NO329866B1 - Fremgangsmate for pavisning av nativt N-terminalt proBNP i en prove som utfores i "sandwich"-format ved anvendelse av minst to antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper i det native N-terminale proBNP, og som samtidig kan bindes til nativt N-terminalt proBNP, anvendelse av fremgangsmaten for differensiering mellom prover, anvendelse av rekombinant N-terminalt proBNP som standard i en fremgangsmate, antistoffer mot N-terminalt proBNP fremstilt ved immunisering av en egnet organisme med rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP, samt cellelinje. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder Fremgangsmåte for påvisning av nativt N-terminalt proBNP i en prøve som utførers i "sandwich"-format ved anvendelse av minst to antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper i det native N-terminale proBNP, og som samtidig kan bindes til nativt N-terminalt proBNP, anvendelse av fremgangsmåten for differensiering mellom prøver, anvendelse av rekombinant N-terminalt proBNP som standard i en fremgangsmåte, antistoffer mot N-terminalt proBNP fremstilt ved immunisering av en egnet organisme med rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP, samt cellelinje. Fremgangsmåten kan anvendes for differensiering hhv. klassifisering av prøver fra friske individer og prøver fira pasienter fra NYHA-klassene I til IV. Dessuten gjelder oppfinnelsen rekombinant N-terminalt proBNP, og anvendelse av dette som standard i en fremgangsmåte for påvisning av N-terminalt proBNP, så vel som antistoffer som gjenkjenner rekombinant N-terminalt proBNP og fremstilling av disse.

Hjertesvikt er et vidt utbredt fenomen, særlig i den vestlige verden. Med hjertesvikt menes ifølge Roche Lexikon Medizin (1993, Urban & Schwarzenberg) akutt eller kronisk, ved belastning eller allerede i hviletilstand, manglende evnen til å gi den utpumping av blod som er nødvendig for stoffskiftet, hhv. motta den venøse tilbake-strømning (såkalt Backward og Forward Failure). Det foreligger altså en svekkelse av pumpefunksjonen. Årsakene til hjertesvikt er mange. Blant annet kan her nevnes betennelsesmessige og degenerative endringer i hjertemuskelen, koronare gjennom-strømningsforstyrrelser, hjerteinfarkt og skader. Dette fører til endringer i det perifere blodkretsløp, forstyrrelse av åndedrettet, nyrefunksjonen og elektrolyttstoffskiftet (ødemer), og til redusert ytelsesevne av skjelettmuskulaturen.

Ifølge New York Heart Association (NYHA) inndeles hjertesvikt ved hjelp av kroppslige belastningsanalyser i såkalte NYHA-klasser: I betyr fullstendig mangel på ubehag ved normal kroppslig belastning, II betyr en svak reduksjon av den kroppslige belastningsevne, III betyr kraftig reduksjon av belastningsevnen, IV betyr at det ved enhver kroppslig aktivitet finner sted en økning av tegn på hjertesvikt, som oftet også foreligger i rolig tilstand.

For en effektiv medikamentbehandling av hjertesvikt ved hjelp av glykosider, vasodilatorer, ACE-hemmere og/eller (3-blokkere anbefales det nøye å diagnostisere forekomst av hjertesvikt, og om mulig også å klassifisere denne ut fra omfanget, og endelig å monitorere forløpet av behandlingen.

Innen teknikkens stand ble noen serummarkører for tidlig diagnose av hjertesvikt, for eksempel ANP (N-terminalt atrialt natriuretisk peptidhormon) og proANP, CNP (C-natriuretisk peptid), adrenomedullin, neuropeptid Y, endothelin og BNP (hjernenatriuretisk peptid) diskutert, ANP og proANP er prinsipielt sett egnede som markører for diagnose av hjertesvikt, men besitter imidlertid lav stabilitet hhv. kort halveringstid i blod, noe som vanskeliggjør diagnostiske målinger (Clin. Sei. 95(3)

(1998), 235-239; Cleland et al. Heart 75 (1996), 410-414.

