KR100572542B1 - Ｎ-말단 ｐｒｏＢＮＰ 확인 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 N-말단 proBNP 의 상이한 에피토프를 검출하는 2 개 이상의 항체로 시료 중 N-말단 proBNP 를 확인하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 NYHA 클래스 I 내지 IV 의 환자의 시료와 건강한 개인의 시료를 구별 또는 분류하는데 사용된다. 본 발명은 또한 재조합 N-말단 proBNP, N-말단 proBNP 를 확인하는 방법에서 표준물로서의 그의 용도, 재조합 N-말단 proBNP 를 검출하는 항체 및 그의 제조에 관한 것이다.
Description
실시예 1
재조합 N-말단 proBNP (1-76)의 제조 방법
1. 재조합 N-말단 proBNP 의 클로닝
N-말단 proBNP (아미노산 서열 1-76)의 뉴클레오티드 서열을 유전적 합성을 이용하여 제조했다. 이.콜라이에서의 유전자의 최적 발현을 얻기 위해 DNA 서열을 이.콜라이에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 맞추었다. 유전자 제조에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기이다:
상기 프라이머로 PCR (폴리머라제 사슬 반응)을 사용하여 유전자의 제조를 수행했다. 증폭된 유전자를 예를 들어 벡터 pUC19 와 같은 적절한 벡터에 클로닝하고 이어서 서열분석했다. 발현 벡터 pQE8 에 유전자를 클로닝하기 위해 벡터 pUC19 에서 제한 절단 지점 Bam Hi 및 Hind III 를 통해 유전자를 잘라내고, 이어서 N-말단 히스티딘-태그가 있는 단백질을 발현시키는 벡터 pQE8 에 라이게이션하고 이.콜라이 M15 에 형질전환했다[pREP4].
2. 이.콜라이에서의 N-말단 proBNP 의 발현
이.콜라이에서 유전자를 발현시키기 위해 하룻밤 동안 배양한 재조합 이.콜라이 클론을 루리아-브로트(Luria-Broth)(100 ㎍/ml 앰피실린 및 50 ㎍/ml 카나마이신)에서 1/60 트랜스펙션하고 1 의 OD 550 에서 IPTG (이소프로필티오갈락토시드; 최종 농도 1 mM)로 유도했다. 유도 후, 배양물을 37 ℃ 에서 4 시간 동안 더 인큐베이션했다. 이어서 배양물을 원심분리하고 세포 펠렛을 pH 8.0 의 50 mM Na-포스페이트 완충액; 300 mM NaCl 에 모았다. 초음파를 통해 세포 현탁액을 분해시킨 후, 현탁액을 원심분리하고 상층액을 Ni-NTA (니트릴로-트리아세테이트) 칼럼 상에 적용했다. pH 8.0 의 50 mM Na-포스페이트 완충액; 300 mM NaCl; 20 mM 이미다졸로의 세척 단계를 거친 후, 히스티딘이 태그된 N-말단 proBNP 를 pH 8.0 의 50 mM Na-포스페이트 완충액; 300 mM NaCl; 300 mM 이미다졸로 용리했다. 용리된 분획을 모으고 pH 8.0 의 50 mM 트리스(Tris)로 투석했다. 불순물을 제거하기 위해 투석물을 Q-세파로스 칼럼에 적용했다. 정제된 N-말단 proBNP 의 질량을 MALDI-TOF 로 측정했다.
실시예 2
N-말단 proBNP 에 대한 폴리클론성 항체의 제조
1. 면역화
양을 완전한 프로인트(Freund) 보강제 내의 재조합 N-말단 proBNP (1-76)으로 면역화했다. 투여량은 동물 당 0.1 mg 였다. 면역화를 4 주 간격으로 10 개월의 기간 동안 반복했다. 초기 면역화를 하고 6 주 후 및 이후 1 달에 1 회 혈청 시료를 수득하고 그의 감응성 및 적정량을 시험했다.
2. 양 혈청으로부터의 폴리클론성 항체의 정제
재조합 N-말단 proBNP 로 면역화된 양의 원료 혈청으로부터 출발하여 지질 성분을 에어로실(aerosil)(1.5 %)로의 탈지화에 의해 제거했다. 이후 면역글로불린을 암모늄 술페이트(2 M)로 분리했다. 용해된 침전물을 15 mM KPO4, 50 mM NaCl pH 7.0 로 투석하고 DEAE 세파로스를 통해 크로마토그래피했다. IgG 분획, PAB<rec.NT-pro-BNP>S-IgG(DE) 가 용리물에 있었다.
3. NT-pro-BNP 특이적 폴리클론성 항체의 제조를 위한 순차적 친화성 크로마토그래피
아미노산 1-21, PAB<rec.NT-pro-BNP>M-IgG(IS, 1-21)에 대한 NT-proBNP 특이적 폴리클론성 항체의 정제를 위해, C-말단 바이오틴화 펩티드 HPLGSPGSASDLETSGLQEQR-Bi (1-21-Bi, 서열 번호 7)을 사용했다. 친화성 매트릭스를 펩티드(1-21-Bi) 1 mg 과 함께 스트렙타비딘-코팅 메타크릴레이트 중합체 입자(베링거 만하임, Ref. 1529188) 10 ml 의 로딩(loading)으로 제조했다.
친화성 매트릭스 10 ml 로 칼럼을 패킹하고 50 mM KPO4, 150 mM NaCl pH 7.5 (PBS)로 평형화했다. 순차적 친화성 크로마토그래피의 제 1 단계에서 PAB<NT-pro-BNP>S-IgG(DE) 850 mg 을 칼럼에 결합시켰다. 용리물을 제 2 단계(하기 참조)를 위해 보존했다. 칼럼을 PBS 및 20 mM KPO4, 500 mM NaCl, 0.1 % 트리톤 X-100, 0.5 % Na-데옥시콜산 pH 7.5 로 세척했다. 친화성 매트릭스에 특이적으로 결합된 IgG 를 ImmunoPure Gentle Ag/Ab 용리 완충액(Pierce, Product N°21013)으로 용리했다. 친화성 매트릭스를 1 M 프로피온산으로 재생시키고 PBS/NaN3 에서 보존했다.
상기에 기재된 것과 동일한 방식으로 펩티드 Bi-ELQVEQTSL (Bi-30-38 서열 번호 8)을 아미노산 30 내지 38 에 대한 NT-proBNP-특이적 면역글로불린의 정제를 위한 친화성 매트릭스의 제조에 사용했다. PAB<rec.NT-pro-BNP>M-IgG(IS, 30-38)을 제 1 친화성 정제의 용리물로부터 모았다.
