を容易にするため、マウスを注射前に２ ０〜３０分間熱ランプ下で温めた。各条件におよそ２０頭のマウスを用いた。

無希釈のｒｓＬｏ、３及びｍ５Ｌ０．３／６のため各マウスへおよそ１７　ｍｇ ／　ｋｇの薬量を投薬し、他方希釈のｒｓＬｏ、３及びｍ５Ｌ０．３／６のため 各マウスへおよそ１０００μｇ／ｋｇの薬量を投薬した。対照の緩衝液は対照区 のマウスに影響を与えなかった。

注射後数分間の若干の毛の逆立ては別として、希釈又は無希釈のｒｓＬｏ、３又 はｍ５Ｌ０．３／６いずれかの投薬を受けたマウスのいずれもが静脈投与による 病的影響を示さなかった。

前記の毒性結果は、ｒｓＬｏ及びｍ５ＬＯがＳＬＯに対するモノクローナル、ポ リクローナル及び組換え型ＤＮＡ由来抗体の生産に利用できることを示している 。

ｒｓＬｏ及びｍＳＬ○に対するモノクローナル抗体を生成する過程において、出 願人はかかる抗体の生産のための方法に改良を見８した。その改良は高密度リポ タンパク質へのｒｓＬｏ又はｍＳ　ＬＯの相互作用あるいはシスティンアミノ酸 残基を還元できる試薬へのｒｓＬｏ又はｍ５Ｌｏの導入に基づいている。これら の改良は例２．ハイブリドーマの製造において詳細に明らかにされる。

例２ ハイブリドーマの製造 ｒｓＬＯ及びｍ５Ｌｏに特異的親和性を有するモノクローナル抗体を作ることが できるハイブリドーマを製造した。利用した材料は以下のとおりである。使用さ れた骨髄腫細胞はＫｅａｒｎｙらのムＩｍｍｕｎｏ１．上旦旦：１５４８　（１ ９７０年）に記載された非分泌性マウス骨髄腫細胞株であるＰ３Ｘ６３−ＡＣ３ ，６５３骨髄腫細胞株から得た。骨髄腫細胞は例えばマウス−ヒト異種骨髄融合 相手であるＳＭＨ−Ｄ３３等の種内ハイブリッドから得ることができる。

Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　β−０：　７３ ０８　（１９８３年）。別にヒトから得た骨髄腫細胞株は例えば治療的状況にお いての使用が好ましいヒトモノクローナル抗体を産生ずる機会を与える。ヒト骨 髄腫細胞株はＮｉ１ｓｓｏｎら、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｅｘ　、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ユニ ４７７　（１９７０年）（”　Ｕ−２６６”　）及びＭａｔｓｕｏｋａら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｓａｃ。

匠Ｂｉｏ１．Ｍｅｄ、１２５　：　１２４６　（１９６９年）じＲＰ’ＭＩ−８ ２２６”）中に記載されている。前記文献は本明細書中に引用して含まれている 。

使用した牌属細胞は以下に開示される手段に従って免疫化されたＢａ１ｂ／ｃマ ウスから得た。成育培地は１０％子牛血清（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ　Ｐｒｏｄｕｓ ｔｓ、Ｃａ１ａｂａｓａｓ、ＣＡ）を追加したＤＭＥ低グルコース（Ｉｒｖｉｎ ｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５ａｎｔａ　Ａｎａ、ＣＡ）及び２ｍＭのＬ−グル タミン（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）である。使用した培地は細胞 を除（ため遠心分離し０．２２μフイルターを通してろ過した６５３．１細胞の 培養３日間のものからの成育培地だった。順化ヒボキサンンチンアミノブテリン チミジン（ＣＨＡＴ）培地は、５０％が成育培地及び５０％が使用後の培地で、 １００ユニツト／ｍｌのペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ｒｒｖｉｎｅ　 ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　）　、　４　Ｘ　１０−’Ｍのアミノプテリン（Ｓｉｇ ｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍ、０．）、ｌ０ＸＩＯ−’Ｍのヒボキサンチ ン及び１．６Ｘ１０−’Ｍのチミジン（両者ともＧＩＢＣＯ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、　Ｙ、より入手）、及び１０ユニット／ｍｌ のインシュリン（Ｅｌｉ　Ｌｉ１１ｙ、ＩｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓＪｎｄ、）を 含んでいる。濁化培地は５０％が成育培地、５０％が使用後培地及び２．５Ｘ１ ０−’Ｍのｂ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）であった。約１３００から １６００の間の分子量を有するポリエチレングリコールじＰＥＧ”）（Ｓｉｇｍ ａ）が使用された。注射用媒質は１００ユニツト／ｍｌのペニシリン・ストレプ トマイシン溶液を含むＤＭＥ低グルコース（ともにＩｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃより入手）であった。０．５ｍｌのブリステンＴＭ（Ｐｒｉｓｔａｎｅ ）溶液（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン；　Ａｌｄｒｉｃｈ） を、ハイブリドーマ注射２週間前の各Ｂａ１ｂ／ｃ？ウスの腹腔内へ注射した。

ハイブリドーマをＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ　２旦６： ４９５（１９７５年）に記載の方法に従って作成した。膵臓を免疫化したマウス から頚椎脱臼後無菌的に除去し、単一細胞懸濁液が得られるまでテイッシェ・シ ーブ中で磨砕した。洗浄後その細胞を膵臓対骨髄騰細胞比２：１で水洗した６５ ３．１骨髄腫細胞と混合し、その後ペレットにした。上清を除去しＰＥＧを１分 間かけてゆっくりと加えた。ＰＢＳを加えて全量を２２ｍ１とし、続いてその細 胞をＰＥＧ添加の開始から８分後ペレットとした。このベレットを２００ｍ１の ＣＨＡＴ培地中へ再＠濁し、１０個の９６ウ工ル微量滴定プレート（全９６０ウ エル）の各ウェルへ０．２ｍｌの懸濁液を加えた。各ウェルに、融合後６又は７ 回目に新しいＣ）ＩＡＴ培地を与えた。

成長についてウェルの試験を１０日日月始め、次の３〜４週間にわたって継続し た。１１５ａ＋ｌのｒｓＬｏ、３　（最終濃度：１．５μｇ／ｍｌの被覆緩衝液 、１．５９ｇのＮａ２ＣＯｓ　、２．９３ｇのＮ　ａ　ＨＣＯｓ、１リツトルの ３反復蒸留水、ｐＨ９，６）を適当な数の微量滴定プレートウェル中へ分散し、 パラフィルムで被われシールされたこれらのプレートを少なくとも使用前３日間 ５−１０℃に保管した。ハイブリドーマの候補上清をＰＢＳ−０，０５％ＴＷＥ ＥＮ２０　（ポリオキシエチレンソルビクンモノラウレート。

Ｓｉｇｍａ　）　、ｐＨ７，２中で標準化した。抗原で被覆した微量滴定ウェル プレートをＰＢＳ−０，０５％ＴＷＥＥＮ２０で洗浄し、次に個々のウェルから 液体すべてを吸引した。それから各ウェルをハイブリドーマ候補からの上清２０ ０μｍで満たし被覆した。次にプレートを被覆し及び３７℃の恒温器中で２時間 培養し、ＰＢＳ−０，０５％ＴＷＥＥＮ２０で（３回）洗浄し、ウサギの抗マウ スコンジュゲー）−（Ｓｉｇｍａ　）の作用希釈液を加えた０次に各ウェルを吸 引乾燥し、次いで２００μｍのアルカリ性ホスファターゼ基質の添加を行った。