En hyppig sitert markør som anses som informativ er BNP (natriuretisk peptid fra hjerne), BNP ble opprinnelig identifisert i svinehjerner. Det dreier seg her om et hjertehormon som besitter strukturell og funksjonell likhet med ANP (atrialt natriuretisk peptid) (Sudhof et al. Nature 332 (1988), 78-81. Humant BNP, som består av 32 aminosyrer, utskilles hovedsakelig fra hjerteventikkelen og sirkulerer i humant blodplasma. Anvendelsen av BNP som diagnostisk markør er for eksempel kjent fra EP-A-0 542 255. BNP inneholder en intramolekylær disulfidbro og er ikke spesielt stabil som analytt, trolig grunnet sin fysiologiske funksjon som hormon, da disse hurtig må nedbrytes igjen, og følgelig bare i begrenset grad er egnet som diagnostisk markør.

(Masuta et al, Clin. Chem. vol. 44 nr. 6 Supplement A (1998), 130; Tsuji et al, Clin. Chem. 40 (1994), 672).

Forløpermolekylet for BNP, proBNP, består av 108 aminosyrer hvorav de tidligere beskrevne 32 C-terminale aminosyrer (77-108), som betegnes BNP, omfatter den egentlige hormonelle virkning. De N-terminale aminosyrer 1-76, som avspaltes fra forløperen, betegnes N-terminalt proBNP. I tillegg til BNP (77-108) sirkulerer også N-terminalt proBNP og andre nedbrytningsprodukter 1-76) i plasma (Hunt et al, Biochem, Biophys. Res. Com. 214 (1995), 1175-1183, slik at N-terminalt proBNP likeledes kommer på tale som markør for hjertesvikt. Hvorvidt også forløpermolekylet proBNP foreligger i plasma er ikke entydig avklart. Det beskrives imidlertid (Hunt et al, Peptides, vol. 18, nr. 10 (1997), 1475-1481), at en svak utskillelse av proBNP kan påvises i plasma, men at enkelte aminosyrer i den N-terminale ende mangler grunnet en svært hurtig partiell nedbrytning. Dette molekyl betegnes i litteraturen som High Molecular Weight-BNP.

IWO 93/24531 (US 5786163) beskrives en immunologisk fremgangsmåte for påvisning av N-terminalt proBNP og antistoffer som anvendes for dette. For frembringelse av antistoffer anvendes her enkelte syntetisk fremstilte peptider fra sekvensen til N-terminalt proBNP. Prinsipielt er også frembringelse av antistoffer ved hjelp av peptidimmunisering mulig, imidlertid er affiniteten overfor det intakte molekyl generelt for lav til at den nødvendige sensitivitet i en analysefremgangsmåte oppnås. I tillegg foreligger det fare for at det ved anvendelse av peptider kan frembringes antistoffer som for eksempel gjenkjenner C-enden av peptidet, og således kun kan binde dette fragment av totalmolekylet. Av dette følger at disse antistoffene ikke eller kun i liten grad vil bindes til totalmolekylet. I WO 93/24531 fremstilles polyklonale antistoffer mot et eneste peptid avledet fra N-terminalt proBNP. Det vises at det fremstilte antistoff også binder immuniseringspeptidet (aminosyrene 47-64) i et kompetitivt analyseformat. Det vises imidlertid ikke at antistoffene i denne prøven er nativt N-terminalt proBNP som intakt molekyl. Den "sandwich"-analyse av en prøve som beskrives i WO 93/24531 kan i tillegg ikke utføres som beskrevet der, da intet egnet standardmateriale står til disposisjon og intet antistoff mot to forskjellige epitoper foreligger.

Ytterligere et problem innen teknikkens stand er analysenes sensitivitet. Ved hjelp av den kompetitive analyse som er utført i WO 93/24531, i hvilken peptidet 47-64 i merket form konkurrerer om sporforbindelse med en prøve, hhv. med den umerkede peptidstandard 47-64, om binding til polyklonale antistoffer fra kaninserum, oppnås etter 48 timers inkubering kun en svært moderat konkurrering som det i beste fall kan utledes en nedre påvisningsgrense på tilnærmet 250 fmol/ml. Dette er verken tilstrekkelig for differensiering mellom friske individer og pasienter med hjertesvik eller for differensiert klassifisering av pasientprøver etter omfang av hjertesvikt. I tillegg er de lange inkubasjonstider i den kompetitive analyse ikke akseptabel for rutinemessig måling av prøver i et automatisert laboratorium.

