JPH07104351B2 - 脂質代謝異常検出用キット - Google Patents
脂質代謝異常検出用キットInfo
- Publication number
- JPH07104351B2 JPH07104351B2 JP23189389A JP23189389A JPH07104351B2 JP H07104351 B2 JPH07104351 B2 JP H07104351B2 JP 23189389 A JP23189389 A JP 23189389A JP 23189389 A JP23189389 A JP 23189389A JP H07104351 B2 JPH07104351 B2 JP H07104351B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipid metabolism
- kit
- lipoprotein
- present
- abnormal lipid
- Prior art date
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は脂質代謝異常の検出用キット、より詳しくは特
に心筋梗塞等の心疾患や、糖尿病、脳卒中等の脳血管障
害等の各種動脈硬化性疾患の発症因子としての脂質代謝
異常の臨床検査乃至診断に有用な新しい検出用キット及
び該キットを利用して脂質代謝異常を検出する方法に関
する。
に心筋梗塞等の心疾患や、糖尿病、脳卒中等の脳血管障
害等の各種動脈硬化性疾患の発症因子としての脂質代謝
異常の臨床検査乃至診断に有用な新しい検出用キット及
び該キットを利用して脂質代謝異常を検出する方法に関
する。
従来の技術 脂質代謝異常とは、リポ蛋白の合成、分泌、異化の過程
で之等のいずれかが異常をきたす状態と定義でき、これ
は先天性リポ蛋白代謝異常と後天性リポ蛋白代謝異常と
に分類される。
で之等のいずれかが異常をきたす状態と定義でき、これ
は先天性リポ蛋白代謝異常と後天性リポ蛋白代謝異常と
に分類される。
また、上記脂質代謝異常は、種々の疾患、例えば心筋梗
塞等の心疾患、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化
性疾患等の発症の重大な因子（リスクファクター）とさ
れており、之等疾患の進展、予後等に重大な影響を及ぼ
すことが知られており、該脂質代謝異常の検出は、各種
の臨床検査乃至診断に極めて重要な成果をもたらす。
塞等の心疾患、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化
性疾患等の発症の重大な因子（リスクファクター）とさ
れており、之等疾患の進展、予後等に重大な影響を及ぼ
すことが知られており、該脂質代謝異常の検出は、各種
の臨床検査乃至診断に極めて重要な成果をもたらす。
従来、上記脂質代謝異常の検出法としては、血液中の総
コレステロール値をパラメーターとするものが最も一般
的に定着している。この方法は、血液中の総コレステロ
ール値を常法、例えば酵素法により測定し、該値が臨床
的及び経験的に設定された域値（正常域）を逸脱する場
合を脂質代謝異常として検出するものである。また近
年、血液中のリポ蛋白、即ち脂質とアポ蛋白との結合物
を比重により分画し、このうち特に高比重のリポ蛋白
（高密度リポ蛋白、HDL）のコレステロール値を測定
し、このHDL−コレステロール値そのもの又は該値に対
する総コレステロール値から該値を引いた値、所謂動脈
硬化指数を、脂質代謝異常の検出パラメーターとする方
法も行なわれている。
コレステロール値をパラメーターとするものが最も一般
的に定着している。この方法は、血液中の総コレステロ
ール値を常法、例えば酵素法により測定し、該値が臨床
的及び経験的に設定された域値（正常域）を逸脱する場
合を脂質代謝異常として検出するものである。また近
年、血液中のリポ蛋白、即ち脂質とアポ蛋白との結合物
を比重により分画し、このうち特に高比重のリポ蛋白
（高密度リポ蛋白、HDL）のコレステロール値を測定
し、このHDL−コレステロール値そのもの又は該値に対
する総コレステロール値から該値を引いた値、所謂動脈
硬化指数を、脂質代謝異常の検出パラメーターとする方
法も行なわれている。
しかしながら、現在までに蓄積された多くの免疫学的検
査の結果及び臨床的知見によれば、之等従来の脂質代謝
異常の検出方法は、実際の脂質代謝異常を必ずしも的確
に反映するものではなく、殊に臨床上その意義は低いこ
とがしばしば指摘されている。即ち、上記従来法はいず
れも総コレステロール値又はこれとHDLコレステロール
値を測定するものであって、これらの測定値はいずれも
脂質代謝異常とは必ずしも関連しない。特に総コレステ
ロール値の高値は虚血性心疾患のリスクファクターの一
つとしての意義は有する〔例えばMed.Clin.North Am.,5