4. PAB<NT-pro-BNP>S-IgG(IS, 1-21)의 바이오틴화
친화성-정제 항체를 바이오틴화 완충액(100 mM KPO4, 70 mM NaCl pH 8.0)으로 투석하고, 이후 용액을 1 mg/ml 의 단백질 농도로 조절한다. D-바이오티노일-아미노카프로산-N-히드록시숙신이미드 에스테르를 DMSO 에 용해시키고 1:7.5 의 몰 관계로 항체 용액에 첨가했다. L-리신을 첨가하여 반응을 정지시키고 표지 시약의 나머지를 투석으로 제거했다.
5. PAB<NT-pro-BNP>S-IgG(IS, 30-38)의 디곡시겐화
친화성-정제 항체를 디곡시겐화 완충액(100 mM KPO4, 70 mM NaCl pH 7.6)으로 투석하고 이후 용액을 1 mg/ml 의 단백질 농도로 조절한다. 디곡시게닌-3-CME-N-히드록시숙신이미드 에스테르를 DMSO 에 용해시키고 1:5 의 몰 관계로 항체 용액에 첨가했다. L-리신을 첨가하여 반응을 정지시키고 표지 시약의 나머지를 투석으로 제거했다.
실시예 3
N-말단 proBNP (1-76)에 대한 모노클론성 항체의 제조 및 스크리닝
1. NT-proBNP (1-76)에 대한 모노클론성 항체의 수득
생후 8-12 주 Balb/c 생쥐를 완전한 프로인트 보강제와 함께 재조합 N-말단 proBNP 항원 100 ㎍ 으로 복강내 면역화한다. 6 주 후 4 주 간격으로 3 회 더 면역화를 수행한다. 최종 면역화를 하고 1 주 후에 혈액을 취하고 항체 적정량을 시험 동물의 혈청에서 측정했다. 양성 반응 생쥐의 지라로부터 B-백혈구를 수득하고 영구 골수종 세포주와 융합시킨다. 융합을 켈러(Koehler) 및 밀스타인(Millstein)의 잘 공지된 방법(Nature 256, 1975, p. 495-497)에 따라 수행한다. 여기서 만들어진 혼성 세포의 1 차 배양물을 일반적인 방식, 예를 들어 시판되는 세포 분류기 또는 "한계희석법"으로 클로닝한다. (적절한 시험 방법으로) 재조합 N-말단 proBNP 와 양성적으로 반응하고 환자 혈청 중 천연 N-말단 proBNP 를 확인하는 상기 클론 배양물만을 프로세싱한다(2 참조). 상기 방식으로 본 발명에 따른 단일클론성 항체를 생성하는 몇몇 하이브리도마 세포주를 모았다.
복수(ascites)를 제조하기 위해 하이브리도마 세포 5 ×106 개를 프리스탄(Pristan) 0.5 ml 로 미리 1-2 회 처리한 Balb/c 생쥐에 복강내 주입한다. 2-3 주 후 복수액을 생쥐의 복부로부터 수득할 수 있다. 상기로부터, 항체를 일반적인 방식으로 분리할 수 있다. 상기 모노클론성 항체는 특이적으로 사람 N-말단 proBNP 에 대한 것이다. 하기에서 상기를 MAB M 10.1.11 또는 MAB M 13.4.14 로 지칭한다. 모노클론성 항체 둘 다는 하위클래스 IgG1, 카파(kappa)에 속한다.
상기 방법을 이용하여, 상기에서 언급한 것처럼 DSMZ 에 기탁된 하이브리도마-세포주 클론 M 10.1.11 및 M 13.4.14 모두가 분리될 수 있었다.
2. proBNP 펩티드 및 재조합 NT-proBNP 에 대한 항체에 대한 스크리닝 시험
면역화된 생쥐의 혈청, 혼성 세포의 배양 상층액 또는 복수액 내의 NT-proBNP 에 대한 항체의 존재 및 특이성을 확인하기 위해 하기 시험 원칙에 따라 클론을 평가했다:
a) 재조합 N-말단 proBNP 와의 반응성
마이크로타이터 플레이트(Nunc, Maxisorb)를 로딩 완충액(베링거, 0.2 M 소듐 카르보네이트/비카르보네이트, pH 9.3-9.5, Cat. No. 726 559) 내의 항원으로서 2.5 ㎍/ml 재조합 NT-proBNP 100 ㎕/웰과 교반하에 실온에서 1 시간 동안 결합시킨다. 후기-로딩을 PBS 완충액(포스페이트 완충 식염수, Oxid, Code-BR 14a) 및 1 % Byco C 에서 30 분 동안 수행한다. 이어서, 세척 완충액(0.9 염화나트륨 용액, 0.05 % 트윈(Tween) 20)으로 세척을 수행한다. 항체 시료를 실온에서 교반하에 1 시간 동안 100 ㎕/웰로 인큐베이션한다. 이어서 세척액으로 2 회 더 세척한다. 이후, 검출 항체 PAB<M-Fcy>S-Fab-퍼옥시다제 콘쥬게이트(베링거 만하임, cat. No. 1500 686)(100 mU/ml) 100 ㎕/웰로 실온에서 교반하에 1 시간 동안 추가로 인큐베이션한다. 세척 완충액으로 더 세척한 후 퍼옥시다제 활성을 일반적인 방식으로 입증한다(예를 들어 ABTS로, 실온에서 30 분 동안 ELISA 판독기를 이용하여 405 nm 에서 mU 로 흡광 차이를 판독함).
b) N-말단 proBNP 펩티드와의 활성:
이 경우 스트렙타비딘-로딩 마이크로타이터 플레이트를 0.5 % 바이코(Byco) C 와, PBS 완충액(포스페이트 완충 식염수, Oxid, Code-BR 14a) 내의 항원으로서 서열 1-10, 8-18, 1-21, 16-30, 30-38, 39-50, 50-63 또는 64-76 의 NT-proBNP-펩티드 바이오틴 콘쥬게이트(250 ng/ml) 100 ㎕/웰과 실온에서 교반하에 1 시간 동안 결합시킨다. 이어서 세척 완충액(0.9 염화나트륨 용액, 0.05 % 트윈 20)으로 세척을 수행한다. 항체 시료 인큐베이션 및 검출 반응을 a)에 기재된 것처럼 수행한다. 특정 NT-proBNP 펩티드와의 반응성 때문에 에피토프의 위치를 결정할 수 있다.