En kompetitiv analyse for påvisning av N-terminalt proBNP beskrives også av (Clinical Endocrinology 47 (1997), 287-296). I denne må plasmaprøven ekstraheres på en kostbar måte før målingen, noe som kan medføre at analytten ødelegges og at feil-målinger opptrer. Det her anvendte antiserum erholdes på tilsvarende måte som i WO 93/24531 ved immunisering med et syntetisk peptid. Ifølge Hunt et al. erholdes antiserumet ved immunisering med aminosyrene 1-13 fra N-terminalt proBNP, og som standard anvendes peptidet fra aminosyre 1-21. Også i denne analyse må en lang inkubasjonstid tas med i beregningen. Etter 24 timers inkubering oppnås en nedre påvisningsgrense på 1,3 fmol/ml.

WO 8912069 Al gjør kjent cDNA og aminosyresekvensen til humant proBNP. Videre beskrives også hvordan proBNP kan fremstilles ved bruk av rekombinante metoder.

Innen teknikkens stand foreligger således ingen fremgangsmåte for påvisning av N-terminalt proBNP som muliggjør en pålitelig, sensitiv påvisning av nativt N-terminalt proBNP ved kort inkubasjonstid.

Det var således en oppgave å frembringe en fremgangsmåte for påvisning av N-terminalt proBNP i en prøve som i størst mulig grad unngår de angitte ulemper innen teknikkens stand. Spesielt skulle det kunne nås en høy sensitivitet i analysen, hvorved en differensiering av pasientprøvene fra friske individer og prøver fra pasienter fra NYHA-klassene I til IV kan oppnås.

Oppgaven løses ved den i patentkravene nærmere definerte fremgangsmåte for påvisning av N-terminalt proBNP i en prøve. Fremgangsmåten særpreges ved at det anvendes minst to antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper i N-terminalt proBNP.

Foreliggende oppfinnelse omfatter således en fremgangsmåte for påvisning av nativt N-terminalt proBNP i en prøve som utførers i "sandwich"-format ved anvendelse av minst to antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper i det native N-terminale proBNP, og som samtidig kan bindes til nativt N-terminalt proBNP, kjennetegnet ved at de minst to antistoffene binder i området til aminosyrene 10-50 i N-terminalt proBNP og antistoffene erholdes ved immunisering av en egnet organisme med rekombinant NTproBNP.

Oppfinnelsen omfatter også anvendelse av fremgangsmåten ifølge ethvert av de foregående krav for differensiering mellom prøver fra friske individer og prøver fra pasienter i NYHA-klassene I til IV.

Videre omfatter oppfinnelsen anvendelse av rekombinant N-terminalt proBNP som standard i en fremgangsmåte for påvisning av N-terminalt proBNP ifølge kravene 1 til 4.

Også omfattet av oppfinnelsen er antistoffer mot N-terminalt proBNP fremstilt ved immunisering av en egnet organisme med rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP, kjennetegnet ved at de spesifikt binder til aminosyre 10 til 50 i N-terminalt proBNP.

Oppfinnelsen omfatter også en cellelinje, kjennetegnet ved at den er cellelinjen M 10.1.11 (DSM ACC 2386) eller M 13.4.14 (DSM ACC 2387) deponert 26.01.1999 ved DSMZ.

Det vesentlige med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er at nativt N-terminalt proBNP er innbefattet i en prøve. Det vil si at antistoffene må være i stand til å gjen-kjenne og spesifikt bindes til det intakte molekyl og eventuelt foreliggende uspaltet proBNP (1-108), og om mulig også proteolytisk nedbrutte bruddstykker i en prøve. I fremgangsmåten anvendes minst to forskjellige antistoffer som bindes til forskjellige isotoper i N-terminalt proBNP. Epitopene kan være lineære eller såkalte konformasjonsepitoper. Det foretrekkes at epitopene er plassert slik at de to antistoffene kan bindes samtidig, og at de ikke ligger for langt fra hverandre.

Da fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ikke tillater differensiering mellom N-terminalt proBNP, proBNP og nært beslektede peptider (nedbrytningsprodukter) skal med NT-proBNP i det påfølgende alle de peptider som påvises i analysefremgangsmåten, særlig det kjente N-terminalt proBNP (1-76), omfattes.

Under begrepet "epitop" menes bindingssetet i en immunologisk bindingspartner, for eksempel et antigen, som et antistoff binder seg spesifikt til. En "epitop" defineres mest entydig med fra 6 til 8 aminosyrer. Bindingspartneren tilsvarer ifølge oppfinnelsen N-terminalt proBNP, fortrinnsvis en delsekvens av dette. Epitopen som bindes til antistoffet er således et delområde i bindingspartneren. Epitopen kan foreligge i lineær form eller som en konformasjonsepitop.

