JP2831352B2 - アポリポタンパク質ｂ特異性単クローン性抗体 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の技術的分野 本発明は一般にアポリポタンパク質Ｂ−100と免疫反
応する無傷抗体又は抗体結合部位イディオタイプ含有ポ
リペプチド部分（以下、本明細書において「受容体分
子」又は「受容体」ともいうを用いる検定方法および装
置に関する。 発明の背景 リポタンパク質は血漿コレステロールおよびトリグリ
セリドの一次担体である。それらは中性脂質（トリグリ
セリドおよびコレステリルエステル）コアを取巻く表面
膜中に組織されるタンパク質（アポタンパク質として示
される）および極性脂質を含むミセル脂質−タンパク質
複合体である。リポタンパク質は初めに超遠心分離によ
り測定して浮上密度に基いて確認された。従って４主要
分類：キロミクロン、超低密度リポタンパク質（VLD
L）、低密度リポタンパク質（LDL）および高密度リポタ
ンパク質（HDL）がある。 超遠心分離の技術の進歩に対応してLDLおよびHDLの密
度のクラスがより均一なサブクラスにさらに細分され
た。例えばLDLは中間密度リポタンパク質（IDL）および
LDL₂サブクラスに分けることができる。しかし、これら
のサブクラスでも、それらのアポタンパク質含量の変動
のためにリポタンパク質粒子の機能的に不均一な集団か
らなる。 ８つの主要タンパク質Ａ−Ｉ、Ａ−II、Ａ−IV、Ｂ、
Ｃ−Ｉ、Ｃ−II、Ｃ−IIIおよびＥが分離され、一定密
度のクラスから多量に回収できるか小量アポタンパク質
の群の多くはまた他の密度クラス中に認めることができ
る。従って大部分のLDL粒子はアポＢのみを含むが、し
かし多少の粒子はまた他のアポタンパク質を含み、これ
がこの密度クラス中に存在する痕跡量のアポＣ−Ｉ、ア
ポＣ−II、アポＣ−III、およびアポＥを説明する。 若干の場合に、特定機能が特定アポタンパク質に帰属
された。例えばアポＢ−100と称される肝臓中に合成さ
れるアポＢの種は細胞のLDL受容体により認識され、結
合される。アポＢ−100の結合により、これらの受容体
はLDL粒子と結合し、それを血漿から抽出する。それに
よりLDLは細胞中に取込まれ、破壊され、そのコレステ
ロールを生じて各細胞の要求に役立てる。従って、アポ
Ｂ−LDL受容体相互作用が血流からのLDLコレステロール
の除去に主要な役割を果たす。 アポＢ−48と称される他の種のアポＢはLDL受容体に
より認識されない。このアポＢ種は、アポＢ−100の大
きさの48％にすぎず、ヒト中、腸によってのみ合成され
る。アポＢ−48を含むリポタンパク質例えばキロミクロ
ンおよびキロミクロンレムナントはLDL受容体に結合し
ない。 アポＢのこの２つの種は別の遺伝子制御下にあると思
われるけれども（体がアポＢ−48を作るがアポＢ−100
を作らない単個患者が記載された）、免疫学研究はアポ
タンパク質Ｂ−100およびＢ−48が抗原決定基を共有す
ることを示した。少くとも３つの研究グループがアポＢ
−100およびアポＢ−48のいずれも結合する合計７つの
異なる単クローン性抗体の発生を報告した。これらの研
究者により報告されたデータはアポＢ−48およびアポＢ
−100が構造的に関連するタンパク質であること、すな
わちアポＢ−48がアポＢ−100タンパク質のタンパク質
を代表できることを示唆する。アポＢ−48およびアポＢ
−100が同一リポタンパク質粒子上に認められず、別の
アポＢ粒子が存在することを示唆する証拠もまた報告さ
れた。 最近、若干の研究者はアポＢの血漿濃度が血漿LDLコ
レステロール濃度よりも冠動脈疾患（AD）の可能性を示
すことができることを示唆した、スナイダーマン（Snid
erman）ほか、プロシーデイングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA,77、604〜608（1980）。動脈硬化症血管疾
患およびその合併症が西側社会の死亡および衰弱の主原
因であり続けているので、生物医学工業内にCADの危険
にある個人を確認できる検定系に対する要求が長く意識
されてきた。 競合的液相および固相放射免除検定（RIA）、酵素結
合抗体免疫検定（ELISA）、放射免疫拡散検定などを含
む特異的抗体含有抗血清を用いる血漿アポタンパク質Ｂ
に対する多くの型の免疫検定が報告された。これらのア
ポＢ免疫検定の広範な適用を制限する問題は再現性並び
に用いる抗血清の品質および特異性であった。種々の型
のアポＢ検定のそれぞれの方法論的問題の総説はカーリ
（Cureey）ほか、クリニカル・ケミストリー（Chin.Che
m.）、24、280〜286（1978）およびロセユニ（Rossene
u）ほか、クリニカル・ケミストリー（Chin.Chem.）、2
8、427〜433（1983）に見出される。 若干の研究者が抗原構造およびリポタンパク質代謝に
おける役割の研究に使用するヒトアポＢに対する単クロ
ーン性抗体のパネルの開発を報告した。さらに、液相RI
A中の血漿アポＢ濃度の測定に対する抗アポＢ単クロー
ン性抗体の使用が報告された、パトン（Patton）ほか、
クリニカル・ケミストリー（Chin.Chem.）、29、1898〜
1903（1983）およびメイナルド（Maynard）ほか、クリ
ニカル・ケミストリー（Chin.Chim.）、30、1620〜1624
（1884）。さらに、１グループは血漿アポＢに対する放
射免疫拡散検定における抗アポＢ単クローン性抗体の混
合物の使用を報告した。マルコンビナ（Marconvina）ほ
か、クリニカ・シミカ・アクタ（Clin.Chim.Acta）、14
7、117〜125（1985）。しかし、これらの検定法は長時
間のインキュベーション、反復する遠心分離、または放
射性物質を使用する必要を免れない。 ヒト体液試料中のアポＢ−100の存在を検定する試薬
として単クローン性抗体の使用は、一度得られればその
ような試薬を終始変らない品質で比較的多量に生成でき
るので魅力的である。しかし、個々の単クローン性抗体
をアポＢ−100検定系における要素として使用すること
が妨げる多くの因子が存在する。 第１に、技術は単クローン性抗体がその標的抗原の抗
原不均一性のために免疫特異的でありすぎて有用でない
ことができることを教示する。例えば、普通の多クロー
ン性抗体含有抗血清の特異性は抗原タンパク質の大部分
またはすべてを包含する抗原決定基に結合する数百数千
の異なる抗体の共働に依存する。その結果、遺伝子の多
形性、グリコシル化の不均一性または多少の変質による
抗原の構造の小変化が通常多クローン性抗体結合にほと
んど影響しない。同様に、多クローン性抗血清の大また
は小亜集団の抗体が通常変性または変質した抗原に結合
する。 対照的に、単クローン性抗体は通常抗原分子上の１抗
原決定基（エピトープ）に結合する。何らかの理由でそ
の決定基が変化しても抗体が結合し続けるか、または結
合し続けないかもしれない。これが問題であるかまたは
利点であるかは個々の環境による。この場合にように単
クローン性抗体をアポタンパク質に対する診断検定に使
用すれば、そのタンパク質中の小抗原変異が大きな誤り
を生ずることができる。 アポタンパク質Ｂ−100の抗原不均一性は十分に証明
されている。例えば、アピＢ上のエピトープの発現は
（１）関連脂質の組成、（２）免疫反応の温度、（３）
自然環境からのLDLの隔離の程度、および（４）個人間
の遺伝子発現、により修飾されることが認められた。 第２に、その特有の特異性のために、単クローン性抗
体（MoAb）の成功使用はしばしば標的抗原に対するその
アフィニティーに依存性である。例えば、MoAb自体が液
相中にある間にMoAbが液相および固相抗原の結合に有用
な十分なアフィニティーを有することができるが、その
同じ抗原が抗原に結合し、溶液から「引抜く」のに有用
な固相に付着した抗体として有用でないことができる。 上記問題は単クローン性抗体の使用に対し一般的であ
る。従って当業者は、用いようとする検定系中で単クロ
ーン性抗体を試験し、確認することが必須であることを
認めた、ゴッデイング（Goding,James,W.）、単クロー
ン性抗体：「原理および実験」（Monoclonal Antibodie
s:“Principles and Practice"、40〜46頁、アカデミッ
ク・プレス（Academic Press,New York）、（1983）参
照。 発明の概要 １観点において、本発明はATCC受託番号HB8746を有す
るHL130C2.3C5として示されるハイブリドーマにより産
生される受容体分子の使用を意図する。このハイブリド
ーマおよびその受容体分子はまたここにMB47として示さ
れる。 他の観点において、本発明はATCC受託番号HB8742を有
するV82A6.1G4として示されるハイブリドーマにより産
生される受容体分子の使用を意図する。このハイブリド
ーマおよびその受容体分子はまたここにMB24として示さ
れる。 具体的に説明すれば、本発明は、以下の発明に関す
る。 1.体液試料をアポタンパク質Ｂ−100の量について検定
する方法であって、 （ａ）検定すべき体液試料を準備する段階、 （ｂ）（ｉ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応し、か
つ （ii）ATCC寄託番号HB8746を有するハイブリドーマま
たはATCC寄託番号HB8742を有するハイブリドーマにより
分泌された第１無傷抗体又はその抗体結合部位イディオ
タイプ含有ポリペプチド部分を生物活性形態に準備する
段階、 （ｃ）前記体液試料の既知量と前記第１無傷抗体又はそ
の抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチド部分の
予定量とを混合して免疫反応混合物を形成する段階、 （ｄ）前記混合物を生物学的検定条件下に、混合物中に
存在する第１無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタ
イプ含有ポリペプチド部分が試料中に存在するアポタン
パク質Ｂ−100と免疫的に結合して免疫反応体を形成す
るのに十分な予定時間維持する段階、および （ｅ）前記混合物中に形成された免疫反応体の量を検定
する段階、 を含む方法。 2.体液試料中のアポＢ−100の量について検定する検定
キットであって、 （ａ）（ｉ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応し、か
つ （ii）ハイブリドーマATCC HB8746により分泌された
無傷抗体又は抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプ
チド部分またはハイブリドーマATCC HB8742により分泌
された第１無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイ
プ含有ポリペプチド部分を含む生物活性第１特異的結合
剤、および （ｂ）前記第１結合剤とアポＢ−100との免疫反応をシ
グナルする生物活性の標識した第２特異的結合剤、 を含むキット。 3.体液試料をアポタンパク質Ｂ−100について検定する
方法であって、 （ａ）検定すべき体液試料を準備する段階、 （ｂ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応し、かつATCC
受託番号HB8746を有するハイブリドーマにより分泌され
る第１無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ含
有ポリペプチド部分を生物活性形態で付着した固体マト
リックスを含む固体支持体を準備する段階、 （ｃ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応し、かつATCC
受託番号HB8742を有するハイブリドーマにより分泌され
る生物活性第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオ
タイプ含有ポリペプチド部分であって、免疫反応体中の
前記第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ
含有ポリペプチド部分の存在をシグナルできる酵素標識
に結合した第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオ
タイプ含有ポリペプチド部分を準備する段階、 （ｄ）（ｉ）前記体液試料、 （ii）前記固体支持体、および （iii）前記標識した第２無傷抗体又はその抗体結合
部位イディオタイプ含有ポリペプチド部分、 を実質的に同時に混合して固／液相免疫反応混合物を形
成する段階、 （ｅ）前記混合物を生物学的検定条件下に、前記第１無
傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペ
プチド部分および前記第２無傷抗体又はその抗体結合部
位イディオタイプ含有ポリペプチド部分が試料中に存在
するアポタンパク質Ｂ−100と免疫的に結合して固相サ
ンドイッチ免疫反応体および液相を形成するのに十分な
予定時間維持する段階、 （ｆ）前記固相サンドイッチ免疫反応体を前記液相から
分離する段階、および （ｇ）前記固相サンドイッチ免疫反応体中に結合した標
識した第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイ
プ含有ポリペプチド部分の量を検定する段階、 を含む方法。 4.体液試料をアポタンパク質Ｂ−100について検定する
競合的方法であって、 （ａ）検定すべき体液試料を準備する段階、 （ｂ）試薬アポタンパク質Ｂ−100の予定量を付着した
固マトリックスからなる固体支持体を準備する段階、 （ｃ）（ｉ）前記体液試料、 （ii）前記固体支持体、および （iii）ATCC受託番号HB8746を有するハイブリドーマ
またはATCC受託番号HB8742を有するハイブリドーマから
分泌されたアポタンパク質Ｂ−100と免疫反応する第１
無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ含有ポリ
ペプチド部分の予定量、 を実質的に同時に混合して固／液相混合物を形成する段
階、 （ｄ）前記混合物を生物学的検定条件下に、無傷抗体又
は抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチド部分が
固体支持体のアポタンパク質Ｂ−100分子および体液試
料中に存在するアポタンパク質Ｂ−100分子と免疫的に
結合し、固相免疫反応体および液相免疫反応体を形成す
るのに十分な時間維持する段階、 （ｅ）前記固相免疫反応体を前記液相から分離する段
階、 （ｆ）前記固相免疫反応体に対して、前記第１無傷抗体