c) 환자 시료 중 천연 N-말단 proBNP 와의 반응성
마이크로타이터 플레이트(Nunc, Maxisorb)를 로딩 완충액(베링거, 0.2 M 소듐 카르보네이트/비카르보네이트, pH 9.3-9.5, Cat. No. 728 559) 내의 5 ㎍/ml PAB<사람 proBNP>S-IgG (IS, (1-21) 또는 (30-38)S-IgG) 100 ㎕/웰과 실온에서 교반하에 1 시간 동안 결합시킨다. 후기-로딩을 PBS 완충액(포스페이트 완충 식염수, Oxid, Code-BR 14a) 및 1 % 바이코 C 에서 30 분 동안 수행한다. 이어서, 세척 완충액(0.9 염화나트륨 용액, 0.05 % 트윈 20)으로 세척을 수행한다. PBS 완충액으로 희석된, 환자 혈장 중 천연 항원을 100 ㎕/웰로 실온에서 교반하에 1 시간 동안 인큐베이션한다. 더 세척한 후 항체 시료 100 ㎕/웰로 실온에서 교반하에 1 시간 동안 인큐베이션한다. 이어서 세척액으로 2 회 더 세척하고, 검출 항체 PAB<M-Fcy>S-Fab-퍼옥시다제 콘쥬게이트(베링거 만하임 게엠바하, cat. No. 1500 686)(100 mU/ml) 100 ㎕/웰로 실온에서 교반하에 1 시간 동안 추가로 인큐베이션한다. 세척 완충액으로 더 세척한 후 퍼옥시다제 활성을 일반적인 방식으로 입증한다(예를 들어 ABTS로, 실온에서 30 분 동안 ELISA 판독기를 이용하여 405 nm 에서 mU 로 흡광 차이를 판독함).
3. 결과: N-말단 proBNP 에 대한 모노클론성 및 폴리클론성 항체의 반응 패턴
a) N-말단 proBNP 펩티드로의 면역화로부터의 MAB (c = 5 ㎍/ml)의 반응성:
상이한 펩티드로의 면역화로부터 수득된 모노클론성 항체는 대응하는 펩티드와 매우 강하게 반응한다. 재조합 N-말단 proBNP 와의 반응성은 2 개의 모노클론성 항체로 인식될 수 있을 뿐인 반면에 환자 풀 중 천연 N-말단 proBNP 와의 반응은 발생하지 않는다(표 1 참조).
b) 재조합 N-말단 proBNP 로의 면역화로부터의 모노클론성 항체(MAB)의 반응성
재조합 N-말단 proBNP 로의 면역화로부터 수득된 모노클론성 항체는 펩티드와 부분적으로 반응할 뿐이지만, 환자 풀 중 천연 N-말단 proBNP 또는 재조합 N-말단 proBNP 와는 매우 강하게 반응한다. 펩티드와 단일 모노클론성 항체의 비-반응은 소위 입체형태 에피토프의 확인을 가리킨다(표 2 참조).
c) 재조합 N-말단 proBNP 로의 면역화에 의한 PAB 의 반응성:
수득된 PAB 가 펩티드 1-21 및 30-38 과 가장 강한 반응을 나타냈다. 이를 근거로 상기 에피토프를 선택하고 PAB 를 상기 펩티드로 양성적으로 면역흡착했다. 펩티드 1-21 로 면역흡착된 PAB 는 영역 8-20 과 가장 강하게 반응하고 N-말단 서열 1-10 과의 반응은 명백하게 감소했다. 상기 방식으로 면역흡착된 PAB 는 재조합 N-말단 proBNP, 및 PAB/PAB 샌드위치 형식에서 천연 시료와 매우 강하게 반응한다(표 3 참조).
실시예 4
NT-proBNP 의 측정을 위한 고 감응성 면역분석
실시예 2 및 3 에서 제조된 항체를 사용하여 고 감응성 면역분석을 수행할 수 있었다. 통상, 상이한 에피토프 인식을 갖는 2 개의 항체를 적용하는 모든 시험 형식이 적절하다. 그 예로 소위 샌드위치-ELISA 를 설명한다.
고상으로서 스트렙타비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트(MTP)를 사용했다. 미처리 시료 또는 검정제(calibrator) 10 ㎕ 를 에피토프-특이적 항체 둘 다를 함유하는 완충액 100 ㎕ 와 함께 MTP 컵에 피펫팅하고 이어서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. 항체로서 1 ㎍/ml 의 바이오틴화 PAB<rec.NT-proBNP>S-IgG(IS, 1-21) 및 0.5 ㎍/ml 의 디곡시겐화 PAB<rec.NT-proBNP>S-IgG(IS, 30-38)를 사용했다. 이후 용액을 흡입 제거하고 세척 완충액 350 ㎕ 로 3 회 세척한다. 콘쥬게이트 용액 100 ㎕ 를 피펫으로 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 다시 인큐베이션한다. 콘쥬게이트로서 항-디곡신-항체-POD 콘쥬게이트를 100 mIU/ml 의 농도로 사용한다. 이어서 콘쥬게이트 용액을 흡입 제거하고 세척 완충액 350 ㎕ 로 3 회 세척한다. 끝으로 ABTS 기질 용액을 웰에 피펫팅하고 실온에서 30 분 동안 측정한다. 30 분 동안의 기질 반응 후 마이크로타이터 플레이트를 직접 MTP 판독기에서 405 nm 의 파장에서 측정하고 495 nm 의 참조파장에 대해 측정한다.
감응성을 측정하기 위해 검정 곡선을 만들고 정확한 표준 0 (n = 21)을 결정했다. 검정제로서 사람 EDTA 혈장을 사용하여, 이를 재조합 N-말단 proBNP 로 원하는 농도로 만들었다. 소 혈장을 표준 0 으로 사용했다. 그 결과를 표 4 에 나타낸다.
22.5 mU x ml/fmol 의 검정 곡선 기울기 및 5.7 mU 의 SD 를 토대로 하기 하한 검출 한계치가 카이저(Kaiser) 식에 따라 주어진다:
LDL = 3 SD 표준 0 / Cc 기울기 = 3 x 5.7/22.5 = 0.76 fmol/ml.