Ved hjelp av den forskjellige spesifisitet til de to antistoffene er det mulig å gjennomføre en hurtig fremgangsmåte for påvisning av analytten, istedenfor den kompetitive langvarige analyseutførelse ifølge teknikkens stand. Påvisningsrfemgangs- måten kan skje ved hjelp av en homogen eller heterogen analyseutførelse. Den heterogene analyseutførelse foretrekkes, og spesielt foretrukket er den "sandwich"-fremgangsmåte som er kjent blant fagfolk.

En slik fremgangsmåte for bestemmelse av N-terminalt proBNP utgjøres fortrinnsvis i følgende trinn: a) behandling av prøven med et første antistoff som er spesifikt for N-terminalt proBNP og som inneholder en gruppe som kan bindes til en fast fase og som binding til en fast fase kan skje ved, eller behandling av prøven med et første antistoff spesifikt for N-terminalt proBNP som allerede er bundet til en fast fase,

b) behandling av denne løsning med det andre antistoff, som gjenkjenner en epitop i NT-proBNP som er forskjellig fra epitopen til det første antistoff og som inneholder en

merket gruppe,

c) binding av det dannede immunkompleks til en fast fase, hvori den faste fase allerede kan foreligge i trinn a),

d) separasjon av den faste fase fra væskefasen, og

e) påvisning av den merkede gruppe i den ene eller begge faser.

Ved kvantitativ bestemmelse utgjøres den samme måte med definert mengde N-terminalt proBNP som standard, og etter bestemmelse av prøven som i trinn f) utføres en sammenligning mellom måleverdien i standarden med måleverdien for prøven og kvantifisering av denne.

Under begrepet "antistoff' menes mono- eller polyklonale, kimære eller humaniserte eller andre antistoffer erholdt ved genteknologisk modifisering, så vel som alle fragmenter kjente blant fagfolk, for eksempel F(ab')2, Fab' eller Fab-fragmenter. Det er bare nødvendig at den immunologiske spesifikke bindingsevne til N-terminalt proBNP er sikret.

Det første antistoff spesifikt for N-terminalt proBNP kan enten være direkte bundet til den faste fase, eller bindingen til den faste fase skjer indirekte via et spesifikt bindingssystem. Den direkte binding av dette antistoff til den faste fase skjer ved fremgangsmåter som er kjente blant fagfolk, for eksempel ved adsorpsjon. Dersom binding gjennomføres indirekte via et spesifikt bindingssystem er det første antistoffet konjugat som består av et antistoff mot N-terminalt proBNP og en reaksjonspartner fra et spesifikt bindingssystem. Med et spesifikt bindingssystem menes her to partnere som kan reagere spesifikt med hverandre. Bindingsevnen kan her bygge på en immunologisk reaksjon eller på en annen spesifikk reaksjon. Som spesifikt bindingssystem anvendes fortrinnsvis en kombinasjon av biotin og avidin eller biotin og streptavidin. Andre foretrukne kombinasjoner er biotin og antibiotin, hapten og anti-hapten, et Fc-fragment fra et antistoff og antistoff mot dette Fc-fragment, eller karbohydrat og lektin. Én av reaksjonspartnerne i det spesifikke bindingssystem er da del av konjugatet.

Den andre reaksjonspartner fra det spesifikke bindingssystem for den første bindingspartner foreligger i belegget på den faste fase. Her anvendes fortrinnsvis streptavidin eller avidin. Binding av den andre reaksjonspartner i det spesifikke bindingssystem til et uløselig bærestoff kan utføres ifølge de vanlige fremgangsmåtene som er kjente blant fagfolk. Her er både kovalent binding og adsorberende binding egnet.

Som fast fase er reagensrør eller mikrotiterplater av polystyren eller egnede kunststoffer som er belagt på den indre overflate med en reaksjonspartner fra det spesifikke bindingssystem egnet. Også egnet, og spesielt foretrukket, er partikkelformede substanser, for eksempel latekspartikler, magnetiske partikler, molekylsiktmaterialer, glasspartikler, kunststoffslanger og lignende. Også porøse, lagformede bærere som papir eller nitrocellulose kan anvendes som bærere. Det foretrekkes spesielt å anvende magnetiske kuler, såkalte "beads", som igjen er belagt med den angjeldende bindingspartner fra det ovenfor beskrevne spesifikke bindingssystem. Denne mikropartikkel kan så etter analysereaksjonens forløp separeres fra væskefasen, for eksempel ved filtrering, sentrifugering eller, for magnetiske partikler, ved hjelp av en magnet.