8,363−379（1974）参照〕が、疾患と直接結びつくもの
ではなく、その検出方法による脂質代謝正常群における
疾患の発生や高度脂質代謝異常群における恒常的な健全
性等は、いずれも何ら希なものではない。またHDL−コ
レステロール値及びこれを基準とする動脈硬化指数をパ
ラメーターとする場合も、上記と同様に実際の脂質代謝
異常を必ずしも的確に反映するものではない〔動脈硬
化、14（４）,931−936（1986）等参照〕。
査の結果及び臨床的知見によれば、之等従来の脂質代謝
異常の検出方法は、実際の脂質代謝異常を必ずしも的確
に反映するものではなく、殊に臨床上その意義は低いこ
とがしばしば指摘されている。即ち、上記従来法はいず
れも総コレステロール値又はこれとHDLコレステロール
値を測定するものであって、これらの測定値はいずれも
脂質代謝異常とは必ずしも関連しない。特に総コレステ
ロール値の高値は虚血性心疾患のリスクファクターの一
つとしての意義は有する〔例えばMed.Clin.North Am.,5
8,363−379（1974）参照〕が、疾患と直接結びつくもの
ではなく、その検出方法による脂質代謝正常群における
疾患の発生や高度脂質代謝異常群における恒常的な健全
性等は、いずれも何ら希なものではない。またHDL−コ
レステロール値及びこれを基準とする動脈硬化指数をパ
ラメーターとする場合も、上記と同様に実際の脂質代謝
異常を必ずしも的確に反映するものではない〔動脈硬
化、14（４）,931−936（1986）等参照〕。
更に、最近の知見によると実際の脂質代謝異常には、超
低比重リポ蛋白（VLDL）等のリポ蛋白が生体内で何らか
の作用を受けることにより生成すると考えられる変性リ
ポ蛋白（異常β−VLDL,abnormal β−migrating very l
ow density lipoproteins）が、重大な影響を及ぼすと
いう報告が種々なされている〔例えばHui,D.Y.,Innerar
ity,T.L.,＆ Mahley,R.W.,J.Biol.Chem.,259,860−869
（1984）:Gonen B et al.,Diabetes,30,875（1981）等
参照〕。
低比重リポ蛋白（VLDL）等のリポ蛋白が生体内で何らか
の作用を受けることにより生成すると考えられる変性リ
ポ蛋白（異常β−VLDL,abnormal β−migrating very l
ow density lipoproteins）が、重大な影響を及ぼすと
いう報告が種々なされている〔例えばHui,D.Y.,Innerar
ity,T.L.,＆ Mahley,R.W.,J.Biol.Chem.,259,860−869
（1984）:Gonen B et al.,Diabetes,30,875（1981）等
参照〕。
従って、この変性リポ蛋白を検出できれば、脂質代謝異
常を正確に検出でき、これは該脂質代謝異常をもたらす
各種疾患の的確な診断手段として、殊に疾患の発見、進
展状態、治療方法の把握等の臨床分野において非常に有
効であると考えられるが、上記変性リポ蛋白の実体は現
在尚不明確で、その検出手段も現在知られていない。
常を正確に検出でき、これは該脂質代謝異常をもたらす
各種疾患の的確な診断手段として、殊に疾患の発見、進
展状態、治療方法の把握等の臨床分野において非常に有
効であると考えられるが、上記変性リポ蛋白の実体は現
在尚不明確で、その検出手段も現在知られていない。
発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、脂質代謝異常を正確に検出でき、該脂
質代謝異常をもたらす各種疾患の発見、進展状態、治療
効果の把握等を可能とする、臨床上非常に有効な新しい
検出手段、そのためのキットを提供することにある。
質代謝異常をもたらす各種疾患の発見、進展状態、治療
効果の把握等を可能とする、臨床上非常に有効な新しい
検出手段、そのためのキットを提供することにある。
本発明者は、上記目的より鋭意研究を重ねた結果、健常
人の総血漿リポ蛋白（脂質）は、アポ蛋白Ａ−Ｉを構成
成分とするリポ蛋白（アポＡ−Ｉ含有リポ蛋白）及びア
ポ蛋白Ｂ−100を構成成分とするリポ蛋白（アポＢ−100
含有リポ蛋白）から実質的になりたっており、他のリポ
蛋白は存在しないのに対して、脂質異常患者では、上記
アポＡ−Ｉ含有リポ蛋白及びアポＢ−100含有リポ蛋白
以外に、前記変性リポ蛋白と呼ばれる如き他のリポ蛋白
が存在するという事実、従って、上記総血漿リポ蛋白の
測定値と、アポＡ−Ｉ含有リポ蛋白及びアポＢ−100含
有リポ蛋白の測定値合計との対比によれば、上記変性リ
ポ蛋白を指標とした脂質異常が検出できるという事実、
特に予め調製された特定の抗体を含むアフィニティゲル
混合物と被検血液とを接触させるときには、上記アポＡ