실시예 5
N-말단 proBNP 의 시료 안정성의 측정
실시예 4 에 기재된 샌드위치 ELISA 의 도움으로 N-말단 proBNP 의 분석물질 안정성을 측정했다. 이를 위해 NYHA-클래스 II-III 의 환자 4 명으로부터 혈액을 EDTA-함유 수집관에 취하고 실온에서 3 일 동안 보존했다. 매일 시료를 취하고 N-말단 proBNP 의 농도를 측정했다. 참고 시료 및 EDTA 혈장 중 안정성 측정을 위한 시료를 직접 4 ℃ 내지 8 ℃ 로 냉각하고 15 분 동안 원심분리했다. EDTA 혈장을 4 ℃ 및 실온에서 보존하고 이어서 24 시간의 스트레스 기간 내에 상이한 시간마다 측정했다. 그 결과를 표 5 에 나타낸다.
상기 데이타는 N-말단 proBNP 가 시험 시간 내에 완전히 안정하고 그러므로 일상적인 파라미터로 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 상기 결과는 문헌 (Hunt et al., Clinical Endocrinology, 47, 287 (1997))과 일치하지 않고, 에피토프가 분석물질의 외부 끝에 있지 않은 2 개의 특이적 항체로의 상기 시험 형식의 선발 및 고안에 의해 분석물질 안정성이 영향을 받을 수 있다는 가정을 확증한다.
실시예 6
N-말단 proBNP 분석의 진단 감응성의 측정
진단 감응성의 측정을 위해서 실시예 4 에 기재된 시험을 다시 사용했다. 이를 위해서, 건강한 개인 114 명 및 NYHA-클래스 I 내지 IV 의 환자 235 명을 측정했다. 보통 건강한 개인과 NYHA 클래스 I 의 환자를 구별하는 것이 특히 중요하다.
상기 고-감응성 분석으로 NT-proBNP 6.6 fmol/ml 의 중간값과 7.3 fmol/ml 의 표준 편차가 건강한 혈액 공여자 110 명에서 측정되었다. 측정된 최저 수준은 0.2 fmol/ml 였다. 상기는 <1.0 fmol/ml 의 감응성이 참고 영역을 정확히 검출하는데 필요하다는 것을 명확하게 나타낸다. 상기 분포로 측정된 보통의 상한 값 영역(백분위수 97.5 %)은 26.6 fmol/ml 였다.
0-26.6 fmol/ml 의 참고 영역에 대해 NYHA 클래스 I-IV 의 환자 223 명 중 오직 16 명의 환자만이 표준 영역대 값을 나타냈다. 이는 93.3 % 의 임상적 감응성에 상응한다. 만약 오직 NYHA 클래스 I 의 환자만을 고려한다면 37 명의 환자 중 30 명이 양성으로 검출되었고, 이는 81.1 % 의 감응성에 상응한다.
이 결과는 고 감응성 N-말단 proBNP 분석으로 NYHA 클래스 I 심부전을 앓는 환자와 건강한 정상적인 집단을 명확하게 구별하는 것이 가능하다는 것을 입증한다. 지금까지 이용가능한 당업계의 분석(Dagubatti et al., Cardiovascular Research 36 (1997), 246)으로 상기는 달성될 수 없었다.
본 발명은 N-말단 pro BNP 의 상이한 에피토프를 검출하는 2 개 이상의 항체로 시료 중 N-말단 proBNP 를 확인하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 건강한 개인의 시료와 NYHA 클래스 I 내지 IV 의 환자의 시료를 구별하거나 분류하는데 사용된다. 본 발명은 또한 재조합 N-말단 proBNP, N-말단 proBNP 를 확인하는 방법에서 표준물로서의 상기의 용도, 재조합 N-말단 proBNP 를 검출하는 항체 및 그의 제조에 관한 것이다.
심부전은 서양에서 특히 널리 퍼져있는 현상이다. 로쉐 의학 사전(Roche medical dictionary, 1993, Urban & Schwarzenberg)에 따르면, 심부전은 운동하는 동안이나 심지어 휴식을 취하는 동안에 대사에 필요한 혈액 흐름을 생성시키거나, 정맥 환류를 확보하는 심장의 급성 또는 만성적인 불능을 말한다(후방 및 전방 심부전). 따라서, 심장의 펌프 기능이 약하다. 심부전의 원인은 매우 복잡하다. 특히, 심근의 염증성 및 퇴행성 변형, 관상동맥 관류 질환, 관상동맥 경색증 및 손상이 여기에서 언급된다. 이는 말초 혈류의 변형, 호흡, 신장 기능 및 전해질 대사(부종)의 질환, 및 골격의 근육 체계의 성능 저하의 원인이 된다.
뉴욕 심장 협회(New York Heart Association, (NYHA))에 따라, 신체 시험을 사용하여 노력한 후, 심부전이 하기 NYHA 클래스로 나누어진다: I 는 정상적인 신체 노력 후 통증이 완전히 없는 것을 의미하고, II 는 신체 견딤의 낮은 한계를 의미하고, III 은 신체 견딤의 강한 한계를 의미하고, IV 는 각각의 신체 활동으로, 대부분 휴식 중에도 또한 존재하는 불충분한 증상이 증가하는 것을 의미한다.
글리코시드, 혈관확장제, ACE 억제제 및/또는 β-차단제를 이용하는 심부전의 효과적인 의학적 치료에 있어서, 무엇보다도 심부전을 정확하게 진단하고 가능하면 심한 정도에 따라 분류하고 또한 치료 과정을 관찰하는 것이 필요하다.
당업계에 따르면, 예를 들어 ANP (N-말단 심방 나트륨배설증가 펩티드 호르몬) 및 pro ANP, CNP (C-나트륨배설증가 펩티드), 아드레노메둘린, 신경펩티드 Y, 엔도텔린(endotheline) 및 BNP (뇌 나트륨배설증가 펩티드)와 같은 심부전의 조기 진단을 위한 일부 혈청 마커가 논의된다. ANP 및 proANP 가 통상 심부전의 진단용 마커로 적절하지만; 상기는 그다지 안정하지 못하거나 혈액에서 짧은 반감기를 가질 뿐이어서 진단 측정에 장애가 된다(Clin. Sci. 95(3) (1998), 235-239; Cleland et al., Heart 75 (1996), 410-413).