アルカリ性リン酸基質は以下のように調整した。１０ｍｇのｐ−ニトロフェニル リン酸（Ｓｉｇｍａ　）を各１ｍｌのジェタノールアミン緩衝液へ溶解した。ジ ェタノールアミン緩衝液を２回蒸留水１００ｍ１中に０．２０３ｇのＭ　ｇ　Ｃ ｌ　ｘ　（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）を溶解し、次いで７５０ｍ１の２回反復 蒸留水中に９５．８７ｍ１のジェタノールアミン（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ） を溶解して調整した。ＰｈはＨＣＩ及びＮａＯＨで９．８へ調整した。２回反復 蒸留水を加えて最終容量を１リツトルとした。作用希釈は１ｍｌのジェタノール アミン緩衝液当たり１ｍｇのリン酸ｐ−ニトロフェニルとして定義サレ、ジェタ ノールアミン緩衝液中でリン酸ｐ−ニトロフェニル−ジェタノールアミン緩衝液 を希釈して調製した。

次にプレートを被覆し、３７℃の恒温器中で３０分間培養した。

その後５０μｌの２規定のＮａＯＨを各ウェルへ加え、続いて静かに振とうして 反応を停止させた。その後で微量滴定ウェルからの吸光度の読み取りを４０５ｎ Ｍに設定した分子装置リーダーで行っ負の対照より大きい吸光度をもつウェルは 翌日再試験した。もし数値が試験二回目で負の対照より大きいままである場合は 、そのコロニーは正でかつクローン化されたと判断した。

クローニングは限界希釈法によって実施し、そこでは２個の９６ウエルプレート を利用し、１つは順化培地中ウェル当たり５細胞としそして１つは順化培地中ウ ェル当たり１細胞とした。クローニング１運間後、単一コロニーを前記酵素免疫 検定法じＥＩＡ“）によって試験した。もしすべてのウェルが正ならば、その株 は純粋であると考えられ、安定させるため二回目の再クローン化を行った。

もしすべてのウェルが１００％正と判定しなかったならば、正のウェルを二回目 のクローニング用に使用した。このプレートをクローニング７日後に再び試験し た。この手順はすべてのクローンが１００％正を示すまで繰り返した。次にこの 細胞を成育堵地中へ拡大しマウス１頭当たり３Ｘ１０’ハイブリドーマ細胞の濃 度でＰｒｉｓｔａｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ　Ｂａ１ｂ／ｃマウスの腹膜空隙中へ注射 媒体中に含ませて注射した。

注射の前に培養細胞からの上清をオフタロニー拡散法（閃田工Ｐａｔｈ、　Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、旦：　５０７　（１９４９年））によってアイ ソタイピングするために使用した。ハイブリドーマ細胞を注射された後約１０日 のマウスから腹水液を採取した。この腹水液を次いでＥＩＡによって滴定し、そ してＩｇＧ含量をＩＣＳ”速度比濁計（Ｂｅｃｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ 、Ｉｎｃ、、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）を用いて測定した。

免疫化のプロトコルは以下のようであった。ＳＬＯＡＳＬＩ及びＳＬＯＡＳ１２ と称されるマウスに対してＦｒｅｕｎｄの完全アジュバントじＦＣＡ”）（１５ ｍｌのＡｒａｃｅｌ　Ａ　（マンナイドモノオレエート））中の２０１ｔｇのｒ ｓＬｏ、３−ＲＡ　（後に記載される）；８．５ｍｌのＢａｙｏｌ　Ｆ　（パラ フィンオイル）；５ｍｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ　 （死菌・乾燥）を腹腔内注射し、６週間後にＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバント （”ＦＩＣＡ”）中の２０μｇのｒｓＬｏ、３−ＲＡの腹腔内注射が行われた。

ＦＩＣＡはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍを含有しない点でＦ ＣＡと相違する。およそ１力月後、ＦＩＣＡ中の１０ｕｇのｒｓＬｏ、３−ＲＡ を腹腔内注射した。３週間後（融合前３日間）、５μｇのｒｓＬｏ、３−ＲＡを ＰＢＳ中ＵＴ腹腔内注射した。ＳＬＯＡＳ１３〜ＡＳ２ｉ包括、ＡＳ１８は含ま ない）と称されるマウスに対して１０μｇのｒｓＬｏ。

３−ＨＤＬ　（後に記載される）をＦＣＡ中腹腔内注射し、６週間後に続いて２ ０ｕｇのｒｓＬｏ、３−ＨＤＬをＦＩＣＡ中腹腔内注射した。およそ９週間後（ 融合前３日間）５μｇのｒＳＬｏ、３−ＨＤＬをＰＢＳ中腹腔内注射した。

２個のモノクローナル抗体候補がｒＳＬｏ、３の溶血活性を妨害できることが確 認された。これら２種の抗体はそれぞれ５ＬＯＡＳ１６及びＳＬＯＡＳ２１から 得られた。同定のプロトコルは以下のとおりであった。０．５ｍｌのＰＢＳ　（ ｐＨ７，０）を０．０８μｇのｒｓＬｏ、３及び０．２μｍの脱脂された腹水液 へ加えた。脱脂腹水液は前記ハイブリドーマからの腹水液とＢｅｃｋｍａｎ脂質 クリーニング溶液（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、　） を濃度比１：１で混合して調製し、この混合液を少な（とも１分間渦状に攪拌し た。室温で５分後、０．５ｍｌのウサギ赤血球（ＰＢＳで一度予洗浄したもの） を前記混合液へ加えた。室温で１０分後、この混合液をＢｅｃｋｍａｎマイクロ 遠沈機中１２．ＯＯＯｒｐｍで５分間遠沈した。

ｒｓＬｏ、３に対するモノクローナル抗体の結合による溶血活性の妨害を示す正 の結果は、清澄な上清及び赤色のペレット（ペレットが赤血球を含む）によって 示され、溶血活性の妨害を示されない負の結果は赤色の上清（溶解が起こってい る）によって示される。

Ｓ、ＬＯＡＳ１６及びＳＬＯＡＳ２１から分泌された抗体を含有するマイクロカ プセルが清澄な上清、即ち正の効果を明示した。

前記のように、マウスをｒｓＬｏ、３−ＲＡ又はｒＳＬｏ、３−ＨＤＬのいずれ かで免疫化した。免疫化に先立つｒＳＬｏ、３の操作を野生型ＳＬＯの二つの性 質に基づいて実施した。第１に分泌された野生型ＳＬＯは最初に宿主中のコレス テロールと結合する傾向がある。第２にＳＬＯは単一のＣｙｓアミノ酸を有する 。これらの操作にはｒｓＬｏ高密度高密度リポタンパ画質分画ｓＬｏ−ＨＤＬ” ）混合物の生成及び還元剤へのｒｓＬｏの導入じｒＳＬＯ−ＲＡ”）が含まれて いる。これらの操作はｒＳＬＯ及びｍ５Ｌ０゜３／６にも適用できる。

いかなる特別な理論へ結びつけられることを望む訳ではないが、出願人はｒＳＬ ｏ、３−ＨＤＬによる免疫化は宿主の免疫系が複合体のＨＤＬ部分を異物として 認識するよう導き免疫反応を引き起こすと仮定した。ＨＤＬに対する反応に伴っ て宿主の免疫系は複合体中のｒｓＬｏ、３の存在に敏感となり、こうして抗体が またｒＳＬｏ、３上の抗原決定基部位に関連する宿主によって生成される。出願 人は同様にＨＤＬへのｒｓＬｏ、３の結合がｒｓＬｏ、３抗原決定基部位に対す る免疫反応へ導（異なる配座構造へと導くことを仮定した。ｒｓＬｏ−ＲＡに関 して、出願人は還元剤がｒｓＬｏ、３のＣｙｓアミノ酸と相互作用し、かくして 単一のジスルフィド結合を介して結合していた２個のｒｓＬｏ、３タンパク質構 造の分離及び２個のｒｓＬｏ、３構造各々へのＳＨ基の形成へと導いていると理 論づけした。これらのｒｓＬｏ、３構造は続いて単一のｒＳＬｏ、３タンパク質 構造とＳＨ基を含むアジュバント中の物質量に混合されたジスルフィド結合を形 成することができる。かかるｒＳＬｏ、３−アジュバント複合体は前記ｒｓＬｏ 、３−ＨＤＬ複合体と類似するであろう。すなわちそのような複合体のアジュバ ント部位が宿主の免疫系によって異物として認識される意味で「類似」であり、 か（して複合体のｒｓＬｏ、３部位へのその系の感作へと導（。

