JPH0431762A - 心筋梗塞の判定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は抗体および定量や診断に有用な試薬に関する。

先行文献および解決課題 脂肪酸結合性蛋白（Ｆａｔｔｙ　　Ａｃ１ｄ　　Ｂｉｎ
ｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ　１以下、ＦＡＢＰという）は
細胞質に存在する蛋白で、脂肪酸と結合する能力を持ち
、脂肪酸の細胞内代謝に関係している。ＦＡＢＰは動物
の肝臓や心筋組織、小腸などに分布している。

最近、ヒトの心筋組織由来のＦＡＢＰ　（以下、ｈｈＦ
ＡＢＰという）が分離精製され、その構造解析も行われ
ている。Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２５２　９＋８　
（１９８９）には、ｈｈ−ＦＡＢＰは＋３２のアミノ酸
から構成され、分子量は＋４７６８であると報告されて
いる。

Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅｓ、、　８５　９８１　
　（１９８９）にはウサギ心筋組織由来のＦＡＢＰを用
いて作成したモノクロナル抗体がｈ　ｈ　−ＦＡＢＰと
交差反応を示すことを利用して、ＥＩＡ法によりｈ　ｈ
　−ＦＡＢＰが定量できると報告されている。しかし、
本法は、標準物質としてｈ　ｈ　−ＦＡＢＰではなくウ
サギ心筋組織由来のＦＡＢＰを用いたことおよび用いた
抗体のｈ　ｈ　−ＦＡＢＰに対する交差性がウサギ心筋
組織由来のＦＡＲＰと同等でないことがあいまって、本
法での測定値はｈｈ　−ＦＡＢＰ量を正確に反映してい
ない。

そこで本発明者らは種々検討し、より正確な免疫学的定
量法を確立するとともに多数の患者の体液中のｈ　ｈ　
−ＦＡＢＰ量を定量したところ、ｈｈ−ＦＡＢＰが心筋
梗塞のマーカーとして有用であることを見い出し、本発
明完成した。

発明の構成 本発明は抗ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ抗体およびこれを利用し
たｈ　ｈ　−ＦＡＢＰの免疫学的定量用試薬および心筋
梗塞の診断のための試薬に関するものである。

本発明の抗体は、ｈｈ−ＦＡＢＰを認識し、ヒト肝臓や
イヌ心筋組織由来のＦＡＢＰおよびヒトミオグロビンと
は実質的に交差反応をしないものである。

本発明の抗体はポリクロ−ナル抗体であってもよいしモ
ノクロ−ナル抗体であってもよい。より一層厳密な特異
性を持ち均質な品質のものが継続的に安定供給できる点
からすればモノクロ−ナル抗体がより好ましい。

本発明の抗体は、通常の方法により製造できる。

ポリクロ−ナル抗体はｈ　ｈ　−ＦＡＢＰでもってマウ
スやウサギ、ヤギ、ウマなどの動物を免疫することによ
り生産せしめることができるし、モノクロ−ナル抗体は
このような免疫された動物の膵臓細胞とミエローマ細胞
とをミルシュタインの方法により細胞融合させ、クロー
ニングをなし、ハイブリドーマを選択し、これをｉｎ　
ｖｉｖｏまたは＋ｎ　ｖ＋ｔｒ。

で培養することにより製造できる。抗原たるｈｈ−ＰＡ
ＢＰはヒト心筋組織から抽出・精製したり、細胞培養や
遺伝子組換え技術により製造できる。

ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰの免疫学的定量には、■本発明の抗
ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ抗体、■抗ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ抗体
と標識物との結合物および■不溶性キャリヤーと抗ｈｈ
−ｐ＾ＨＰ抗体の結合ないしは吸着物の内の少なくとも
１種または２種の試薬が用いられる。

標識物としては、ペルオキシダーゼやβ−ガラクトシダ
ーゼ、アルカリホスファターゼの如き酵素、＋５１のよ
うな放射性物質、フルオレッセイフインチオシアネート
のような蛍光性物質さらにはスビ／化合物などが挙げら
れる。不溶性キャリヤーとしては細菌細胞壁片、ガラス
やボリスチレ／のビーズ、チューブ、マイクロプレート
などのＥＩＡやＲＩＡで用いられるものや凝集反応用の
ラテックス粒子などが挙げられる。本発明の抗体と標識
物等との結合は、これらが存するカルボキシル基やアミ
ノ基、ＳＨ基、ＯＨ基などを利用して、結合剤の存在下
または非存在下、常法に従って行われる。

ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰの免疫学的定量は、本発明の抗体の
特異的な抗原結合能力を利用する方法であればいずれで
もよく、例えば、ＥＩＡ法やＲＩＡ法、ラテックス凝集
反応法などの方法により実施できる。

これらの免疫学的定量法で用いられる試薬としては、例
えば、競合ＥＩＡ法では、 ■　抗ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ抗体 ■　■の抗体に対する不溶化抗体（第２抗体）■　酵素
標識抗原 ■　標識酵素に対する基質 ■　標準ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ溶液 などが用いられ、サンドイッチＥＩＡ法では、■　酵素
標識抗ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ抗体■　不溶化抗ｈ　ｈ　−
ＦＡＢＰ抗体 ■　標識酵素に対する基質 ■　標準ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ溶液 などが用いられ、ラテックス凝集反応法、では、■　ラ
テックス粒子と抗ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ抗体との結合また
は吸着物 ■　標準ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ溶液 などが用いられる。

血清や尿の如きヒト体液中のｈ　ｈ　−ＦＡ［ｌＰｌ／
ベルを検知することは心筋梗塞の診断に有用である。

通常、ｈｈ−ＦＡＢＰレベルは心筋梗塞のｌｔ後に、ま
ず、血清レベルがピークに達し、その１〜２時間後に尿
中レベルがピークになるという変動パターンをとる。尿
中レベルは血清レベルよりも高く、血清レベルの５０〜
１００倍にも達することがある。

血清中のｈ　ｈ　−ＦＡＢＰのピークが出現する速さ（
時間）は、ヒトミオグロビンの場合と同様に速い。

なお、ヒトミオグロビンは心筋梗塞の初期にそのピーク
が出現する点において評価されるマーカーであるが、心
筋４１１ｔａ由来のものと骨格筋組織由来のものとを区
別できず、診断はかならずしも正確でないという欠点が
ある。ヒトの血清や尿中のｈｈ　−ＦＡＢＰの検知は、
先に説明した免疫学定量法により行える。治療の緊急度
によって、いずれの方法を選択するのかを決定すればよ
い。例えば、手術中における心筋梗塞の発症をモニター
するときはラテックス凝集反応法のような定量あるいは
定性の結果がすみやかに得られる方法が好適であり、心
筋梗塞が疑われる患者、例えば狭心痛を訴える患者に運
動負荷を施し、ｈｈ−ＦＡＢＰレベルを検知するような
、治療の閑急性よりも診断の正確さが求められるときは
競合ＥＩＡ法などが選択される。

具体例 次に参考例および実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明する。

なお、以下で略記号でもって表わされる緩衝液は次の組
成からなるものである。

緩衝液Ａ；０．１％ＢＳＡ−０，１％ＮａＮ３−０．９
％ＮａＣ］−００，０４Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０緩衝
液Ｂ；１０％グリセロール−１璽ＭＥＤ丁＾−２■Ｍ２
−メルカプトエタノール−０，９％ ＮａＣ１２０■Ｍす／酸緩衝液、ｐＨ７，４緩衝液Ｃ；
　１０％グリセロール−１ｍＭＥＤ丁＾−２■Ｍ２−メ
ルカプトエタノールー２０■Ｍ リン酸緩衝液、ｐＨ７，４ 緩衝液０１１０％グリセロール−１ｍＭＥＤＴ＾−２ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール−１５−Ｍ トリス−塩酸緩衝液、ｆ）Ｈ８，４ 緩衝液Ｅ　；　０．Ｉ　Ｍリン酸緩衝液、ｆ）８７．０
緩衝液Ｆ　；　０．０２Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，０緩
衝液Ｇ；１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＩ（４，０１１
１ｉ　Ｇ　Ｈ；　０．９　％　Ｎ＆Ｃｌ−０，１Ｍ　’
）　７　ａ！Ｉ緩衝液、ｐＨ７，４ 緩衝液１　；　０．０５Ｍリン酸−ホウ酸緩衝液、ｐＨ
６，０参考例　１　　　　　　ｈ　ｈ　−ＦＡＢｐＩ７
１＋調製死後５時間後に行われた病理解剖に際して得ら
れたヒトの心筋組織２５０ｇを用いてｈ　ｈ　−ＦＡＢ
Ｐを以下の方法で抽出・精製した。