자주 인용되고 의미있는 마커는 BNP (뇌 나트륨배설증가 펩티드)이다. 원래, BNP 는 돼지의 뇌에서 확인되었다. 이것은 구조적으로 및 기능적으로 ANP (심방 나트륨배설증가 펩티드)와 유사한 심장 호르몬이다(Sudoh et al., Nature 332 (1988), 78-81). 아미노산 32 개로 구성된 사람 BNP 는 주로 심실에서 분비되고 사람 혈장에서 순환한다. 진단 마커로서의 BNP 의 용도는 예를 들어, EP-A-0 542 255 에 공지되어 있다. BNP 는 분자내 이황화 다리를 갖고, 아마도 빠르게 분해되어야만 하는 호르몬으로서의 그의 생리학적 기능 때문에 분석물질로서 그다지 안정적이지는 않다. 그러므로, 진단 마커로서의 그의 용도는 단지 제한되어 있다 (Masuta et al., Clin. Chem. Vol. 44 No. 6 Supplement A (1998), 130; Tsuji et al., Clin. Chem. 40 (1994), 672).
BNP 의 전구체 분자, 즉 proBNP 는 아미노산 108 개로 구성되어 있는데, 이 중 BNP 라 불리는 상기에 언급된 C-말단 아미노산 32 개(77-108)가 실제 호르몬 효과를 나타낸다. 전구체로부터 방출된 N-말단 아미노산 1-76 은 N-말단 proBNP 로 불린다. BNP (77 - 108) 이외에도 N-말단 proBNP 및 더 분해된 생성물(1 - 76)이 또한 혈장 내에서 순환하므로(Hunt et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 214 (1995), 1175-1183) N-말단 proBNP 또한 심부전의 마커로서 관련이 있다. 전구체 분자 proBNP 도 또한 혈장에 있는지의 여부는 완전히 밝혀지지 않았다. 그러나 혈장 내 proBNP (1-108)의 낮은 방출이 검출가능하지만 N-말단에서의 매우 빠른 부분적 분해 때문에 일부 아미노산이 없다는 것이 문헌 [Hunt et al., Peptides, Vol. 18, No. 10 (1997), 1475-1481]에 기재되어 있다. 상기 분자는 문헌에서 고분자량(High Molecualr Weight) BNP 로 불린다.
WO 93/24531 (US 5,786,163)에는 N-말단 proBNP 를 확인하는 면역학적 방법 및 그것에 사용되는 항체가 기재되어 있다. 이 항체를 수득하기 위해 N-말단 proBNP 의 서열로부터의 단일 합성 제조 펩티드가 여기에 사용된다. 펩티드 면역화를 이용하여 항체를 제조하는 것은 이론상 가능하지만, 전체 분자와 관련된 친화성이 통상 너무 낮아서 시험 방법에서 필요한 감응성에 도달할 수 없다. 또한, 펩티드를 사용할 경우 수득된 항체가 예를 들어 펩티드의 C-말단을 확인할 수 있고, 그러므로 전체 분자 중 이 프래그먼트에만 결합할 수 있는 위험이 있다. 이로부터 상기 항체가 전체 분자에 결합할 수 없거나 단지 낮은 정도로만 결합할 수 있다는 결과가 도출된다. WO 93/24531 에서 N-말단 proBNP 로부터 유도된 하나의 단일 펩티드에 대한 폴리클론성 항체가 제조되었다. 제조된 항체가 경쟁적 시험 형식에서 면역화 펩티드(아미노산 47-64)에 결합하는 것이 나타나 있다. 그러나 항체가 시료 중 전체 분자로서의 천연 N-말단 proBNP 에 결합할 수 있다는 것을 보여주지는 않는다. 또한, WO 93/24531 에 기재된 샌드위치 시험이 기재된 것처럼 시료 내에서 수행될 수 없는데 왜냐하면 적절한 표준 재료가 없고 2 개의 상이한 에피토프에 대한 항체가 없었기 때문이다.
당업계의 또다른 문제는 시험 감응성이다. 표지된 형태로 추적자로서 펩티드 47-64 가 시료 또는 비표지된 펩티드 표준물 47-64 와 토끼 혈청으로부터의 폴리클론성 항체에 결합하기 위해 경쟁하는, WO 93/24531 에서 수행된 경쟁적 시험으로, 48 시간의 인큐베이션 후에 매우 보통인 경쟁에 이르게 되고 이로부터 대략 250 fmol/ml 의 하한 검출 한계치만이 유도될 수 있다. 상기는 건강한 개인과 심부전을 앓는 환자를 구별하는 것 및 심부전의 심한 정도에 따라 환자 시료를 구별 분류하는 것에도 충분하지 않다. 또한, 경쟁적 시험의 장시간의 인큐베이션이 자동화 실험에서 시료의 일상적인 측정에는 만족스럽지 못하다.
Hunt 등은 또한 N-말단 proBNP 의 검출을 위한 경쟁적 시험을 설명한다 (Clinical Endocrinology 47 (1997), 287-296). 이를 위해 혈장 시료의 복합 추출이 측정 전에 필요한데; 이는 분석물질의 파괴 및 측정 오류로 이어질 수 있다. 사용된 항혈청은 합성 펩티드로의 면역화로 WO 93/24531 과 유사하게 제조된다. Hunt 등은 N-말단 proBNP 아미노산 1-13 으로의 면역화에 의해 항혈청을 제조하고, 아미노산 1-21 의 펩티드가 표준물로 사용된다. 이 시험을 위해서 장시간의 인큐베이션이 또한 필요하다. 24 시간 동안 인큐베이션한 후에, 1.3 fmol/ml 의 하한 검출 한계치에 도달한다.
따라서, 짧은 인큐베이션 기간으로 천연 N-말단 proBNP 의 신뢰성 있고 감응성 있는 검출을 가능하게 하는 N-말단 proBNP 검출 방법이 당업계에는 없다.
그러므로 당업계의 상기 단점을 가능한한 많이 피하면서 시료 중 N-말단 proBNP 를 확인하는 방법을 제공하는 것이 목표였다. 특히 건강한 개인과 NYHA 클래스 I 내지 IV 의 환자의 환자 시료를 구별하기 위해서는 높은 시험 감응성에 도달하여야만 한다.