高密度リポタンパク質分画はいかなる晴乳動物をも入手源とできるが、哨乳動物 源は免疫化される嗜乳動物と同一でないことが最も好ましい。従っていずれのＨ ＤＬも本発明に利用できるが牛のＨＤＬコレステロール及びヒトのＨＤＬコレス テロールが特に好ましい。最も好ましいＨＤＬはＰｅｎｔｅｘｌｌヒトコレステ ロール濃縮液ＩＩ（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｋａｎｋａｋｅｅ 、Ｉｌｌ、ソース：ヒトのプラズマ、約２嶋 比は、約１０：１から約１：１の間であり、好ましくは約６：１から約１：１、 及び最も好ましくは約２：１である。

利用できる還元剤には、メルカプトエタノール、ナトリウムポロ水素化物、ナト リウムシアノボロ水素化物、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アス コルビン酸（ビタミンＣ）、尿酸、ジチオエリスレイトール及びジチオスレチオ ールがある。これらのうち、ジチオスレチオールが特に好ましい還元剤である。

還元剤の濃度は好ましくは約２．０ｍＭと約８．０ｍＭの間、より好ましくは約 ３．０ｍＭと約７．０ｍＭの間、そして最も好ましくは約５、０ｍＭである。

ｒｓＬｏ．３−ＲＡのため、２０μｇのｒｓＬｏ．３をＰＢＳ中の５．ＯｍＭＤ ＴＴ中で溶解した。この混合液と免疫化前に３０分間３７℃で熱した。

ｒｓＬｏ．３−ＨＤＬのため、ｒｓＬｏ．３　（１ｍｇ／ｍｌ）を免疫化前に容 積比６　：　１　（ｒ　Ｓ　Ｌｏ．　３　：　Ｐｅｎｔｅｘｌ″）でＰｅｎｔｅ ｘ”ヒトコレステロール濃縮液ＩＩと混合した。

この方法で製造されたハイブリドーマは、ｒＳＬｏに特別の親和性をもつモノク ローナル抗体を生産することができた。

例３ 野生型ＳＬＯに対するＳＬ○モノクローナル抗体の結合ＳＬＯ　ＡＳ１６及びＳ ＬＯ　ＡＳ２１ハイブリドーマから得たモノクローナル抗体はｒｓＬｏ．３へ結 合できたけれども、これらがまた野生型ＳＬＯに結合できるかどうかは絶対的で はない。再言すれば、必要なモノクローナル性を有するモノクローナル抗体がそ れが特異的である抗原性物質に対して特異的な親和性を有することが予想される けれども、かかるモノクローナル抗体がいずれか他の物質に対する特異的親和性 を持つかどうかに保証はない。従ってこれらのモノクローナル抗体が野生型ＳＬ Ｏに対して特異的親和性を宵するかどうを決定するため検討が行われた。

野生型ＳＬＯはＤＩＦＣＯラボラトリーズ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，　Ｍｉｃｈｉｇａ ｎ，　Ｃｏｄｅ０４８２）から入手した。このＤＩＦＣＯ　ＳＬＯはグループＡ ストレプトコッカスから製造した還元型のストレプトリジンＯの乾燥標準化した ろ液である。Ｄ　Ｉ　ＦＣＯ５ＬＯは使用直前に供給元の指示に従って水中で再 水和した。

０、５ｍｌの再水和したＤＩＦＣＯ　ＳＬＯへ、ＰＢＳ中の指定されたモノクロ ーナル抗体を含む脱脂腹水液の１００倍希釈液２０μｍを加えた。この混合物を 少なくとも１分間、渦状に攪拌した。室温で５分後、０．５ｍｌのウサギ赤血球 細胞（ＰＢＳで一旦予洗浄したもの）を前記混合物へ加えた．室温で１０分後、 混合物をＢｅｃｋｍａｎマイクロ遠心機中１２ｒｐｍでＳ分間遠心した。

正の結果、すなわち野生型ＳＬＯへの所定のモノクローナル抗体の結合による溶 血活性の妨害を示す結果は清澄な上清及び赤色のペレットによって示される。負 の結果、溶血活性の妨害を示さない結果は赤色の上清によって示される。所定の モノクローナル抗体を含むマイクロ遠沈管は清澄な上清、つまり正の結果を明示 した。

コノ結果は、ＳＬＯ　ＡＳ１６及びＳＬＯ　ＡＳ２１ハイブリトーマから得られ ｒｓＬｏ．３に関して特異的である所定のモノクローナル抗体が赤血球細胞の分 解を抑制するため野生型ＳＬＯへ十分に結合できたことを示している。このよう に、これらのモノクローナル抗体はｒｓＬｏ．３への特異的親和性を有するだけ でなく、それらは付加的に野生型ＳＬＯに対しても特異的親和性を有する。結合 した場合、野生型ＳＬ○の溶血活性はモノクローナル抗体により実質的に抑止さ れる。か（して例２において製造されたハイブリドーマは野生型ＳＬＯに対する 特異的親和性を有するモノクローナル抗体を生産することができた。

これらの結果は、かかるＳＬＯモノクローナル抗体には多種の用途があることを 示している。例えばかかるＳＬＯモノクローナル抗体は野生型ＳＬＯの精製及び ＳＬＯを測定する検定において使用できる。以下はＳＬＯモノクローナル抗体の みに限定されることな（、ＳＬＯポリクローナル抗体及びＳＬＯ抗体由来の組換 え体ＤＮＡは同じく利用可能であることが理解されるべきである。最も好ましく はＳＬＯ誘導体又はＳＬＯ変異体に特異的なモノクローナル抗体が利用され、よ り好ましくはｒｓＬｏ、３に特異的なモノクローナル抗体、及び最も好ましくは ＳＬＯＡＳ１６及びＳＬＯＡＳ２１ハイブリドーマから由来のモノクローナル抗 体が使用される。

Ａ）」二ュ旦旦旦五」ｌ 野生型ＳＬＯの精製は、適当な固形の支持体へモノクローナル抗体を結合するこ とにより、ＳＬＯ誘導体等に特異的なモノクローナル抗体を用いて達成できる。

新たに調整したもの又は予め凍結し解凍したもののいずれかが使用できる。モノ クローナル抗体はそれ自身がタンパク質に高い親和性を有しない物質へ結合でき るけれども、ガラスピーズ、アガロース及びその誘導体等の物質が好ましい。最 も好ましいのはＢｉｏ−ＲａｄＡｆｆｉ−Ｇｅｔ　１０　”である。かかる物質 へモノクローナル抗体を結合する方法が知られている。例えばＯ，ＬＭ　ＭＯＰ Ｓ緩衝液ｐＨ７゜５中に前記モノクローナル抗体１００ｍｇを準備し、そこへ１ ０ｍ１の未洗浄Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ａｆｆｉ−Ｇｅｌｌ　Ｏを加える。生じたスラ リーを室温で２時間反応させ、例えばＢｅｃｋｍａｎ　Ｔ　Ｊ　−６遠心機中１ ５０Ｏｒｐｍで遠心する。次に上清を取り除き、残ったゲルペットを蒸留水及び 次ｉ、：　Ｐ　Ｂ　Ｓで徹底的に洗浄する。