心筋組織をナイフで切断し、２５００ｍ　ｌの緩衝液Ｂ
を加え、ポリトロン型ホモゲナイザーで処理し、遠心（
１０万Ｘｇ、９０分）し上清を得る。上清を緩衝液Ｂで
平衡化したセファクリルＳ−１００ＨＲ（ファルマシア
社）カラム（２，５Ｘ９５ｃｍ）を用いて分画する。分
子量１〜２万の分画を緩衝液Ｃに対して十分透析後、緩
衝液Ｃで平衡化したヒドロキシアパタイト（ナカライテ
スク社）カラム（２，５Ｘ３０ｃｍ）に添加し緩衝液Ｃ
で溶出する。最初に溶出される分画（粗製のｈ　ｈ　−
ＦＡＢＰ）を得る。これは後記実施例１における免疫抗
原として用いた。

粗製ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ溶液を緩衝液りに対して十分透
析後、緩衝液りで平衡化したＤＥＡＥ−セフ７セル（フ
ァルマシア社）カラム（ＩＸ５０ｃｍ）に添加し十分洗
浄後、吸着した蛋白を塩化カリの直線的濃度勾配（０〜
１５０　ｍ　Ｍ　）を有する緩衝液Ｃを用いて溶出する
。溶出される蛋白分画を２８０　ｎ　ｍの吸光度で追跡
し、各ピークを電気泳動法により分析し、分子量が約１
６０００の単一バンドを示す分画をｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ
溶液とした。

実施例　１　　　ポリクロ−ナル抗体の調製参考例１で
得た粗製ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ　（２，５ｍ　ｇ蛋白／ｍ
ｌ）に生理食塩水を蛋白濃度が１ｍｇ／ｒｒ＋ｊ！とな
るように加え、更に等量のフロイント完全アジュバント
を加えてＷｌｏＷ：！エマルジｇノを作成し、これをウ
サギの足ｌ！２カ所、背部皮下８ケ所に０．１ｍｌづつ
注射する。２週間後に背部皮下５カ所に０．１ｍｌづつ
注射する。以後同様にして追加免疫を２週間毎に６回行
う。最終免疫は、粗製ｈｈＦＡＢＰを蛋白濃度が２ｍｇ
／ｍ１となるように生理食塩水で希釈した溶液を等量の
フロイント完全アジュバントを加えＷｌｏ　Ｍ１エマル
ジョンを作成し、これをウサギの背部皮下１０ケ所にＯ
，１ｍｌづつ注射することにより行う。その９日後に頚
動脈より全血を採取し、血清を分離する。血清を緩衝液
Ａで希釈したものを抗ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰポリクロ−ナ
ル抗体溶液とした。

実施例　２　　モノクロ−ナル抗体の調製実施例１に準
じてＢＡＬＢ／Ｃマウスを免疫し、そのｎ臓細飽を採取
する。対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ
６３−Ａｇ８−０１　　（ＡＴＣＣ力９　ｃｌグ番号Ｃ
ＲＬ−１５９７）の５Ｘ１０’個と抗体生産性膵臓細胞
のｌＸｌ０’個を混合し、これを緩衝液Ｈで遠心（４０
０Ｘｇ１１０分）洗浄後、３７℃に保温した０、５　ｍ
　ｌのポリエチレングリコール１５００−　ＲＰ　Ｍ　
Ｉ　−１６４０培地（１：　１）を徐々に加え、ゆくつ
り撹拌する。