상기 목적은 청구항에 더 자세히 설명된, 시료 중 N-말단 proBNP 를 확인하는 방법으로 얻어진다. 이 방법은 N-말단 proBNP 의 상이한 에피토프를 검출하는 2 개 이상의 항체가 사용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법에서 중요한 것은 천연 N-말단 proBNP 가 시료에서 검출된다는 것이다. 이것은 항체가 시료 중 온전한 분자 및 아마도 존재하는 비절단 proBNP (1-108)을 확인하고 특이적으로 이것에 결합할 수 있어야만 하고, 가능하다면 부분적으로 단백질분해적으로 소화된 프래그먼트에도 또한 결합할 수 있어야만 하는 것을 의미한다. 이 방법에 있어서, N-말단 proBNP 의 상이한 에피토프에 결합하는 2 개 이상의 상이한 항체가 사용된다. 에피토프는 선형 또는 소위 입체형태(conformation) 에피토프일 수 있다. 바람직하게는 에피토프들은 두 항체가 동시에 결합하게 할 수 있고 서로 너무 멀리 떨어지지 않게 할 수 있는 방식으로 위치한다.
본 발명에 따른 방법이 N-말단 proBNP, proBNP 및 모 펩티드(분해 생성물)를 구별하도록 하지 않기 때문에, NT-proBNP 는 하기 시험 방법에서 확인된 모든 펩티드, 특히 공지된 N-말단 proBNP (1-76)을 의미한다.
본 발명에 있어서, "에피토프"라는 용어는 항체가 특이적으로 결합하는 항원과 같은 면역학적 결합 짝 상의 결합 부위를 의미한다. 보통 에피토프는 6 내지 8 개의 아미노산으로 명확하게 규정된다. 본 발명에 있어서, 결합 짝은 N-말단 proBNP 또는 그의 부분 서열에 대응한다. 항체가 결합하는 에피토프는 결합 짝 상에서 부분적인 영역을 구성한다. 에피토프는 선형 형태 또는 입체형태 에피토프로서 존재할 수 있다.
특이성이 다른 2 개의 항체를 이용하여, 당업계의 긴 경쟁적 시험 방법 대신에 분석물질을 더 빠르게 확인하는 방법을 수행하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 검출 방법은 동종 또는 이종 시험 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는 이종 시험 방법이 사용되고, 전문가에게 공지된 샌드위치 방법이 특히 바람직하다.
바람직하게는, N-말단 proBNP 의 상기 측정 방법을 하기 단계에 따라 수행한다:
a) 시료를, 고상에 결합하기에 적절한 기를 보유하는 제 1 N-말단 proBNP-특이적 항체와 혼합하거나, 이미 고상에 결합된 제 1 N-말단 proBNP-특이적 항체와 혼합하는 단계
b) 제 1 항체와는 다른 NT-proBNP 의 에피토프를 확인하고 표지를 보유하는 제 2 항체와 상기 용액을 혼합하는 단계
c) 단계 a)에 이미 존재할 수 있는 고상에 면역 복합체를 결합시키는 단계
d) 액상으로부터 고상을 분리하는 단계
e) 2 개의 상 중 하나 또는 둘 다에서 표지를 검출하는 단계.
정량 측정에서, 표준물로서 N-말단 proBNP 의 규정된 양으로 동일한 측정을 수행하고, 시료의 측정 후 단계 f), 즉 표준물의 측정값과 시료의 측정값의 비교를 수행하고, 이어서 수량화를 실행한다.
(본 발명에 있어서) "항체"라는 용어는 유전공학적인 변형에 의해 수득가능한 모노- 또는 폴리클론성, 키메라 또는 사람화 항체 또는 다른 항체뿐만 아니라 전문가에게 공지된 모든 프래그먼트, 예를 들어 F(ab')2, Fab' 또는 Fab 프래그먼트를 의미한다. N-말단 proBNP 에 대한 면역학적 특이적 결합 능력만이 보장되어야만 한다.
N-말단 proBNP 에 특이적인 제 1 항체는 직접적으로 고상에 결합되거나 특이적 결합 시스템을 통해 간접적으로 결합될 수 있다. 고상에 대한 상기 항체의 직접 결합은 전문가에게 공지된 방법, 예를 들어 흡착 방식을 따른다. 만약 결합이 특이적 결합 시스템을 통해 간접적이라면 제 1 항체는 N-말단 proBNP 에 대한 항체 및 특이적 결합 시스템의 반응 짝으로 구성되는 콘쥬게이트이다. 특이적 결합 시스템은 여기서 서로 특이적으로 반응할 수 있는 2 개의 짝을 의미한다. 결합 능력은 면역학적 반응 또는 상이한 특이적 반응을 토대로 할 수 있다. 바람직하게는, 바이오틴과 아비딘, 또는 바이오틴과 스트렙타비딘의 배합물을 특이적 결합 시스템으로서 사용한다. 더 바람직한 배합은 바이오틴과 항바이오틴, 합텐과 항-합텐, 항체의 Fc-프래그먼트와 이 Fc 프래그먼트에 대한 항체, 또는 탄수화물과 렉틴이다. 특이적 반응 시스템의 반응 짝 중 하나는 콘쥬게이트의 일부이다.
특이적 결합 시스템에서 제 1 결합 짝의 다른 반응 짝은 고상의 층이다. 바람직하게는 스트렙타비딘 또는 아비딘이 사용된다. 특이적 결합 시스템의 다른 반응 짝을 불용성 담체 물질에 결합시키는 것을 전문가에게 공지된 일반적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 여기서 공유 및 흡착 결합이 적절하다.
고상으로서, 특이적 결합 시스템의 반응 짝으로 그의 내부 표면에 코팅된, 폴리스티렌 또는 유사한 플라스틱으로 만들어진 시험관 또는 마이크로타이터(microtiter) 플레이트가 적절하다. 적절하고 특히 바람직한 다른 물질은 입자 물질, 예를 들어 라텍스 입자, 자성 입자, 분자 체 물질, 유리 미립자, 플라스틱관 등이다. 다공성의 층상 담체, 예를 들어 종이 또는 니트로셀룰로스 또한 담체로 사용할 수 있다. 특히 바람직하게는 상기에 기재된 특이적 결합 시스템의 대응하는 결합 짝으로 코팅된 자성 비드(bead)를 사용한다. 시험 반응의 완결 후, 상기 미세입자를, 예를 들어 여과, 원심분리에 의해 또는 자성 입자의 경우에는 자석을 통해 검출 반응 방법을 위해 액상으로부터 분리할 수 있다.
제 2 특이적 항체는 제 1 항체에 비해 N-말단 proBNP 의 상이한 에피토프를 확인한다. 분자 상의 2 개의 에피토프의 거리는 충분히 길어서 N-말단 proBNP 에 항체들이 동시에 결합하는 것이 제한 없이 가능하여야 한다; 만약 그렇지 않다면 샌드위치 복합체가 만들어질 수 없다.