親和性ゲルに結合した５ｍｌのモノクローナル抗体を、例えばｓ、ｐｙｏｇｅｎ ｅｓの培養ブロスから得た新しい又は再水和した野生型ＳＬＯの２００ｍ１と４ 時間４℃で培養する。親和性ゲルに結合したモノクローナル抗体へ結合した野生 型ＳＬＯから成る生成したスラリーを、小さなり１ｏ−Ｒａｄ　Ｅｃｏｎｏカラ ム上に載せ４℃で１００ｍ１のＰＢＳで洗浄する。

結合した野生型ＳＬＯの除去は溶離クロマトグラフィーが好ましいが、当業者に 周知の方法によって行うことができる。例えば脱イオン水でカラムを流すことに よりカラムのイオン強度が低下し野生型ＳＬＯが溶出する。同様に約６．０以上 のｐＨの緩衝液も類似の結果を与えるけれども約６．０又はそれ以下のｐＨの緩 衝液が野生型ＳＬＯの溶出に使用できる。溶出用の試薬は周知であり、例えば高 ｐＨ試薬（１００ｍｍトリエチルアミン、ｐＨ１１，５；　１００ｍｍリン酸、 ｐＨ１２，５）；低ｐＨ緩衝液（１００ｍａ＋グリシン、ｐＨ２，５；１００ｍ ｍグリシン、ｐＨ１，８）；高濃度塩緩衝液（５ｍＬｉＣ１，１０ｍｍリン酸塩 、ｐＨ７，２；　３．５ＭｇＣ１，１０ｍｍＩ）”、を酸塩、ｐＨ７，２）；− ＋’ｔン性洗剤（１％ＳＤＳ　；　１％ＤＯＣ）；解離剤（２ｍ　ｖｒｅａ；　 ８ｍ　ｖｒｅａ：　２ｍグアニジンＨＣＩ）、カオトロピック剤（３ｍチオシア ネート）；及び有機溶媒（１０％ジオキサン；５０％エチレングリコール、ｐＨ １１，５；　５０％エチレングリコール、ｐＨ８，０）が含まれる。

超精製のため、生成した精製野性型ＳＬＯにを同じ精製プロトコルを再び受けさ せることができる。

Ｂ）ストレプトリジン０のレベルを′　る　Ｈａ　−法免疫診断検定の例には、 ＳＬＯの異なる抗原決定基部位に特異的な少なくとも２種のモノクローナル抗体 がビオチン化されている（ｂｉｏｔｉｎｙｔａｔｅｄ）比濁測定又は濁り測定検 定がある。これらビオチン化されたモノクローナル抗体（又はそのフラグメント ）はＳＬＯ及びアビジンを含有すると思われるサンプルと混合される。

アビジンは卵白中に見昌された比較的大きな高分子タンパク質で４つのサブユニ ットを有する。ビオチンは比較的小さな安定な水溶性のビタミンである。アビジ ン分子の４つのアビジンサブユニットの各々はビオチンの分子に特異的に結合す ることができる。このようにビオチン化されたＳＬＯモノクローナル抗体接合体 はアビジン分子と結合することができる。

濁り測定においては、粒子又は凝集体の懸濁液を通して送られる光の減少が測定 される。この減少は凝集体による光の反射、散乱あるいは吸収によって生じる。

比濁測定では、測定される光の直接の通路に設置されない検出器に対して光が散 乱され反射される。それゆえもしビオチン化されたＳＬＯモノクローナル抗体、 アビジン及びＳＬＯを含有すると思われるサンプルが混合され、その混合液が濁 り測定あるいは比濁測定プロトコルを受ければ、そのサンプル中に存在するＳＬ Ｏ量が測定できる。濁り測定及び比濁測定プロトコルは周知であり、ここでその 詳細について明記はしない。Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、　Ｊ、　Ｃ，、ｒ免疫沈降反 応による特異タンパク質測定のための速度比濁計Ｊ　、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ、、 旦：８，１４５６−１４６４　（１９７７ｆＥ）を参照。特に有用な比濁計はＢ ｅｃｋｍａｎ　Ｉ　ＣＳ　”比濁計（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 　Ｉｎｃ、　）である・サンプル中のＳＬＯの存在にかかわりな（、ビオチン化 されたＳＬＯモノクローナル抗体はアビジンに結合する。もしＳＬＯがサンプル 中に存在しないか又は限定された力価で存在する場合、凝集体の形成は制限され るであろう。しかしながら、もしＳＬＯがサンプル中に存在するならば、次いで ＳＬＯモノクローナル抗体がそれに結合でき、下記のような凝集体の形成を増大 する。

（アビジン：ビオチン−ＭＡｂｌ　：ＳＬＯ：ＭＡｂｚ−ビオチン）７（式中、 ＭＡｂ、及びＭＡｂ、は異なるＳＬＯ抗原決定基部位に特異的なＳＬＯモノクロ ーナル抗体であり、ｎはかっこ内が連続であることを示す。）前記技術はアビジ ン及びビオチンの使用を必要とせずにもまた実施できることに注目すべきである 。

ＳＬＯモノクローナル抗体は例えばラテックス増加比濁測定での使用のためラテ ックス粒子と結合することができる。このようなプロトコルはＳＬＯモノクロー ナル抗体が（ビオチンの代わりに）ラテックス粒子と結合する前記比濁測定検定 法に類似している。これらは次にサンプル中のＳＬＯと結合でき、こうして散乱 中心の数を増加する。例えばその表面にカルボキシル基を有するラテックスビー ズ（１７−２９ｎｍ、ＩＤＣより入手可能）は、例えばＳＬＯモノクローナル抗 体に結合できる。カルボキシル基は例えば可溶性のカルボジイミド、１−エチル −３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（”ＥＤＣ”）とともに 活性化することができ、例えばｎ−ヒドロキシスクシンアミドじＮＨＳ”）によ って安定化でき、その濃度はそれぞれ１０ｍＭ及び７０ｍＭである。過剰の未反 応ＥＤＣ及びＮＨＳを遠心によって除去し、活性化されたビーズを適当な付着混 合物中で再懸濁する。適当な付着混合物は５　ｍｇ／ＩＩ＋１のＳＬＯモノクロ ーナル抗体を含むＰＢＳ及び１％（容積百分率）ＴＷＥＥＮ’　−２０を含むこ とができる。適当な付着期間の後、ＳＬＯモノクローナル抗体・ラテックスビー ズを２回遠沈によりＰＢＳで洗浄しＰＢＳ中に再懸濁する。

前記のものに類似の比濁測定において、抗ストレプトリジンＯのレベルを決定す るための阻害検定もまた実施できる。このようなプロトコルにおいて、固定した 比濁信号がＳＬＯ（好ましくはｒＳＬＯ又はｍ５Ｌｏ）の固定量とＳＬＯモノク ローナル抗体の固定量との組み合わせによって決定される。その後でＡＳＯを含 有していると思われる血清サンプルはＳＬＯの固定量と結合され免疫反応が起こ る。その後免疫反応性混合物に加えられるであろうＳＬＯモノクローナル抗体の 固定量の添加を行う。阻害信号は、固定信号とは異なるが、サンプル中にあるＡ ＳＯの程度まで得られる。即ちサンプル中のＡＳＯの量が増加すれば免疫用の信 号は５ＬＯ−ＳＬＯモノクローナル抗体信号から得た固定信号とは相違するであ ろう。

代わりに、ＳＬＯモノクローナル抗体のＦａｂ’又はＦａｂ部分を取り込みある いはいわゆる”ディツプスティック（ｄｉｐ−ｓｔｉｃｋ）”の第１領域上に被 Ｉできる。これらはディツプスティックの領域に沿って移動することができる０ 例えばｒｓＬｏ、３等のＳＬＯ誘導体は第一領域のそれの上の第二領域上に永続 的に付看することができ、ＳＬＯモノクローナル抗体に対する標識抗体を第三領 域の上の第三領域上にとり込み被覆され又は永続的に付看されることができる。