又はその抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチド
部分と免疫反応して第２固／液相反応混合物を形成する
生物活性第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタ
イプ含有ポリペプチド部分であって、免疫反応体中の前
記第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ含
有ポリペプチド部分の存在をシグナルできる酵素標識を
結合した第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタ
イプ含有ポリペプチド部分を混合する段階、 （ｇ）前記第２固／液相反応混合物を、前記第２無傷抗
体又はその抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチ
ド部分が固相免疫反応体として存在する第１無傷抗体又
はその抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチド部
分と免疫的に結合して固相サンドイッチ免疫反応体を形
成するのに十分な時間維持する段階、 （ｈ）固相サンドイッチ免疫反応体を前記液相から分離
する段階、および （ｉ）前記固相サンドイッチ免疫反応体中に結合した標
識した第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイ
プ含有ポリペプチド部分の量を検定する段階、 を含む競合的方法。 本発明は若干の利益および利点を提供する。 本発明の利益の１つは本発明のハイブリドーマを用い
てアポＢ−100と免疫反応する受容体を終始変らない品
質で比較的多量に生成できることである。 本発明の他の利益は本発明の受容体が、中でも体液試
料中のアポＢ−100をもつコレステロールの量の検定に
有用なことである。 本発明の１利点は、本発明の受容体を遠心分離操作を
必要としないフオーマットでアポＢ−100の酵素結合抗
体免疫検定に使用できることである。 他の利点は本発明の検定法を比較的短時間で終えるこ
とができることである。 本発明の他の利点および利益は本発明の以下の説明、
図面および特許請求の範囲から当業者に容易に明らかに
なろう。 図面の簡単な説明 第１図は脱脂キロミクロンおよびVLDLから得られたア
ポＢ−100およびアポＢ−48と免疫反応するMB47およびM
B24受容体分子の能力を示すウエスターンブロット検定
オートラジオグラフの写真である。VLDLおよびキロミク
ロンは脱脂し、３〜６％勾配ゲルを用いたSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）にかけた。VLD
Lタンパク質60μｇおよびキロミクロンタンパク質20μ
ｇを交互レーンのゲル上で移動させ、それにより各調製
物のタンパク質を大きさにより分離した。ゲルを0.1％
クーマシーブルーで染色することにより電気泳動パター
ンのタンパク質バンドを可視化するとキロミクロンおよ
びVLDL中のアポＢ−100およびアポＢ−48が現われた。
次いでタンパク質バンドをニトロセルロース紙に電気泳
動的に移すことにより付着させて固体支持体を形成し
た。固体支持体に付着したアポタンパク質抗原を次いで
MB47およびM24受容体分子と個々に免疫反応させた。固
相付着抗原に免疫的に結合した単クローン性MB47および
単クローン性MB24受容体分子を¹²⁵Ｉ標識ヤギ抗マウスI
gおよびオートラジオグラフィーを用いて検定した。 パネルＡは単クローン性MB24がVLDL（Ｖ）およびキロ
ミクロン（Ｃ）のアポＢ−100と免疫反応するが、Ｂ−4
8とは反応しないことを示す。パネルＢは単クローン性M
B47がＶおよびＣのアポＢ−100と免疫反応するが、しか
しＶまたはＣのアポＢ−48と免疫反応しないことを示
す。パネルＣはヒツジ赤血球細胞に特異性の単クローン
性抗体が、存在する抗原と免疫反応しないことを示す陰
性対照である。パネルＤはフェニル−β−Ｏ−グリコシ
ドに対し免疫精製した多クローン性抗血清が、存在する
抗原を認識しないことを示す他の陰性対照である。パネ
ルＥはヒトLDL−アポタンパク質に対する免疫精製ウサ
ギ多クローン性抗血清がＶおよびＣ中のアポＢ−100お
よびアポＢ−48の両方を認識することを示す陽性対照で
ある。 第２図は液相放射免疫検定（RIA）における単クロー
ン性抗体MB47〔横軸:Ab濃度（MoAb）〕のモル濃度の増
加による結合された¹²⁵Ｉ標識LDL粒子の百分率（縦軸）
を示すグラフである。 LDLは10被験者のプールした血漿（−−−）または１
正常脂肪血被験者（−）から調製した。血漿は約12時間
絶食した後の被験者のプラズマフフエレシスにより得
た。 第３図は培養ヒト線維芽細胞による¹²⁵ＩヒトLDL結
合、インターナリゼーションおよび分解の抗体MB47（白
バー:MB47）および過剰の非標識ヒトLDL（ハッチ付バ
ー:LDL）による抑制程度を示す棒グラフである。線維芽
細胞層は35mmウエル中、10％ウシ胎仔血清を含むDME中
で成長させた。 線維芽細胞LDL−受容体は、2.5ミリグラム毎ミリリッ
トル（mg/ml）のリポタンパク質除去血清（LDS）を含む
増殖培地（DME−LDS）とともに約24時間の線維芽細胞の
前インキュベーションにより刺激した。2.5マイクログ
ラム毎ミリリットル（μg/ml）の¹²⁵Ｉ−LDLを含むDME
−LDLと20％MB47ハイブリドーマ培養上澄み（v/v）また
は200倍過剰非標識LDL（最終濃度500μg/ml）とを混合
し、線維芽細胞単層上に置く前に４℃で約16時間維持
（インキュベート）した。 結合、インターナリゼーション、および分解は３重に
行ない、単クローン性受容体MB47の存在なく測定した対
照値の百分率として示す。単クローン性受容体MB47によ
る特異的結合、インターナリゼーション、および分解を
200倍過剰の非標識LDLにより生したものと比較した。 第４図にはヒト線維芽細胞による¹²⁵ＩヒトLDL結合お
よび分解を抑制する単クローン性抗体MB47の一価Fabフ
ラグメントの能力を示す２つのグラフが含まれる。MB47
−Fabフラグメントの増加量を含む個々の培地と一定量
の¹²⁵Ｉ−LDL（2.5μm/ml）とを混合し、線維芽細胞単
層上に置く前に４℃で約15時間維持（インキュベート）
した。Fab濃度は各培地中に存在するFab/LDLモル比とし
て示される〔Fabの分子量（MW）を40,000ドルトンと、
アポＢの分子量を550,000ドルトンと仮定した〕。 結合および分解はMB47−Fabフラグメントの存在しな
い対照値の百分率として示す。測定はすべて２重に行な
った。過剰の非標識LDL（最終濃度500μg/ml）は¹²⁵Ｉ
−LDL結合（パネルＡ）および分解（パネルＢ）の95％
以上の抑制を生じた。同様の結果は単クローン性受容体
MB47の種々のFab調製物による３研究で得られた。 第５図は２つのグラフが含まれる。グラフＡは増加量
のMB24受容体分子の存在下の固相付着試薬アポＢ−100
との免疫反応に対する既知一定量の西洋ワサビペルオキ
シダーゼ標識MB47（HRPO−MB47）受容体の能力を示す。
縦軸は相対化学濃度であり、横軸は競合相手として加え
た非標識抗体のマイクログラム毎ミリリットル（μg/m
l）の単位である。 一定量（20μｇ）のHRPO結合MB47受容体を増加量の非
標識MB47（●）または非標識MB24（▲）受容体および固
相付着試薬アポＢ−100（LDL）と実質的に同時に混合し
た。混合物を25℃で３時間維持し、それにより受容体を
試薬アポＢ−100に免疫的に結合させ固相免疫反応体を
形成させた。次いで固相結合標識MB47の量を、物質およ
び方法において記載する競合的ELISAにおけるように検
定した。 グラフＡは増加量の非標識MB47受容体の免疫反応混合
物中の存在が相応して固相免疫反応体として結合した標
識したMB47受容体の量を低下することを示す。従って、
非標識MB47はLDLに対し、標識したMB47と競合する。 一方グラフＡは増加量の非標識MB24が固相免疫反応体
として結合して標識したMB47の量を有意に低下しないこ
とを示す。従って非標識MB24はLDLに対する結合に対し
て標識したMB47と競合しない。 グラフＢはHRPO標識MB24受容体および非標識MB47受容
体を用いると類似の結果が得られることを示す。従って
MB47およびMB24受容体がアポＢ−100の表面上で十分離
れ、結合を立体的に競合し抑制することなく単一アポＢ
−100分子に対する両受容体の結合を可能にする異なる
エピトープに結合する。 第６図には２つのグラフが含まれる。グラフＡは液相
RIAにおける¹²⁵Ｉ標識B47のLDLに対する結合を示す。縦
軸は結合したフェムトモル（fmol）単位であり、横軸は
混合した抗体のナノモル（nM）単位である。 免疫精製した単クローン性抗体MB47はヨードゲン（Io
dogen）法を用いて¹²⁵Ｉで3,000カウント毎分毎ナノグ
ラム（cpm/ng）の比活性にヨウ素化した。リン酸塩緩衝
食塩水（PBS）に対する広範囲の透析後放射能の95％以
上が10％トリクロロ酢酸（TCA）により沈殿した。¹²⁵Ｉ
−MB47の97％以上がLDLカラムに結合した。検定は10×7
5mmシリコーン被覆ガラス管中で３重に行なった。ウシ
血清アルブミン−バルビタール（BSA−バルビタール）
緩衝液（pH値8.0）0.1ml中の¹²⁵Ｉ−MB47の増加濃度
を、BSA−バルビタール緩衝液0.2ml中に希釈した100ng
のプールした正常脂肪血ヒトLDLに加えた。各管にLDLア
ポB182fmolを入れた（アポＢ分子量を550,000ドルトン
と仮定）。 ４℃で16時間インキュベート（混合および維持）した
後、LDLがヒトLDLに特異性のリポタンパク質除去ウサギ
抗血清により定量的に沈澱させた、〔単クローン性抗体
MB47がウサギアポリポタンパク質Ｂに結合するので、1.
21g/ml以上の密度（ｄ）を有するウサギ抗血清の画分の
みを用いた〕。 予備試験で¹²⁵ＩヒトLDL100ngの98％以上を沈澱する
脱脂ウサギ抗血清の濃度を決定した。ウサギ抗血清の添
加後、管を４℃で約16時間インキュベートした。 上澄みを除き、ペレットを氷冷バルビタール緩衝液
（pH値8.0）2mlで２回洗浄した。非特異的結合および沈
降を２組の並行管中で測定した。第１組において初期イ
ンキュベーションにヒトLDLを加えないので同量のウサ
ギ第２抗体を加えた。第２組の管には非免疫ウサギ血清
（ｄが1.21mg/mlより大きい画分）を免疫ウサギ血清抗
体の代りに用いた。 両方法は非特異的結合に対する実質的に等しい値を生
じ、それは¹²⁵Ｉ−MB47単クローン性抗体の濃度の増加
と直線的であり、すべての場合に加えた全カウント数の
１％未満であった。LDLに対する特異的¹²⁵Ｉ−MB47結合
は全結合から非特異的結合を差引くことにより得た。結
合データは抗体アフィニティ定数（Ka）および受容体ま
たはエピトープの濃度の評価を与えるリガンド結合系の
スキヤッチャード（Scatchard）分析に対する線形回帰
プログラムを用いて分析した。 LDLに対する¹²⁵Ｉ−MB47のKaはそれにより3.82×10⁹
Ｍ^-1であると決定された。無限抗体過剰の条件に対する
直線の補外はアポＢの分子量を550,000ドルトンである
と仮定したときにLDL182fmol（100ng）により結合され
た¹²⁵Ｉ−MB47、212fmol（35ng）の評価を生じた。これ
らのデータは第６図のグラフＢに示され、縦軸は結合
（Ｂ）の遊離（Ｆ）抗体に対する比（B/F）の単位であ
り、横軸は結合した抗体のfmol（MB47のfmol）の単位で
ある。 第７図は「脂質研究臨床手順（Lipid Research Chini
c Procedures）」、NHWパブリケーションNo.75−628（N
IH）、２版、Wash.,D.C.Gov.Print Off.（1974）により
測定したLDL−コレステロールのmg毎試料デシリットル
（dl）と、物質および方法において記載する非競合的EL
ISAを用いて測定したアポＢ−100のmg毎試料dlとの間の
相関を示す。 ノンパラメトリックデータに対するスピアマン・ラン
ク（Spearman Rank Correlation）試験〔ソカル（Soka
l）ほか、バイオメトリー（Biometry）、２版、W.H.フ
リーマン社（W.H.Freeman Co.,San Francisco,CA）、56
1〜616（1981）〕により決定した相関係数、γ＝0.89、
は60ヒト血漿試料中の、ここに記載した非競合的ELISA
により測定されたアポＢ−100の濃度とLDL−コレステロ
ール濃度との間の有意な相関を示す。 第８図は第７図に類似し、同一60ヒト試料中の本発明
の競合的ELISA法により測定したアポＢ−100の濃度とLD
L−コレステロール濃度との間の有意な相関、γ＝0.9
2、を示す。 第９図は第７図および第８図に用いた同一60ヒト試料
における非競合的ELISA（縦軸）および競合的ELISA（横
軸）を用いた得た結果の間のスピアマン・ランク順位相
関試験により決定した有意な時間、γ＝0.92を示す。 発明の詳細な説明 I.一般的論議 A.定義 「抗体」という語は抗原と特異的に結合できる免疫グ
ロブリンといわれるグリコシル化タンパク質の族の一員
である受容体分子を示す。 「抗体結合部位」は抗原を特異的に結合する重鎖およ
び軽鎖可変および高度可変領を含む抗体分子の構造部分
である。 「抗原」という語は歴史的に抗体により結合されるエ
ンテイテイーを示す、また抗体の生成を誘導するエンテ
イテイーを示すために使用された。より最近の用法は抗
原の意味を抗体により結合されるエンテイテイーに限定
し、「免疫原」が抗体生成を誘導するエンテイテイーに
使用される。ここに論議するエンテイテイーが免疫原お
よび抗原の両方である場合には一般に抗原として示され
る。 「抗原決定基」は抗体結合部位により免疫的に結合さ
れる抗原の実際の構造部分を示す。その語はまた「エピ
トープ」と同じ意味に使用される。 「生物活性」という語は少くともリガンドまたは特異
的結合剤を特異的に結合する能力を示すが、他の一般的
または作用因子能力もまた存在することができる。 用いた「複合体」という語は特異的結合剤が標的リガ
ンドに結合するときに形成される生成物を示す。複合体
の適例は免疫反応体、抗体に結合したタンパク質Ａなど
である。 「ELISA」は固相に結合した抗体または抗原および酵
素−抗原または酵素−抗体結合体を、試料中に存在する
抗原または抗体の検出および量の定量に用いる酵素結合
抗原免疫検定を示す。ELISA法の説明は1982年にランゲ
・メディカル・パブリケーション（Lange Medical Publ
ication,Los Altos,CA）により発行されたサイテス（D.