９０秒後、３７℃に保温した１０ｍ　ｌの細胞融合用無
血清培地（５０Ｕ／ｍ　ｌペニシリンＧ　Ｎ　５０μｇ
　／　ｍ　ｌ　ストレブトマイシ／含訂ＲＰＭＩ　−１
６４０培地）を同様にして加え、１０分後、同培地１０
ｍ　ｌを加えた後に遠心（４００Ｘ　ｇ　、　１０分）
シ、上清を除去する。得られるベレットにＨＡＴ培地を
加えて、常法により培養する。抗体価の高いハイブリド
ーマを選択し、限界希釈法によりクローニングをなし、
クローン化ハイブリドーマを樹立する。なお、抗体価の
検定は後記実施例３で調製したβ−ガラクトシダーゼ標
ｍ　ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰを用いて行った。クロ、−ン化
ハイブリドーマを、予めブリスタン処理したＢＡＬＢ／
Ｃマウスに接種し、目的のモノクロ−ナル抗体を含有す
る腹水を得る。

このモノクロ−ナル抗体の性質は次のとおりである。

■　ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰを認識する ■　ヒト肝臓由来のＦＡＢＰと実質的に交差しないＯイ
ヌ心筋組織由来のＦＡＢＰと実質的に交差しない ０　ヒトミオグロビンと実質的に交差しない＠ｈｈ−Ｆ
ＡＢＰおよび酵素標識ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰの双方に対し
て競合的に結合する 実施例　３　　酵素標ｍｈｈ−ＦＡＢＰノＩＩ製参考例
１で調製した精製ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ　（３，５ｍ　ｇ
蛋白／　ｍ　１　）　０．２　ｍ　ｌと１ｍＩの緩衝液
Ｅとの混液に２００μｇのｍ−ＭＢＳを含むジオキサン
０．２ｍｌを滴下し、室温で３０分間撹拌する。これに
ｌ０ｍ１の緩衝液Ｆを加え、ＹＭ−５限外濾過膜（アミ
７７社）で濃縮し、さらに同緩衝液Ｆの７ｍｌで２回洗
浄濃縮を行う。濃縮液１．５　ｍ　ｌに５００μｇの大
腸菌由来β−ガラクトシダーゼ（ベーリンガマンハイム
社）を含む緩衝液Ｆ０．２ｍｌと飽和硫安溶液０．２　
ｍ　ｌの混液を滴下し、室温で８０分撹拌する。緩衝液
Ａで十分洗浄したセファロース６Ｂ（ファマンア社）カ
ラム（１，５Ｘ７０ｃ　ｍ　）に上記反応混液を流し、
緩衝液Ａで溶出し、２ｍｌづつ分画する。２５〜３３番
目の分画をプールし、これを緩衝液Ａで５００倍に希釈
したものを酵素標識ｈｈ　−ＦＡＢＰ溶液とした。

実施例　５　　　不溶化第２抗体の調製ラクトバチルス
　プランタルム＾ＴＣＣ８０１９の細菌細胞壁片４０ｍ
　ｇを水４ｍｌに懸濁し、十分に均一にした後に１ｍｇ
の抗つサギＩｇＧヤギ抗体（第２抗体）を加え、撹拌下
、６０μｌの緩衝液Ｇ、５％水溶性カルボジイミド水溶
液１２０μｌおよび２５％グルタルアルデヒドｌＯμｌ
を順次加え、室温で１時間撹拌する。反応混液を遠心（
１５００Ｘｇ、　　１０分）シ、沈殿に５ｍＡ＋の緩衝
液Ａを加えて遠心洗浄する。これを３回くり返し、０．
５％の細胞壁片を含有する２０ｍ　ｌの緩衝液Ａに懸濁
する。

実施例　５　　　　　競合ＥＩＡ法 標準標準ｈ　−ＦＡＢＰ溶液または検体５０μｌを試験
管にとり、これに実施例１で得た抗ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ
ポリクロ−ナル抗体溶液２００μｌを加えて撹拌し、室
温で１５〜２０時間放置する。これに実施例３で得た酵
素標識ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ溶液２００μｌを加え、３７
℃で３０分間放置する。次に実施例４で得た不溶化第２
抗体の懸濁液２００μｌを加え３７℃で３０分間放置し
た後、０．９％ＮｉＣ１溶液２ｍｌを加え遠心（＋５０
０Ｘｇ１１０分）シ、上清を除去する。この洗浄操作を
さらに１回くり返す。沈殿に０．５　ｍ　ｌの緩衝液Ａ
を加えミキサーで撹拌して沈殿を完全に分散させ、３７
℃で３分間予熱し、これに１００μ！の酵素基質溶液［
０，３ｍＭ４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラク
トビラ／シト−１ｍＭＭｇｃ１２０．０４Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）］を加えて３７℃で放置する。６０分
後に酵素反応停止液（０，１Ｍに２ＨＰＯ４ＮａＯＨ緩
衝液、ｆ）　Ｈ１１）を加えて撹拌し、蛍光強度（励起
波長３６５ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）を測定する。