キャピラリー動作で操作するディツプスティックをＳＬＯを含有していると思わ れるサンプル中に挿入し、サンプルは第一領域から第二領域を通し次に第三領域 を通って移動することができる。もしＳＬＯがサンプル中にあればそれはＳＬＯ モノクローナル抗体との結合に至るであろう。キャピラリー動作は結合及び未結 合のＳＬＯモノクローナル抗体双方を第二領域へ運ぶであろう。しかしながら、 未結合のものは第二領域中で固定化されたＳＬＯと結合し、かくして５ＬＯ−Ｓ ＬＯモノクローナル抗体複合体のみが第三領域へ移動できるであろう。この領域 では標識抗ＳＬＯモノクローナル抗体がそれらの複合体へ結合するので、ラベル （放射性、化学発光、生物発光、酵素的他）に依存して、標識複合体を直接ある いはラベルの読み取り前に別途化学分析を受け取ることにより読み取ることがで きる。かかるモノクローナル抗体との結合に利用できる適当なディツプスティッ クは周知であり、ここで詳細には検討しない。例えば米国特許第５，０１３，６ ６９号を参照。

競争的結合測定法もまた実用的であり、これによりＳＬＯ（野性型、例えばｒｓ Ｌｏ、３等（７）ＳＬＯ誘導体、又は例えばｍ５Ｌｏ。

３／６等のＳＬＯ変形体）を例えば放射能標識、化学発光標識、生物発光標識、 発蛍光団、酵素、ビオチン他を用いる既知の標識方法によって標識する。ＳＬＯ 誘導体はｒｓＬｏ、３が好ましい。かがる測定法においては、既知量の標識ＳＬ Ｏ誘導体を不溶化されたＳＬＯモノクローナル抗体及びＳＬＯを含有していると 思われるサンプルと混合する。これらのパラメーターのもとで、標識ＳＬＯ及び サンプルＳＬＯが不溶化されたＳＬＯモノクローナル抗体と結合して競合するの で、不溶化された標識の量はサンプル中のＳＬＯ量に逆比例する。

以下の試薬グループＡ、Ｂ及びＣの各々から少なくとも−が混合されるサンドイ ッチ検定法と称される二部位が同様に利用できる。

グループＡは不溶化されたＳＬＯポリクローナル抗体、組換え型ＤＮＡ技術によ って生産されるＳＬＯ抗体あるいは第一のＳＬＯ抗原決定基部位に特異的なＳＬ Ｏモノクローナル抗体を含んでなり；グループＢは既知量の標識ＳＬＯポリクロ ーナル抗体、第一部位以外の異なるＳＬＯ抗原決定基部位に特異的なＳＬＯモノ クローナル抗体あるいは組換え型ＤＮＡ技術によって生産されたＳＬＯ抗体を含 んでなり；グループＣはＳＬＯを含有していると思われるサンプルを含んでなる 。不溶化されたＳＬＯ抗体、サンプルからのＳＬＯ及び標識ＳＬＯ抗体を含む不 溶化三重複合体が次に生成されるので、不溶化された標識の量はサンプル中のＳ ＬＯ量に直接比例する。

前記は決して徹底したものではない。むしろＳＬＯのために記載された検定法は ＳＬＯ抗体を利用するＳＬＯ検定法の例示である。

類似の検定法が当業者に明らかである。

例４ ｒｓＬｏに対するポリクローナル抗体の製造ｒＳＬ○に対する抗体を製造するた め、２５μｇ（７）ｒｓＬｏ、３をウサギの２本の脚の各々の筋肉内へ投薬した 。これは、等量のｒｓＬｏ、３をリン酸緩衝食塩水じＰＢＳ”）中０　、２　ｍ ｇ／ｄｉの開始濃度でＦＣＡと混合することにより達成された。この接種源を次 に泡状組織が得られるまで乳液化した。

０．５＋＋＋１の接種源を前記のとおり投与した。０．５ｍｌの接種源を同様に ウサギの背部１ｏ箇所の各々へ皮下投与した。

およそ１力月後、一つの例外を除いて同一のプロトコルに従った。第二回目の免 疫化のため、ｒｓＬｏ、３を等量の５０％ＦＣＡ及び５０％ＦＩＣＡと混合した 。

２５μどのｒｓＬｏ、３のブースター注射を数カ月間毎月行った。ブースター注 射のプロトコルは前記と同一であるが２つの例外がある。ブースター注射のため ｒｓＬｏ、３を等量のＦＩＣＡと化合し、０．２ｍｌの接種源をウサギの背部１ ５置所へ皮下投与した。

例５ ｍ５ＬＯに対するポリクローナル抗体の製造ｍ５Ｌｏに対するポリクローナル抗 体の製造を以下の例外、ａ）１００μｇのｍ５Ｌ０．３／６を２匹のウサギの２ 本の脚の各々へ筋肉内投与した　ｂ）ｍｓＬｏ、３／６の開始が７．０ｍｇ／ｄ ｉであった、を除いて例４に記載のプロトコルに従って同様に行った。

例６ ｒｓＬｏポリクローナル抗体の精製 例４の方法によって製造されたウサギ抗ｒｓＬｏに対するポリクローナル抗体を 当該技術分野の公知の手段に従って精製した。最も好ましい精製プロトコルは親 和性精製である。

アフィニティーゲルに結合したＳＬＯ（野性型、例えばｒｓＬ。

等のＳＬＯ誘導体又は例えばｍ５Ｌｏ等のＳＬＯ変形体）を最初に０．１Ｍ　Ｍ ＯＰＪ衝液ｐ８７．５　３０ｍ１中テ１００ｍｇ（７）Ｓ　ＬＯを可溶化するこ とによって調製した。続いてこのＳＬＯ溶液へ未洗浄のＢｉｏ−Ｒａｄ　Ａｆｆ ｆ−Ｇｅｌ　１０　Ｔ″アフｒ−ティーゲル１０ｔｎｌを加える。生成したスラ リーを室温で２時間反応させる。反応が行われたスラリーを１５００ｒｐｍで遠 心する。好ましい遠心分離機はＢｅｃｋｍａｎ　Ｔ　Ｊ　−６Ｔ′である。その 上清を除去し、残ったゲルベレットを蒸留水と次にＰＢＳで徹底的に洗浄する。

アフィニティーゲルに結合したＳＬ０５ｍｌを次に例２の方法から得た２００ｍ １のプールされたウサギ抗ｒｓＬ０．３抗血清とともに４時間４℃で培養する。

アフィニティーゲルに結合したＳＬＯに結合したウサギ抗ｒｓＬ０．３抗体から 成る生成したスラリーを小型のＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｅｃｏｎｏカラム上に載せ、４ ℃で１００ｍ１のＰＢＳで洗浄する。

結合したポリクローナル抗体を解放する方法は技術分野において周知である。例 ３Ａにおいて前記したように、溶離クロマトグラフィーが特に好ましい。　前記 方法は、ｒｓＬｏに対する精製されたポリクローナル抗体を与える。好ましくは ｒｓＬｏに対するポリクローナル抗体はＳＬ○以外のＳ−ｐ３１ｏｇｅｎｅｓ抗 原と実質的に交差反応があってはならず、ｒｓＬｏ以外の抗原と実質的に交差反 応がないことが最も好ましい。

例７ ｍ５Ｌｏポリクロ一ナル抗体の精製 例６の精製プロトコルは同様に例５の方法から得たプールされたウサギ抗ｍ５Ｌ ０．３／６抗血清に利用できるので、ｍ５ＬＯに対する精製されたポリクローナ ル抗体が提供される。好ましくはｍ５ＬＯに対するポリクローナル抗体はＳＬＯ 以外のＳ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原と実質的に交差反応性があるべきではなく、 実質的にｍ５Ｌｏ以外の抗原と交差反応性がないことが最も好ましい。