P.Sites）ほかによる「基礎および臨床免疫学（Basic a
nd Clinical Immunology）」４版、22章、並びに米国特
許第3,654,090号、第3,850,752号および第4,016,043号
中に見出され、それらはすべて参照により加入される。 「酵素」はしばしば特異的である基質中の若干の変化
を触媒作用により促進または生成することができるタン
パク質を示す。 「エピトープ」は抗体結合部位により特異的に認識さ
れる分子の部分を示す。それはまた決定基または抗原決
定基として示される。 「イデイオトープ」または「イデイオタイプ決定基」
は他の抗体の結合部位により認識されることができる抗
体分子の可変および高度可変部分上の抗原決定基であ
る。イデイオトープは通常、結合部位関連決定基に結合
するものおよび非結合部位に関連するものの２つの型に
分けられる。抗体分子上のイデイオトープの集合がその
イデイオタイプを構成する。ハイブリドーマにより生成
される抗体結合部位は単一の特有の組のイデイオトー
プ、すなわち特有の抗体結合部位イデイオタイプ、を有
すると思われる。 用いた「免疫反応体」という語は免疫反応の生成物、
すなわちリガンドが受容体分子により免疫的に結合され
たときに生ずるエンティティーを示す。「免疫反応体」
は特定の型の「複合体」である。 受容体分子に関連して用いた「分離した」という語は
実質的に単に１種の抗体結合部位が存在することを意味
する。 「標識手段」、「指標基」または「標識」という語は
同じ意味で使用され、免疫反応体の存在を示すために検
出できるシグナルの生成に直接または間接的に含まれる
単一の原子または分子を含む。標識手段は受容体に結合
または取込まれ、あるいは別個に用いることができ、こ
れらの原子または分子は単独または他の試薬とともに用
いることができる。そのような指標基または標識自体は
免疫化学においてよく知られ、単にそれらが他の点で新
規な受容体、方法および（または）系で使用されれば本
発明の一部を構成する。 「リガンド」は特異的受容体により結合される構造部
分を含む分子、例えば受容体により結合される抗原を示
す。 「受容体」という語は抗原に（又は抗原と）免疫的に
結合する生物活性分子を示すために用いる。そのような
結合は典型的には約10⁵〜約10¹⁰リットル毎モル（M^-1）
のアフイニティーで起り、抗原のエピトープと受容体の
抗体結合部位との特異的相互作用である。 本発明の受容体分子は無傷抗体、実質的に無傷の抗
体、あるいは例えば腹水または組織培養上澄み中の抗体
の抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチド部位
（例えばFabフラグメント）である。 「受容体」という語はまた他の分子を結合する細胞表
面上の分子に用いる。細胞表面受容体は不明確さを避け
るために常に「受容体」という語に先行する結合エンテ
ィティーの名称とともに示される。細胞表面「受容体」
の適例は先に記載したLDL受容体である。 受容体分子の生物活性は、水性媒質中で少くとも生理
的pH値およびイオン強度でそれらを混合したときに受容
体とその抗原リガンドとが免疫反応し免疫反応体を生ず
ることにより証明される。好ましくは、生物活性は生物
学的検定条件下、すなわち約５〜約９のpH値範囲内で蒸
留水ないし約１モルの塩化ナトリウムのようなイオン強
度で、約４〜約45℃の温度で本発明の受容体分子が抗原
リガンドに結合する条件下に生ずる。記載した受容体分
子はすべて生物活性であった。 抗体の抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチド
部分（抗体結合部位）は結合部位イディオタイプを含
み、リガンドに結合する抗体分子の部分であり、抗体の
Fab、Fab′、Ｆ（ab′）₂およびＦ（Ｖ）部分が含まれ
る。抗体のFabおよびＦ（ab′）₂部分はよく知られ、よ
く知られた方法により実質的に無傷の抗体に対するそれ
ぞれパパインおよびペプシンのタンパク質加水分解反応
により製造される、例えばテオフィロポロウス（Theofi
lopolous and Dixon）に対する米国特許第4,342,566号
参照。Fab′抗体部分もまたよく知られ、例えばメルカ
プトエタノールを有する２つの重鎖部分を連結するジス
ルフィド結合を還元し、次いで生じたタンパク質メルカ
プタンをヨードアセトアミドのような試薬でアルキル化
することによりＦ（ab′）₂部分から製造される。無傷
抗体が好ましく、Fab部分とともに本発明の単クローン
性受容体分子の例として利用される。 「分泌する」および「生成する」という語はしばしば
抗体分子が得られる細胞に関連して同じ意味で使用され
る。しかし抗体を生成する細胞はこれらの分子をその環
境中へ分泌することができない。関心のハイブリドーマ
細胞は単クローン性抗体をその環境中へ分泌する。しか
し、そのような細胞はしばしば「抗体生成」細胞として
示され、それらの抗体は技術的に使用される言い回しに
従って「生成された」として示される。 用いた「特異的結合剤」という語はリガンドを選択的
に結合できる分子エンティティーを示す。特異的結合剤
の適例は受容体、補体フラグメント、プロテインＡなど
である。 受容体分子に関連して使用される「実質的に純粋」と
いう語は検出限界内で単に１種の抗体結合部位がアポＢ
−100に対する有効な結合剤として存在することを意味
する。従って、実質的に純粋な受容体分子の調製物は１
種以上の抗体結合部位を含むことができるけれども、そ
のような調製物はアポＢ−100に対して単一結合アフイ
ニティーを示す。例えば本発明のハイブリドーマにより
生成された組織培養上澄みは典型的には骨髄腫タンパク
質および本発明の受容体を含む。実質的に純粋な形態の
受容体分子はそのような組成物が単クローン性ハイブリ
ドーマ培養を用いて生成されるので、典型的には当業者
により「単クローン性抗体」と称される。 免疫反応混合物を形成するために３つまたはそれ以上
の抗原および受容体成分の混合物に関連して用いた「実
質的に同時」という語は全成分が任意の２つの成分の混
合物の約15分以内、好ましくは約５分以内に存在し、単
一混合物に混合されることを意味する。 B.ハイブリドーマおよび単クローン性受容体 本発明は研究室呼称HL130C2.3C5を有し、 （ａ）アポタンパク質Ｂ−100上の保存抗原決定基と免
疫反応し、 （ｂ）LDL受容体に対するアポタンパク質Ｂ−100の結合
を競合的に抑制し、 （ｃ）液相競合的平衡放射免疫検定（RIA）において約
3.82×10⁹M^-1のLDLに対するアフイニティー定数を有す
る、 受容体分子を生成するハイブリドーマを意図する。これ
らの受容体分子は通常MB47として示される。 本発明はまた研究室呼称V82A6.1G4を有し、アポタン
パク質Ｂ−100抗原決定基と免疫反応し、固相競合的平
衡RIAにおいて約3.0×10⁹M^-1のLDLに対するアフイニテ
ィー定数を有する受容体分子を生成するハイブリドーマ
を意図する。これらの受容体分子は通常MB24として示さ
れる。 ハイブリドーマHL130C2.3C5およびV82A6.1G4はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC,Rockv
ille,MD）に1985年３月６日に次のATCC受託番号のもと
で寄託された： ハイブリドーマ 受容体名称 ATCC受託番号 V82A6.1G4 MB 24 HB 8742 HL130C2.3C5 MB 47 HB 8746 上記ATCC寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承
認に関するブタペスト条約に従って行なった。 本発明のハイブリドーマは抗体生成細胞と骨髄腫細胞
系との融合により形成された。そのような受容体生成細
胞は、初めにコーラーほか（Kohler and Milstein）、
ネーチャー（Nature）、256、495（1975）に記載され、
その記載は参照により加入される。受容体は典型的には
ハイブリドーマ細胞培養、好ましくは単クローン性細胞
培養の上澄みから、あるいは非ヒト温血宿主動物、好ま
しくは組織適合性または免疫易感染性でありハイブリド
ーマ細胞を導入して培養したものから得られた腹水また
は他の体液から得られる。 従って他の態様において、本発明は（ａ）本発明のハ
イブリドーマ、（ｂ）ハイブリドーマにより分泌され、
アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応する受容体分子、お
よび（ｃ）ハイブリドーマに対する培地を含む細胞培養
を意図する。これらの組成物の調製に有用な培地はよく
知られ、市販され、合成培地、近交マウスなどを含む。
合成培地の適例は、4.5g/lグルコース、20mmグルタミン
および20％ウシ胎仔血清を補足したダルベッコ（Dulbec
co）の最少必須培地〔DMEM;ダルベッコ（Dulbecco）ほ
か、バイロロジー（Virol.）、8、396（1959）〕であ
る。近交マウス系の適例はBalb/cである。 なお他の態様において、本発明はMB47およびMB24と呼
称され、それぞれHB8746およびHB8742と称されるハイブ
リドーマにより生成され、アポタンパク質Ｂ−100と免
疫反応する受容体を意図する。従って、本発明の受容体
は適当な培地中で本発明の適当なハイブリドーマを培養
し、培地から受容体を回収することにより調製すること
ができる。 先にカーチス（Curtiss）ほか、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）257、1
5213（1982）はハイブリドーマHB8742により生成される
MB24と呼称されるものを含め11のアポＢ特異性受容体分
子の生成および確認を報告した。ハイブリドーマHB8742
は物質および方法において詳細に記載するように、ヒト
VLDLで免疫処置したマウスの脾細胞の融合により得られ
た。 HB8742の腹腔内成長から生じたMB24を含む腹水のIgG
画分は等電点電気泳動（IEF）により確認された。カー
チス（Curtiss）ほか、前掲、に記載されるように、融
合IgG₁K免疫グロブリンを分泌するP3×63Ag8の骨髄腫細
胞で行なった。従って、IEFでHB8742腹水は多重タンパ
ク質バンドの特有のパターンを示し、P3×63Ag8の骨髄
腫IgG₁K抗体および受容体MB24に加えて無作為に混ざっ
た重鎖および軽鎖を含む免疫グロブリン分子を示す。 ハイブリドーマHB8746はMB47受容体分子を生成し、LD
Lで免疫処置したマウスの脾細胞とP3×63Ag8.653.1骨髄
腫細胞との融合により形成された。親骨髄腫のこの変種
は骨髄腫タンパク質を分泌しない。HB8746腹水のIEFはI
gG2a重鎖およびｋ軽鎖を示す特有パターンのタンパク質
バンドを示す。従って、本発明の両ハイブリドーマは一
部はそれらが生成する受容体分子のIEFパターンにより
確認できる。 本発明のV82A6.1G4ハイブリドーマが１種以上の受容
体分子を生成するけれども、本発明の受容体分子はその
個々のアポＢ−100抗原決定基と免疫反応する能力によ
り容易に確認し、分離することができる。MB24およびMB
47の抗原特異性を、ここに記載するウェスターンプロッ
ト検定でそれらの個々のキロミクロン、VLDL、LDLおよ
びHDLから得られたアポタンパク質と免疫反応する能力
の検定により試験した。 得られたデータはMB47およびMB24がLDL、VLDLおよび
キロミクロンから得たＢ−100と免疫反応するがVLDLま
たはキロミクロンのアポＢ−48と反応しないことを示し
た。両MB47およびMB24のキロミクロンおよびVLDLのアポ
Ｂ−100と個々に免疫反応する能力は第１図に示され
る。 （１）MB47により免疫的に結合されたアポＢ−100抗原
決定基の確認 先の研究はアポＢ−100中の抗原不均一性を示した。
すなわち若干のアポＢ−100エピトープがすべてLDL粒子
により発現されるわけではない。従って、液相RIA中の
過剰の一定単クローン性抗体との混合物はすべて放射性
標識LDL（¹²⁵Ｉ−LDL）粒子の免疫結合を生ずるとは限
らない。 MB47受容体分子により認識されたエピトープすべての
LDLにより均一に発現されるかどうかを決定するために
液相RIAにおいて¹²⁵Ｉ−LDLに免疫的に結合するMB47の
能力を調べた。10正常被験者のプールにした血漿および
単個正常被験者から分離したLDLを後記のように放射性
標識し、生物活性MB47受容体分子と混合して免疫反応混
合物を形成した。混合物を生物学的検定条件下に、MB47
受容体分子が各試料中のアポＢに免疫的に結合して免疫
反応生成物（免疫反応体）を形成するのに十分な予定時
間維持した。 全受容体分子をIgSORB〔ジ・エンザイム社（The Enzy
me Co.,Boston,MA）製〕で沈殿させ、沈殿中の¹²⁵Ｉ−L
DL関連カウントをγカウンター中で定量することにより
過剰のMB47受容体分子により結合された¹²⁵Ｉ−LDLの最
大量を検定した。トリクロロ酢酸（TCA）により沈殿し
た¹²⁵Ｉ−LDLの百分率として示した第２図に示される結
果は実質的にすべての¹²⁵Ｉ−LDLが抗体により結合され
たことを示し、MB47により認識され、結合されたエピト
ープがすべてのLDL粒子により発現されることを示す。 （２）LDL−受容体に対するアポＢ−100の結合のMB47に
よる競合的抑制 アポタンパク質Ｂ−100はヒトおよび他の哺乳動物のL
DL中の主アポタンパク質であり、それは線維芽細胞LDL
受容体に対するLDLの結合を仲介する。先の研究は哺乳
動物リポタンパク質代謝中のLDL受容体の中心的役割を
示した。多くの動物種から分離したLDL粒子がヒトLDL受
容体結合ドメインに特異的に結合する事実から、アポＢ
−100分子上の結合部位が進化的に保存され、従って全
動物種からのLDL粒子によって発現されるに相違ない。 MB47受容体分子がヒトアポＢ−100LDL受容体結合ドメ
イン内に位置する抗原決定基と免疫反応するかどうかを
試験するために、MB47が細胞LDL受容体に対する¹²⁵Ｉ−
LDLの結合を抑制する能力を試験した。これはMB47受容
体分子を完全抗体分子の形態で¹²⁵Ｉ−LDLと混合して免
疫反応混合物を形成することにより行なった。免疫反応
混合物を次いで生物学的検定条件下に、MB47受容体分子
が存在する¹²⁵Ｉ−LDLを免疫的に結合して免疫反応体を
形成するのに十分な予定時間維持した。 次に、免疫反応体含有免疫反応混合物を、線維芽細胞
LDL受容体を発現するヒト線維芽細胞上に置いた。次い
で、線維芽細胞LDL受容体が¹²⁵Ｉ−LDL−MB47免疫反応
生成物上の利用できるLDL受容体結合部位に特異的に結
合するのに十分な予定時間培養を維持した。MB47により
示した受容体分子が、LDL−受容体結合中にも構造が含
まれるアポＢ−100抗原決定基と免疫反応すればそのよ
うな細胞受容体−LDL相互作用が抑制されると仮定され
る。 この研究の結果は第３図に示され、MB47受容体分子が
ヒト線維芽細胞による¹²⁵Ｉ−LDLの細胞受容体仲介結
合、インタナリゼーションおよび分解を、200倍過剰の
非標識LDLにより生ずる抑制に匹敵する程度に抑制した
ことを示す。 MB47受容体がアポＢ受容体ドメインに隣接するエピト
ープに結合し、その大きさのためにアポＢのLDL受容体
に対する結合を立体的に障害する可能性を試験するため
に、MB47抗体分子のFabフラグメントがヒトLDL取込みお
よび分解を抑制する能力もまた上記線維芽細胞検定で試
験した。 第４図に示すように、MB47−FabフラグメントはLDLの
特異的細胞結合および分解を著しくブロックした。MB47
−Fabフラグメントは無傷MB47−抗体分子より実質的に
小さいので、MB47抗体結合部位により認識されるエピト