−Ｉ含有リポ蛋白及びアポＢ−100含有リポ蛋白が見事
に系外に除去でき、残りの系（上記変性リポ蛋白を含む
か否か）の脂質測定によって、健常人と脂質代謝異常患
者とを確実に区別できるという事実を見出だした。本発
明はこの新しい知見に基いて完成されたものである。
人の総血漿リポ蛋白（脂質）は、アポ蛋白Ａ−Ｉを構成
成分とするリポ蛋白（アポＡ−Ｉ含有リポ蛋白）及びア
ポ蛋白Ｂ−100を構成成分とするリポ蛋白（アポＢ−100
含有リポ蛋白）から実質的になりたっており、他のリポ
蛋白は存在しないのに対して、脂質異常患者では、上記
アポＡ−Ｉ含有リポ蛋白及びアポＢ−100含有リポ蛋白
以外に、前記変性リポ蛋白と呼ばれる如き他のリポ蛋白
が存在するという事実、従って、上記総血漿リポ蛋白の
測定値と、アポＡ−Ｉ含有リポ蛋白及びアポＢ−100含
有リポ蛋白の測定値合計との対比によれば、上記変性リ
ポ蛋白を指標とした脂質異常が検出できるという事実、
特に予め調製された特定の抗体を含むアフィニティゲル
混合物と被検血液とを接触させるときには、上記アポＡ
−Ｉ含有リポ蛋白及びアポＢ−100含有リポ蛋白が見事
に系外に除去でき、残りの系（上記変性リポ蛋白を含む
か否か）の脂質測定によって、健常人と脂質代謝異常患
者とを確実に区別できるという事実を見出だした。本発
明はこの新しい知見に基いて完成されたものである。
課題を解決するための手段 即ち、本発明はアポ蛋白Ａ−Ｉに対するモノクローナル
抗体を結合させたアフィニティゲルとアポ蛋白Ｂ−100
に対するモノクローナル抗体を結合させたアフィニティ
ゲルとの混合物を必須成分として含有することを特徴と
する脂質異常検出用キットに係わる。
抗体を結合させたアフィニティゲルとアポ蛋白Ｂ−100
に対するモノクローナル抗体を結合させたアフィニティ
ゲルとの混合物を必須成分として含有することを特徴と
する脂質異常検出用キットに係わる。
本発明キットは、血液中総リポ蛋白からアポ蛋白Ａ−Ｉ
含有リポ蛋白及びアポ蛋白Ｂ−100含有リポ蛋白を除い
たリポ蛋白、即ち前記変性リポ蛋白と考えられるリポ蛋
白（以下単に「変性リポ蛋白」という）を測定するため
のものであり、本発明によれば、上記キットを利用して
測定される変性リポ蛋白量をパラメーターとして、脂質
代謝異常の検出及びこれによる各種疾患の臨床検査乃至
診断を行ない得る。即ち、上記変性リポ蛋白は、脂質代
謝が正常な場合は血液中には殆んど存在しないが、脂質
代謝異常の程度に応じてその存在量が増加し、該異常を
的確に反映するものであり、本発明キットの利用によれ
ばこの脂質代謝異常を正確に測定、検出できる。
含有リポ蛋白及びアポ蛋白Ｂ−100含有リポ蛋白を除い
たリポ蛋白、即ち前記変性リポ蛋白と考えられるリポ蛋
白（以下単に「変性リポ蛋白」という）を測定するため
のものであり、本発明によれば、上記キットを利用して
測定される変性リポ蛋白量をパラメーターとして、脂質
代謝異常の検出及びこれによる各種疾患の臨床検査乃至
診断を行ない得る。即ち、上記変性リポ蛋白は、脂質代
謝が正常な場合は血液中には殆んど存在しないが、脂質
代謝異常の程度に応じてその存在量が増加し、該異常を
的確に反映するものであり、本発明キットの利用によれ
ばこの脂質代謝異常を正確に測定、検出できる。
以下、本発明キット及びその利用による変性リポ蛋白の
検定乃至脂質代謝異常の検定法につき詳述する。
検定乃至脂質代謝異常の検定法につき詳述する。
本発明キットを利用した検定法において、検体としては
血液、特に空腹時の血清又は血漿が好ましく、之等は被
検者より採決後、常法に従い調製できる。
血液、特に空腹時の血清又は血漿が好ましく、之等は被
検者より採決後、常法に従い調製できる。
血液中のリポ蛋白は、コレステロール、トリグリセライ
ド、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質とアポ蛋白とが結合
して存在しているのであるから、変性リポ蛋白としては
その総量、その脂質のいずれか又は全部、そのアポ蛋白
の総量等をいずれも用い得、之等のコレステロール値
は、例えば酵素法により測定できる。
ド、リン脂質、遊離脂肪酸等の脂質とアポ蛋白とが結合
して存在しているのであるから、変性リポ蛋白としては
その総量、その脂質のいずれか又は全部、そのアポ蛋白
の総量等をいずれも用い得、之等のコレステロール値
は、例えば酵素法により測定できる。
本発明に係わるキットは、アポ蛋白Ａ−Ｉに対するモノ
クローナル抗体（抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体）及びアポ蛋白
Ｂ−100に対するモノクローナル抗体（抗アポ蛋白Ｂ−1
00抗体）を結合させたアフィニテイゲルの混合物をその
まま又は振盪及び遠心分離が可能なチューブに調製して
おくことが好ましく、また予め適当な緩衝液、例えば0.
