JPH0977798A - 抗コレステリルエステル転送蛋白抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】コレステリルエステル転送蛋白（ＣＥＴＰ）に
対して高力価を有し、測定妨害物質である血中蛋白質に
対する交差反応性が低く、且つＣＥＴＰ分子中に安定に
存在する抗原決定基を認識する抗ＣＥＴＰ抗体、及び該
抗体を用いた簡便且つ高精度な検体中のＣＥＴＰの免疫
学的測定法、並びにこれに用いるＣＥＴＰ測定用試薬の
提供。 【解決手段】ＣＥＴＰに対して高力価を有し、且つ血中
に存在する測定妨害物質に対して交差反応性を有さない
モノクローナル抗体、及び予めＳＤＳで処理した検体
と、該抗体とを、ＳＤＳの存在下で反応させて抗原抗体
複合物を生成させることを特徴とする、検体中のＣＥＴ
Ｐの免疫学的測定法、並びにそれに用いるＣＥＴＰ測定
用試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、コレステリルエス
テル転送蛋白（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒ
ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：以下ＣＥＴＰと略
記する。）に対する抗体、及び該抗体を用いたＣＥＴＰ
の免疫学的測定法、並びに、これに用いるＣＥＴＰ測定
用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＣＥＴＰは、高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）
中のコレステリルエステル（ＣＥ）を引き抜き、超低比
重リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、中間比重リポ蛋白（ＩＤ
Ｌ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）へ転送する働きを有す
る蛋白質で、コレステロール代謝経路の一つである、所
謂コレステリルエステル転送経路に於ける中心的な役割
を果たすものの一つである。

【０００３】このＣＥＴＰは、1980年代後半には、いく
つかのグループにより完全精製法が確立されている蛋白
であり［Jarnagin,A.S.,et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci US
A 84,1854-1857(1987)；Hesler,C.B.,et.al.,J.Biol.Ch
em. 262,2275-2282(1987)；Kato,H.,et.al.,J.Biol.Che
m. 264,4082-4087(1989)］、ｍ−ＲＮＡを用いた解析に
よると、肝臓、脾臓、脂肪組織、小腸及び副腎等の臓器
等で主に生合成され、生体内に於ては血中に存在するこ
とが知られている。ヒトのＣＥＴＰは、476個のアミノ
酸からなる分子量約74000のシアル酸を含む糖蛋白質で
あり、糖鎖を完全に切断した場合の分子量は約58000と
なることが判っている。また、ＣＥＴＰは、構成アミノ
酸のうち約44％が疎水性のアミノ酸よりなるため、他の
血中蛋白質に比べて極めて疎水性が高いことが特徴であ
る。

【０００４】ＣＥＴＰの生体内での作用機序について
は、未だ解明されていない点が多いが、動脈壁中のマク
ロファージや平滑筋細胞に於けるＣＥＴＰの生成が、動
脈壁からのコレステロールの除去に関与していることを
示唆する報告［Stein,O.,et.al.,Arteriosclerosis 6,7
0-78(1986)］がなされており、この場合ＣＥＴＰは抗動
脈硬化的に働いている可能性が考えられる。

【０００５】一方、血中ＣＥＴＰ活性の強さは動物種に
よって異なり、例えば兎では非常に強く、ラット、羊等
は殆ど活性が認められない。ヒトＣＥＴＰ活性はこの中
間であるが、ＣＥＴＰ活性の強い動物種ではコレステロ
ール負荷による動脈硬化が惹起されやすく、逆にＣＥＴ
Ｐ活性の低い動物種では動脈硬化が誘発されにくいこと
が知られている。また、組織細胞から肝臓へコレステロ
ールを逆転送する経路のコレステロールの運搬体として
知られるＨＤＬでは、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤ
Ｌコレステロール）の血中濃度と虚血性心疾患との間で
負の相関があり、逆に組織細胞へのコレステロールの運
搬体であるＬＤＬでは、ＬＤＬ中のコレステロール（Ｌ
ＤＬコレステロール）の血中濃度と虚血性心疾患との間
で正の相関があることが知られている。遺伝性のＣＥＴ
Ｐ活性欠損症は、ＣＥＴＰ活性を欠損しているために血
中ＨＤＬコレステロール濃度が上昇し、高ＨＤＬコレス
テロール血症となるが、この患者家系では長寿のものが
多く認められている［Inazu,A.et.al.,N.Engl.J.Med. 3
23,1234-1238(1990)］。これはＣＥＴＰが欠損している
ことにより、動脈硬化が誘発されにくいので、結果的に
動脈硬化等の成人病の発病が起こりにくいためであると
考えられている。更に、ＣＥＴＰ活性を高めるために、
ヒトのＣＥＴＰ遺伝子を組み込んだトランスジェニック
マウスでは、ＨＤＬが20〜30％減少し［Agellon,L.B.,e
t.al.,J.Biol.Chem. 266,10796-10801(1991)］、これに
高コレステロール添加食を与えた場合、冠動脈硬化が起
こり、ＣＥＴＰが動脈硬化を促進することを示唆する知
見が報告されている［Marotti,K.R.,et.al.,Nature 36
5,73-75(1993)］。また更に、原発性胆汁性肝硬変（Ｐ
ＢＣ）の患者検体に於ても、ＣＥＴＰ活性が上昇するこ
とが知られており、ＰＢＣの指標としての有用性が示唆
されている。

【０００６】以上述べた如く、ＣＥＴＰ活性又はＣＥＴ
Ｐ濃度を正確に測定することは、動脈硬化関連疾患や肝
疾患等の研究分野に於て、或いはこれら疾患の診断分野
に於て極めて重要であると考えられており、これまでＣ
ＥＴＰを測定するために、ＣＥＴＰ活性を測定する方法
やＣＥＴＰ濃度を測定する方法等、様々な測定法が試み
られてきた。

【０００７】ＣＥＴＰ活性を測定する方法としては、例
えば、コレステリルエステル（ＣＥ）をラジオアイソト
ープで標識したドナーリポ蛋白（ＨＤＬ）とアクセプタ
ーリポ蛋白（ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ）とを一定の割
合で含有する反応液に試料を加え、一定温度で一定時間
加温する。その後、超遠心法又はヘパリン−マンガン法
等の沈殿法を用いて、ドナーリポ蛋白とアクセプターリ
ポ蛋白とを分離し、それぞれの放射活性を測定し、ＣＥ
転送活性を算出する方法［新井洋由，井上圭三，The Li
pid 2/2,183-195(1991)］等が知られている。しかしな
がら、この活性測定法では、高度な技術と特殊な設備を
必要とし、且つ操作が非常に煩雑であるうえに測定に長
時間を要するという問題があった。