ープがLDLアポＢ−100上のLDL受容体結合ドメイン内に
含まれると思われる。抗体MB24は抗体MB47の性質を有さ
ず、培養線維芽細胞による¹²⁵Ｉ−LDLの結合および分解
を抑制しない。 （３）立体的抑制 本発明の検定法の若干の態様のために、第１および第
２受容体がアポＢ−100分子の異なるエピトープに結合
しなければならず、またこれらのエピトープは１受容体
の結合が他の受容体の結合を立体的に抑制しないように
十分離れていなければならない。従って、MB47およびMB
24がそれぞれ他の固相付着試薬アポＢ−100に対する免
疫結合を競合的に抑制する能力を試験した。 その試験の結果は第５図に示され、70倍過剰の非標識
MB24がペルオキシダーゼ標識MB47の試薬アポＢ−100に
対する結合を有意に抑制しなかったことを示す。同様
に、70倍過剰の非標識MB47がペルオキシダーゼ標識MB24
の試薬アポＢ−100に対する結合を有意に抑制しなかっ
た。従って、MB24およびMB47はアポＢ−100上の異なる
エピトープに結合し、これらのエピトープが十分離れて
いて無傷抗体としてのMB24およびMB47が単一アポＢ−10
0分子に対するそれぞれ他の結合を抑制しない。 （４）アポＢ−100に対するMB47の結合の化学量論およ
びアフイニティー MB47受容体分子により認識されたLDL上のアポＢ−100
分子当りの抗原決定基部位の数を決定するために抗体標
識RIAを用いた。この検定において、MB47受容体分子を
腹水から精製（分離）し、方法および物質において詳細
に記載されるよく知られた方法により放射性標識した（
¹²⁵Ｉ−MB47）。 第６図Ａに示されるように、増加量の¹²⁵Ｉ−MB47を
別々の反応混合物中のLDL形態の一定量のアポＢ−100と
混合した。混合物を生物学的検定条件下に、¹²⁵Ｉ−MB4
7受容体分子がアポＢ−100（LDL）に免疫的に結合し、
免疫反応体を形成するのに十分な予定時間維持した。次
いでヒトLDLに特異性のウサギ抗血清を用いてLDL（結合
および遊離）を定量的に沈殿させ、免疫反応体として存
在する¹²⁵Ｉ−MB47の量をガンマカウンティングにより
検出することにより免疫反応体の存在を検定した。 ¹²⁵Ｉ−MB47受容体分子の特異的免疫結合は第６図Ａ
に示されるように飽和可能であった。さらにこの研究で
得られた結合データのスキャッチャードプロットは直線
状であり（第６図Ｂ）、LDL粒子上のMB47結合部位の均
一性を示唆した。 さらに抗体標識RIAにより評価したLDL形態のヒトアポ
Ｂ−100に対するMB47の見掛けアフイニティー定数（K
a）は3.82×10⁹M^-1と認められた。スキャッチャード分
析はまた最大212fmolの¹²⁵Ｉ−MB47抗体がLDL182fmolに
結合したことを示し、単に１個のMB47分子がアポＢ−10
0の各分子に結合することを示す。すなわちMB47がアポ
Ｂ−100上の１個の特有の抗原決定基に結合する。 アポＢ−100に対するMB47の平均アフイニティー定数
もまた前記標識RIAで評価した。この競合的平衡液相RIA
において、LDLとして存在する非標識アポＢ−100が¹²⁵
Ｉ−LDLの完全な置換を生じた。この検定におけるLDLに
対する完全な無傷抗体として存在するMB47受容体分子の
算出アフイニティー定数は４×10⁹M^-1であり、前記抗体
標識検定により決定されKaとよく一致した。 C.検定法 本発明の受容体分子は体液試料例えば血液、血清また
は血漿中のアポタンパク質Ｂ−100の存在および量の検
定に殊に有用である。 １態様において、本発明は下記段階を含む、体液試料
をアポタンパク質Ｂ−100の量について検定する方法を
意図する： （ａ）検定すべき体液試料を準備する段階。典型的には
そのような試料は測定した量または既知量の血液、殊に
血漿または血清として準備される。血液、血漿および血
清の試料を準備する方法はよく知られ、さらに論議しな
い。 （ｂ）（ｉ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応する、
かつ（ii）ATCC受託番号HB8746を有するハリブリドーマ
またはATCC受託番号HB8742を有するハイブリドーマによ
り分泌され、検定の実施に有効な量で存在する受容体分
子を生物活性形態に準備する段階、 好ましい態様において受容体は無傷抗体またはFabフ
ラグメントである。 受容体分子の有効量は、とりわけよく知られるよう
に、用いる個々の検定法により異なることができる。当
業者により標準研究室技術を用いて有効量を容易に決定
できることもまたよく知られている。 （ｃ）体液試料を段階（ｂ）の受容体分子と混合して免
疫反応混合物を形成する段階。 （ｄ）混合物を生物学的検定条件下に、受容体分子の抗
体結合部位が体試料中のアポタンパク質Ｂ−100を免疫
的に結合して免疫反応体（第１複合体）を形成するのに
十分な数分ないし数十時間の予定時間例えば10分ないし
約16〜20時間維持する段階。生物学的検定条件は本発明
の受容体分子の生物活性を維持する条件下であり、約４
〜約45℃の温度範囲、約５〜約９のpH値範囲および蒸留
水から約１モルの塩化ナトリウムまで変化するイオン強
度が含まれる。そのような条件を最適化する方法はよく
知られている。 （ｅ）形成された免疫反応体の量、それにより前記試料
中に存在するアポＢ−100の量を検定する段階。 好ましい態様において段階（ａ）の体液試料を段階
（ｅ）による検定のためにさらに次の段階により調製さ
れる： （ｆ）段階（ｂ）で使用したものとは別のハイブリドー
マより分泌された生物活性第２受容体分子を準備する段
階。 （ｇ）第２受容体分子の予定量を体液試料と混合して免
疫反応混合物を形成する段階。 （ｈ）形成された第２受容体／体液試料混合物を段階
（ｄ）の記載と同様の方法で維持して１アポＢ−100分
子に免疫的に結合した1MB47分子および1MD24分子を含む
サンドイッチ免疫反応体（第２複合体）を形成する段
階。 上記一般検定法はよく知られているように、種々の異
なるフォーマットを用いて行なうことができる。従っ
て、下記の一層特定的な検定法は固相フォーマットを用
いるけれども本発明はそれに限定されない。 固相検定フォーマットは固相マトリックスに付着して
固体支持体を形成する受容体分子または抗原を用いて行
なうことができる。固体支持体が段階（ｂ）の受容体を
含む態様において、段階（ｃ）の混合物は固／液相混合
物であり、段階（ｄ）の免疫反応体は体試料アポＢ−10
0を含む固相免疫反応体である。 固相支持体が試薬アポＢ−100を含む態様において、
段階（ｃ）の混合物はまた固体／液体混合物であるが、
しかし段階（ｄ）の体試料アポＢ−100含有免疫反応体
は液相免疫反応体である。試薬アポＢ−100は生物活
性、すなわち調査下にあるもの以外の源により、典型的
には分離LDLの形態で提供される抗原性アポＢ−100であ
る。 段階（ｄ）で免疫反応体として結合したアポＢ−100
の量の検定はよく知られた検定法により直接または間接
的に行なうことができる。例えば、すべて参照により加
入される米国特許第4,536,479号、第4,233,401号、第4,
233,402号および第3,996,345号に記載された均一検定系
を用いることができる。 好ましい固相態様において、体液はさらに標識した特
異的結合剤の使用による検定のために調製される。標識
した特異的結合剤の型および特異性は、よく知られるよ
うに、使用される方法およびフォーマットによる。 固体支持体が段階（ｂ）の受容体、すなわち本発明の
受容体、を含む好ましい固相態様において、固相結合ア
ポＢ−100の量は検定のために次の段階により調製され
る： （ｉ）体液試料中に存在するアポタンパク質Ｂ−100に
結合して免疫反応体を形成する生物活性の標識した第２
受容体分子を準備する段階。標識した第２受容体の標識
は免疫反応体中の標識した第２受容体の存在をシグナル
することができる。 特定態様において、標識した第２受容体分子は固相受
容体分子が反応するエピトープと異なる第２のアポＢ−
100エピトープと免疫反応し、固相受容体分子がアポＢ
−100と反応するのを実質的に抑制しない。好ましく
は、標識した第２受容体分子は段階（ｂ）のいずれかの
残余のハイブリドーマにより分泌されたもの、すなわち
第１受容体分子として選ばれなかった前記の受容体分子
である。 受容体分子が同一抗原に対する他の受容体分子の免疫
結合を抑制（妨害）するかどうかを測定する方法はよく
知られ、後に詳細に記載される。 （ｊ）標識した第２受容体分子の予定量を体液試料と混
合して免疫反応混合物を形成する段階。 形成された混合物は、段階（ｉ）が前記段階（ｂ）の
前に行なわれるときのように液体混合物であることがで
き、あるいはそれは標識した第２受容体を段階（ｂ）と
実質的に同時または後に混合するときに固体／液体混合
物であることができる。段階（ｉ）を段階（ｂ）の前ま
たは実質的に同時に行なうと、標識した第２受容体分子
は固相受容体分子が反応するエピトープとは異なる第２
のアポＢ−100エピトープと免疫反応し、固相結合受容
体分子がアポＢ−100と免疫反応するのを実質的に抑制
しない。 好ましい態様において、段階（ｉ）は段階（ｂ）と実
質的に同時に、または段階（ｃ）後に行なわれる。 （ｋ）形成された標識した第２受容体／体液試料混合物
を段階（ｄ）に記載したと同時に維持して免疫反応体を
形成する段階。 固相結合受容体分子および第２受容体分子は、従って
体液試料中に存在するアポＢ−100に免疫的に結合し、
それにより、その部分として結合した標識を含む固相結
合サンドイッチ免疫反応体を形成する。すなわち、標識
を含む固相サンドイッチ免疫反応体は１分子のアポＢ−
100が固相結合受容体分子および標識した第２受容体分
子と免疫反応するときに形成される。好ましい態様にお
いて、固相結合免疫反応体の部分を形成しない標識した
第２受容体分子（すなわち固相受容体分子に結合するア
ポＢ−100に免疫的に結合しなかったもの）は、免疫反
応体として存在する標識した第２受容体の量を検定する
前に、好ましくは洗浄により、免疫反応体から分離され
る。 段階（ｅ）により形成された免疫反応体の量の検定は
アポＢ−100を含む免疫反応体の部分として結合した標
識した第２受容体の量に対する検定により行なわれる。
これは試料中のアポＢ−100の量に対する直接検定を与
える。その量が０であり、それにより検出できる限界内
で試料中にアポＢ−100が存在しないことを示すことが
できる。標識した第２受容体の量に対する検定法は用い
た標識により、そのような標識および検定法はよく知ら
れている。 固体支持体が標識アポＢ−100を含む好ましい固相態
様において、段階（ｄ）で形成された免疫反応体の量は
検定のために次の段階により調製される： （ｌ）固相免疫反応体として存在する段階（ｂ）に用い
た受容体分子に結合する生物活性の標識した特異的結合
剤、好ましくは受容体分子を混合して複合体、好ましく
は第２免疫反応体、を形成する段階。標識した特異的結
合剤の標識は複合体中の標識した特異的結合剤の存在を
シグナルすることができる。これらの検定型の好ましい
態様において、段階（ｉ）〜（ｋ）は段階（ｄ）の後に
行なわれる。 （ｍ）標識した特異的結合剤の予定量を体液試料と混合
して反応、好ましくは免疫反応、混合物を形成する段
階。 （ｎ）形成された標識した特異的結合剤／第１免疫反応
体混合物を段階（ｄ）に記載したと同様に維持して複合
体を形成する段階。 そのように形成された固相複合体はその部分として結
合した標識を含む。好ましい態様において、固相複合体
の部分として結合しない標識した特異的結合剤は、固相
結合標識の存在について検定する前に、好ましくは洗浄
により、複合体から分離される。 段階（ｅ）により形成された免疫反応体の量の検定は
複合体の部分として存在する標識の量を検定することに
より行なわれる。これは試料中に存在するアポＢ−100
の量に対する間接検定を与える。 タンパク質抗原および特異的結合剤の標識はよく知ら
れている。例えば、ハイブリドーマにより生成される受
容体は組織培地中に成分として与えられる放射性同位元
素含有アミノ酸の代謝取込みにより標識することができ
る、例えばガルフレ（Galfre）ほか、メソーズ・イン・
エンジモロジー（Meth.Enzymol.）、73、３〜46（198
1）参照。 活性化官能基によるタンパク質結合またはカップリン
グの方法は殊に適用することができ、抗原または特異的
結合剤に共有結合した標識を生ずる、例えばオーラミー
ス（Aurameas）ほか、スカンジナビアン・ジャーナル・
オブ・イムノロジー（Scand.J.Immunol.）、８巻、Supp
l7、７〜23（1978）および米国特許第4,493,795号参
照、それらは参照により加入される。さらに、標識が抗
原または受容体の生物活性を実質的に妨害しないように
特定部位カップリング反応を行なうことができる、例え
ばロッドウエル（Rodwell）ほか、バイオテクノロジー
（Biotech.）、3、889〜894（1985）。 標識手段は抗体または抗原に、それらを変質すること
なく化学的に結合し、免疫螢光トレーサーである螢光色
素（染料）を形成する螢光標識剤であることができる。
適当な螢光標識剤は螢光色素例えばフルオレセインイソ
シアネート（FIC）、フルオレセインイソチオシアネー
ト（FITC）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスル
ホニルクロリド（DANSC）、テトラメチルローダミンイ
ソチオシアネート（TRITC）、リサミン、ローダミン820
0スルホニルクロリド（RB200SC）などである。免疫螢光
分析法の記載はデルカ（DeLuca）、「免疫螢光分析（Im
munofluorescence Analysis）」、アンティボディ・ア
ズ・ア・ツール（Antibody As A Tool）、マーチャロニ
ス（Marchalonis）ほか編、ジェー・ワイリー・アンド
・サンズ（J.Wiley ＆ Sons,Ltd.）,189〜231頁、1982
に見出され、それは参照により加入される。 好ましい態様において、指標基は酵素例えば西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（HRPO）、グルコースオキシダーゼ
などである。主指標基が酵素例えばHRPOまたはグルコー
スオキシダーゼである場合に他の試薬が受容体−リガン
ド複合体（免疫反応体）の形成を可視化するために必要
である。HRPOのためのそのような添加試薬には過酸化水
素および酸化染料前駆物質例えばジアミノベンジジンが
含まれる。グルコースオキシダーゼで有用な添加試薬は
2,2′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンゾチアゾリン
−Ｇ−スルホン酸）（ABTS）である。 放射性元素もまた有用な標識剤であり、ここに例示的
に使用される。 放射性標識剤の適例はγ線放射を生ずる放射性元素で
ある。γ線を放射する元素例えば¹²⁴Ｉ、¹²⁵Ｉ、
¹²⁸Ｉ、¹³¹Ｉ、¹³²Ｉおよび⁵¹Ｃγは１種のγ線放射を
生ずる放射性元素指標基を代表する。殊に好ましいもの
は¹²⁵Ｉである。有用な指標基の他の群は¹¹Ｃ、¹⁸Ｆ、
¹⁵Ｏおよび¹³Ｎのような元素であり、それらは陽電子を
放出する。そのように放出された陽電子は動物体中に存
在する電子に遭遇するとγ線を生ずる。β−放出体例え
ば¹¹¹インジウムもまた有用である。 本発明の検定法および系は、従って固体マトリックス
に付着して固体支持体を形成する本発明の受容体を利用
しまたはそれを含むことができる。 抗原または受容体は典型的には水性媒質からの吸着に
より固体マトリックスに付着されるが、しかし当業者に
よく知られた若干の吸着の方式および他の付着の方式を
用いることができる。そのような方式の適例はブロモシ
アンと、グルコース含有マトリックス例えば架橋デキス