01Mトリス塩酸緩衝液（pH7.4）＋0.15M NaCl等の緩衝
液で上記ゲルを平衡化しておくのが好ましい。更に上記
緩衝液には、例えばアジ化ナトリウム等の通常の保存剤
を含ませることができる。
クローナル抗体（抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体）及びアポ蛋白
Ｂ−100に対するモノクローナル抗体（抗アポ蛋白Ｂ−1
00抗体）を結合させたアフィニテイゲルの混合物をその
まま又は振盪及び遠心分離が可能なチューブに調製して
おくことが好ましく、また予め適当な緩衝液、例えば0.
01Mトリス塩酸緩衝液（pH7.4）＋0.15M NaCl等の緩衝
液で上記ゲルを平衡化しておくのが好ましい。更に上記
緩衝液には、例えばアジ化ナトリウム等の通常の保存剤
を含ませることができる。
本発明に用いるアフィニテイゲルは、通常の方法で調製
できる。つまり、抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋白
Ｂ−100抗体のそれぞれをブロモシアン等で活性化させ
たアフィニティゲルにカップリングさせ、その後両者を
混合し、適当な緩衝液にて平衡化する。ここで用いられ
る抗体としては、抗ヒトアポＡ−Ｉモノクローナル抗体
及び抗体ヒトアポＢ−100モノクローナル抗体（いずれ
も株式会社日本抗体研究所構造）を代表例として例示で
きるが、特に之等に限定されるものではない。また用い
られるアフィニティゲルの代表例としては、例えば予め
ブロモシアン等で活性化されたセファロース4B（ファル
マシア社製）等を例示でき、カップリング反応は上記ゲ
ルと蛋白とのカップリング反応に慣用される常法に従
い、通常pH8〜10の範囲でゲル1ml当たり約１〜10mg（Ig
G）の抗体を用いて、室温（約20〜25℃）下に２時間以
内で実施できる。
できる。つまり、抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋白
Ｂ−100抗体のそれぞれをブロモシアン等で活性化させ
たアフィニティゲルにカップリングさせ、その後両者を
混合し、適当な緩衝液にて平衡化する。ここで用いられ
る抗体としては、抗ヒトアポＡ−Ｉモノクローナル抗体
及び抗体ヒトアポＢ−100モノクローナル抗体（いずれ
も株式会社日本抗体研究所構造）を代表例として例示で
きるが、特に之等に限定されるものではない。また用い
られるアフィニティゲルの代表例としては、例えば予め
ブロモシアン等で活性化されたセファロース4B（ファル
マシア社製）等を例示でき、カップリング反応は上記ゲ
ルと蛋白とのカップリング反応に慣用される常法に従
い、通常pH8〜10の範囲でゲル1ml当たり約１〜10mg（Ig
G）の抗体を用いて、室温（約20〜25℃）下に２時間以
内で実施できる。
本発明キットの必須成分とする上記ゲル混合物における
抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋白Ｂ−100抗体の配
合割合は、特に限定されるものではなく、適宜決定でき
るが、通常前者に対して後者を等重量以上、好ましくは
約１〜２倍重量の範囲から選択するのが望ましい。また
得られるゲル混合物のpHは一般には約７〜7.5の範囲に
調製されるのが好適である。
抗アポ蛋白Ａ−Ｉ抗体及び抗アポ蛋白Ｂ−100抗体の配
合割合は、特に限定されるものではなく、適宜決定でき
るが、通常前者に対して後者を等重量以上、好ましくは
約１〜２倍重量の範囲から選択するのが望ましい。また
得られるゲル混合物のpHは一般には約７〜7.5の範囲に
調製されるのが好適である。
かくして調整されるゲル混合物を必須成分とする本発明
キットには、更に必要に応じてサッカロースやウシ血清
蛋白等の安定化剤及び／又は保存剤を添加配合できる。
この保存剤はキットの使用に際し実験値に悪影響を与え
ないものから選択され、例えば代表的には希釈したアジ
化ナトリウム（sodium azide）等を使用できる。また本
発明キットには水溶性もしくは水と混和し得るグリセリ
ン、アルコール類、グリコール類、グリコールエーテル
類等を含有させることもできる。
キットには、更に必要に応じてサッカロースやウシ血清
蛋白等の安定化剤及び／又は保存剤を添加配合できる。
この保存剤はキットの使用に際し実験値に悪影響を与え
ないものから選択され、例えば代表的には希釈したアジ