Det andre spesifikke antistoff gjenkjenner en annen epitop i N-terminalt proBNP og N-terminalt proBNP enn det første antistoff. Avstanden mellom de to epitoper i molekylet må være så stor at samtidig binding av de to antistoffer til N-terminalt proBNP er mulig uten begrensninger, da det ellers ikke vil dannes et "sandwich"-kompleks.

Deteksjonen av den spesifikke bindingsreaksjon mellom antistoffene mot N-terminalt proBNP og N-terminalt proBNP kan skje på forskjellige måter. Generelt er det andre antistoff merket. Egnede merkingsgrupper er kromogene grupper, fluoroforer, forbindelser som gir kjemi- eller elektrokjemiluminescens, radioaktive isotoper, haptener, enzymer eller forbindelser som igjen kan danne et spesifikt bindingspar, som for eksempel biotin/streptavidin. Påvisning av immunkomplekset skjer så ut fra signalene som utsendes av den merkede gruppe. Det andre antistoff kan for eksempel være merket med haptenet digoksigenin. Dette hapten bindes deretter av ytterligere et antistoff som er spesifikt for digoksigenin. Antistoffet som er spesifikt for digoksigenin er selv merket med for eksempel et enzym som peroksidase. Den endelige påvisning skjer så ved hjelp av den farge- hhv. ekstinktionsendring som opptrer grunnet reaksjon mellom peroksidasen og et tilsvarende substrat.

Som prøver for gjennomføring av fremgangsmåten for påvisning av N-terminalt proBNP kan alle biologiske væsker som er kjente blant fagfolk anvendes. Fortrinnsvis anvendes som prøve kroppsvæsker som helblod, blodserum, blodplasma, urin eller spytt, det foretrekkes spesielt å anvende blodserum og -plasma.

I tillegg til de såkalte væskeanalyser, i hvilke analysereagensene foreligger i

væskefase, kan alle tilgjengelige tørrtestformater som er egnet for påvisning av antigener, haptener, peptider, proteiner, antistoffer osv. anvendes. I disse tørranalyser eller analyse-strips, som for eksempel er beskrevet i EP-A-0 186 799, er generelt alle analysebestand-

deler unntatt prøven som skal undersøkes anbrakt på en bærer. Påvisningsreaksjonen skjer når analysestrippen bringes i kontakt med væskeprøven.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen særpreges ved at den nedre påvisningsgrense for N-terminalt proBNP ligger på under 1 fmol/ml (tilsvarende 1 pmol/1). Den høye sensitivitet ifølge oppfinnelsen på < 1 fmol/ml oppnås uten lange inkubasjonstider. I alt ligger tidsforløpet for fremgangsmåten ved en mikrotiterplateanalyse på under to timer, fortrinnsvis, med sensitive påvisningsfremgangsmåter som elektrokjemiluminescens, på 15 minutter. En øvre grense for påvisningsfremgangsmåten når det gjelder konsentrasjonen som skal påvises eksisterer praktisk talt ikke. Den teknologiske øvre grense gis generelt ut fra den anvendte målefremgangsmåte. Fremgangsmåten påviser prinsipielt også svært høye konsentrasjoner av N-terminalt proBNP.

En videre fordel ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er den gode differensiering mellom prøver fra pasienter med og uten hjertesvikt, ved hjelp av den erholdte måleverdi. Påvisningsfremgangsmåten er så sensitiv at man til og med kan oppnå en differensiering mellom pasienter uten koronar sykdom og pasienter med en bare svakt utpreget eller langsomt startende hjertesvik tilsvarende NYHA-klassene I og II. En slik tidlig erkjennelse av en begynnende hjertesvikt kan påvirke en avgjørelse om tidlig medikamentbehandling, og således i betydelig grad forlenge pasientens overlevelses-frekvens.

En videre gjenstand for oppfinnelsen er rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP. Med N-terminalt proBNP menes den N-terminale del avspaltet fra det 108 aminosyrer store forløpermolekyl proBNP, som består av aminosyrene 1-76. Med N-terminalt proBNP menes også deler av dette, som kan foreligge på grunn av ned-brytningsreaksjoner for dette molekyl i blodet.