例８ 組み換え型ＤＮＡ技術によるＳＬＯ抗体ＳＬＯ抗体は組換え型ＤＮＡ技術を使い て精製できる。この試みにおいて野性型ＳＬＯ，ＳＬＯ誘導体又はＳＬＯ変異体 が前記のもの等の標準的免疫化プロトコルを使用してＳＬＯ抗体を得るために利 用できる。その後で器官（例えば膵臓、ＰＢＬ又はリンパ節）生成り細胞が免疫 化のソースから除去される。次にリンパ細胞が単離され、さらにｍ　ＲＮ　Ａが 単離される。その後ｃＤＮＡが単離されたｍＲＮＡから合成されてｃＤＮＡライ ブラリが得られる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、ら、立五２旦二三之ｊ　（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　ニラポラトリマ三ｘ７）Ｌ−２版、コールドハ ーバ−ラボラトリプレス（１９８９年）第１〜３巻、及びＰｅｒｂａｌ、Ｂｅｒ ｎａｒｄ、ｒ　クローニングの立工上」第２版、ジョンウィリーアンドサンズ、 ニューヨーク（１９８８年）等、本明細書中に引用されているものに明らかにさ れているｃＤＮＡクローニングのための方法論が利用できる。一旦ｃＤＮＡが得 られると、例えばＩｍｏ＋ｕｎｏ　Ｚａｐ”クローニング及び表現システム（Ｓ ｔｒａｔａｃｙｔｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、、　ＵＳＡから入手可能）を 用いて抗体表現ライブラリを作ることができる。

本文中に引用されている５ａｓｔｒｙ、Ｌ、ｒモノクローナル触媒抗体の生成の ための大腸菌における免疫的レパートリ−のクローニング。

Ｈ鎖変動部分特異的ｃＤＮＡライブラリの構造Ｊ、ＰＮＡＳ、ＵＳＡ、１旦：５ ７２８−５７３２　（１９８９年）を同様に参照。

代わりの手順を同様に利用することができる。ＳＬＯ抗体を含めて抗体はおヨソ 約１００．０００７５）ら１３０．０ＯＯｋＤの間の分子量を持っている。平均 分子量が約１００ｋＤの各アミノ酸により、１００，０ＯＯｋＤタンパク質は約 ２７２７の塩基の長さのメツセージによってエンコードされるおよそ９０９のコ ドンによってエンコードされ、１３０，０００　ＫＤタンパク質は約３５４５の 塩基の長さのメツセージによってエンコードされるおよそ１１８２のコドンによ ってエンコードされる。このように伝統的見通しから、ＳＬＯ抗体を発現しかつ 約３５４５塩基対より大きいＢ細胞生成器官から作られたｃＤＮＡの精製が好ま しく、約２７２７塩基対より大きい精製されたフラグメントが同様に利用できる 。その後単離されたｃＤＮＡフラグメントを一般的方法で精製し、かかるフラグ メントヘアニーリングできる対応する末端を有する適当な発現ベクター（例えば λｇｔｌ１等）へ連結する。このベクターは次に大腸菌等の１個の適当な細胞へ ＳＬＯ抗体ゲノムライブラリの成長に適する条件の下で移入される。

スクリーニングは当業者に知られるいかなる方法によっても達成できる。例えば 抗体タンパク質はタンパク質結合フィルター（例えばＰＶＤＦ膜、Ｍｉｌｌｉｐ ｏｒｅ）を用いてプラークから取り出すことができる。このフィルターを標ｍ５ Ｌｏ又はＳＬＯと培養し、その後に洗浄及び櫟識抗ＳＬＯ抗体との培養を行う。

ＳＬＯに対する親和性を荷するＳＬＯ抗体を発現するプラークの同定が可能であ る。本スクリーニング方法は腹当たり数千のプラークが篩分けられるので数百刃 台のクローンを比較的短期間内に篩分けられることができる。

例９ 酵素、ビオチン、フルオロクローム及び薬物搬送粒子を用いたＳＬＯ抗体の変形 記載されたＳＬＯ抗体は酵素、ビオチン及びフルオロクロームで標識することが できる。このような標識ＳＬＯモノクローナル抗体は例えば診断目的（前記のも の等）、スクリーニング目的又は治療目的に使用することができる。

好ましくはＳＬＯモノクローナル抗体の使用が好ましく、そしてそのＩｇＧアイ ソトープの使用が最も好ましい。その標識前にＳＬＯ抗体を精製することが好ま しい。精製はタンパク質Ａ又は結合配位子としてのＳＬＯとのアフィニティーク ロマトグラフィーで行うことができる。高速イオン交換クロマトグラフィーによ る精製も同様に利用できる。Ｃｒａｎｅ、　Ｌ、　Ｆ、　ｒ高速イオン交換クロ マトグラフィーによるモノクローナル抗体の精製」、第９章、［モノクローナル の　′　と応　Ｊ　、Ｌ、Ｂ、５ｃｈｏｏｋ、ＭＭａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ編 、Ｉｎｃ。

Ｎ、　Ｙ、、　Ｎ、　Ｙ　（１９８７年）（以下モノクローナル　体　′と称す る）。この章は本文中に引用されている。精製ＩｇＧアイソトープをペプシンで 消化してＦ　（ａ　ｂ’　）　ｚを生成し、次いで還元してＦａｂ’　を生成す る。

このＦａｂ’　フラグメントを次に例えばＩｓｈｉｋａｗａ、　Ｅ、ら、「酵素 、ビオチン及びフルオロクロームを用いたモノクローナル抗体の変形及びその応 用」第８章モノクローナル“　ｌ（ＭｏｎｏｃｌｏｎａＬＡｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐ ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｒｃｈｎｉｑｕｅｓ）に概説された手段に従って標識 した。この童は本文中に引用して含まれている。

重要な薬剤のための貯蔵所又はモノリス型装置として機能している粒子の定めら れた搬送が多数の治療的処置のための主要な目標である、これらの粒子は一般的 にナノメーターからマイクロメーターの大きさのコロイド粒子で、生分解性かつ 無害、生体吸着性で、組織によって保持され、そして薬剤の徐放的又は制御され た放出を行う。モノリス型装置は薬剤が粒子マトリックス中に分散されるもので あり、他方貯蔵型装置は薬剤が粒子によって被包されたものである。粒子の調製 に用いられる天然ポリマーには、デンプン及びセルロース誘導体等の多糖類及び アルブミン、コラーゲン及びゼラチン等のタンパク質がある０合成生分解性ポリ マーにはポリラクチド、ポリアミノ酸及びラクチドーコーグリコリド、ラクチド ーコーＥ−カプロラクトール、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルア ミドの共重合体、ポリオルジエステル及びポリ無水物がある。リボゾーム及びリ ポタンパク質も同様に搬送ベクターとして有効である。Ｓｈａｗ、　Ｊ、　Ｍ、 ら、「薬物搬送粒子及びモノクローナル抗体」第１５童、モノクローナル　′。

この童は本文中に引用して含まれている。

この粒子はＳＬＯ抗体又はそのＦ　（ａｂ’　）−及びＦａｂ’　フラグメント へ１接結合することができる。このような結合方法論は当業者には直ちに明らか ではあるけれどもＳｈａｗ、Ｊ、Ｍ、（前記）に記載されている。この結合後の 精製が未結合のＳＬＯ抗体又はＦ（ａｂ’）ｉ及びＦａｂ’　フラグメントを除 去するために推奨される。精製の後、薬剤は粒子中へ取り込まれる。さらに一般 的に患者の造影処理に使用される放射性同位元素を粒子中に取り込むことができ る。