【０００８】また、ＣＥＴＰ濃度を測定する方法として
は、抗体を用いたイムノアッセイ法も報告されている
［Y.L.Marcel,et.al.,J.Clin.Invest. 85,10-17(1990),
H.Mezdour,et.al.,Clin.Chem. 40/4,593-597(1994)］。
しかしながら、このようなイムノアッセイ法に使用され
ている抗体の殆どは、ＣＥＴＰのＣ末端側の極めて不安
定な脂質転送活性部位付近を認識しており、ＣＥＴＰ分
子中に存在する安定な抗原決定部位を認識していないの
で［Y.L.Marcel,et.al.,J.Clin.Invest. 85,10-17(199
0)］、検体中のＣＥＴＰの脂質転送活性が失われると同
時にＣＥＴＰ濃度も測定不可能となる、という問題があ
った。加えて、精製ＣＥＴＰや検体中に存在するＣＥＴ
Ｐは極めて不安定であり、凍結融解や４℃での保存で容
易に脂質転送活性が失われることが知られており、通
常、このＣＥＴＰの失活を防止するために、精製ＣＥＴ
Ｐや検体を−80℃以下の超低温で保存しなければならな
い、という問題もあった。これらのことは、精製ＣＥＴ
Ｐを使用した標準品の作製を困難にし、測定されたＣＥ
ＴＰ活性或いは濃度自体の信頼性を低くし、ひいては市
販のＣＥＴＰ測定キットの開発を困難ならしめている大
きな要因ともなっていた。

【０００９】また、このような従来の抗体は、例えば、
アルブミン、イムノグロブリン、フィブリノーゲン等の
血中蛋白質に対して著しい交差反応性を示すことが確認
されており、そのため、このような抗体を用いても、血
中のＣＥＴＰを正確に測定することは極めて困難であっ
た。

【００１０】また、これらの問題を解消するために、Ｃ
ＥＴＰ分子中に安定に存在し、且つ測定妨害物質である
血中蛋白質に対して交差反応性を示さない部分をエピト
ープとして認識する抗体の取得方法として、例えば、公
知のＣＥＴＰのアミノ酸配列から化学的に合成した合成
ペプチドを免疫原として抗体を作製する方法等も提案さ
れている。しかしながら、この方法で得られた抗体は、
測定妨害物質となる血中蛋白質に対する交差反応の程度
は低いものの、ＣＥＴＰに対する反応性も低いため、Ｃ
ＥＴＰ測定系を組むために用いるには問題の多いもので
あった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、ＣＥＴＰに対して高力価
を有し、測定妨害物質である血中蛋白質に対する交差反
応の程度が低く、且つＣＥＴＰ分子中に安定に存在する
抗原決定基を認識する抗ＣＥＴＰ抗体、及び該抗体を用
いた簡便且つ高精度な検体中のＣＥＴＰの免疫学的測定
法、並びに、これに用いるＣＥＴＰ測定用試薬を提供す
ることを目的とする。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）ＣＥＴ
Ｐに対して高力価を有し、且つ血中に存在する測定妨害
物質に対して交差反応性を有さないモノクローナル抗
体、の発明である。

【００１３】また、本発明は、（２）ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）で処理したＣＥＴＰと特異的に反応す
る抗体、の発明である。

【００１４】更に、本発明は、（３）ＳＤＳで処理した
ＣＥＴＰと特異的に反応するモノクローナル抗体、の発
明である。

【００１５】更にまた、本発明は、（４）予めＳＤＳで
処理した検体と、上記（２）又は（３）に記載の抗体と
を、ＳＤＳの存在下で反応させて抗原抗体複合物を生成
させることを特徴とする、検体中のＣＥＴＰの免疫学的
測定法、の発明である。

【００１６】また、本発明は、（５）上記（１）〜
（３）の何れかに記載の抗体を含んでなることを特徴と
する、ＣＥＴＰ測定用試薬、の発明である。

【００１７】即ち、本発明者らは、ＣＥＴＰに対して高
力価を有し、測定妨害物質である血中蛋白質に対する交
差反応の程度が低く、且つＣＥＴＰ分子中に安定に存在
する抗原決定基を認識する抗ＣＥＴＰ抗体を得るために
鋭意研究を重ねた結果、予めＳＤＳで処理し、負荷電状
態としたＣＥＴＰを免疫原として用いることにより、Ｃ
ＥＴＰ分子中に安定に存在する抗原決定基を認識し、測
定妨害物質である血中蛋白質に対して交差反応性を有さ
ず、且つＣＥＴＰ、特にＳＤＳ処理したＣＥＴＰに対し
て高力価を有する抗ＣＥＴＰ抗体を得ることができるこ
とを見出した。更には、意外にも、該抗体を使用して検
体中のＣＥＴＰを測定する場合に、検体を予めＳＤＳで
処理し、次いで、この検体と該抗体とを、本来であれば
抗原抗体反応を強く阻害するＳＤＳの存在下で反応させ
れば、検体中のＣＥＴＰを、簡便に、特異的且つ高精度
に測定することが可能であることを見出し、本発明を完
成するに至った。

【００１８】本発明の抗ＣＥＴＰ抗体は、ＳＤＳで処理
し、負荷電状態としたＣＥＴＰを免疫原とすることによ
り得られ、ＣＥＴＰ、特にＳＤＳ処理したＣＥＴＰに対
して高力価を有し、且つ血中に存在する測定妨害物質で
ある、例えばアルブミン、イムノグロブリン、フィブリ
ノーゲン等の血中蛋白質に対して交差反応を有さないも
の（交差反応の程度が低いもの、即ち、該抗ＣＥＴＰ抗
体を使用したＣＥＴＰ測定に於て、実用上問題となるよ
うな交差反応性を示さないものを含む。）である。ま
た、本発明のＳＤＳで処理したＣＥＴＰと特異的に反応
する抗ＣＥＴＰ抗体は、ＳＤＳで処理したＣＥＴＰに特
異性を有するものであれば、特に限定されないが、未処
理のＣＥＴＰに対して反応性を有さないもの、或いは反
応性が低いものであって、血中の測定妨害物質（例えば
アルブミン、イムノグロブリン、フィブリノーゲン等）
と交差反応性を全く有さないか、或いは交差反応の程度
が低い（即ち、実用上該抗ＣＥＴＰ抗体を使用したＣＥ
ＴＰ測定に影響を及ばさないようなもの）抗体であるこ
とが好ましい。本発明の抗ＣＥＴＰ抗体は、上記した如
き性質を有するものであればその由来については特に限
定されず、ポリクローナル抗体であっても、モノクロー
ナル抗体であっても何れにても良い。

【００１９】このような性質を有するポリクローナル抗
体を得る方法としては、ＳＤＳ処理したＣＥＴＰを、例
えば馬、牛、羊、山羊、兎、モルモット、ラット、マウ
ス等の動物に免疫する常法により得られる抗ＣＥＴＰポ
リクローナル抗体血清を、ＳＤＳ処理したＣＥＴＰを固
定化したアフィニティーカラムにより精製することによ
り得る方法等が挙げられる。