Innen teknikkens stand er til nå intet rekombinant N-terminalt proBNP kjent, da fremstilling av dette ikke lett oppnås på grunn av den korte aminosyresekvens. Kjemisk syntese av et peptid på mer enn 30 aminosyrer er intet alternativ til rekombinant fremstilling i en vertsorganisme, grunnet de foreliggende feilsekvenser og et sterkt avtagende utbytte pr. syntesesyklus.

For en diagnostisk påvisningsrfemgangsmåte er det i tillegg alltid nødvendig med et standard- eller kontrollmateriale med hvis hjelp en kvantitativ bestemmelse av analytten kan skje og med hvilket blant annet funksjonsevnen til analysen kan prøves. Dersom en kvantifisering skal skje må dette oppnås ved hjelp av en standardrekke av en definert, kvantitativ justering. En slik justering er videre bare meningsfull dersom det materiale som anvendes som standard oppfører seg i den immunologiske analyse på samme måte som eller svært likt analytten. Her er det vesentlig at standarden besitter en svært stor strukturell og, spesielt, immunologisk likhet med analytten, hvorved bindingen av standarden til påvisningsantistoffene skjer på samme måte som for det native molekyl i prøven.

Et slikt standardmateriale for en fremgangsmåte for påvisning av N-termalt proBNP er ikke tilgjengelig innen teknikkens stand. Kun korte syntetiske peptider beskrives. Ifølge oppfinnelsen er det nå for første gang blitt mulig ved hjelp av gensyntese å fremstille en DNA-sekvens som koder for N-terminalt proBNP og deretter oppnå en rekombinant ekspresjon av N-terminalt proBNP i E. Fremgangsmåten er beskrevet i Eksempel 1.

En videre gjenstand for oppfinnelsen er anvendelse av rekombinant N-terminalt proBNP som standard i en fremgangsmåte for påvisning av N-terminalt proBNP i en prøve ved hjelp av minst to antistoffer som gjenkjenner forskjellige isotoper i N-terminalt proBNP.

For immuniseringsformål ble innen teknikkens stand lenge bare syntetiske, korte peptider avledet fra N-terminalt proBNP anvendt. Ulempen ved peptidimmunisering er at det hovedsakelig erholdes antistoffer med bare svært lav affinitet, hhv. antistoffer som bare reagerer med lineære epitoper og som ikke kan bindes til det native, foldede antigen i prøven (se Eksempel 3).

Det er derfor viktig for immunisering for fremstilling av antistoffer å anvende et immunogen som viser en tilstrekkelig stor likhet med de analytter som til slutt skal påvises. Bare således kan det sikres at den native analytt i prøven bindes av antistoffene med høy affinitet.

En gjenstand for oppfinnelsen er således også anvendelse av rekombinant N-terminalt proBNP som immunogen for fremstilling av antistoffer mot N-terminalt proBNP.

Det beskrives også antistoffer mot rekombinant N-terminalt proBNP. Definisjonen av begrepet antistoffer tilsvarer definisjonen i avsnittet vedrørende analyse-utførelsen. Antistoffene ifølge oppfinnelsen gjenkjenner fortrinnsvis spesifikke epitoper i den N-terminale del av det 76 aminosyrer store N-terminalt proBNP, fortrinnsvis i området mellom aminosyren 10 og 66, spesielt foretrukket i området mellom aminosyre 10 og 50 eller 10 og 38. Det er fornuftig dersom epitopene som gjenkjennes av antistoffene er plassert slik at også N-terminalt proBNP som i en prøve allerede har blitt proteolytisk spaltet i endene fortsatt inneholder disse epitoper. Således kommer stabiliteten av analytten i prøven i annen rekke. Epitopene i de foretrukne områder i N-terminalt proBNP kan foreligge som lineære epitoper eller som konformasjonsepitoper.

En foretrukket gjenstand som beskrevet heri er således monoklonale antistoffer som produseres av cellelinjene MAK M 10.1.11 og MAK M 13.4.14, deponert og innlevert 26.01.1999 hos DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellekulturen GmbH, Braunschweig, Tyskland. For antistoffene som produseres av disse to cellelinjer dreier det seg om antistoffer av IgG-typen. Cellelinjene M 10.1.11 og M 13.4.14 er likeså gjenstand for oppfinnelsen.