N-말단 proBNP에 대한 항체와 N-말단 proBNP 사이의 특이적 결합 반응의 검출을 상이한 방식으로 수행할 수 있다. 통상, 제 2 항체를 표지한다. 일반적인 표지는 색소원, 형광단, 화학적- 또는 전기화학적발광제로 적절한 물질, 방사성동위원소, 합텐, 효소 마커 또는 특이적 결합 쌍을 이룰 수 있는 물질, 예를 들어 바이오틴/스트렙타비딘이다. 따라서 면역 복합체는 표지에 의해 방출된 신호를 이용하여 검출된다. 제 2 항체는 예를 들어 합텐 디곡시게닌으로 표지될 수 있다. 이 합텐은 다시 추가의 디옥시게닌-특이적 항체에 의해 결합된다. 디곡시게닌에 특이적인 이 항체는 그 자체로 예를 들어 퍼옥시다제와 같은 효소에 의해 표지된다. 이어서 최종 검출을 특정 물질이 퍼옥시다제에 첨가되었을 때 발생하는 흡광 또는 색상에서의 변화를 이용하여 수행한다.
전문가에게 공지된 모든 생물학적 액체를 N-말단 proBNP 를 확인하는 방법의 과정을 위한 시료로 사용할 수 있다. 바람직한 시료는 전혈, 혈액 혈청, 혈장, 소변 또는 침과 같은 체액이다. 혈액 혈청 및 혈장을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
액상 시험 시약으로의 소위 습식 시험 이외에, 항원, 합텐, 펩티드, 단백질, 항체 등의 검출에 적절한 일반적인 모든 건식 시험 형식을 또한 사용할 수 있다. 예를 들어 EP-A-0 186 799 에 기재되어 있는 상기 건식 시험 또는 시험 스트립(strip)은 하나의 단일 담체 상에서 모든 시험 성분을 배합한다(분석될 시료는 제외함). 검출 반응은 시험 스트립이 액체 시료와 접촉할 때 시작한다.
본 발명에 따른 방법은 N-말단 proBNP 에 대한 하한 검출 한계치가 1 fmol/ml (1 pmol/l 에 상응함) 미만인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 < 1 fmol/ml 의 높은 감응성은 장기간 동안 인큐베이션하지 않고 이루어진다. 마이크로타이터 시험의 총 기간은 2 시간 미만, 바람직하게는 전기화학적발광과 같은 더 감응성 있는 검출 방법으로 약 15 분이다. 검출될 농도에 관한 상한치는 실제로 상기 검출 방법에 대해서는 존재하지 않는다. 기술적인 상한치는 사용된 측정 방법에 의해 통상 주어진다. 또한 이 방법은 이론적으로 N-말단 proBNP 의 매우 높은 농도를 검출한다.
본 발명에 따른 방법의 다른 장점은 얻은 측정값을 이용하여 심부전이 있는 환자와 심부전이 없는 환자의 시료를 구별하는 것에 있어서 우수하다는 것이다. 이 검출 방법이 매우 감응성이 있어서 심지어 관상동맥 질병이 없는 개인과 심하지 않거나 단지 천천히 착수된 NYHA 클래스 I 및 II 의 심부전을 앓는 환자를 구별할 수 있다. 초기 심부전의 조기 입증은 약물로의 조기 치료의 시작을 결정하는 데 영향을 미칠 수 있고, 따라서 환자의 생존률을 분명히 연장시킬 수 있다.
본 발명의 다른 주제 문제는 재조합적으로 제조된 N-말단 proBNP 이다. N-말단 proBNP 는 아미노산 1-76 으로 구성된 N-말단 부분이고 108 개의 아미노산으로 구성된 전구체 분자 proBNP 로부터 방출된다.
N-말단 proBNP 는 또한 이 분자의 분해 반응 때문에 혈액에 존재할 수 있는 그의 부분을 포괄한다.
재조합 N-말단 proBNP 는 짧은 아미노산 서열로 인해 용이하게 제조될 수 없기 때문에 지금까지 당업계에 공지되어 있지 않았다. 아미노산이 30 개를 초과하는 펩티드를 화학적으로 합성하는 것은 합성 주기마다 크게 감소하는 수율 및 에러 서열의 발생 때문에 숙주 유기체의 재조합체 제조에 비해 대안이 아니다.
그러나 진단 검출 방법에 있어서 표준 또는 대조군 재료는 한편으로는 분석물질을 정량적으로 측정하고 다른 한편으로는 시험의 기능적 능력을 점검하는데 항상 필요하다. 만약 수량화가 필요하다면 규정된 정량적 검정을 표준 시리즈를 사용하여 수행해야만 한다. 그러나 상기 검정은 표준물로서 사용되는 물질이 분석물질과 관련하여 면역학적 시험에서 동일하거나 유사한 양상을 보이는 경우에만 유용하다. 표준물이 충분히 구조적이고 특히 분석물질에 대해 면역학적 유사성을 가져서 검출 항체에 대한 표준물의 결합이 시료 중 천연 분자의 결합과 유사한 것이 중요하다.
N-말단 proBNP 의 검출 방법을 위한 상기 표준 물질은 당업계에 의해 제공되어 있지 않다. 단지 짧은 합성 펩티드가 기재되어 있다. 본 발명에 따라, 유전적 합성의 도움으로 N-말단 proBNP 를 코딩하는 DNA 서열을 제조하는 것 및 이.콜라이(E. coli)에서 N-말단 proBNP 를 재조합 발현시키는 것이 이제 처음으로 가능하다. 실시예 1 이 하기 단일 단계를 설명한다.
그러므로 본 발명의 다른 주제 문제는 N-말단 proBNP 의 상이한 에피토프를 인식하는 2 개 이상의 항체를 이용하여 시료 중 N-말단 proBNP 를 확인하는 방법에 서 표준물로서의 재조합 N-말단 proBNP 의 용도이다.
면역화의 동기로 N-말단 proBNP 로부터 유도된 짧은 합성 펩티드만을 당업계에서 사용해 왔다. 펩티드 면역화의 단점은 대부분 단지 매우 낮은 아핀(affine) 항체가 수득되거나, 수득된 항체는 오직 선형 에피토프와 반응하고, 천연의 폴딩된 항원은 시료에서 결합될 수 없다는 것이다(실시예 3 참조).