【００２０】また、本発明の抗ＣＥＴＰモノクローナル
抗体を得る方法としては、ＳＤＳ処理し、負荷電状態と
したＣＥＴＰを免疫原として免疫した、例えば馬、牛、
羊、山羊、兎、モルモット、ラット、マウス等の動物
の、例えば脾細胞、リンパ球等の免疫感作された細胞
と、例えば骨髄腫細胞等の永久的に増殖する性質を有す
る細胞とを、ケラーとミルシュタインらにより開発され
た自体公知の細胞融合技術により融合させてハイブリド
ーマを作製し、ＳＤＳ処理したＣＥＴＰと特異的に反応
するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを選
択し、該ハイブリドーマを培地中に培養するか、動物の
腹腔内に投与して腹水中に抗体を産生させて、該培養物
又は腹水より目的のモノクローナル抗体を採取する方
法、例えば遺伝子組換え技術等を応用した自体公知の方
法［Eur.J.Immunol.,6,511(1976)］により上記した如き
性質を有する抗体を産生する細胞を作製し、この細胞を
培養することにより目的のモノクローナル抗体を採取す
る方法等が挙げられる。

【００２１】本発明の抗ＣＥＴＰ抗体を得る方法に於
て、免疫原として用いるＳＤＳ処理したＣＥＴＰは、例
えばヒト血漿を濃度勾配超遠心法、連続的等密度超遠心
法等の超遠心法により比重1.21以上の画分とし、これを
アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過、硫酸アンモニウム分画、塩析
等の自体公知の精製法により精製して得られる、所謂粗
精製ＣＥＴＰ［N.M.Pattnaik,et.al.,B.B.A. 530,428-4
38,(1978)等］や、これを更に、例えばアフィニティー
クロマトグラフィー等により精製して得られる、所謂精
製ＣＥＴＰ［H.Kato,et.al.,J.Biol.Chem. 264/7,4082-
4087(1989)］を、ＳＤＳ処理することにより得ることが
できる。より具体的には、例えば以下の如き方法により
得た粗精製ＣＥＴＰ或いは精製ＣＥＴＰを用いればよ
い。

【００２２】即ち、ヒト新鮮血漿に硫酸アンモニウムを
加え50％飽和とした後、４℃で１〜２時間攪拌する。次
いで該溶液を7000rpmで30分間遠心処理し沈殿を得る。
得られた沈殿を10mMリン酸緩衝液（0.15M NaCl、2mM ED
TA含有、pH7.4）で溶解し、該緩衝液を用いて４℃で一
晩透析処理する。次いで、これにNaBrを添加溶解し、比
重を1.21〜1.25g/mlに調整した後、超遠心分離機にて、
255000Gav.で16℃、17時間超遠心処理し、比重1.21g/ml
以上の下層画分を回収する。回収した画分を、10mM Tri
s-HCl緩衝液（2M NaCl、2mM EDTA含有、pH8.0）で予め
平衡化しておいたフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラ
ム（φ2.6×60cm、ファルマシア社製）にかけてＣＥＴ
Ｐを吸着させ、次いで、該カラムを、ベッド体積の約２
倍量の10mM Tris-HCl緩衝液（2M NaCl、2mM EDTA含有、
pH8.0）で洗浄後、ベッド体積の約２倍量の2mM EDTA水
溶液でＣＥＴＰ活性画分を溶出する。得られたＣＥＴＰ
活性画分に、１／９容量の0.5M酢酸緩衝液（pH4.5）添
加し、これを、50mM酢酸緩衝液（pH4.5）で平衡化した
ＣＭ−セルロースカラム（ＣＭ−５２）（φ2.5×17c
m、ワットマン社製）にかけてＣＥＴＰを吸着させ、次
いで、ベッド体積の約10倍量の50mM酢酸緩衝液（pH4.
5）で洗浄後、ベッド体積の約10倍量の50mM酢酸緩衝液
（90mM NaCl含有、pH4.5）で活性画分を溶出すれば粗精
製ＣＥＴＰを得ることができる。更に、得られた粗精製
ＣＥＴＰを、39mMリン酸緩衝液（0.025％EDTA含有、pH
6.8）を用いて透析した後、予め同緩衝液で平衡化した
スクシニル化低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）を固定化したセ
ファロース４Ｂカラム（φ1.5×18cm、ファルマシア社
製）にかけてＣＥＴＰを吸着させ、次いで、ベッド体積
の約５倍量の該緩衝液で洗浄後、ベッド体積の約２倍量
の4mMリン酸緩衝液（pH6.8）で活性画分を溶出すれば精
製されたＣＥＴＰを得ることができる。

【００２３】上記の如き方法によって得られたＣＥＴＰ
をＳＤＳ処理する方法としては、例えばＣＥＴＰとＳＤ
Ｓを共存させ、これを通常15〜100℃、好ましくは25〜1
00℃、より好ましくは37〜100℃で、通常２分乃至20時
間、好ましくは２分乃至２時間、より好ましくは２分乃
至１時間加熱処理して負荷電状態とする方法、例えば自
体公知のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
りＣＥＴＰを泳動し、負荷電状態とした後、該ポリアク
リルアミドゲルからＣＥＴＰ分画を切り出し、これをホ
モジナイズする方法［役にたつ免疫実験法 p.9〜10
嶋田孝吉 他編集 講談社］、例えば上記の２つの方法
を組み合わせて行う方法等が挙げられる。

【００２４】上記の如き方法で得られたＳＤＳ処理した
ＣＥＴＰを用いて、本発明の抗ＣＥＴＰモノクローナル
抗体を得る方法をより具体的に述べれば、例えば以下の
如くなる。

【００２５】即ち、先ず、上記の如き方法により得られ
たＳＤＳ処理したＣＥＴＰと、完全フロイントアジュバ
ント等のアジュバントとを混合して懸濁液を作製する。
この懸濁液を前述の如き適当な動物に適当量、例えばＣ
ＥＴＰ量として、通常１回量0.1〜100μg、好ましくは
0.1〜10μgとなる量で、通常１〜５週間毎に、好ましく
は２〜５週間毎に、通常３〜10回、好ましくは３〜８
回、皮下、静脈内或いは腹腔内に投与して免疫する。免
疫後、該動物より採血し、その抗血清がＳＤＳ処理した
ＣＥＴＰと反応することを、例えばＳＤＳ処理したＣＥ
ＴＰを固相に用いた固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ
法）等の自体公知の方法により確認する。確認後、最終
免疫から３日後に免疫化動物から脾臓を摘出し、脾細胞
を常法により調製する。得られた脾細胞と、例えばＮＳ
−１細胞等の骨髄腫細胞とを常法に従い細胞融合し、常
法に従って、融合細胞をＨＡＴ選択する。選択された融
合細胞を培養し、培養上清を、ＳＤＳ処理したＣＥＴＰ
を固相に用いたＥＬＩＳＡ法や、ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動後ウエスタンブロットしたポリビニ
リデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜を用いる免疫染色法
に供して、上記の如き性質を有する抗ＣＥＴＰ抗体を産
生する細胞を更に選択する。次いで、限界希釈法による
クローニングを２回行い、安定して高力価の抗体を産生
することが認められたものを抗ＣＥＴＰモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。次いで常法
に従い、得られたハイブリドーマを動物の腹腔内に注射
し、腹水中に抗ＣＥＴＰ抗体を産生させる。この腹水を
採取し、例えば硫酸アンモニウム塩析、例えばリン酸緩
衝液等の緩衝液を用いた透析、例えばＤＥＡＥ−セルロ
ースカラム、プロテインＡカラム等の通常この分野で使
用される精製方法に従い精製し、精製モノクローナル抗
体とする。尚、モノクローナル抗体のサブクラスの決定
は、二重免疫拡散法（金原出版株式会社 臨床検査法提
要 第30版 P.842-843）等の自体公知の方法によって
行えばよい。