第１図は本法における定量曲線である。

実施例　６　心筋梗塞患者のｈ　ｈ　−ＦＡＢＰレベル
実施例５に従って、ある心筋梗塞患者の血中および尿中
のｈ　ｈ　−ＦＡＢＰレベルを定量し、第２図の結果を
得た。なお、同一検体について、日本臨床化学会年会記
録第２６集、８９頁（１９８Ｂ＞に記載の方法に従って
ミオグロビンも定量した。第２図において「Ｓ−」とあ
るのは血清を検体とした場合であり、ｒｕ−Ｊとあるの
は尿を検体とした場合を意味し、Ｍｂはミオグロビンを
意味する。従って例えば、ｒ　ｕ　−ｈ　ｈ　−ＦＡＢ
ＰＪは尿中のｈ　ｈ　−ＦＡＢＰを意味する。

第２図に示すように、この患者の場合には心筋梗塞の発
作が発生してから約５時間後に５−ｈｈ−ＦＡＢＰがピ
ークになり、その約３時間後にｕ−ｈｈ　−ＦＡＢＰの
ピークが出現し、そして５−ｈｈ−ＦＡＢＰのピークは
ｓ−Ｍｂのピークと一致している。

ｕ　−ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰピーク濃度はＳ　−ｈ　ｈ　
−ＦＡＢＰの約１００倍である。

緩衝液■に懸濁した１０％カルボン酸変性ラテックＸ　
ＨＯ９０１（粒径０．９３μ、日本合成ゴムｅ！Ｊｌ）
３５０μｌに２．５　ｍ　ｇの水溶性カルボジイミドを
含む水溶液５０μｌを滴下し、室温で撹拌する。３０分
後、実施例２で得たマウス腹水（抗ｈ　ｈ　−ＦＡＢＰ
モノクロナル抗体溶液）１００μｌを滴下し室温で３０
分撹拌する。遠心後、沈殿を５ｍｌの緩衝液Ａで３回洗
浄し、超音波処理によりラテックスを分散させ、緩衝液
Ａに懸濁し、１％の抗ｈ１１−　ＦＡＢＰモノクロ−ナ
ル抗体感作ラテックス懸濁液を調製する。

■　凝集反応 反応はラテックススライド法により行った。抗ｈ　ｈ　
−ＦＡＢＰモノクロ−ナル抗体感作ラテックス懸濁液２
０μｌを判定用スライドに滴下し、これに健常者または
種々の心筋梗塞患者の尿２０μｌを加え、よく混合し、
室温における３分後のスライド凝集像により凝集の程度
を判定し、次表の結果を得た。

なお、次表には同一検体について、実施例５の競合ＥＩ
Ａ法で定量した結果もあわせて掲載している。

および血中ミオグロビン（Ｓ Ｍｂ）の変動バタ ／を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト心筋組織由来の脂肪酸結合性蛋白（以下、ｈ
   ｈ−ＦＡＢＰという）を認識する抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体
   。
2. （２）抗体がポリクロ−ナル抗体である請求項１記載の
   抗体。
3. （３）抗体がモノクロ−ナル抗体である請求項１記載の
   抗体。
4. （４）［１］抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体、［２］抗ｈｈ−Ｆ
   ＡＢＰ抗体と標識物質との結合物および［３］不溶性キ
   ャリヤーと抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体との結合または吸着物
   の内の少なくとも１種または２種を構成要素とするｈｈ
   −ＦＡＢＰの免疫学的定量用試薬。
5. （５）［１］抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体、［２］抗ｈｈ−Ｆ
   ＡＢＰ抗体と標識物質との結合物および３不溶性キャリ
   ヤーと抗ｈｈ−ＦＡＢＰ抗体との結合または吸着物の内
   の少なくとも１種または２種を構成要素とする心筋梗塞
   の診断のための試薬。