利用される特異的薬剤はモノクローナル抗体の標的に基本的に依存する。ＳＬＯ に関して例えばリウマチ熱などを伴うと同様にその心臓に有害な影響が知られて いる。従って放射性同位元素を含む粒子に結合したＳＬＯモノクローナル抗体の 一つの応用は、ＳＬＯが特異的に相互作用する特異的区切り及び領域の同定であ る。これはかかる領域への特異的薬剤の搬送を可能にするであろう。例えば、も しＳＬＯの心臓有害毒性効果が心筋組織へのＳＬＯの直接的結合に関連している ならば、薬剤がかかる組織へ運ばれるべ（適切かつ迅速に選択することができる 。さらに、ＳＬＯとりウマチ熱の関係を証明する文書が十分提供されているが、 その特異的相互作用は十分に理解されていない、しかしながら、もしリウマチ熱 と関連する関節の炎症が関節の組織及び筋肉と結合するＳＬＯによって生じるな らば、薬剤をかかる部位へ運ぶべく適切かつ迅速に選択する事ができる。ＳＬＯ の結合部位の同定のための・かかるアイソトープの選択は当業者の知識範囲内に あると考えられる。さらに一旦そのような局部化した領域が識別されると、特定 目的のためかかる領域へ運ばれる特異的薬剤も同様に当業者の知識範囲内にある と考えられる。

本文中の例は好ましい特定のハイブリドーマ細胞株に限定されるものと解釈され てはならないｅ　ｒ　Ｓ　Ｌ　０５ｍ５Ｌｏ及び／又は野性型ＳＬＯに親和性を もつモノクローナル抗体を生産することができるハイブリドーマ細胞株を生成す るために記載された方法論は、好ましいハイブリドーマ細胞株のみに限定される ものとして解釈されてはならない、同様に前記好ましいハイブリドーマ細胞株は 、これらが出願人が権利を付与される唯一のハイブリドーマ細胞株であることを 実際にも暗にでも決して認めさせるものではない。彼らは適用可能な特許のもと て十分な幅の保護を受ける資格がある。さらにそのような細胞株から生成された モノクローナル抗体は同様に限定されない。好ましいハイブリドーマ細胞株は出 願人によって５ＬＯＡＳＩＩ、ＳＬＯＡＳＬ２．ＳＬＯＡＳ１６及びＳＬＯＡＳ ２１として確認されている。指定により特定の細胞株をクレームする目的のため 、このハイブリドーマ細胞株を１９９１年７月１６日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）　、１２３０１　 Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、　 ２０８５２へ特許手続きの目的で微生物の寄託の国際的承認のためのブタペスト 条約の条項の下で寄託した。このハイブリドーマ培養は１９９１年７月１９日に 試験されすべて活性な培養であると確認された。ＡＴＣＣはこの４種のハイブリ ドーマ細胞株へＡＴＣＣ寄託番号、ＨＢ１０８２６、ＨＢ１０８２７．ＨＢ１０ ８２８及びＨＢ１０８２９をそれぞれ与えた。

本発明をある程度のその好ましい実施態様に関してかなり詳細に記載したけれど も、本発明の教示の範囲内で他の実施態様が可能である。例えば開示された抗体 のい（つかはＳＬＯ誘導体のｒＳＬｏ、３及びＳＬＯ変形体のｍ５Ｌ０．３／６ を基礎とするけれども、本発明はそれにより限定されない。このように、これら 特定のＳＬＯ誘導体及び変異体へのＳＬＯ抗体の生産が詳細に記載されているが 、これらは例示と解釈されるべきであり他のｒｓＬｏ又はｍ５ＬＯ抗原候補を本 開示の思想及び範囲内でモノクローナル、ポリクローナル及び組換え型ＤＮＡ由 来抗体の生成のために使用することができる。従って、本開示又は以下のクレー ムは本文中の好ましい実施態様の記載による限定を意図したものではなく、また そのように解釈されるべきではない。

国際！１審磐牛 国＠調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｙ　９２８４−４ＣＡＤＺ　Ｄ　９２８４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　３／１８ １５１０４　８５１７−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　５／２０ Ｉ