【００２６】本発明の抗ＣＥＴＰ抗体のより好ましい具
体例としては、ハイブリドーマＣＭ５ａ−27が生産する
ＣＭ５ａ−27及びハイブリドーマＣＭ５ａ−39が生産す
るＣＭ５ａ−39が挙げられる。尚、ハイブリドーマＣＭ
５ａ−27及びハイブリドーマＣＭ５ａ−39は、夫々平成
７年９月６日付で通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に、寄託番号FERM P-15156及び寄託番号FERM P
-15157として寄託してある。

【００２７】本発明の抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体
を、検体中のＣＥＴＰの免疫学的測定法により測定する
際に利用すれば、検体中のＣＥＴＰを従来法に於ける場
合よりも簡便に且つ高精度に測定することが可能であ
る。

【００２８】本発明のＣＥＴＰの免疫学的測定法は、Ｓ
ＤＳ処理した検体と本発明の抗ＣＥＴＰ抗体を用いて、
ＳＤＳの存在下でＣＥＴＰと抗ＣＥＴＰ抗体との抗原抗
体複合物を生成させる以外は、自体公知の免疫学的測定
法、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法
（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫比濁法、
免疫比ろう法等の常法に従い実施すればよく、使用され
る試液類もこれら自体公知の方法に準じて適宜選択すれ
ばよい。

【００２９】本発明のＣＥＴＰの免疫学的測定法に於け
る検体としては、ＣＥＴＰを含有するものであれば特に
限定されないが、より具体的には、例えば血漿、血清、
細胞組織液等の体液が挙げられる。

【００３０】本発明の測定法を実施するには、先ず、検
体をＳＤＳで処理する。検体をＳＤＳで処理する方法と
しては、ＳＤＳを用いて検体中のＣＥＴＰを負荷電状態
にさせ得る方法であれば特に限定されないが、例えば、
ＳＤＳ含有溶液と検体とを混合し、得られた混合液を加
熱処理する方法等が挙げられる。混合液を加熱処理する
場合は、例えばＳＤＳ含有溶液と検体とを混合し、得ら
れた混合液を、通常15〜100℃、好ましくは25〜100℃、
より好ましくは37〜100℃で、通常２分乃至20時間、好
ましくは２分乃至２時間、より好ましくは２分乃至１時
間加熱処理することにより実施される。また、ＳＤＳの
使用量としては、検体中のＣＥＴＰを負荷電状態にさせ
得る量であれば特に限定されないが、例えば上記の如き
ＳＤＳ含有溶液と検体とを混合し、得られた混合液を加
熱処理する方法に於ては、混合液中の濃度として、通常
0.001〜10％（W/V）、好ましくは0.01〜１％（W/V）の
範囲から適宜選択される。

【００３１】検体をＳＤＳで処理する際に使用される、
ＳＤＳを含有させる溶液としては、検体中のＣＥＴＰを
負荷電状態にすることを妨げる性質を有するものでなけ
れば良く、例えば精製水、例えばpH５〜９、好まし
くはpH６〜８で、１〜500mM、好ましくは１〜50mMの、
例えばリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、例えばＢＥ
Ｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等のグッドの緩衝液、等が好
ましく挙げられる。また、この溶液中には、検体中のＣ
ＥＴＰを負荷電状態にすることを妨げない量であれば、
例えばＮａＣｌ等の塩類、界面活性剤、防腐剤等が含ま
れていても良い。

【００３２】本発明のＣＥＴＰの免疫学的測定法に於て
用いられる抗ＣＥＴＰ抗体は、ＳＤＳ処理したＣＥＴＰ
と特異的に反応するもの、即ち、未処理のＣＥＴＰに対
して反応性を有さないもの、或いは反応性が低いもの
（例えば、未処理のＣＥＴＰに対して殆ど反応性を有さ
ないもの、未処理のＣＥＴＰよりもＳＤＳで処理したＣ
ＥＴＰに対する反応性の方が高いもの等）であれば特に
限定されないが、このような性質を有するものであっ
て、且つ血中に存在する測定妨害物質である、例えばア
ルブミン、イムノグロブリン、フィブリノーゲン等の血
中蛋白質に対して交差反応性を有さないもの、或いは交
差反応の程度が低いもの（即ち、該抗ＣＥＴＰ抗体を使
用したＣＥＴＰ測定に於て、実用上問題となるような交
差反応性を示さないもの）が好ましい。また、本発明の
ＣＥＴＰの免疫学的測定法に於て用いられる抗ＣＥＴＰ
抗体としては、上記の如き性質を有するものであれば、
例えば馬、牛、羊、山羊、兎、モルモット、ラット、マ
ウス等の動物に由来するポリクローナル抗体でもモノク
ローナル抗体でも何れでもよいが、特異性や品質の安定
性等を考慮するとモノクローナル抗体の方が好ましい。
このようなモノクローナル抗体としては、前述の如くし
て作製されたハイブリドーマから産生される抗ＣＥＴＰ
モノクローナル抗体が好ましく挙げられ、なかでも、ハ
イブリドーマＣＭ５ａ−27が生産するＣＭ５ａ−27及び
ハイブリドーマＣＭ５ａ−39が生産するＣＭ５ａ−39が
より好ましく挙げられる。また、これら抗ＣＥＴＰ抗体
は単独で用いても良いし、適宜組み合わせて用いても良
い。

【００３３】本発明のＣＥＴＰの免疫学的測定法に於い
て、ＣＥＴＰと抗ＣＥＴＰ抗体との抗原抗体複合物を生
成させる反応は、ＳＤＳの存在下で行われる。また、Ｓ
ＤＳの使用量は、抗原抗体複合物の生成を妨げない量で
あれば特に限定されないが、少量では抗原抗体複合物の
生成が不十分となり、また多量に存在する場合は、抗原
抗体複合物の生成自体を阻害してしまうので、ＣＥＴＰ
と抗ＣＥＴＰ抗体とを反応させる溶液中の濃度として、
通常0.001〜0.3％（W/V）、好ましくは0.01〜0.1％（W/
V）、より好ましくは0.02〜0.03％（W/V）の範囲から適
宜選択される。また、ＳＤＳの存在下でＣＥＴＰと抗Ｃ
ＥＴＰ抗体との抗原抗体複合物を生成させる反応に於け
る反応条件としては、特に制限はなく、通常行われてい
る反応条件と同様に行うことができるが、通常４〜40
℃、好ましくは25〜37℃で、通常0.5〜48時間、好まし
くは１〜５時間反応を行えばよい。尚、反応溶液中のＳ
ＤＳ濃度が高い場合（例えば、0.1％以上の場合）は、1
5℃未満で反応を行うとＳＤＳが析出する可能性がある
ので、このような場合は、15℃以上で反応を行うべきで
ある。