化ナトリウム（sodium azide）等を使用できる。また本
発明キットには水溶性もしくは水と混和し得るグリセリ
ン、アルコール類、グリコール類、グリコールエーテル
類等を含有させることもできる。
本発明キットを利用した変性リポ蛋白の検出の好ましい
一実施態様によれば、まず本発明キットの必須成分とす
るアフィニティゲル混合物を振盪及び遠心可能な適当な
容器乃至テストチューブに入れ、適当な緩衝液で平衡化
させた後、該容器内に所定量の被検血清を加え、室温で
静値又は振盪して反応させた後、比較的低速度（約800
〜1000rpm）で遠心分離し、得られる上清にコレステロ
ール発色試薬を加えて所定時間インキュベートした後、
該上清の脂質又はアポ蛋白を吸光度測定器により測定す
ることによって、被検血清中の変性リポ蛋白量を測定す
ることができる。この方法における被検血清の使用量
は、通常本発明ゲル混合物重量の約1/8重量程度、好ま
しくは1/4〜1/16重量程度とするのがよい。
一実施態様によれば、まず本発明キットの必須成分とす
るアフィニティゲル混合物を振盪及び遠心可能な適当な
容器乃至テストチューブに入れ、適当な緩衝液で平衡化
させた後、該容器内に所定量の被検血清を加え、室温で
静値又は振盪して反応させた後、比較的低速度（約800
〜1000rpm）で遠心分離し、得られる上清にコレステロ
ール発色試薬を加えて所定時間インキュベートした後、
該上清の脂質又はアポ蛋白を吸光度測定器により測定す
ることによって、被検血清中の変性リポ蛋白量を測定す
ることができる。この方法における被検血清の使用量
は、通常本発明ゲル混合物重量の約1/8重量程度、好ま
しくは1/4〜1/16重量程度とするのがよい。
発明の効果 本発明キットの利用によれば、変性リポ蛋白を簡便に測
定でき、これを脂質代謝異常のパラメーターとして該異
常を容易且つ有効に検出できる。殊に、血液中の変性リ
ポ蛋白量は脂質代謝異常及びその程度を的確に反映する
ものであり、本発明キットを用いた脂質代謝異常の検出
によれば、前記した各種疾患の発見、進展、治療効果の
把握等、特に従来の検出法では把握できなかった心筋梗
塞等の心疾患や肥満等の病態の把握を充分且つ有効に行
ない得る。
定でき、これを脂質代謝異常のパラメーターとして該異
常を容易且つ有効に検出できる。殊に、血液中の変性リ
ポ蛋白量は脂質代謝異常及びその程度を的確に反映する
ものであり、本発明キットを用いた脂質代謝異常の検出
によれば、前記した各種疾患の発見、進展、治療効果の
把握等、特に従来の検出法では把握できなかった心筋梗
塞等の心疾患や肥満等の病態の把握を充分且つ有効に行
ない得る。
実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げ
る。
る。
実施例 １ （１） 患者より空腹時EDTA採決し、遠心分離（2500〜
3000rpm）して血漿を得た。
3000rpm）して血漿を得た。
得られた各血漿について、トリグリセライド量を酵素法
（TG−555、協和メディクス社製）により測定した。ま
たコレステロール量を酵素法（Mereko Test CHO、関東
化学社製、2ml/10μ血漿、37℃、10分間インキュベー
ト）により測定（365nmでの吸光度測定）した。
（TG−555、協和メディクス社製）により測定した。ま
たコレステロール量を酵素法（Mereko Test CHO、関東
化学社製、2ml/10μ血漿、37℃、10分間インキュベー
ト）により測定（365nmでの吸光度測定）した。
（２） 上記血漿20μを試験管に加え、抗アポＡ−Ｉ
モノクローナル抗体及び抗アポＢ−100モノクローナル
抗体をそれぞれ結合させたアフィニティゲル（ゲル1ml
当り各抗体を蛋白量として10mgずつカップリング反応さ
せたブロムシアン活性化セファロース−4B）を含有する
反応液（各ゲルを等量の0.01Mトリス塩酸緩衝液（pH7.
4）に混和して調製したもの、各抗体のそれぞれ80μ
を含む）600μを分注し、振盪を30分間行ない、その
後15分間静置して上清200μを分取した。
モノクローナル抗体及び抗アポＢ−100モノクローナル
抗体をそれぞれ結合させたアフィニティゲル（ゲル1ml
当り各抗体を蛋白量として10mgずつカップリング反応さ
せたブロムシアン活性化セファロース−4B）を含有する
反応液（各ゲルを等量の0.01Mトリス塩酸緩衝液（pH7.