Claims (67)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１０−６のｒＳＬＯに親和性を有するモノクローナル抗体。
2. ２．少なくとも１０−６のｍＳＬＯに親和性を有するモノクローナル抗体。
3. ３．少なくとも１０−６の野生型ＳＬＯ及びｒＳＬＯに親和性を有するモノクロ ーナル抗体。
4. ４．ｒＳＬＯに親和性を有するポリクローナル抗体。
5. ５．ｍＳＬＯに親和性を有するポリクローナル抗体。
6. ６．ｒＳＬＯに対する抗体をエンコードするポリヌクレオチド配列。
7. ７．ｍＳＬＯに対する抗体をエンコードするポリヌクレオチド配列。
8. ８．ｒＳＬＯの抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞株。
9. ９．ハイブリドーマがｒＳＬＯを含むアジュバントで免疫化された動物からのＢ 細胞源と動物骨髄腫細胞とのハイブリットである請求の範囲第８項に記載のハイ ブリドーマ細胞株。
10. １０．Ｂ細胞源が動物脾臓細胞である請求の範囲第９項に記載のハイブリドーマ 細胞株。
11. １１．動物がマウスである請求の範囲第１０項に記載のハイブリドーマ細胞株。
12. １２．骨髄腫細胞がマウス及びヒトからなる群から選ばれた動物から得られる請 求の範囲第９項に記載のハイブリドーマ細胞株。
13. １３．Ｂ細胞源動物がマウスであり、骨髄腫細胞源動物がマウスである請求の範 囲第９項に記載のハイブリドーマ細胞株。
14. １４．ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２６によって指定されるハイブリドーマ細胞 株。
15. １５．ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２７によって指定されるハイブリドーマ細胞 株。
16. １６．ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２８によって指定されるハイブリドーマ細胞 株。
17. １７．ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２９によって指定されるハイブリドーマ細胞 株。
18. １８．ＡＴＣＣ識別番号ＨＢ１０８２６，ＨＢ１０８２７，ＨＢ１０８２８及び ＨＢ１０８２９によって指定されるハイブリドーマ細胞株からなる群から選ばれ たハイブリドーマ細胞株によって分泌される抗体。
19. １９．野生型ＳＬＯに対する抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞株 。
20. ２０．ハイブリドーマがｒＳＬＯを含むアジュバントで免疫化された動物からの Ｂ細胞源と動物骨髄腫細胞とのハイブリッドである請求の範囲第１９項に記載の ハイブリドーマ細胞株。
21. ２１．Ｂ細胞源が動物脾臓細胞である請求の範囲第２０項に記載のハイブリドー マ細胞株。
22. ２２．動物がマウスである請求の範囲第２１項に記載のハイブリドーマ細胞株。
23. ２３．骨髄腫細胞がマウス及びヒトからなる群から選ばれた動物から得られる請 求の範囲第１９項に記載のハイブリドーマ細胞株。
24. ２４．Ｂ細胞源動物がマウスであり、骨髄腫細胞源動物がマウスである請求の範 囲第１９項に記載のハイブリドーマ細胞株。
25. ２５．ｍＳＬＯの抗体を分泌することができるハイブリドーマ細胞株。
26. ２６．ハイブリドーマがｒＳＬＯを含むアジュバントで免疫化された動物からの Ｂ細胞源と動物骨髄腫細胞とのハイブリッドである請求の範囲第２５項に記載の ハイブリドーマ。
27. ２７．Ｂ細胞源が動物脾臓細胞である請求の範囲第２６項に記載のハイブリドー マ。
28. ２８．動物がマウスである請求の範囲第２７項に記載のハイブリドーマ。
29. ２９．骨髄腫細胞がマウス及びヒトからなる群から選ばれた動物から得られる請 求の範囲第２６項に記載のハイブリドーマ。
30. ３０．Ｂ細胞源動物がマウスであり、該骨髄腫細胞源動物がマウスである請求の 範囲第２５項に記載のハイブリドーマ。
31. ３１．ｒＳＬＯに対する抗体。
32. ３２．抗体がＩｇＧのアイソタイプである請求の範囲第３１項に記載の抗体。
33. ３３．ｍＳＬＯに対する抗体。
34. ３４．抗体がＩｇＧのアイソタイプである請求の範囲第３３項に記載の抗体。
35. ３５．ａ）野生型ＳＬＯを含むソースを得る工程、ｂ）野生型ＳＬＯに特異的親 和性を有するｒＳＬＯに対する不溶化された抗体へ該ソースを導入して、該野生 型ＳＬＯを該不溶化抗体へ結合させる工程、 ｃ）ｒＳＬＯに対する該不溶化抗体から望ましくない物質を除去する工程、及び ｄ）その溶出液が精製された野生型ＳＬＯを含む溶出によって該野生型ＳＬＯを 置換する工程 を含んでなる野生型ＳＬＯの精製方法。
36. ３６．方法が少なくとも一度繰り返される請求の範囲第３５項に記載の方法。
37. ３７．該野生型ＳＬＯを置換できるエルチネータ（ｅｌｕｔｉｎａｔｏｒ）が脱 イオン水溶液、野生型ＳＬＯを含む該ソースのｐＨより小さいｐＨを有する溶液 、有機溶媒、カオトロピック剤、解離剤、イオン性洗剤及び高塩濃度含有緩衝液 、からなる群から選択される請求の範囲第３５項に記載の方法。
38. ３８．ａ）野生型ＳＬＯを含むソースを得る工程、ｂ）野生型ＳＬＯに特異的親 和性を有するｍＳＬＯに対する不溶化された抗体へ該ソースを導入して、該野生 型ＳＬＯを該不溶化抗体へ結合させる工程、 ｃ）ｍＳＬＯに対する該不溶化抗体から望ましくない物質を除去する工程、及び ｄ）その溶出液が精製された野生型ＳＬＯを含む溶出によって該野生型ＳＬＯを 置換する工程 を含んでなる野生型ＳＬＯの精製方法。
39. ３９．方法が少なくとも一度繰り返される請求の範囲第３８項に記載の方法。
40. ４０．該野生型ＳＬＯを置換できるエルチネーターが、脱イオン水溶液、野生型 ＳＬＯを含む該ソースのｐＨより小さいｐＨを有する溶液、有機溶媒、カオトロ ピック剤、解離剤、イオン性洗剤及び高塩濃度含有緩衝液、からなる群から選択 される請求の範囲第３９項に記載の方法。
41. ４１．該アイソタイプがそのＦａｂ′フラグメント部分を生じるように操作され ている請求の範囲第２７項に記載のＩｇＧアイソタイプ。
42. ４２．それに抱合された試剤を含んでなる請求の範囲第４１項に記載のＦａｂ′ フラグメント。
43. ４３．試剤が酵素、ビオチン、フルオロクローム、ラテックス、粒子、放射性同 位元素、化学発光標識、生物発光標識及びその内部に薬剤を取り込むことができ る粒子からなる群から選択される請求の範囲第３４項に記載のＦａｂ′フラグメ ント。
44. ４４．それに抱合された試剤を含んでなる請求の範囲第１，第２及び第３項に記 載のモノクローナル抗体。
45. ４５．該試剤が酵素、ビオチン、フルオロクローム、ラテックス粒子、放射性同 位元素、化学発光標識、生物発光標識及びその内部に試剤を取り込むことができ る粒子からなる群から選択される請求の範囲第４４項に記載のモノクローナル抗 体。
46. ４６．ｒＳＬＯに特異的親和性を有するモノクローナル抗体の生産方法において 、ｒＳＬＯを高密度リボタンパク質へ複合体化し、動物をｒＳＬＯ・高密度リボ タンパク質複合体で免疫化することを含んでなる改良方法。
47. ４７．ｍＳＬＯに特異的親和性を有するモノクローナル抗体の生産方法において 、ｍＳＬＯを高密度リボタンパク質へ複合体化し、動物をｍＳＬＯ・高密度リボ タンパク質複合体で免疫化することを含んでなる改良方法。
48. ４８．ｒＳＬＯに特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体の生産方法に おいて、ｒＳＬＯ及びシステインアミノ酸残基を還元することができる試剤を含 むアジュバントで動物を免疫化することを含んでなる改良方法。
49. ４９．ｍＳＬＯに特異的な結合親和性を有するモノクローナル抗体の生産方法に おいて、ｍＳＬＯ及びシステインアミノ酸残基を還元することができる試剤を含 むアジュバントで動物を免疫化することを含んでなる改良方法。
50. ５０．該還元剤がメルカプトエタノール、ナトリウムボロ水素化物、ナトリウム シアノボロ水素化物、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビ ン酸、尿酸、ジチオエリスレイトール及びジチオスレチオールからなる群から選 択される請求の範囲第４８項に記載の方法。
51. ５１．該還元剤がジチオスレチオールである請求の範囲第４８項に記載の方法。
52. ５２．該アジュバント中の該還元剤の濃度が約２．０ｍＭと約８．０ｍＭの間で ある請求の範囲第４８項に記載の方法。
53. ５３．該アジュバント中の該還元剤の濃度が約３．０ｍＭと約７．０ｍＭの間で ある請求の範囲第４８項に記載の方法。
54. ５４．該アジュバント中の該還元剤の濃度が約５．０ｍＭである請求の範囲第４ ８項に記載の方法。
55. ５５．該還元剤がメルカプトエタノール、ナトリウムボロ水素化物、ナトリウム シアノボロ水素化物、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビ ン酸、尿酸、ジチオエリスレイトール及びジチオスレチオールからなる群から選 択される請求の範囲第４９項に記載の方法。
56. ５６．該還元剤がジチオスレチオールである請求の範囲第４９項に記載の方法。
57. ５７．該アジュバント中の該還元剤の濃度が約２．０ｍＭと約８．０ｍＭの間で ある請求の範囲第４９項に記載の方法。
58. ５８．該アジュバント中の該還元剤の濃度が約３．０ｍＭと約７．０ｍＭの間で ある請求の範囲第４９項に記載の方法。
59. ５９．該アジュバント中の該還元剤の濃度が約５．０ｍＭである請求の範囲第４ ９項に記載の方法。
60. ６０．高密度リボタンパク質分画がウシ及びヒトからなる群から選ばれる哺乳動 物源からのものである請求の範囲第４６項に記載の方法。
61. ６１．高密度リボタンパク質分画に対するｒＳＬＯの重量比が約１０：１と約１ ：１の間である請求の範囲第４６項に記載の方法。
62. ６２．高密度リボタンパク質分画に対するｒＳＬＯの重量比が約６：１と約１： １の間である請求の範囲第４６項に記載の方法。
63. ６３．高密度リボタンパク質分画に対するｒＳＬＯの重量比が約２：１である請 求の範囲第４６項に記載の方法。
64. ６４．高密度リボタンパク質分画がウシ及びヒトからなる群から選択される哺乳 動物源からのものである請求の範囲第４７項に記載の方法。
65. ６５．高密度リボタンパク質に対するｒＳＬＯの重量比が約１０１と約１：１の 間である請求の範囲第４７項に記載の方法。
66. ６６．高密度リボタンパク質に対するｒＳＬＯの重量比が約６：１と約１：１の 間である請求の範囲第４７項に記載の方法。
67. ６７．高密度リボタンパク質に対するｒＳＬＯの重量比が約２：１である請求の 範囲第４７項に記載の方法。