【００３４】本発明のＣＥＴＰの免疫学的測定法の一例
を示すと、以下の如くになる。即ち、前述の如くしてＳ
ＤＳ処理した検体と一定量の抗ＣＥＴＰ抗体（一次抗
体）とをＳＤＳの存在下で、要すれば適当な溶液中で、
４〜40℃で0.5〜48時間反応させて抗原抗体複合物（検
体中のＣＥＴＰ−抗ＣＥＴＰ抗体複合物）を生成させた
後、得られた反応液を、ＣＥＴＰを固定化した不溶性担
体と接触させ、該反応液中の未反応の抗ＣＥＴＰ抗体と
固定化されたＣＥＴＰとをＳＤＳの存在下で４〜40℃で
0.5〜48時間反応させて不溶性担体上に抗原抗体複合物
（固定化ＣＥＴＰ−抗ＣＥＴＰ抗体複合物）を生成させ
る。更に、この不溶性担体を常法により洗浄した後に、
抗ＣＥＴＰ抗体に対する標識抗体（二次抗体、例えば、
抗ＣＥＴＰ抗体がマウス由来のモノクローナル抗体であ
る場合は、抗マウスＩｇＧ抗体に適当な標識をしたも
の。）と４〜40℃で0.5〜16時間反応させて標識抗原抗
体複合物（固定化ＣＥＴＰ−抗ＣＥＴＰ抗体−標識抗体
複合物）を生成させ、該担体上の標識抗原抗体複合物中
の標識量を測定する。得られた標識量を、予め濃度既知
のＣＥＴＰ溶液を検体とし、上記と同じ試薬を用い同様
の操作を行って得た、標識量とＣＥＴＰ濃度との関係を
示す検量線にあてはめることにより、検体中のＣＥＴＰ
濃度を求めることができる。上記の例は、競合法の原理
による測定法の例であるが、非競合法の原理に基づく測
定法、所謂サンドイッチ法によっても、本発明の測定法
を実施することができることは言うまでもない。

【００３５】本発明の抗ＣＥＴＰ抗体は、ＣＥＴＰの脂
質転送活性部位を認識していないため、本発明のＣＥＴ
Ｐ測定法に於ては、失活したＣＥＴＰを標準品として使
用することが可能である。そのため、本発明のＣＥＴＰ
測定法では、従来の脂質転送活性を有するＣＥＴＰ標準
品（極めて不安定である。）を使用せざるを得なかった
測定法よりも、ＣＥＴＰ測定精度が大幅に向上してい
る。

【００３６】上記の如き測定法で使用される不溶性担体
としては、通常の免疫学的測定法で用いられるものであ
れば何れも使用可能であるが、例えばポリスチレン、ポ
リプロピレン、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリ
クロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバ
ー等の合成高分子化合物、例えば多孔性ガラス、スリガ
ラス、アルミナ、シリカゲル、活性炭、金属酸化物等の
無機物質等が好ましく挙げられる。また、これら不溶性
担体は、チューブ、ビーズ、ディスク状片、微粒子（ラ
テックス粒子）、マイクロプレート等多種多様の形態で
使用し得る。なかでもマイクロプレートは、洗浄の容易
さ及び多数の検体を同時処理する際の操作性等の点から
特に好ましく用いられる。尚、不溶性担体としてマイク
ロプレートを使用する場合には、標識量の測定にマイク
ロプレートリーダーを利用すれば、より簡便に測定を行
うことができる。また、このような不溶性担体に、抗原
を固定化させる方法としては、自体公知の固定化方法、
例えば共有結合により固定化する方法或いは物理的に吸
着させて固定化する方法（特公平5-41946号公報等）等
の固定化方法を利用すればよい。

【００３７】本発明の測定法に於て、ＣＥＴＰと抗ＣＥ
ＴＰ抗体との抗原抗体複合物を測定するために使用する
抗ＣＥＴＰ抗体に対する抗体（二次抗体）を標識するた
め或はＣＥＴＰをサンドイッチ法により測定する場合に
用いられる標識抗ＣＥＴＰ抗体を作製するために用いら
れる標識物質としては、例えばパーオキシダーゼ、マイ
クロパーオキシダーゼ、酸性フォスファターゼ、アルカ
リフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、
アセチルコリンエステラーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ル
シフェラーゼ等の酵素、例えば^99mＴｃ、¹³¹Ｉ、
¹²⁵Ｉ、¹⁴Ｃ、³Ｈ等の放射性同位元素、例えばフルオレ
セイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフ
チルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えば
ルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス
（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の
発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アントラ
セン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物
質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチル
ピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，
５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−
ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−
オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）
−ｐ−トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に
代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質
等、通常この分野で用いられている標識物質が全て挙げ
られる。

【００３８】また、これらの標識物質を、抗ＣＥＴＰ抗
体に対する抗体或は抗ＣＥＴＰ抗体に標識するには、例
えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦＩＡ等に於て一般
に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実
験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、19
71；図説 蛍光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフトサ
イエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合
忠、室井潔編、第２版、医学書院、1982等］を適宜利用
して行えばよい。また、標識方法として、アビジン（又
はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常
法を利用しても良いことは言うまでもない。

【００３９】本発明の測定法に於て抗原抗体複合物を生
成させる際に使用される溶液としては、抗原抗体複合物
の生成反応を妨げないものであれば良く特に限定されな
いが、通常この分野で用いられる緩衝液、例えばpH５〜
９、好ましくはpH６〜８の１〜500mM、好ましくは１〜5
0mMの例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、例えばＢＥ
Ｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等のグッドの緩衝液等は全て
挙げられる。尚、本発明の抗ＣＥＴＰ抗体とＣＥＴＰと
の抗原抗体複合物を生成させる場合に使用するために
は、該溶液中にＳＤＳを上で述べた如き濃度範囲で含有
させておかなければならないことは言うまでもない。
尚、この溶液中には、通常この分野で安定化剤として使
用されているもの、例えば糖類、蛋白質、界面活性剤等
が、通常この分野で使用される濃度範囲内で含有されて
いても良い。