4）に混和して調製したもの、各抗体のそれぞれ80μ
を含む）600μを分注し、振盪を30分間行ない、その
後15分間静置して上清200μを分取した。
該上清にMercko Test CHO（関東化学社製）2mlを添加
し、37℃で20分間インキュベート後、該血清中のコレス
テロール量を365nmでの吸光度測定により求めた。
し、37℃で20分間インキュベート後、該血清中のコレス
テロール量を365nmでの吸光度測定により求めた。
（３） その結果、トリグリセライドがコレステロール
に比べて高い相関を示しており、このことより、外因性
脂質代謝異常の一つの指標であるカイロミクロンレムナ
ント及び内因性脂質代謝異常の一つの指標である異常VL
DL（β−）あるいはIDLを反映する変性リポ蛋白の検出
が行ない得ることが確認できた。
に比べて高い相関を示しており、このことより、外因性
脂質代謝異常の一つの指標であるカイロミクロンレムナ
ント及び内因性脂質代謝異常の一つの指標である異常VL
DL（β−）あるいはIDLを反映する変性リポ蛋白の検出
が行ない得ることが確認できた。
（４） また、上記において複数の健常人を検体とし
て、同様にして血漿コレステロール値及び変性リポ蛋白
量を求めた。
て、同様にして血漿コレステロール値及び変性リポ蛋白
量を求めた。
その相関関係を、横軸に血漿コレステロール値（mg/d
l）、縦軸に変性リポ蛋白量（mg/dl）を取り第１図に示
す。
l）、縦軸に変性リポ蛋白量（mg/dl）を取り第１図に示
す。
該図より、本発明キットの利用により、健常人の変性リ
ポ蛋白量を、コレステロール値とは関連なく常に０付近
に測定できることが判る。
ポ蛋白量を、コレステロール値とは関連なく常に０付近
に測定できることが判る。
（５） 比較のため、本発明キットを用いた上記方法に
代えて以下の方法を実施した。この方法は抗アポＡ−Ｉ
モノクローナル抗体結合アフィニティゲルを充填したカ
ラムと、抗アポＢ−100モノクローナル抗体結合アフィ
ニティゲルを充填したカラムとを用いて、血漿中のアポ
蛋白Ａ−Ｉ含有リポ蛋白（吸着画分）とアポ蛋白Ｂ−10
0含有リポ蛋白（吸着画分）とのそれぞれのコレステロ
ール値を求め、之等を加算した値を血漿総コレステロー
ル値から差引くことによって、変性リポ蛋白のコレステ
ロール値を求めるものであり、以下の通り行なわれた。
代えて以下の方法を実施した。この方法は抗アポＡ−Ｉ
モノクローナル抗体結合アフィニティゲルを充填したカ
ラムと、抗アポＢ−100モノクローナル抗体結合アフィ
ニティゲルを充填したカラムとを用いて、血漿中のアポ
蛋白Ａ−Ｉ含有リポ蛋白（吸着画分）とアポ蛋白Ｂ−10
0含有リポ蛋白（吸着画分）とのそれぞれのコレステロ
ール値を求め、之等を加算した値を血漿総コレステロー
ル値から差引くことによって、変性リポ蛋白のコレステ
ロール値を求めるものであり、以下の通り行なわれた。
即ち、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体結合アフィニテ
ィゲルを充填したミニカラムと、抗アポＢ−100モノク
ローナル抗体結合アフィニティゲルを充填したミニカラ
ムとに、各々前記（４）と同一の複数の健常人からの血
漿250μを流して吸着させ、カラムを0.01MPBS緩衝液
（pH7.2）20mlで洗浄後、1M酢酸及び0.5M NaCl混液10m
lで溶出させ、溶出液に1/2倍量の3.5Mトリス塩酸緩衝液
を加え、その1mlにMercko Test CHO（関東化学社製）2m
lを添加し、37℃で30分間インキュベートした後、コレ
ステロール量を365nmでの吸光度測定により求めた。
ィゲルを充填したミニカラムと、抗アポＢ−100モノク
ローナル抗体結合アフィニティゲルを充填したミニカラ
ムとに、各々前記（４）と同一の複数の健常人からの血
漿250μを流して吸着させ、カラムを0.01MPBS緩衝液
（pH7.2）20mlで洗浄後、1M酢酸及び0.5M NaCl混液10m
lで溶出させ、溶出液に1/2倍量の3.5Mトリス塩酸緩衝液
を加え、その1mlにMercko Test CHO（関東化学社製）2m
lを添加し、37℃で30分間インキュベートした後、コレ
ステロール量を365nmでの吸光度測定により求めた。
次いで上記で求めたコレステロール値を血漿総コレステ
ロール値当たりの比として、下記式（Ｉ）に従うパラメ
ーター（Ｐ）を算出した。
ロール値当たりの比として、下記式（Ｉ）に従うパラメ
ーター（Ｐ）を算出した。
但し、Ａは血漿総コレステロール値（mg/dl）を、Ｂは
血漿から分離したアポ蛋白Ａ−Ｉ含有リポ蛋白のコレス
テロール値（mg/dl）を、Ｃは血漿から分離したアポ蛋
白Ｂ−100含有リポ蛋白のコレステロール値（mg/dl）を
それぞれ示す。
血漿から分離したアポ蛋白Ａ−Ｉ含有リポ蛋白のコレス
テロール値（mg/dl）を、Ｃは血漿から分離したアポ蛋
白Ｂ−100含有リポ蛋白のコレステロール値（mg/dl）を
それぞれ示す。
得られた結果（血漿総コレステロール値:TCHO）及び変
性リポ蛋白コレステロール値:LipoZ−CHO）を、前記
（４）記載の本発明方法と対比して、下記第１表に示
す。
性リポ蛋白コレステロール値:LipoZ−CHO）を、前記
（４）記載の本発明方法と対比して、下記第１表に示
す。
上記第１表より、本発明のキットを利用する方法によれ
ば、比較法に比べて、より正確に変性リポ蛋白量を測定
でき、バラツキのないことが判ると共に、本発明の測定
法は、それ自体容易且つ簡便であり、非常に優れたもの
であることが明らかである。