トロースまたはセルロース、グルタルアルデヒドとの反
応により生じた反応性カルボキシル官能性と受容体また
は抗原の反応、後にラテックス粒子などに関連して記載
する結合である。 有用な固体マトリックスはよく知られている。そのよ
うな物質はファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Phar
macia Fine Chemicals,Piscataway,NJ）から商標セファ
デックス（Sephadex）のもとで入手できる架橋デキスト
ラン；アガロース；アボット・ラボラトリーズ（Abbott
Laboratories,North Chicago,IL）から入手できる直径
約１μ〜約5mmのポリスチレンビーズのビーズ；ポリ塩
化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニ
トロセルロースまたはナイロンベースウエブ例えばシー
ト、ストリップまたはパドル；あるいは管、平板または
マイクロタイタープレート例えばポリスチレンまたはポ
リ塩化ビニルから作られたもの、の壁が含まれる。 凝集型検定に有用なラテックス粒子もまた有用な固体
マトリックスである。そのような物質は日本合成ゴム社
（Japan Synthetic Rubber Compnay,Tokyo Japan）によ
り供給され、アニオン石けん中に分散されたカルボキシ
官能性粒子として説明されている。そのような粒子の典
型的なロットは0.308ミクロン（μ）の平均直径を有
し、約15〜約30平方オングストローム毎カルボキシ基の
平均カルボキシ官能基分布を有する。 使用前に、粒子をジアミン例えば1,3−ジアミノ−２
−プロパノールと反応させて遊離アミン基を維持して粒
子のカルボキシル基と複数のアミド結合を形成する。遊
離アミンはその後ジアルデヒド例えばグルタルアルデヒ
ドおよび受容体または抗原と反応させてシッフ塩基反応
生成物を形成する。シッフ塩基反応生成物をその後水溶
性還元剤例えば水素化ホウ素ナトリウムで還元して有用
な固体支持体を与える。 当業者はここに使用できる固相免疫検定の多くの方法
があることを理解しよう。有用な固相検定の適例には酵
素多重免疫検定法（enzyme multiplied immunoassay te
chniques）（EMIT）および螢光免疫検定法（FIA）が、
特に論議したRIAおよびELISAに加えて含まれる。しかし
アポタンパク質Ｂ−100と本発明の受容体分子との検出
可能な反応を生ずる任意の方法は本発明の一部と考えら
れる。これらの検定法のそれぞれは指標手段を免疫反
応、それにより本発明の受容体で検定されるアポタンパ
ク質Ｂ−100の結合、をシグナルするのに利用される単
個または二重抗体法を用いることができる。技術の適例
はマギオ（Maggio）、「酵素免疫検定（Enzyme Immunoa
ssay）」、CRCプレス（CRC Press,Cleveland,OH）、（1
981）；およびゴルドマン（Goldman）、「螢光抗体法
（Fluorescent Antibody Methods）」、マカデミック・
プレス（Academic Press,New York,NY）（1980）中に説
明を見出すことができる。 本発明の固相付着受容体を用いて体液試料をアポＢ−
100について検定する特定方法の１態様は免疫反応を逐
次行なう非競合的ELISAである。そのような検定におい
て、MB47受容体のアリコート例えば約１〜約500μｇを
マイクロタイターウエルの内壁に付着させて固体支持体
を形成する。 準備した体試料中に存在するアポＢ−100を次いで固
相付着支持体と免疫反応させる。これは既知量例えば約
10〜約20マイクロリットル（ml）の試料（前希釈でき
る）例えば血清または血漿をマイクロタイターウエル中
で固相付着受容体と混合して固／液相混合物を形成する
ことにより行なわれる。混合物を生物学的検定条件下
に、試料中に存在するアポＢ−100が受容体分子に免疫
的に結合して固相免疫反応体を形成するのに十分な予定
時間維持する。固相および液相をその後分離し、固相
を、典型的には洗浄して非特異的結合物質の除去を保証
する。 固相免疫反応体として存在するアポＢ−100（すなわ
ち固相付着MB47受容体に結合したアポＢ−100）を次い
で酵素標識した第２受容体分子と免疫反応させる。これ
は水性緩衝溶液中の予定量例えば約0.1〜約10μｇの酵
素標識した第２受容体分子、好ましくは西洋ワサビペル
オキシダーゼ（HRPO）標識したMB24受容体を混合して第
２固体／液体混合物を形成することにより行なわれる。
第２混合物は前記のように維持し、従ってMB47受容体、
アポＢ−100および酵素標識したMB24受容体からなる固
体免疫反応体「サンドイッチ」を形成させる。 前記のように固相から液相を分離した後HRPOに対する
色原体基質、例えばｏ−フェニレンジアミン（OPD）の
アリコートを、固相免疫反応体を含むマイクロタイター
ウエル中で混合して第３の固体／液体混合物を形成す
る。この混合物を生物学的検定条件下に、免疫反応体と
して存在する酵素が比例量の基質を着色生成物に転化す
るのに十分な予定時間維持する。次いで生じた着色溶液
の光学濃度を測定し、既知量の試薬アポＢ−100を含む
溶液を用いて得た結果と比較する。 上記並びに物質および方法において一層詳細に記載す
る非競合的逐次的ELISAの、体液試料中のアポＢ−100を
検出する能力を試験した。この研究において、既知量の
試薬アポＢ−100を混合したリポタンパク質除去ヒト血
漿（LDP）のアリコートを対照体液試料として用いた。 その研究の結果は表１に示され、上記方法が体液試料
中に存在するアポＢ−100の臨床関連量を正確に検定で
きることを示す。 1.臨床的に低、正常および高、アポタンパク質Ｂ−100
含有対照溶液はジョンソン・アンド・ジョンソン・バイ
オテクノロジー・センター社（Johnson ＆ Johnson Bio
technology Center,Inc.,La Jolla,CA）（Ｂ）およびタ
ゴ社（Tago,Inc,Burlingame,CA）（Ｔ）から入手した。
血漿試料は臨床的に正常な個人から入手し（１または２
文字呼称およびC1〜C4）、プールはそのような10試料の
混合物を示す。 2.試料に加えた全タンパク質により決定した実際のアポ
タンパク質Ｂ−100濃度、表に示した濃度はすべてmg/dl
の単位である。 3.後期参照検定（Ref.）を用いて測定したアポタンパク
質Ｂ−100の濃度。値は３標準偏差範囲として示され
る。 4.前記のように非競合的逐次的ELISAにおいて固相付着M
B47受容体およびHRPO標識MB24受容体を用いて得たアポ
タンパク質Ｂ−100濃度（平均±３標準偏差） 5.初めに固相免疫反応体を形成して逐次免疫反応を行な
った非競合的ELISAにおいて固相付着MB24受容体およびH
RPO標識B18受容体〔カーチス（Curtiss）ほか、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）、257、15213〜15221（1982）〕を用いて得たア
ポタンパク質Ｂ−100濃度（行なった場合に繰返値が示
されている）。 体液試料をアポＢ−100について検定する特定方法の
他の態様は免疫反応を実質的に同時に行なう非競合的EL
ISAである。固相付着MB47受容体を含む前記マイクロタ
イターウエルに、準備した体試料および第２アポＢ−10
0エピトープと免疫反応し、アポＢ−100に対するMB47受
容体の結合を実質的に抑制しない酵素標識した第２受容
体を実質的に同時に混合する。そのような酵素標識第２
受容体は好ましくはMB24受容体である。 生じた固体／液体混合物を次に維持し、分離し、固相
結合免疫反応体サンドイッチの部分として存在する酵素
の量を前記のように測定する。 上記非競合的ELISAを用いて冠動脈疾患（CAD）を有す
る20患者、家族性コレステロール過剰血症を有する20患
者および20正常被験者の血漿のアポＢ−100含量を試験
した。表２に示すように、正常被験者の平均血漿アポＢ
−100濃度は85ミリグラム／デシリットル（mg/dl）で±
21mg/dlの２標準偏差範囲であると測定された。この値
はカーリ（Curry）ほか、クリニカル・ケミストリー（C
lin.Chem.），24、280〜286（1987）およびロセニュ（R
osseneu）ほか、クリニカル・ケミストリー（Clin.Che
m.），28、427〜433（1983）による各異なる免疫検定を
用いて報告されたアポＢ値の正常範囲と非常に一致す
る。 さらにCADおよびコレステロール過剰血症を有する患
者中の血漿アポＢ−100濃度は正常に対して認められた
２標準偏差範囲の上限より高かった。CADおよびコレス
テロール過剰血症患者に対し他の技術を用いた類似の結
果はスナイダーマン（Sniderman）ほか、プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、77、604〜608
（1980）およびリピド・リサーチ・カウンシル（Lipid
Research Council）、JAMA251;351〜364（1984）により
報告された。 1.被験者は20正常脂肪血、健康対照（正常）；心カテー
テル法により規定された冠動脈疾患を有する20被験者
（CAD）；および家族性コレステロール過剰血症を有す
る20被験者（FH）を含む。 2.示した値は平均±平均からの２標準偏差（±SD）であ
り、mg/dlの単位である。 3.全コレステロール。 4.HDLとして存在するコレステロール。 5.LDLとして存在するコレステロール。 6.物質および方法において記載する競合的（Compet）EL
ISAにより測定したアポＢ−100濃度。 7.固相付着MB47受容体およびHRPO標識MB24受容体を用
い、試料および受容体を実質的に同時に混合した非競合
的（Non−Compet）ELISAにより測定したアポＢ−100濃
度。 8.タゴ社（Tago,Inc,Burlingame,CA）から入手できる放
射免疫拡散キットモデルDiffu−gen RIDを用いて測定し
たアポＢ濃度。 9.カルビオケム−ベーリング（Calbiochem−Behring,La
Jolla,CA）から入手できる放射免疫拡散キットモデル
Ｍ−Partigen RIAを用いて測定したアポＢ濃度。 非競合的同時ELISAによるアポＢ−100について検定す
る前の体液試料の希釈効果もまた試験した。この結果は
表３に示され、５倍の範囲の血漿希釈、すなわち1:1,00
0〜1:5,000、にわたって測定したアポＢ−100濃度に有
意な差異がなかったことを示す。 1.血漿アポＢ−100濃度、mg/dl単位。 2.3希釈すべてに対する平均血漿アポＢ−100濃度。 3.1標準偏差。 4.種々の希釈に対して得られた結果間のパーセント変動
係数（coefficient of variance）。 上記正常および患者試料に対するLDLコレステロール
と非競合的ELISAにより測定したアポＢ−100濃度との間
の相関が第７図に示される。0.89の相関係数はアルバー
ス（Albers）ほか、メタボリズム（Metabolism），24,1
339〜1351（1975）およびスレーター（Slater）ほか、
クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.），31,841〜84
5（1985）により報告された値に類似する。 固体マトリックスに付着した試薬アポＢ−100を含む
固体支持体を用いる本発明の検定法の態様は次の段階を
用いて行なわれる： （ａ）アポＢ−100を含む体液試料を前記のように準備
する段階。 （ｂ）（ｉ）体液試料、 （ii）予定量のMB24またはMB47受容体分子、および （iii）予定量の固相付着試薬アポＢ−100、を実質的に
同時に混合して液／固相免疫反応混合物を形成する段
階。 混合物を生物学的検定条件下に、受容体分子の抗体結
合部位が試薬アポＢ−100または体液試料中に存在する
アポＢ−100と免疫反応（免疫的に結合）するのに十分
な予定時間維持する。体試料中に存在するアポＢ−100
を免疫的に結合する受容体分子が液相免疫反応体を形成
し、固相付着試薬アポＢ−100を結合するものは固相免
疫反応体を形成する。 （ｃ）次いで固相付着免疫反応体の存在を検定し、それ
により試料中に存在するアポＢ−100の量を後記のよう
に同様の固相付着アポＢ−100と混合した既知量のMB47
またはMB24により示される結合の量の比較により決定す
る段階。好ましくは免疫反応体の検定は段階（ｂ）の液
相および固相を、例えば洗浄により分離した後行なわれ
る。液相免疫反応体として結合した試料アポＢ−100の
量は本発明の受容体分子と免疫反応する標識した抗体例
えばペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgの使用によ
り、または記載した他の方法により測定することができ
る。 競合的検定の殊に好ましい態様において、約１〜約10
μｇの試薬アポＢ−100を固体マトリックス、好ましく
はマイクロタイターウエル、に付着させて固体支持体を
形成する。固体支持体上の非特異的結合部位は典型的に
はタンパク質例えばBSAなどでブロックする。 予定量例えば一般に約0.1〜約10μｇの本発明の受容
体分子を固相付着試薬Ｂ−100および体液試料（希釈す
ることができる）例えば血清または血漿、中に存在する
アポＢ−100と実質的に同時に免疫反応させる。これは
試料のアリコートおよび受容体分子を、固相付着試薬ア
ポＢ−100を含むマイクロタイターウエル中で実質的に
同時に混合することにより行なわれる。 形成された固体／液体混合物を生物学的検定条件下
に、存在する受容体分子が、存在するアポＢ−100を免
疫的に結合する十分な時間維持する。固相および液相
を、好ましくはその後例えば洗浄により分離し、典型的
には固相を洗浄して非特異的結合物質の除去の保証を援
助する。 次いで固相付着免疫反応体の存在を、典型的には本発
明の受容体分子を免疫的に結合する標識した抗体例えば
ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgGの使用により検
定する。 競合的ELISAにおいて、患者試料中に存在するアポＢ
−100は一定の既知量の試薬アポＢ−100と免疫反応混合
物中の一定既知数の受容体分子抗体結合部位に対して競
合する。試料アポＢ−100により与えられる競合は検出
可能固相付着免疫反応体の低下を生じ、低下が大きいほ
ど調査下の体試料中に存在するアポＢ−100の量が大き
い。 患者血漿中に存在するアポＢ−100の相対量を得るた
めに、患者血漿中に存在するアポＢ−100を競合相手と
して用いて得た結果を既知量の試薬アポＢ−100を含む
競合標準を用いて得た結果と比較した。32〜0.25mg/ml
（320〜2.5mg/dl）のLDL濃度範囲を用いて標準曲線を調
製した。 上記競合的ELISAを用いて非競合的ELISAにより評価し
た同一正常および患者試料を試験した。これらの結果は
また、表２に示され、非競合的検定により得られた結果
と非常に一致する。 上記競合的ELISAにおいてアポＢを検定する前の体液
試料の希釈効果を試験した。この結果は表４に示され、
４倍の範囲、すなわち1:100〜1:400、の血漿希釈にわた
って測定したアポＢ濃度に有意な差異を示さない。 1.血漿アポＢ−100濃度、mg/dl単位。 2.3希釈すべてに対する平均血漿アポＢ−100濃度。 3.1標準偏差。 4.種々の希釈に対して得られた結果間のパーセント変動
係数。 LDLコレステロールと、上記正常および患者試料に対
する競合的ELISAにより測定された血漿アポＢ濃度との
間の相関が第８図に示される。0.92の相関係数はアルバ
ース（Albers）ほか、メタボリズム（Metabolism），2