【００４０】また、抗ＣＥＴＰ抗体に対する標識抗体
（二次抗体）或は標識抗ＣＥＴＰ抗体を反応させて生成
した標識された抗原抗体複合物中の標識量を測定する方
法としては、標識物質の種類により異なるが、標識物質
が有している何らかの方法により検出し得る性質に応じ
て、夫々所定の方法に従い実施すればよい。例えば、標
識物質が酵素の場合にはＥＩＡの常法、例えば「酵素免
疫測定法、蛋白質 核酸酵素 別冊 No.31、北川常廣・南
原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63頁、共立出版
（株）、1987年９月10日発行」等に記載された方法に準
じて測定を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合に
はＲＩＡの常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種
類及び強さに応じて液浸型ＧＭカウンター、液体シンチ
レーションカウンター、井戸型シンチレーションカウン
ター、ＨＰＬＣ用カウンター等の測定機器を適宜選択し
て使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、
第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、1971等参
照。）。また、標識物質が蛍光性物質の場合には蛍光光
度計等の測定機器を用いるＦＩＡの常法、例えば「図説
蛍光抗体、川生明著、第１版、(株)ソフトサイエンス
社、1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよ
く、標識物質が発光性物質の場合にはフォトカウンター
等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、
蛋白質 核酸 酵素別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻
章夫・石川榮治編集、252〜263頁、共立出版（株）、19
87年９月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を
行えばよい。更に、標識物質が紫外部に吸収を有する物
質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によ
って測定を行えばよく、標識物質がスピンの性質を有す
る場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば
「酵素免疫測定法、蛋白質核酸 酵素 別冊 No.31、北川
常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271頁、
共立出版（株）、1987年９月10日発行」等に記載された
方法に準じて夫々測定を行えばよい。

【００４１】より具体的には、例えば標識物質が酵素で
ある場合は、これを発色試薬と反応させて発色反応に導
き、その結果生成する色素量を分光光度計等により測定
する方法等の自体公知の方法が挙げられる。このような
目的で用いられる発色試薬としては、例えばｏ−フェニ
レンジアミン、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
シド、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチア
ゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、Ｎ−エチル−
Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、ｐ
−ニトロフェニルリン酸等、通常この分野で用いられる
発色試薬が挙げられる。また、発色反応を停止させるに
は、例えば反応液に１〜６Ｎの硫酸等の酵素活性阻害剤
を添加する等、通常この分野で行われている反応停止方
法を利用すればよい。

【００４２】検体中のＣＥＴＰを測定する目的で使用さ
れる、本発明の抗ＣＥＴＰ抗体を含んでなるＣＥＴＰ測
定用試薬は、上記した如き性質を有する抗ＣＥＴＰ抗体
を含んでいる以外は、自体公知の免疫学的測定用試薬に
使用される試薬類を、この分野で使用される濃度範囲内
で含有するように調製されたものであり、構成要件の好
ましい態様や使用濃度等は、上で述べた通りである。

【００４３】本発明の抗ＣＥＴＰ抗体を含んでなるＣＥ
ＴＰ測定用試薬は、上で述べた如き種々の免疫学的測定
法に於て使用することが可能である。

【００４４】本発明のＣＥＴＰの免疫学的測定法を実施
するにあたり、必要な試薬類を組み合わせたＣＥＴＰ測
定用キットを利用しても良い。このようなキットとして
は、ＳＤＳと抗ＣＥＴＰ抗体を含有する試薬を組み合わ
せたキットは全て挙げられる。より具体的には、例えば
ＣＥＴＰ固定化プレートを使用する免疫学的測定法に使
用する場合のキットとしては、ＣＥＴＰ固定化プレー
ト、検量線作成用標準ＣＥＴＰ溶液、ＳＤＳ含有検
体処理液、抗ＣＥＴＰ抗体含有試薬、酵素標識され
た、抗ＣＥＴＰ抗体に対する抗体含有試薬（以下、標識
抗体含有試薬と略記する。）、標識された酵素を検出
するための発色試薬、酵素反応停止液等を含んでなる
キット形態が好ましく挙げられる。該キットの各種溶液
や試薬中には、反応に悪影響を与えないものであれば、
例えば糖類、蛋白質、界面活性剤等の安定化剤等を通常
この分野で使用されている濃度範囲内で含有させておい
ても良い。また、抗ＣＥＴＰ抗体含有試薬や標識抗体含
有試薬等は、溶液でも凍結乾燥品でも良く、凍結乾燥品
の場合、該キットにはその溶解用溶液を含有させておく
ことが好ましい。これら抗ＣＥＴＰ抗体含有試薬や標識
抗体含有試薬の溶液或いは凍結乾燥品溶解用溶液中に
は、緩衝剤、保存剤、安定化剤等を通常この分野で使用
されている濃度範囲内で含有させておいても良い。

【００４５】以下に、参考例及び実施例を挙げて本発明
をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に
より何等限定されるものではない。

【００４６】

【実施例】

参考例．１ ＣＥＴＰの精製 ヒト新鮮血漿1000mlに硫酸アンモニウムを加え50％飽和
とした後、４℃で１時間攪拌した。攪拌後、４℃で7000
rpm／min、30分間遠心処理し、得られた沈殿を10mMリン
酸緩衝液（0.15M NaCl、2mM EDTA含有、pH7.4）（以
下、ＰＢＳ緩衝液と略記する。）約100mlで溶解し、Ｐ
ＢＳ緩衝液に対して４℃で一晩透析した（約５ｌ×２
回）。次いで、得られた溶液を適当量のNaBrを用いて、
比重1.21〜1.25g／mlに調整し、超遠心分離機にて、255
000×Gav、16℃で17時間超遠心処理した後に、下層画分
（比重が1.21g／ml以上の画分）を回収した。回収した
下層画分を、予め10mM Tris-HCl緩衝液（2M NaCl、2mM
EDTA含有、pH8.0）で平衡化したフェニルセファロース
ＣＬ−４Ｂカラム（φ2.6×60cm、ファルマシア社製）
にかけてＣＥＴＰを吸着させた後、該カラムを該緩衝液
約700mlで洗浄し、次いで2mM EDTA水溶液約700mlでＣＥ
ＴＰ画分を溶出させた。得られたＣＥＴＰ画分に１／９
容量の0.5M酢酸緩衝液（pH4.5）を添加、混合した後
に、予め50mM酢酸緩衝液（pH4.5）で平衡化したＣＭ−
セルロース（ＣＭ−５２）カラム（φ2.5×17cm、ワッ
トマン社製）に通してＣＥＴＰを吸着させた。該カラム
を50mM酢酸緩衝液（pH4.5）約500mlで洗浄後、90mM NaC
lを含有した該緩衝液約500mlでＣＥＴＰを溶出させて、
粗精製ＣＥＴＰ画分を得た。次に、得られた粗精製ＣＥ
ＴＰ画分を39mMリン酸緩衝液（0.025％ EDTA含有、pH6.
8）に対して透析し、これを、予め39mMリン酸緩衝液
（0.025％ EDTA含有、pH6.8）で平衡化した、サクシニ
ル化低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）を固定化したセファロー
ス４Ｂカラム（φ1.5×18cm、ファルマシア社製）にか
けてＣＥＴＰを吸着させた後、該カラムを39mMリン酸緩
衝液（0.025％ EDTA含有、pH6.8）約150mlで洗浄後、4m
Mリン酸緩衝液（pH6.8）でＣＥＴＰ画分を溶出し、精製
ＣＥＴＰを得た。尚、得られた粗精製ＣＥＴＰ画分、精
製ＣＥＴＰ画分（サクシニル化ＬＤＬカラム4mMリン酸
緩衝液溶出画分）、対照として、サクシニル化ＬＤＬを
固定化したセファロースカラムに吸着しなかった画分
（サクシニル化ＬＤＬカラム非吸着画分）及びサクシニ
ル化ＬＤＬを固定化したセファロースカラムを洗浄後、
1mMリン酸緩衝液（pH6.8）で溶出した画分（サクシニル
化ＬＤＬカラム1mMリン酸緩衝液溶出画分）を、10％Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）［新版 電気泳動実験法 平井秀松ら監修 電
気泳動学会編集 P288〜298（1989）(株)文光社］によ
り分画し、ＣＥＴＰの存在を確認した結果を図１に示
す。［各蛋白質の検出は、銀染色IIキットワコー（和光
純薬工業(株)製）を使用した、銀染色法により染色検出
した。］ 尚、図１中の各レーン番号は以下の試料を使用した結果
を夫々示す。 Ｌａｎｅ Ａ：分子量マーカー（SDS-PAGEスタンダード
low：バイオラッド社製） Ｂ：粗精製ＣＥＴＰ Ｃ：サクシニル化ＬＤＬ非吸着画分 Ｄ：精製ＣＥＴＰ（サクシニル化ＬＤＬ4mMリン酸緩衝
液溶出画分） Ｅ：サクシニル化ＬＤＬ1mM
リン酸緩衝液溶出画分 また、図１中「←」印はＣＥＴＰ部位を示す。