ば、比較法に比べて、より正確に変性リポ蛋白量を測定
でき、バラツキのないことが判ると共に、本発明の測定
法は、それ自体容易且つ簡便であり、非常に優れたもの
であることが明らかである。
（６） 更に、上記（４）において健常人に代えて糖尿
病患者、虚血性心疾患患者、脳血管障害患者のそれぞれ
複数人（各５名）を検体として、同様にして本発明キッ
トを利用して変性リポ蛋白コレステロール値（LipoZ−C
HO、mg/dl）を求めると共に、総コレステロール値（TCH
O）、トリグリセライド値（TG）、高密度リポ蛋白コレ
ステロール値（HDL−Ｃ）をそれぞれ求めた。
病患者、虚血性心疾患患者、脳血管障害患者のそれぞれ
複数人（各５名）を検体として、同様にして本発明キッ
トを利用して変性リポ蛋白コレステロール値（LipoZ−C
HO、mg/dl）を求めると共に、総コレステロール値（TCH
O）、トリグリセライド値（TG）、高密度リポ蛋白コレ
ステロール値（HDL−Ｃ）をそれぞれ求めた。
即ち、上記（１）と同様にして調製した各患者の血漿20
μを試験管に加え、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体
及び抗アポＢ−100モノクローナル抗体をそれぞれ結合
させたアフィニティゲル（ゲル1ml当り各抗体を蛋白量
として10mgずつカップリング反応させたブロムシアン活
性化セファロース−4B）を含有する反応液（各ゲルを等
量の0.15M NaCl含有0.01Mトリム塩酸緩衝液（pH7.4）
に混和して調製した、各抗体のそれぞれ160μを含
む）600μを分注し、30分間振盪後、10分間静置して
上清200μを分取し、次に該上清にMercko Test CHO
（関東化学社製）2mlを添加し、37℃で20分間インキュ
ベート後、該上清中のLipo−Ｚ−CHO量を吸光度測定に
より求めた。
μを試験管に加え、抗アポＡ−Ｉモノクローナル抗体
及び抗アポＢ−100モノクローナル抗体をそれぞれ結合
させたアフィニティゲル（ゲル1ml当り各抗体を蛋白量
として10mgずつカップリング反応させたブロムシアン活
性化セファロース−4B）を含有する反応液（各ゲルを等
量の0.15M NaCl含有0.01Mトリム塩酸緩衝液（pH7.4）
に混和して調製した、各抗体のそれぞれ160μを含
む）600μを分注し、30分間振盪後、10分間静置して
上清200μを分取し、次に該上清にMercko Test CHO
（関東化学社製）2mlを添加し、37℃で20分間インキュ
ベート後、該上清中のLipo−Ｚ−CHO量を吸光度測定に
より求めた。
結果を各患者毎に下記第２表に示す。
（７） 更にWHOが定めている高脂血症の型分類に従っ
て分類された患者の血漿を用いて、変性リポ蛋白量を上
記（１）と同様にして測定した。
て分類された患者の血漿を用いて、変性リポ蛋白量を上
記（１）と同様にして測定した。
その結果を下記第３表に示す。
実施例 ２ 実施例１に従うトリグリセライド（TG）及び総コレステ
ロール（TCHO）測定値が高値［TG＞150、TCHO＞250］を
示し、高脂血症を呈すると判断された患者につき、98日
間に亘って毎日朝晩プロブコール500mg（250mg錠２錠）
を投与し、その投与開始前（治療前）及び投与期間終了
後に、それぞれ実施例１と同様にして、トリグリセライ
ド値及び血漿コレステロール値を測定すると共に、実施
例１に示したと同一の本発明キットを利用して、変性リ
ポ蛋白値を測定した。
ロール（TCHO）測定値が高値［TG＞150、TCHO＞250］を
示し、高脂血症を呈すると判断された患者につき、98日
間に亘って毎日朝晩プロブコール500mg（250mg錠２錠）
を投与し、その投与開始前（治療前）及び投与期間終了
後に、それぞれ実施例１と同様にして、トリグリセライ
ド値及び血漿コレステロール値を測定すると共に、実施
例１に示したと同一の本発明キットを利用して、変性リ
ポ蛋白値を測定した。
その結果、トリグリセライド値は、治療前値425から治
療後値389に変化した。また、血漿コレステロール値の
変化は第２図（１）に、変性リポ蛋白値は第２図（２）
に示す通りであった。
療後値389に変化した。また、血漿コレステロール値の
変化は第２図（１）に、変性リポ蛋白値は第２図（２）
に示す通りであった。
之等の図から、本発明によれば症状に対応する正確な変
性リポ蛋白の測定が可能であり、疾患の診断が行ない得
ることが判る。
性リポ蛋白の測定が可能であり、疾患の診断が行ない得
ることが判る。
第１図は本発明キットを利用した変性リポ蛋白の測定値
と血漿コレステロール値との相関を調べた図であり、第
２図（１）及び（２）は、高脂血症患者の血漿コレステ
ロール値及び変性リポ蛋白値を治療前に測定した結果を
示す図である。
と血漿コレステロール値との相関を調べた図であり、第
２図（１）及び（２）は、高脂血症患者の血漿コレステ
ロール値及び変性リポ蛋白値を治療前に測定した結果を
示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】アポ蛋白Ａ−Ｉに対するモノクローナル抗
体を結合させたアフィニティゲルとアポ蛋白Ｂ−100に
対するモノクローナル抗体を結合させたアフィニティゲ
ルとを必須成分として含有することを特徴とする脂質代
謝異常検出用キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23189389A JPH07104351B2 (ja) | 1988-09-29 | 1989-09-06 | 脂質代謝異常検出用キット |