4,1339〜1351（1975）およびスレーター（Slater）ほ
か、クリニカル・ケミストリー（Clin.Chem.），31,841
〜845（1985）により報告された値に類似し、従って競
合的ELISAが循環LDLコレステロール濃度を正確に予示す
ることを示す。 競合的および非競合的ELISAを用いて得られたアポＢ
−100濃度間の相関を調べた。第９図に示されるよう
に、各検定で得られた結果間に高い相関（γ＝0.92）が
あった。 上記検定法の実施に有用な、好ましくはキット形態
の、診断装置は、個々のパッケージ中に（ａ）試薬が
（ｉ）アポＢ−100と免疫反応する、かつ（ii）ハイブ
リドーマHB8746により分泌された受容体（MB47）または
ハイブリドーマHB8742により分泌された受容体（MB24）
から選ばれる第１特異的結合剤、および（ｂ）前記第１
結合剤とアポＢ−100との免疫反応をシグナルする標識
した第２特異的結合剤を含む。好ましくは標識した特異
的結合剤は酵素に結合した受容体である。より好ましく
は標識した結合剤は酵素に結合した上記（ａ）のいずれ
かの残りの受容体である。 好ましい態様において、装置はさらに、対照および
（または）標的抗原として用いる試薬アポＢ−100の他
の容器を含む。装置が、第１特異的結合剤または試薬ア
ポＢ−100が付着して固体支持体を形成する固体マトリ
クッスを含む態様もまた好ましい。有用な固体マトリッ
クスは既に記載したとおりである。しかし、好ましくは
固体マトリックスはマイクロタイタープレートのウエル
である。 既知量の特異的結合剤が提供される。これらの量は少
くとも１回の検定の実施に十分である。提供される特異
的結合剤は典型的には水、食塩水または緩衝液例えばpH
7.3〜7.5のリン酸塩緩衝食塩水で前記容積に希釈するよ
うに設計した形態および量で供給される。 他のパッケージもまた装置に含むことができる。その
ようなパッケージは（ｉ）乾燥または液体形態の緩衝
塩、（ii）酵素基質例えばｏ−フェニレンジアミンなど
を含むことができる。 パッケージの適例にはガラスおよびプラスチック例え
ばポリエチレンおよびポリプロピレンボトルまたはバイ
アル；プラスチック、プラスチック−金属箔、プラスチ
ック−金属箔−紙外被などが含まれる。特異的結合剤は
腹水または緩衝液中のような水性液体形態でパッケージ
することができるが、しかし好ましくは、それらは乾燥
形態例えば凍結乾燥により提供される形態で供給され
る。 D.アフィニティー吸着剤 本発明はまた固体マトリックスに付着して固体支持体
を形成する本発明の生物活性受容体を含む、好ましくは
無菌の、アフィニティー吸着剤を意図する。固体マトリ
ックスは好ましくは粒状形態である。そのようなアフィ
ニティー吸着剤はコレステロール過剰血症を患う患者の
血漿から免疫吸着によりアポタンパク質Ｂ−100含有リ
ポタンパク質（VLDLおよびLDL）を特異的に除去するの
に有用である。 固体支持体は広範な物質例えば架橋デキストラン例え
ばファルマシア・ファイン・ケミカラズ（Pharmacia Fi
ne Chemicals,Piscataway,N.J.）から入手できるセファ
デックスＧ−25、−50、−100、−200など、アガロース
および架橋アガロース例えばファルマシア・ファイン・
ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）から入手でき
るセファロース（Sepharose）6B、CL6B、4B、CL4Bな
ど、またはバイオ−ラド・ラボラトリーズ（Bio−Rad L
aboratories,Richmond,CA）から入手できるバイオ−ゲ
ル（Bio−Gel）Ａ−0.5M、Ａ−1.5M、Ａ−50Mなど、あ
るいはポリアクリルアミドビーズ、例えばバイオ−ラド
・ラボラトリーズ（Bio−Rad Laboratories）から入手
できるバイオ−ゲルＰ−２、Ｐ−30、Ｐ−100、Ｐ−300
など、であることができる。アガロースおよび架橋アガ
ロース物質はその高い多孔性および低い非特異的結合性
のために好ましく、例示的に固体マトリックスとして使
用される。 受容体および固体マトリックスの滅菌は典型的には結
合前に行なわれる。生物活性を維持するために受容体を
通常濾過により、例えば0.22μニトロセルロースフィル
ターを通すことにより滅菌される。マトリックスの滅菌
はよく知られているように、マトリックスの型による。
例えばセファロースはオートクレーブにより滅菌できな
いが、しかしそれは化学的に例えばジエチルピロカルボ
ネートで処理することにより滅菌することができる。一
方、架橋セファロースはpH7、120℃で20分間オートクレ
ーブにかけることにより滅菌することができる。 セファデックスまたはセファロースマトリックスは典
型的にはよく知られた方法によりブロモシアンを用いて
結合に対し活性化する。次いで活性化したマトリックス
を洗浄し、アポＢ−100と免疫反応しハイブリドーマHB8
746またはハイブリドーマHB8742により泌される受容体
に結合させる。マトリックスに結合した受容体は次いで
洗浄して使用準備が終る。支持体上の反応しなかった反
応性基は、望むならばアミン例えばエタノールアミンま
たはトリスと反応させることができる。 アフィニティー吸着剤はそのゆるい状態で使用できる
が、好ましくはカラム中に収容される。次いでアポＢ−
100を含む患者の血漿をアフィニティー吸着剤と混合し
て免疫反応混合物を形成する。混合物を生物学的検定条
件下に、固体マトリックス付着受容体が血漿中に存在す
るアポＢ−100を免疫的に結合して固体マトリックス付
着免疫反応体を形成するのに十分な時間維持する。次い
で血漿を固体マトリックス付着免疫反応体から分離す
る。次いで生じたアポＢ−100（LDLおよびVLDL）除去血
漿を、それを初めに得た患者に導入することができる。 アフィニティー吸着剤の調製および血漿からアポリポ
タンパク質Ｂ含有リポタンパク質の除去に使用すること
はストフエル（Stoffel）ほか、プロシーディングズ・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA,78,611〜615（1981）に記
載され、それは参照により加入される。実質的に純粋な
MB47受容体をCNB4活性化したセファロース4Bに結合する
ことにより調製したアフィニティー吸着剤カラムはLDL3
mg毎固体支持体mlを免疫吸着（結合）すると認められ
た。 II.物質および方法 Ａ ヒトリポタンパク質の調製 ヒトリポタンパク質画分は遠心分離により次の密度に
分離した:VLDL,1.006g/ml未満の密度（ｄ）;LDL,1.025
〜1.050g/mlに等しいd;HDL,1.070〜1.21g/mlに等しいd;
およびLDS,1.21g/mlに等しいｄ。若干の場合に、ヒトLD
Lはまた1.019〜1.063g/mlまはた1.045〜1.065g/mlで分
離された。血漿および各画分のタンパク質濃度はマーク
ウエル（Markwell）ほか、アナリティカル・バイオケミ
ストリー（Anal.Biochem.），87,206〜210（1978）によ
り改良されたローリー（Lowry）法〔ローリー（Lowry）
ほか、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー（J.Biol.Chem.），193,265〜275（1951）〕によりBS
A標準を用いて測定した。 各LDLおよびVLDL画分に対するアポＢ含量の評価はま
たケーン（Kane）ほか、ジャーナル・オブ・クリニカル
・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.），56,162
2〜1634（1975）〕の方法を用いるテトラメチル尿素（T
MU）またはイクサ（Iqusa）ほか、ジャーナル・オブ・
リピド・リサーチ（J.Lipid.Res.），24,1261〜1267（1
983）の方法に従うイソプロピルアルコールでアポＢを
沈殿させることにより行なった。 新空腹時ヒト血清は正常健康供血者からプラズマフェ
レシスにより得、0.1％EDTA（s/v）に調整した。他に記
載しなければ３名またはそれ以上の供血者から作ったプ
ールを用いた。リポタンパク質は密度（ｄ）調整のため
に固体KBrを用いて血漿の逐次遠心分離により分離し
た。リポタンパク質画分にはVLDL,1.006g/ml未満のd;ID
L,d＝1.006〜1.019g/ml;LDL,d＝1.019〜1.063g/ml;およ
びHDL,d＝1.063〜1.25g/ml、が含まれた。 リポタンパク質除去血清を含むボトム画分（ｄが1.25
g/mlより大）もまた捕集した。 画分は0.15M−Nacl、0.3mM−EDTA、0.0005％α−トコ
フェロールを含むpH値7.4のリポタンパク質緩衝液に対
して完全に透析した。 キロミクロン画分は非空腹時プール血漿のVLDL画分か
ら４℃で40分間120,000xgにおける超遠心分離でリポタ
ンパク質緩衝液を通してキロミクロンを浮上させること
により分離した。 リポタンパク質はすべて濾過滅菌し、４℃で20日を超
えることなく貯蔵した。リポタンパク質はBSA標準を用
いてローリー（Lowry），ジャーナル・オブ・バイオロ
ジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），193,265〜275
（1951）の方法の変形によりタンパク質含量について分
析した。リポタンパク質濃度はすべてタンパク質を基に
して示される。 各リポタンパク質クラスのアポタンパク質組成はSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価した。キ
ロミクロンはアポタンパク質Ｂ、ＥおよびＣの検出可能
量を含有したが、VLDLはアポタンパク質Ｂ、Ｅ、Ｃおよ
び痕跡量のアポタンパク質Ａ−Ｉを含有した。 IDLはアポタンパク質Ｂ、ＥおよびＣを含有したが、L
DLはアポタンパク質Ｂのみを含有した。HDLはアポタン
パク質AI、AIIおよびＣを含有した。 これらの研究の過程中、リポタンパク質調製物は終始
アポタンパク質組成を示した。アポタンパク質の可能な
タンパク質加水分解を制御するために、選んだ血漿プー
ルを分離し、1mg/mlゲンタマイシン硫酸塩、0.2％アジ
化ナトリウム、および/mMベンズアミジン、10mMフルオ
ロリン酸ジイソプロピル、10μg/mlダイズトリプシン阻
害因子の存在下に貯蔵した。 超遠心分離の直後および３週間までの貯蔵後のこれら
のリポタンパク質並びに抗生物質およびプロテアーゼ阻
害因子の存在なく分離したもののSDS−PAGEアポタンパ
ク質染色パターンを比較してタンパク質加水分解の証拠
が示されなかった。用いた調製物はすべて滅菌であっ
た。 B.ハイブリドーマの生成および培養 プールした血漿から分離した無傷自然リポタンパク質
を免疫処置に用いた。４〜５週令のBalb/cマウスを完全
フロインドアジュバント中の50μｇのリポタンパク質で
腹腔内に免疫処置した。リポタンパク質50μｇの二次静
脈内注入は第28〜33日に行なった。最後の注入72時間後
に、免疫処置マウスから脾臓を取出し、単個細胞浮遊液
をHT培地中に調製した。血液もまた捕集し、血清を各免
疫検定の陽性対照として用いた。 0.1mMアザグアニンを含む完全TH培地〔ケネット（Ken
net）ほか、カーレント・トピックス・イン・マイクロ
バイオロジー・アンド・イムノロジー（Curr.Top.Micro
biol.Immunol.），81,77〜91（1978）、これは参照によ
り加入される〕中の静置培養中、マウス骨髄腫細胞系を
対数期増殖に維持した。融合は30％（v/v）ポリエチレ
ングリコール1000〔シグマ（Sigma,St.Louis,MO）製〕
の存在下に10:1の免疫脾細胞とP3x63Ag8との比で行なっ
た。融合３日後、0.1mMアミノプテリンを含むHT培地中
１×10⁵生細胞／ウエルで96ウエル組織培養平板中で細
胞を培養した。 融合後７日およびその後必要に応じて約４〜５日の間
隔で細胞にHT培地を供給した。増殖を検鏡し、固相RIA
による抗原特異性抗体生成の検定のために培養上澄みを
第14日に捕集した。特異性抗体生成ハイブリドーマを融
合19〜47日後Balb/c脾臓支持細胞の存在下に限界希釈に
よりクローン化し、単個コロニーを含むウエル中のハイ
ブリドーマを10日後固相RIAにより抗体生成についてス
クリーニングした。クローン化ハイブリドーマを10％仔
ウシ血清を含む培地中で培養し、液体窒素中に凍結貯蔵
した。 C.LDL結合、インターナリゼーションおよび分解の抑制 ヒト線維芽細胞による¹²⁵Ｉ−LDLの結合、インターナ
リゼーションおよび分解の抑制に対する抗アポＢ−100
受容体の能力を次の方法で評価した。LDLをビルハイマ
ー（Bilheimer）ほか、ジャーナル・オブ・クリニカル
・インベスティゲーション（J.Clin.Invest.），56,142
0〜1430（1975）の一塩化ヨウ素法を用いて¹²⁵Ｉ（比活
性200cpm/ng）でヨウ素化した。 抗体−LDL相互作用を可能にするため各ハイブリドー
マ上澄み0.1mlを¹²⁵Ｉ−LDL（最終濃度2.5mg/ml）とと
もに、2.5mg/mlリポタンパク質欠失血清（LDS）を含む
ダルベッコ最少必須培地（DME）0.4ml中で４℃で12時間
インキュベート（混合および維持）した。次いで個々に
インキュベートした混合物を直径10mmのウエル中の10％
ウシ胎仔血清（FCS）を有するDME中で成長させたヒト包
皮線維芽細胞単層に継代した。これらの細胞のLDL受容
体はこれらの細胞の2.5mg/mlを含むDME中の24時間の前
インキュベーションにより最大限に発現された。 上澄みおよび線維芽細胞の37℃における６時間の個々
のインキュベーション後、¹²⁵Ｉ−LDLの細胞分解をドレ
フォン（Drevon）ほか、ジャーナル・オブ・リピド・リ
サーチ（J.Lipid Res.），22,37〜46（1981）の方法に
より評価した。対照培養は¹²⁵Ｉ−LDLを含むDME0.4mlお
よび、（ａ）20％ウシ胎仔血清を含む新ハイブリドーマ
培地0.1mlまたは（ｂ）アポＢ特異的抗体生成に陰性で
あったハイブリドーマコロニーのウエルからのハイブリ
ドーマ培地0.1ml;（ｃ）2.5mg/mlLDSを含むDME0.1ml;あ
るいは（ｄ）非標識LDL0.1ml（培地中の最終非標識LDL
濃度を500μｇ毎mlにする）の１つを有した。 D.抗LDL免疫グロブリンの分離 本発明の受容体を含む腹水は鉱油0.3mlで感作し３〜5
0×10⁵ハイブリドーマ細胞を腹腔内注入した10週令Bolb
/cマウスから得た。腹水の生ずる平均時間は12日であっ
た。４℃において１時間15,000xgで遠心分離することに
より透明にした後腹水をプールし、−20℃で凍結貯蔵し
た。 分離した抗体MB47はプロティンＡ−セファロース4Bカ
ラム〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmaci
a Fine Chemicals,Piscataway,New Jersey）製〕上の単
クローン性ハイブリドーマ腹水のクロマトグラフィーに
より調製した。抗体は0.1モル（Ｍ）酢酸でカラムから
溶出させた。 分離した受容体はまた10mMトリス、pH8.0中のカラム
供給方向に従う０〜0.5M−Nacl勾配を用いるファルマシ
ア（Pharmacia）FPLC系におけるファルマシアMono Q HR
5/5アニオン交換カラム上の単クローン性ハイブリドー
マ腹水の迅速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPL
C）により調製した。 E.ハイブリドーマ抗体の確認 各プールの腹水の全ガンマグロブリン（Ig）含量は75