Ytterligere en gjenstand som beskrevet heri er antistoffer som har en bindingsevne til N-terminalt proBNP som er ekvivalent med bindingsevnen til antistoffene som produseres av cellelinjene M 10.1.11 og M 13.4.14. Under begrepet "på ekvivalent vis fremstilte" antistoffer forstås at antistoffene frembringes ved immunisering med rekombinant N-terminalt proBNP.

Også en gjenstand som beskrevet heri er fremgangsmåter for fremstilling av antistoffer som spesifikt bindes til N-terminalt proBNP.

Fremstillingen av polyklonale antistoffer skjer fortrinnsvis via trinnene: immunisering av en egnet organisme, for eksempel sau, med rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP, isolering av antistoffene, søk etter de mest reaktive epitoper og opprensing av antistoffene ved immunadsorpsjon til egnede peptider. En slik fremgangsmåte er beskrevet i Eksempel 2.

Fremstilling av monoklonale antistoffer skjer fortrinnsvis via trinnene: immunisering av en egnet organisme, for eksempel mus, med rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP og utvelgelse av kloner ut fra antistoffets reaktivitet med nativt N-terminalt proBNP i forskjellige porsjoner av pasientserum. En slik fremgangsmåte er beskrevet i Eksempel 3.

De påfølgende eksempler skal belyse oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1

Fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant N-terminalt proBNP (1-76)

1. Kloning av rekombinant N- terminalt proBNP

Nukleotidsekvensen til N-terminalt proBNP (aminosyresekvens 1-76) ble fremstilt ved hjelp av gensyntese. For å oppnå en optimal ekspresjon av genet i E. coli ble DNA-sekvensen tilpasset de kodoner som hyppigst anvendes i E. coli. Sekvensen av oligonukleotidene som ble anvendt for fremstilling av genet er som følger. Pro5' (SEKV. ID Nr. 1)

Fremstillingen av genet skjedde med disse primere og ved hjelp av PCR (polymerase-kjedereaksjonen). Det amplifiserte gen ble klonet i en egnet vektor, for eksempel vektoren pUC19, og sekvensiert. For kloning av genet i ekspresjonsvektoren pQE8 ble genet utkuttet fra vektoren via restriksjonssnittsetene Barn HI og Hind III, legert inn i vektoren pQE8, som tillater ekspresjon av proteiner med en N-terminal histidinmerkelapp, og transformert inn i E. coli Ml5 [pREP4].

2. Ekspresjon av N- terminalt proBNP i. E . coli

For ekspresjon av genet i E. coli ble en over natt kultur av en rekombinant E. cø//-klon fortynnet 1/60 med Luria-medium (med 100 |ig/ml ampicillin og 50 ug/ml kanamycin) og indusert med IPTG (isopropyltiogalaktosid; 1 mM sluttkonsentrasjon) ved en OD 550 på 1. Etter induksjonen ble kulturene inkubert i ytterligere 4 timer ved 37 °C. Kulturene ble sentrifugert og de nedsentrifugerte cellene suspendert i 50 mM Na-fosfatbuffer, pH 8,0; 300 mM NaCl. Etter oppbryting av cellesuspensjonen med ultralyd ble suspensjonen sentrifugert, og supernatanten ble påsatt en Ni-NTA (nitriltriacetat) kolonne. Eter et vasketrinn med 50 mM Na-fosfatbuffer, pH 8,0; 300 mM NaCl; 20 mM imidazol ble histidinmerket N-terminalt proBNP eluert med 50 mM Na-fosfatbuffer, pH 8,0; 300 mM NaCl; 300 mM imidazol. De eluerte fraksjoner ble slått sammen og dialysert mot 50 mM tris pH 8,0. For fjerning av forurensninger ble dialysatet påsatt en Q-sefarosekolonne. Massen av renset N-terminalt proBNP ble bestemt ved MALDI-TOF.

Eksempel 2

Fremstilling av polyklonale antistoffer mot N-terminalt proBNP

1. Immunisering

Sauer ble immunisert med rekombinant N-terminalt proBNP (1-76) i komplett Freunds adjuvans. Dosen utgjorde 0,1 mg pr. dyr. Immuniseringen ble gjentatt over 10 måneder med 4 ukers mellomrom. 6 uker etter første immunisering og deretter én gang i måneden ble serumprøver fremstilt og undersøkt for sensitivitet og titer.