【００４７】実施例.１ 抗ＣＥＴＰモノクローナル抗
体の調製 参考例．１で得られたＣＥＴＰ画分と分子量マーカー
（SDS-PAGEスタンダードlow：バイオラッド社製）と
を、10％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、分子量マーカー
を流したポリアクリルアミドゲルのみをクイック ＣＢ
Ｂ染色試薬（和光純薬工業(株)製）を用いて、クマシー
ブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色した。次いで、ＣＥ
ＴＰ画分を流したポリアクリルアミドゲルを蒸留水約10
0mlで２回洗浄し、ＣＢＢ染色した分子量マーカーから
推定した、分子量約74000のＣＥＴＰ画分に相当する部
分を、約１mmの幅でポリアクリルアミドゲルから切り出
した。切り出したゲル（10レーン分）にＰＢＳ緩衝液２
mlを加え、この混合液を22Gの注射針を付けた注射筒か
ら数回押し出すことによりゲルを破砕し、これを抗原溶
液とした。次いで、この抗原溶液を、リビ アジュバン
ト システム ＭＰＬ＋ＴＤＭ エマルジョン（リビ・
イムノケム・リサーチ社製）の標準操作法に従って処理
して調製した懸濁液を免疫原として、ＣＥＴＰ量が0.1
〜10μg／匹となるように、マウスの腹腔内に該標準操
作法に従って、１回目の免疫から３週間後に２回目の免
疫を行い、更に２週間後に最終免疫を行った。最終免疫
から３日後に、脾臓を摘出し、これを滅菌したスリガラ
スを用いて良くほぐした後、ＲＰＭＩ １６４０培地
（日水製薬（株）製）に懸濁、遠心分離処理を数回繰り
返して、良く洗浄した。この洗浄した脾細胞1.5×10⁸個
と、同様にＲＰＭＩ １６４０培地で良く洗浄したマウ
スのミエローマ細胞（P3-NS-1-Ag4(NS-1)）1.5×10⁷個
とを試験管に取り、混合した後該試験管の底に広げた。
これに、ＲＰＭＩ １６４０培地で50％（W/V）としたポ
リエチレングリコール6000（和光純薬工業(株)製）溶液
１mlを静かに流し込み良く混和して、１分間細胞融合反
応を行った後、ＲＰＭＩ １６４０培地11mlを徐々に加
えてＰＥＧを希釈し、細胞融合反応を停止させた。得ら
れた細胞懸濁液を1500rpmで５分間遠心処理して上清を
除き、細胞を10％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ １６４
０培地100mlに懸濁した。これを96穴マイクロプレート
の各ウェルに0.1mlずつ分注し、５％ＣＯ₂の存在下、37
℃でインキュベートした。24時間インキュベート後、通
常の２倍濃度のＨＡＴ培地を各ウェルに0.1mlずつ分注
し、およそ48時間インキュベート後には、通常のＨＡＴ
培地で各ウェルの培養上清の培地交換を行った。細胞融
合反応より１週間後、各ウェルの培養上清0.1mlを除去
し、ＨＴ培地0.1mlを添加した。この操作をその翌日も
行った。細胞融合反応より10日後、培養上清について、
精製ＣＥＴＰを固相に用いたＥＬＩＳＡ法により抗体価
を調べ、抗体活性の強いウェルの細胞を限界希釈法によ
りクローニングを行った。更に、得られたクローンの培
養上清について、ウェスタンブロッティング法を用いた
免疫染色法［Towbin.,et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A.,76,4350(1979)］により抗体の特異性を調べ、抗体活
性が強く、特異性の高い抗体を産生するクローン３種類
（ＣＭ５ａ−２７、ＣＭ５−ａ３１及びＣＭ５ａ−３
９）を得た。

【００４８】実施例．２ 測定妨害物質との交差反応性
の検討 実施例．１で得られた３クローンが産生する夫々のモノ
クローナル抗体と、測定妨害物質となる血中蛋白質との
交差反応性を、血中蛋白質として、ヒトＩｇＧ、ヒトア
ルブミン及びヒトフィブリノーゲンを夫々用いたウェス
タンブロッティング法による免疫染色法［Towbin.,et.a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,76,4350(1979)］により検
討した。また、対照として、従来の抗ＣＥＴＰモノクロ
ーナル抗体であるＴＰ−３［Swenon,T.L.,et.al.,J.Bio
l.Chem.264,14318-14326(1989)］及び市販品抗ＣＥＴＰ
モノクローナル抗体（シバヤキ社製）と血中蛋白質との
反応性についても同様に検討した。結果を表１に示す。
尚、表１に於て、◎、○、△及び×は各血中蛋白質との
反応性を示し、◎は非常に強く反応することを、○は強
く反応することを、△は弱く反応することを、×は反応
しないことを夫々示す。また、これら５種類の抗ＣＥＴ
Ｐモノクローナル抗体について、精製ＣＥＴＰを固相に
用いたＥＬＩＳＡ法により、夫々の抗体力価を調べた。
この結果もあわせて表１に示す。尚、表１中の力価は、
ＴＰ−３の抗体力価を１としたときの相対値として示し
てある。

【００４９】

【表１】

【００５０】表１の結果から明らかな如く、本発明の抗
ＣＥＴＰモノクローナル抗体は、ＴＰ−３と比較する
と、測定妨害物質である血中蛋白質との交差反応性が非
常に少ないことが判る。また、市販品の抗ＣＥＴＰモノ
クローナル抗体は、血中蛋白質との交差反応性は少ない
ものの、ＣＥＴＰとの反応力価が極めて低いことも判
る。一方、本発明の抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体のう
ちＣＭ５ａ−２７及びＣＭ５ａ−３９は、ＴＰ−３及び
市販品の抗ＣＥＴＰモノクローナル抗体と比べて、ＣＥ
ＴＰに対する反応力価が極めて高いことが判る。以上の
ことから、ＣＥＴＰの免疫学的測定法に於て使用する抗
体としては、測定妨害物質との交差反応性が極めて低く
且つＣＥＴＰに対して高力価を示す本発明のモノクロー
ナル抗体が最も適していることが判る。尚、上記のクロ
ーンのうち、ＣＭ５ａ−２７とＣＭ５ａ−３９は、通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
おり、その寄託番号及び寄託日は以下の通りである。 クローンＣＭ５ａ−２７：寄託番号；FERM P-15156 寄託日；平成７年９月６日 クローンＣＭ５ａ−３９：寄託番号；FERM P-15157 寄託日；平成７年９月６日