mMベロナール緩衝液中8.6のpH値で200ミリボルト（mV）
で45分間の酢酸セルロースストリップの１〜3ml試料の
電気泳動により得た。Igであった全タンパク質の百分率
はポンソー（Ponceau）Ｓ−染色ゲルのデンシトメータ
ースキャンにより定量し、全タンパク質は前記改良ロー
リー（Lowry）法により測定した。 マウスIg重鎖および軽鎖は0.9％アガロース中の二重
拡散により確認した。適当希釈度の腹水10μｌを等容積
の適当に希釈したウサギ抗マウス重鎖および軽鎖特異的
抗血清〔リットン・バイオネティクス（Litton Bioneti
cs）製〕と反応させた。20℃で約15時間拡散し洗浄した
後沈降素線を0.5％クーマシーブリリアントブルーＲ−2
50による染色により確認した。 各単クローン性抗体の等電点プロフィルは５〜８、
（LKB）のpH範囲内で10％ソルビトール、２％アンホラ
インを含む0.8％アガロース（EF802−300LKB）中で腹水
の0.01ml試料を３ワット定力で150分間の等電電気泳動
により得た。固定し、乾燥した後、ゲルをクーマシーブ
リリアントブルーで染色し、写真を撮った。 （１）ウエスターンブロッティング アポタンパク質は垂直スラブゲル装置（14×12×0.15
cm）〔ヘーファー・サイエンティフィック・インストル
メンツ（Hoeffer Scientific Instruments,San Francis
co,CA）製〕中のリポタンパク質のドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
により分離した。ゲルはpH値8.6で25mMトリス−グリシ
ン緩衝液を用いて調製した。上部スタッキングゲルは１
％SDS、３％アクリルアミドを含み、下部ランニングゲ
ルは１％SDSを含む３〜20％または３〜６％アクリルア
ミド勾配であった。リポタンパク質は１％ドデシル硫酸
ナトリウム、10mMトリスおよび0.24mM−EDTAを含む電気
泳動試料緩衝液中３分間煮沸により脱脂した。分子量マ
ーカーおよびそのそれぞれの見掛け相対分子質量は；フ
イブリノーゲン,340,000;IgG,140,000;アルブミン,69,0
00;オボアルブミン,43,000;ダイズトリプシン阻害因子2
0,500;およびリゾチーム14,300であった。ゲルは約18時
間13.5ミリアンペア（mA）定電流で電気泳動した。 ゲルは蒸留水中で10分間次いで20％（v/v）メタノー
ルを含む25mMトリス、192mMグリシン、pH8.3、中で10分
間洗浄した。ニトロセルロース（0.45micro,ミリポア社
（Millipore Corp.）製〕への転移は400mAで１時間の電
気泳動により行なった。ニトロセルロース上の残余の活
性結合部位は３％BSA、３％正常ヤギ血清、0.01％アジ
化ナトリウムを含むPBS（ブロッキング溶液）中の一夜
浸漬により飽和させた。 固定化ゲルまたはニトロセルローズ転移体は４℃で18
時間、３％BSA、３％正常ヤギ血清、0.05％ツイーン20
〔ポリオキシエチレン（20）モノラウラート〕を含むPB
S中に適当に希釈した免疫マウス血清または腹水ととも
にインキュベートした。洗浄を繰返した後、抗体結合を
同一緩衝液中の¹²⁵Ｉヤギ抗免疫Ig（0.5マイクロ（i/m
l）とともに４℃における第２の４時間インキュベーシ
ョンを行ない次いで再び多数回洗浄することにより検出
した。 ニトロセルロースに対する非特異的結合は第１および
第２抗体とのインキュベーション後の３％BSA、0.05％
ツイーン20を含むPBS中、次いで0.1％SDSを含む0.5M−L
icl中の洗浄により著しく低下した。 ゲルまたはニトロセルロース転移体は乾燥し、−20℃
でオートラジオグラフィー〔Ｘ−Omat、イーストマン・
コダック（Eastman Kodak）製〕により分析した。適当
な場合にはメリル（Merril）ほか、プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA,76,4335〜4339（1979）
により記載されたようにゲルを50％トリクロロ酢酸中の
0.1％クーマシーブリリアントブルーＲ−250、またはシ
ルバーステイン〔バイオ・ラド〕（Bio−Rad）〕で染色
した。 F.Fabフラグメントの調製 分離した受容体分子抗体のFabフラグメントはパパイ
ンによる消化により形成した。抗体Fc部分および非消化
抗体はプロティンＡ−セファロース4Bカラムの通過によ
り除去した。FabフラグメントのSDS−PAGEは25,000およ
び40,000ドルトンの２つの分離したバンドに示した。Fa
bフラグメントの免疫反応性は固相RIA中のLDLに対する
特異的結合により実証された〔ミルン（Milne）ほか、
アルテリオスクレロシス（Arteriosclerosis），3,23〜
30（1983）〕。 G.放射免疫検定（RIA） （１）液相¹²⁵Ｉ標識抗原RIA MB47およびMB24により結合された¹²⁵Ｉ−LDL粒子の画
分の測定に液相RIAを用いた〔カーチスほか（Curtiss a
nd Edgington），ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー（J.Biol.Chem.），25,15213〜15221（198
2）〕。10正常被験者のプール血漿から分離したものお
よび１正常被験者の血漿から分離したものの２つの異な
るLDL（ｄ＝1.019〜1.063g/ml）調製物を調べた。ヨー
ドゲン（Jodogen）〔ピアス・ケミカル社（Pierce Chem
ical Co.,Rockford,IL））法を用いて調製した¹²⁵Ｉ−L
DL（2,000cpm/ng）は90％トリクロロ酢酸（TCA）沈降性
であった。それを９％ウシ血清アルブミン（BSA）〔シ
グマ（Sigma,St.Louis,MO）製〕中に希釈し、各検定前
に15分間30,000xgで遠心分離して複合体物質を除いた。
検定は３重に12×75mmガラス管中、150mM−Nacl、0.02
％アジ化ナトリウム、３％BSAおよび1.5mMナトリウムED
TAを含むpH値８の55mMバルビタールナトリウム緩衝液中
で行なった。¹²⁵Ｉ−LDL0.1ml（20ngLDLタンパク質を含
む）0.1mlに、緩衝液または競合抗原0.1mlおよびBSA−
バルビタール緩衝液中に希釈した増加濃度の分離MB47受
容体0.1mlを加えた。４℃で18時間後にIg SORB〔ジ・エ
ンザイム社（The Enzyme Co.,Boston,MA）製〕0.1mlを
混合した。２時間維持した後BSAを含まないバルビター
ル緩衝液2mlを加え、直ちに管を1,500xgで60分間遠心分
離した。沈殿を２回バルビタール緩衝液で洗浄した。Ig
SORBを100％TCAで置換することにより最大沈降性放射
能を測定した。最小沈降性放射能はMB47受容体の存在な
く測定した。次いで結合した¹²⁵Ｉ−LDL百分率を計算し
た。 （２）液相¹²⁵Ｉ標識受容体RIA 免疫精製により分離した無傷抗体MB47受容体をヨード
ゲン（比活性3,000cpm/ng）〔ピアス（Pierce）〕法を
用いて¹²⁵Ｉでヨウ素化した。PBSに対して広範透析した
後放射能の95％以上が10％TCAにより沈殿できた。¹²⁵Ｉ
−MB47の98％以上がヒトLDLアフィニティーカラムに結
合した。検定は３重に、10×75mmシリコーン被覆ガラス
管中で行なった。BSA−バルビタール緩衝液0.1ml中の増
加濃度の¹²⁵Ｉ−MB47を、BSA−バルビタール緩衝液0.2m
l中に希釈した100ngのプールした正常ヒトLDLに加え
た。各管はLDLアポB182fmol（アポＢ分子量を550,000ド
ルトンと仮定）を含有した。４℃で16時間維持した後、
LDLをヒトLDLに特異性のリポタンパク質除去ウサギ抗血
清により定量的に沈殿させた（抗体MB47がウサギアポＢ
に結合するのでウサギ抗血清の1.21g/mlより大きい密度
の画分のみを用いた）。 予備試験で100ngの¹²⁵ＩヒトLDLの97％を沈殿する除
去ウサギ抗血清の濃度を決定した。ウサギ抗体の混合
液、管を４℃で16時間維持し、次いで４℃で50分間15,0
00xgで回転した。上澄みを除去し、ペレットを２回氷冷
バルビタール緩衝液2mlで洗浄した。非特異的結合およ
び濃縮度は２組の並行管中で測定した。 第１組において初期インキュベーションにヒトLDLを
加えないで同量のウサギ第２抗体を加えた。第２組の管
には非免疫ウサギ抗血清（1.21g/mlに等しいかまたはそ
れより大きい密度の画分）を免疫ウサギ血清抗体の代り
に用いた。 両方法は非特異的結合に対して等しい値を生じ、それ
は¹²⁵Ｉ−MB47抗体の濃度の増加と直線的であり、すべ
ての場合に加えた全カウント数の１％未満であった。LD
Lに対する¹²⁵Ｉ−MB47の結合は全結合から非特異的結合
を差引くことにより得た。結合データはリガンド結合系
のスキャッチャード分析に対する線形回帰プログラムを
用いて分析し、抗体アフィニティー定数（Ka）および受
容体またはエピトープ濃度の評価を与えた〔ムンソン
（Munson）ほか、アナリティカル・バイオケミストリー
（Anal.Biochem.），107,220〜239（1980）〕。 （３）固相付着抗原RIA ハイブリドーマ培養が本発明の受容体を生成したかど
うかを決定するスクリーニング検定は個体マトリックス
として軟質丸底ポリ塩化ビニルマイクロタイタープレー
ト〔ダイナテク社（Dynatech Inc.,Aexandria,VA）製〕
中で行なった。リポタンパク質緩衝液中のリポタンパク
質0.05mlを混合し、プレートを室温で３時間インキュベ
ートして一定最終結合抗原濃度および固体支持体を与え
ることにより、リポタンパク質抗原（試薬アポＢ−10
0）をマイクロタイタープレートウエルの内壁に付着
（結合）させた。放射性ヨウ素化リポタンパク質を用い
た予備直接結合研究は各リポタンパク質がプラスチック
マイクロタイターウエルに結合した効率に有意な差異が
あることを示した。従って、50ngタンパク質／ウエルの
最終結合抗原濃度を達成するためにVLDLは50μg/mlで、
LDLは6.2μg/mlで、LDLは4.4μg/mlで、およびHDLは24
μg/mlで用いた。次いで各ウエル中にブロッキング溶液
0.25mlを混合し、混合物を１時間維持し、次いでブロッ
キング溶液をウエルから分離することにより非特異的結
合部位をブロックし、それにより低い非特異的結合能力
を有する固体支持体を形成した。 検定のために３％BSA、３％正常ヤギ血清および0.05
％ツイーン20〔ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモ
ノラウラート〕を含むPBS中に希釈した0.05mlの抗血
清、培養上澄みまたは腹水をウエル中に混合して固／液
相免疫反応混合物を形成した。次いで混合物を４℃で18
時間維持（免疫反応）した。 ３％BSAおよび0.05％ツイーン20を含むPBSでウエルを
洗浄して非結合物質を除去した後、直接検定のために各
ウエルに免疫化学的に精製し放射性ヨウ素化したヤギ抗
マウスIg10mgを混合して第２回／液相混合物を形成する
ことにより固相結合受容体を調製した。この混合物を４
℃で４時間維持して標識した第２受容体を固相結合第１
受容体に結合させてサンドイッチ免疫反応体を形成させ
た。 非結合標識受容体を除くための最終洗浄後、個々のウ
エルを取出し、¹²⁵Ｉについて計数した、検出された¹²⁵
Ｉの量は固相反応体として結合した第１受容体の量に正
比例する。 免疫化学的に精製した第２抗体は固定化ラクトペルオ
キシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ〔エンジモビ
ーズ（Enzymobeads）、バイオーラド（Bio−Rod,Burlin
game,CA）製〕を用いて３〜４マイクロCi/マイクログラ
ムの比活性に酵素的に放射性ヨウ素化した。 （４）競合的固相付着受容体RIA ヒトアポＢに対する競合的固相放射免疫検定（RIA）
は抗体MB47を用いて行なった。ポリ塩化ビニルウエル
を、PBS、pH7.35、中に10μg/mlに希釈したヒトLDL（試
薬アポＢ−100）0.5mlで覆い、37℃で２時間維持した。
非特異的結合部位をPBS中の５％BSAで室温で30分間覆う
ことによりブロックした。次いでプレートをさらに0.1
％BSA、0.01％アジ化ナトリウムおよび0.05％ツイーン2
0を含むPBS洗浄緩衝液で洗浄した。 プールした正常血漿から調製した新ヒトLDLを0.4〜9
7.2μg/mlの範囲の希釈で標準曲線のための試薬アポＢ
−100として用いた。希釈はすべて３％BSA、0.01％アジ
化ナトリウムおよび0.05％ツイーン20を含むPBS中に行
なった。標準LDLまたは競合相手（0.025ml）を、次いで
固定した制限量の単クローン性抗体（腹水）を含む緩衝
液0.025mlをLDL被覆ウエルに混合した。抗体の最適最終
濃度は予備抗体希釈研究から決定し、50％の最大結合を
生ずる量を抗体の量として選んだ。 プレートを４℃で約18時間維持し、次いでPBS洗浄緩
衝液で洗浄した。次いでマウス抗体結合を¹²⁵Ｉ免疫精
製ヤギ抗マウスIg0.05mlの混合物（450ng/ウェル、8,00
0cpm/ng）により定量した。４℃で４時間維持した後プ
レートを洗浄し、個々のウエルを計数した。 H.酵素結合抗体免疫検定（ELISA） （１）非競合的ELISA １μg/ml受容体タンパク質を含む炭酸水素ナトリウム
緩衝液pH9.0,0.15mlを各ウエル中へ混合することによ
り、分離したMB47受容体をポリスチレンマイクロタイタ
ープレートウエル〔ナンクーイムノ・プレート（Nunc−
Immuno Plate）Ｉ〕の壁に付着させた。ウエルを４℃で
16時間維持し、次いで0.1％BSAおよび0.05％ツイーンを
含むPBSで３回洗浄した。次いで各ウエルにPBS中の３％
BSA0.2mlを混合し、混合物を23℃で１時間維持し、次い
で前記のように洗浄することにより残留非特異的結合部
位をブロックした。調製したウエル（固体支持体）は増
湿室中に貯蔵すると調製後約１ケ月まで使用できる。 標準対照溶液として用いるため、試薬アポＢ−100
（ヒトLDL）をPBS中に2.0〜0.062μg/mlの範囲の濃度に
希釈した。血漿試料はBPS中に1:2,000に希釈した。 標準または試料50μｌをウエル中に、３重に混合し
た。その後約５分内にHRPO標識MB24受容体mg/mlを含むP
BS50μｌを各ウエルに混合した。免疫反応混合物を25℃
で30分間維持した。次いで非結合物質を前記のように洗
浄によりウエルから除去した。 HRPO標識を含む固相付着サンドイッチ免疫反応体の量
を、次いで新調製基質溶液〔３％H₂O₂および0.67mg/mlo
−フェニレンジアミン（OPD）を含む蒸留水〕0.1mlを各
ウエルに混合することにより検定した。色は25℃で30分
間発色させた。次いで各ウエルに4N−H₂O₂、0.05mlを混
合することにより基質転化反応を停止させた。溶液の光
学濃度（O.D.）はダイナテク（Dynatech）MR600〔ダイ
ナテク（Dynatech,Alexandria,VA）製〕マイクロタイタ
ープレートリーダーを用い、490ナノメートル（nm）波
長で測定した。 （２）競合的ELISA 分離したヒトLDL5μg/mlを含むPBS0.2mlを各ウエルに
混合することにより試薬アポＢ−100を軟質ポリ塩化ビ
ニルマイクロタイタープレートウエル〔マイクロテスト
（Microtest）III、ファルコン・ラブウェア，ベクト
ン，ディッキンソン・アンド・カンパニー（Falcon Lab
ware,Becton,Dickinson ＆ Co.,Oxnard,（Ａ）製〕の壁
に固体マトリックスとして付着させた。ウエルは４℃で
16時間維持し、次いで１％BSA、0.5％ツイーンおよび0.