그러므로, 항체의 제조를 위해서 검출될 분석물질과 충분히 유사성이 있는 면역원을 사용하는 것이 중요하다. 오직 이 방식에 의해서만이 항체가 높은 친화성으로 시료 중의 천연 분석물질에 결합하는 것이 보장될 수 있다.
그러므로 본 발명의 주제 문제는 또한 N-말단 proBNP 에 대한 항체의 제조에 있어서 면역원으로서의 재조합 N-말단 proBNP 의 용도이다.
본 발명의 다른 주제 문제는 재조합 N-말단 proBNP 에 대한 항체이다. 용어 항체의 정의는 시험 방법에 관한 단락에서 주어진 정의에 해당한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 큰 76-아미노산 N-말단 proBNP 의 N-말단 부분, 바람직하게는 10 내지 66 의 아미노산 영역, 특히 더 바람직하게는 10 내지 50 또는 10 내지 38 의 영역의 에피토프를 특이적으로 확인한다. 항체에 의해 확인된 에피토프의 유용한 위치화는 끝부분에서 시료에서 단백질분해적으로 이미 소화된 N-말단 proBNP 가 상기 에피토프를 포함할 때에 이루어진다. 따라서 시료 중 분석물질의 안정성은 따라서 다소 2 차적으로 중요하다. N-말단 proBNP 의 바람직한 영역의 에피토프는 선형 형태 또는 입체형태 에피토프로서 존재할 수 있다.
그러므로 본 발명의 바람직한 주제 문제는 DSMZ (독일 미생물 및 세포 배양물 콜렉션) 게엠바하(브라운슈바이크, 독일)에 1999 년 1 월 26 일자로 기탁 및 이관된 세포주 MAB M 10.1.11 및 MAB M 13.4.14 에 의해 제조된 모노클론성 항체이다. 상기 2 개의 세포주에 의해 제조된 항체는 IgG-형 항체이다. 세포주 M 10.1.11 및 M 13.4.14 는 또한 본 발명의 주제 문제이다.
본 발명의 다른 주제 문제는 세포주 M 10.1.11 및 M 13.4.14 의 것처럼 동등한 방식으로 제조된 N-말단 proBNP 에 특이적으로 결합하기에 적절한 항체이다. "동등한 방식으로 제조된 항체"라는 표현은 항체가 재조합 N-말단 proBNP 로의 면역화에 의해 수득된다는 것을 의미한다.
본 발명의 주제 문제는 또한 N-말단 proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법이다.
폴리클론성 항체의 제조는 바람직하게는 하기 단계에 따라 수행된다: 예를 들어 양과 같은 적절한 유기체를 재조합적으로 제조된 N-말단 proBNP 로 면역화하는 단계, 항체를 분리하는 단계, 가장 반응성 있는 에피토프에 대해 스크린하는 단계, 및 적절한 펩티드에서 면역흡착을 통해 항체를 정제하는 단계. 상기 방법을 실시예 2 에서 설명한다.
모노클론성 항체의 제조는 바람직하게는 하기 단계에 따라 수행된다: 예를 들어 생쥐와 같은 적절한 유기체를 재조합적으로 제조된 N-말단 proBNP 로 면역화하는 단계, 및 상이한 환자 혈청 풀(pool) 중 천연 N-말단 proBNP 와 항체의 반응성과 관련되어 클론을 선별하는 단계. 상기 방법을 실시예 3 에서 설명한다.
본 발명은 하기 실시예에서 더 자세히 설명한다.
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<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Escherichia coli
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<213> Escherichia coli
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
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<212> PRT
<213> Escherichia coli
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1 5 10 15
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20
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 8
Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu
1 5
Claims (19)
- N-말단 proBNP 에 동시적으로 결합할 수 있는 N-말단 proBNP 의 상이한 에피토프를 검출하는 2 개 이상의 항체로 샌드위치 형식으로 수행되고, 상기의 2 개 이상의 항체들이 N-말단 proBNP 의 10 내지 50 번 아미노산의 영역에 결합하는, 시료 중 천연 N-말단 proBNP 의 확인 방법.
- 삭제
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- 제 1 항에 있어서, 수득된 값을 이용하여 건강한 환자와 NYHA-클래스 I 내지 IV 의 심부전이 있는 환자로부터 취한 시료를 구별할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 수득된 값을 이용하여 건강한 환자와 NYHA-클래스 I 의 환자로부터 취한 시료를 구별할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
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- 하기의 서열 번호 1 내지 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머를 이용하여 증폭될 수 있는 유전자에 의해 코딩되는 재조합 N-말단 proBNP 에 대한 항체:
- 제 12 항에 있어서, N-말단 proBNP 의 10 내지 66 번 아미노산의 영역에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 재조합적으로 제조된 N-말단 proBNP 로 적절한 유기체를 면역화하여 수득가능한 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 12 항에 있어서, 1999 년 1 월 26 일자로 DSMZ 에 기탁된 세포주 M 10.1.11 (수탁 번호 DSM ACC 2386) 또는 M 13.4.14 (수탁 번호 DSM ACC 2387)로부터 수득가능한 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 15 항에 있어서, 세포주 M 10.1.11 (수탁 번호 DSM ACC 2386) 또는 M 13.4.14 (수탁 번호 DSM ACC 2387)로부터 제조한 항체처럼 N-말단 proBNP 를 사용하여 동일한 방식으로 수득한 항체.
- 1999 년 1 월 26 일자로 DSMZ 에 기탁된 세포주 M 10.1.11 (수탁 번호 DSM ACC 2386) 또는 M 13.4.14 (수탁 번호 DSM ACC 2387).
- 재조합적으로 제조한 N-말단 proBNP 로 적절한 유기체를 면역화하는 단계, 항체를 단리하는 단계, 가장 반응성 있는 에피토프에 대해 스크리닝하는 단계, 및 적당한 펩티드로 면역흡착하여 항체를 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 12 항에 청구된 폴리클론성 항체의 제조 방법.
- 재조합적으로 제조한 N-말단 proBNP 로 적절한 유기체를 면역화하는 단계 및 환자 혈청의 상이한 풀 중 천연 N-말단 proBNP 와의 항체 반응성에 관해 클론을 선발하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 12 항에 청구된 폴리클론성 항체의 제조 방법.
Applications Claiming Priority (4)
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|---|---|---|---|
| DE19903489.3 | 1999-01-29 | ||
| DE19903489 | 1999-01-29 | ||
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| DE19911044 | 1999-03-12 |
Publications (2)
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