【００５１】実施例．３ 検体中のＣＥＴＰの測定 （１）ＣＥＴＰ固定プレートの作製 参考例．１で得られた精製ＣＥＴＰ0.2μg／ml含有50mM
炭酸緩衝液（pH9.6）100μlを、96穴マイクロプレート
に分注し、４℃で16時間固定化処理し、次いで、１％Ｂ
ＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液200μlで37℃で１時間ブロ
ッキング処理した後、ＰＢＳ緩衝液で４回洗浄して目的
のＣＥＴＰ固定プレートを作製した。 （２）検体の前処理 原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）患者血漿23例及び健常者
血漿20例を検体とし、夫々の検体10μlに、0.5％ＳＤＳ
水溶液10μlを添加し、37℃で１時間反応させた。得ら
れた反応液に、ＣＭ５ａ−２７モノクローナル抗体（１
次抗体）17ngAb／ml含有10mMリン酸緩衝液（1％ＢＳＡ
含有、pH7.4）（ＰＢ緩衝液）200μlを添加し、37℃で
１時間反応させて、処理検体を調製した。 （３）検体中のＣＥＴＰの測定 （２）で得られた処理検体50μlと、0.023％ＳＤＳ水溶
液50μlとを、上記（１）で作製したＣＥＴＰ固定プレ
ートの各ウェルに添加し、37℃で２時間反応させた（未
反応のＣＭ５ａ−２７モノクローナル抗体とプレート上
のＣＥＴＰとの反応）。該プレートをＰＢＳ緩衝液で４
回洗浄後、各ウェルにホースラディッシュパーオキシダ
ーゼ標識抗マウスイムノグロブリンウサギポリクローナ
ル抗体（２次抗体：ダコ・ジャパン社製）を1.3μgAb／
ml含有ＰＢ緩衝液100μlを分注し、37℃で１時間反応さ
せた。反応後、該プレートをＰＢＳ緩衝液で４回洗浄し
た後、ｏ−フェニレンジアミン３mg／mlを含有する発色
液（0.017％H₂O₂及び50mMクエン酸含有、100mMリン酸緩
衝液、pH4.8）100μlを各ウェルに分注し、室温で30分
間酵素反応を行わせた後、６N硫酸100μlを各ウェルに
添加してその反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、
ＳＯＦＴmax-J（Ver．2.2、和光純薬工業(株)製）によ
りλ＝490nm、エンドポイント測定に条件設定したマイ
クロプレートリーダーＵＶmax（モレキュラーデバイス
社製）で測定した。得られた各吸光度を、予め精製ＣＥ
ＴＰをＰＢ緩衝液に添加して、ＣＥＴＰ濃度が夫々、
０，1.5，３，６，９，12μg／mlとなるように調製した
標準ＣＥＴＰ溶液を検体とした以外は上記と同じ試薬を
用い、同様の操作を行なって得られた、ＣＥＴＰ濃度と
吸光度との関係を表す検量線にあてはめ、各検体中のＣ
ＥＴＰ濃度を求めた。 （４）結果 標準ＣＥＴＰ溶液を用いて作製した検量線を図２に、ま
た、検量線に基づいて求めた、各検体中のＣＥＴＰ濃度
を表２に、更に、得られたＣＥＴＰ濃度に基づいた、Ｐ
ＢＣ患者と健常者との間の有意差検定の結果を図３に、
夫々示す。

【００５２】

【表２】

【００５３】表２及び図３の結果から明らかな如く、Ｐ
ＢＣ患者検体中のＣＥＴＰ濃度と、健常者検体中のＣＥ
ＴＰ濃度との間には、明らかに有意差が認められること
が判る。このことから、本発明の測定法により求めた各
患者血漿中のＣＥＴＰ濃度を、ＰＢＣ診断に利用するこ
とが可能となることも判る。

【００５４】

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、ＣＥＴＰに
対して高力価を有し、測定妨害物質である血中蛋白質に
対する交差反応の程度が低い抗ＣＥＴＰモノクローナル
抗体、ＳＤＳで処理したＣＥＴＰと特異的に反応する抗
体、該抗体を用いた検体中のＣＥＴＰの免疫学的測定
法、並びに、これに用いるＣＥＴＰ測定用試薬を提供す
るものであり、本発明の抗ＣＥＴＰ抗体を使用したＣＥ
ＴＰ測定法を利用することにより、従来の方法に比べ
て、簡便且つ高精度にＣＥＴＰを測定し得るという効果
を奏する発明であるので、斯業に貢献するところ大なる
発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例．１で得られた各画分を、10％ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果を示す。

【図２】実施例．３で得られた、コレステリルエステル
転送蛋白（ＣＥＴＰ）濃度と吸光度（OD.490nm）との関
係を表す検量線を示す。

【図３】実施例．３で得られた、原発性胆汁性肝硬変
（ＰＢＣ）患者と健常者との間の有意差検定の結果を示
す。

【符号の説明】

図１に於て、各レーン番号は以下の試料を使用して10％
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結果
を示す。 Ｌａｎｅ Ａ：分子量マーカー（SDS-PAGEスタンダード
low：バイオラッド社製） Ｂ：粗精製ＣＥＴＰ Ｃ：サクシニル化低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）非吸着画分 Ｄ：精製ＣＥＴＰ（サクシニル化ＬＤＬ4mMリン酸緩衝
液溶出画分） Ｅ：サクシニル化ＬＤＬ1mM
リン酸緩衝液溶出画分 また、図１中「←」印はＣＥＴＰ部位を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コレステリルエステル転送蛋白に対して
   高力価を有し、且つ血中に存在する測定妨害物質に対し
   て交差反応性を有さないモノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 ドデシル硫酸ナトリウムで処理したコレ
   ステリルエステル転送蛋白と特異的に反応する抗体。
3. 【請求項３】 ドデシル硫酸ナトリウムで処理したコレ
   ステリルエステル転送蛋白と特異的に反応するモノクロ
   ーナル抗体。
4. 【請求項４】 予めドデシル硫酸ナトリウムで処理した
   検体と、請求項２又は３に記載の抗体とを、ドデシル硫
   酸ナトリウムの存在下で反応させて抗原抗体複合物を生
   成させることを特徴とする、検体中のコレステリルエス
   テル転送蛋白の免疫学的測定法。
5. 【請求項５】 請求項１〜３の何れかに記載の抗体を含
   んでなることを特徴とする、コレステリルエステル転送
   蛋白測定用試薬