02％アプロチニン〔シグマ・ケミカル社（Sigma Chemic
al Co.）製〕を含むPBS0.2mlで３回洗浄した。残留非特
異的結合部位は非競合的ELISAに記載のようにブロック
した。 標準曲線のために、各プレート上に含まれた、試薬ア
ポＢ−100を0.5％リポタンパク質除去血漿（LPDP）を含
むPBS中に希釈して32〜0.25mg/mlの範囲内の濃度を与え
た。 血漿試料は0.5％LPDPを含むPBS中に1:200に希釈し
た。標準または試料50μｌを３重に、ウエル中に混合し
た。その後約５分以内に、３％BSAおよびMB24受容体約
４μg/mlを含むPBS50μｌを各ウエルに加えた。形成さ
れた混合物を４℃で約18時間維持した。次いで非結合物
質を前記のように洗浄することにより固相付着MB24−試
薬アポＢ−100免疫反応生成物から分離した。 固相免疫反応体は検定のために１％BSAを含むPBS0.1m
lおよび有効量のHRPO標識ヤギ抗マウスIgGを各ウエルに
混合することにより調製した。この第２免疫反応混合物
を24℃で約１時間維持し、次いで前記のように洗浄して
サンドイッチ免疫反応体を形成した。 HRPO標識を含む固相付着サンドイッチ免疫反応体の量
は競合的ELISAにおいて記載したように検定した。 I.血漿試料およびリポタンパク質の定量 血漿試料はカルディアク・カテーテリゼーション・ラ
ボラトリー（Cardiac Cathetarization Laboratory,San
Diego VA Hospital）から冠動脈疾患を有する20患者、
およびユニバシティ・オブ・カリフォルニア，サン・ジ
ェゴ・クリニック（University of California,San Die
go Clinic）からの家族性コレステロール過剰血症を有
する20患者から得た。さらに血漿を20正常被験者から得
た。 血液を1.5mg/mlエチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）を
入れた管中に捕集し、直ちに４℃で遠心分離することに
より血漿を分離した。 全血漿コレステロールおよびトリグリセリドは新血漿
試料で、標準臨床研究室でアボット（Abbott）ABA−200
ニクロム酸塩アナライザー、並びにベーリンガー・マン
ハイム（Boehringer−Mannheim）高性能コレステロール
試薬236691およびアボット・ラボラトリーズ（Abbott L
aboratories）トリグリセリドＡ−gentを用いて測定し
た。LDL−およびHDL−コレステロールは「脂質研究臨床
手順（Lipid Research Clinic Procedures）」,HEW Pu
b.No.75〜628（NIH）,2版,Washington,D.C.Gov.Print O
ff.（1974）に記載の方法を用いて測定した。アポタン
パク質Ｂ濃度は２つの市販放射免疫拡散キット;Diffu−
gen RID〔タゴ社（Tago.Inc.,Burlingame,CA）製〕、こ
れはRID＃１として示す、およびＭ−Partigen RID〔カ
ルビオケム−ベーリング（Calbiochem−Behring,La Jol
la,CA）製〕、これはRID＃２として示す、を用いて測定
した。 J.MB47−セファロース4Bカラムに対するLDLの結合 プロテインＡカラムクロマトグラフィーにより得た実
質的に純粋なMB47受容体50mgをブロモシアン活性化セフ
ァロース4B〔ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Ph
armacia Fine Chemicals,Piscataway,NY）製〕12mlに、
製造業者の説明書に従って結合させた。次いでLDL10mg
をカラムに加え、４℃で一夜（約16時間）維持した。次
いで非結合LDLを前記のように溶離し、前記のようにLDL
タンパク質について検定した。 特定態様を含む前記明細は本発明の例示であり、限定
と解すべきではない。多くの他の変形および改変は本発
明の新規概念の真の精神および範囲から逸脱することな
く行なうことができる。

【図面の簡単な説明】 第１図は脱脂キロミクロンおよびVLDLから得たアポＢ−
100およびアポＢ−48と免疫反応するMB47およびMB24受
容体分子の能力を示すウエスターンブロット検定オート
ラジオグラムの図面であり、 第２図は液相放射免疫検定における単クローン性抗体MB
47のモル濃度の増加による結合された¹²⁵Ｉ標識LDL粒子
の百分率を示すグラフであり、 第３図は培養ヒト線維芽細胞による¹²⁵ＩヒトLDL結合、
インターナリゼーションおよび分解の抗体MB47および過
剰の非標識ヒトLDLによる抑制程度を示す棒グラフであ
り、 第４図はヒト線維芽細胞による¹²⁵ＩヒトLDL結合および
分解を抑制する単クローン性抗体MB47の一価Fabフラグ
メントの能力を示すグラフであり、 第５図は固相検定においてLDLに対する結合に対してペ
ルオキシダーゼ標識MB24およびMB47と競合する非標識MB
24およびMB47の能力を示すグラフであり、 第６図Ａは液相RIAにおける¹²⁵Ｉ標識B47のLDLに対する
結合を示すグラフ、第６図ＢはLDL−¹²⁵I B47結合のス
キッチャードプロットを示すグラフであり、 第７図はLDL−コレステロールと直接ELISAアポＢ濃度と
の相関を示すグラフであり、 第８図はLDL−コレステロールと競合的ELISAアポＢ濃度
との相関を示すグラフであり、 第９図は直接ELISAアポＢ濃度と競合的ELISAアポＢ濃度
との相関を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 リンダ ケイ カーティス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92126 サン ディエゴ フランダース ドライヴ 8926 (56)参考文献 特開 昭60−193926（ＪＰ，Ａ) 国際公開86／4144（ＷＯ，Ａ１) ＡＲＴＥＲＩＯＳＣＬＥＲＯＳＩＳ, Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．２，1986，ｐ．178 −188 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 257，Ｎｏ．24，1982，ｐ．15213− 15221 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/577 C12P 21/08 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．体液試料をアポタンパク質Ｂ−100の量について検
   定する方法であって、 （ａ）検定すべき体液試料を準備する段階、 （ｂ）（ｉ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応し、か
   つ （ii）ATCC寄託番号HB8746を有するハイブリドーマまた
   はATCC寄託番号HB8742を有するハイブリドーマにより分
   泌された第１無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタ
   イプ含有ポリペプチド部分を生物活性形態に準備する段
   階、 （ｃ）前記体液試料の既知量と前記第１無傷抗体又はそ
   の抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチド部分の
   予定量とを混合して免疫反応混合物を形成する段階、 （ｄ）前記混合物を生物学的検定条件下に、混合物中に
   存在する第１無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタ
   イプ含有ポリペプチド部分が試料中に存在するアポタン
   パク質Ｂ−100と免疫的に結合して免疫反応体を形成す
   るのに十分な予定時間維持する段階、 （ｅ）前記体液試料中に存在するアポタンパク質Ｂ−10
   0と免疫反応し、かつATCC受託番号HB8746を有するハイ
   ブリドーマまたはATCC受託番号HB8742を有するハイブリ
   ドーマにより分泌された、前記第１無傷抗体又はその抗
   体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチド部分と異な
   る生物活性の第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディ
   オタイプ含有ポリペプチド部分を準備する段階、 （ｆ）前記第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオ
   タイプ含有ポリペプチド部分の予定量を前記体液試料と
   混合して免疫反応混合物を形成する段階、 （ｇ）前記免疫反応混合物を生物学的検定条件下に、混
   合物中に存在する無傷抗体又は抗体結合部位イディオタ
   イプ含有ポリペプチド部分が試料中に存在するアポタン
   パク質Ｂ−100と免疫的に結合してサンドイッチ免疫反
   応体を形成するのに十分な予定時間維持する段階、 （ｈ）前記混合物中に形成された免疫反応体の量を検定
   する段階、 を含む方法。 ２．第１無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ
   含有ポリペプチド部分が固体マトリックスに付着して固
   体支持体を形成し、第２無傷抗体又はその抗体結合部位
   イディオタイプ含有ポリペプチド部分が免疫反応体中の
   前記第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ
   含有ポリペプチド部分の存在をシグナルできる標識を含
   み、段階（ｈ）において検定される免疫反応体が前記標
   識を含む固相サンドイッチ免疫反応体である、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３．体液試料中のアポＢ−100の量について検定する検
   定キットであって、 （ａ）（ｉ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応し、か
   つ （ii）ハイブリドーマATCC HB8746により分泌された無
   傷抗体又は抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチ
   ド部分またはハイブリドーマATCC HB8742により分泌さ
   れた無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ含有
   ポリペプチド部分を含む生物活性第１特異的結合剤、お
   よび （ｂ）（ｉ）前記第１結合剤とアポＢ−100との免疫反
   応をシグナルし、かつ （ii）ハイブリドーマATCC HB8746により分泌された無
   傷抗体又は抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプチ
   ド部分またはハイブリドーマATCC HB8742により分泌さ
   れた無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ含有
   ポリペプチド部分であって、第１特異的結合剤と異なる
   無傷抗体又は抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペプ
   チド部分を含む生物活性の標識した第２特異的結合剤、 を含むキット。 ４．標識が酵素である、特許請求の範囲第３項記載のキ
   ット。 ５．第１特異的結合剤が固体マトリックスに付着して固
   体支持体を形成している、特許請求の範囲第３項記載の
   キット。 ６．体液試料をアポタンパク質Ｂ−100について検定す
   る方法であって、 （ａ）検定すべき体液試料を準備する段階、 （ｂ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応し、かつATCC
   受託番号HB8746を有するハイブリドーマにより分泌され
   る第１無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ含
   有ポリペプチド部分を生物活性形態で付着した固体マト
   リックスを含む固体支持体を準備する段階、 （ｃ）アポタンパク質Ｂ−100と免疫反応し、かつATCC
   受託番号HB8742を有するハイブリドーマにより分泌され
   る生物活性第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオ
   タイプ含有ポリペプチド部分であって、免疫反応体中の
   前記第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ
   含有ポリペプチド部分の存在をシグナルできる酵素標識
   に結合した第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオ
   タイプ含有ポリペプチド部分を準備する段階、 （ｄ）（ｉ）前記体液試料、 （ii）前記固体支持体、および （iii）前記標識した第２無傷抗体又はその抗体結合部
   位イディオタイプ含有ポリペプチド部分、 を実質的に同時に混合して固／液相免疫反応混合物を形
   成する段階、 （ｅ）前記混合物を生物学的検定条件下に、前記第１無
   傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイプ含有ポリペ
   プチド部分および前記第２無傷抗体又はその抗体結合部
   位イディオタイプ含有ポリペプチド部分が試料中に存在
   するアポタンパク質Ｂ−100と免疫的に結合して固相サ
   ンドイッチ免疫反応体および液相を形成するのに十分な
   予定時間維持する段階、 （ｆ）前記固相サンドイッチ免疫反応体を前記液相から
   分離する段階、および （ｇ）前記固相サンドイッチ免疫反応体中に結合した標
   識した第２無傷抗体又はその抗体結合部位イディオタイ
   プ含有ポリペプチド部分の量を検定する段階、 を含む方法。