| EP89117937A EP0361468B1 (en) | 1988-09-29 | 1989-09-28 | A kit for the detection of denatured lipoproteins |
| DE1989606742 DE68906742T2 (de) | 1988-09-29 | 1989-09-28 | Testsatz zum Nachweis von denaturierten Lipoproteinen. |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24498788 | 1988-09-29 | ||
| JP63-244987 | 1988-09-29 | ||
| JP23189389A JPH07104351B2 (ja) | 1988-09-29 | 1989-09-06 | 脂質代謝異常検出用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02216460A JPH02216460A (ja) | 1990-08-29 |
| JPH07104351B2 true JPH07104351B2 (ja) | 1995-11-13 |
Family
ID=26530168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23189389A Expired - Lifetime JPH07104351B2 (ja) | 1988-09-29 | 1989-09-06 | 脂質代謝異常検出用キット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0361468B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07104351B2 (ja) |
| DE (1) | DE68906742T2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5403745A (en) * | 1990-04-27 | 1995-04-04 | Genzyme Corporation | Determination of analytes in biological fluids in the presence of substances interfering with assays therefor |
| JP3356556B2 (ja) | 1993-10-22 | 2002-12-16 | 第一化学薬品株式会社 | 変性リポプロテイン類の測定法 |
| CN1048808C (zh) * | 1995-05-17 | 2000-01-26 | 北京大学 | 一种用于检测高血脂血清的试剂盒及其制备方法 |
| CA2453538A1 (en) * | 2001-07-12 | 2003-01-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method for determination of denatured lipoprotein, reagent for determination of denatured lipoprotein, method for detection of cardiovascular disease, and reagent for detection ofcardiovascular disease |
| US7399638B2 (en) | 2003-12-26 | 2008-07-15 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Prediction method for lipidosis |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2070820T3 (es) * | 1986-08-06 | 1995-06-16 | Scripps Clinic Res | Anticuerpos monoclonales especificos de la apolipoproteina b, producidos por dos nuevos hibridomas. |
-
1989
- 1989-09-06 JP JP23189389A patent/JPH07104351B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 DE DE1989606742 patent/DE68906742T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 EP EP89117937A patent/EP0361468B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0361468A1 (en) | 1990-04-04 |
| DE68906742D1 (de) | 1993-07-01 |
| JPH02216460A (ja) | 1990-08-29 |
| EP0361468B1 (en) | 1993-05-26 |
| DE68906742T2 (de) | 1993-12-16 |
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