2. Opprensing av pol<y>klonale antistoffer fra saueserum

Lipidbestanddeler ble fjernet fra råserumet fra en sau immunisert med rekombinant N-terminalt proBNP ved delipidisering med Aerosil (1,5 %). Deretter ble immunglobulinene utfelt med ammoniumsulfat (2M). Det oppløste bunnfall ble dialysert mot 15 mM KP04, 50 mM NaCl pH 7,0 og kromatografert på DEAE-sefarose. IgG-fraksjonen, PAK< rek. NT-proBNP > S-IgG(DE), befant seg i den ubundne fraksjon.

3. Sekvensiell affinitetskromatografi for fremstilling av polyklonale antistoffer spesifikke for NT- proBNP

For opprensing av polyklonale antistoffer spesifikke for NT-proBNP og rettet mot aminosyrene i 1-21, PAK< rek. NT-proBNP > M-IgG(IS,l-21), ble det C-terminalt biotinylerte peptid HPLGSPGSASDLETSGLQEQR-Bi( 1 -21 -Bi, SEKV. ID Nr. 7) anvendt. Affinitetsmatriksen ble fremstilt ved å lade 10 ml metakrylatpolymerpartikler belagt med streptavidin (Boehringer Mannheim, Best. nr. 1529188) med Img peptid (1-21-Bi).

En kolonne ble pakket med 10 ml av affinitetsmatriksen og ekvilibrert med 50 mM KP04, 150 mM NaCl pH 7,5 (PBS). For det første trinn i den sekvensielle affinitetskromatografi ble 850 mg PAK < NT-proBNP > S-IgG(DE) påsatt kolonnen. Ubundet materiale ble tatt vare på for et andre trinn (se nedenfor). Kolonnen ble vasket med PBS og 20 mM KP04, 500 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,5 % Na-deoksicholsyre pH 7,5. IgG spesifikt bundet til affinitetsmatriksen ble eluert med ImmunoPure® Gentle Ag/Ab Elution Buffer (Pierce. Produkt #: 21013). Affinitetsmatriksen ble regenerert med IM propionsyre og lagret i PBS/NaN3.

På samme måte som beskrevet ovenfor ble peptidet Bi-ELQVEQTSL (Bi-30-38 SEKV. ID Nr. 8) anvendt for fremstilling av en affinitetsmatriks for rensing av NT-proBNP-spesifikke immunglobuliner rettet mot aminosyrene PAK < rek. NT-proBNP > M-IgG (IS, 30-38) ble gjenvunnet fra ubundet materiale fra første affinitetsrensing.

4. Biotinvlerin<g>av PAK<NT- proBNP>S- IgGQS. l- 2n

De affinitetsrensede antistoffer dialyseres mot biotinyleringsbufferen (100 mM KPO4, 70 mM NaCl pH 8,0), hvoretter løsningen justeres til en proteinkonsentrasjon på 1 mg/ml. D-biotinoyl-aminokapronsyre-N-hydroksysuksinimidester løses i DMSO og blandes med antistoffløsningen i et molart forhold på 1:7,5. Reaksjonen stanses ved tilsetning av L-lysin, og overskudd av merkingsreagenset fjernes ved dialyse.

5. Digoksigenvlering av PAK<NT- proBNP>S- IgGQS. 30- 38)

De affinitetsrensede antistoffene dialyseres mot digoksigenyleringsbufferen (100 mM KPO4, 70 mM NaCl pH 7,6), hvoretter løsningen justeres til en proteinkonsentrasjon på 1 mg/ml. Digoksigenin-3-CME-N-hydroksysuksinimidester løses i DMSO og blandes med antistoffløsningen i et molart forhold på 1:5. Reaksjonen stanses ved tilsetning av L-lysin, og overskudd av merkingsreagens fjernes ved dialyse.

Eksempel 3

Fremstilling av og søk etter monoklonale antistoffer mot N-terminalt

proBNP (1-76)

1. Frembringelse av monoklonale antistoffer mot NT- proBNP ( 1- 76)

8-12 uker gamle balb/c-mus immuniseres intraperitonealt med 100 fig rekombinant N-terminalt proBNP-antigen med komplett Freunds adjuvans. Etter 6 uker gjennomføres ytterligere tre immuniseringer med 4 ukers mellomrom. Én uke etter siste immunisering tappes blod, og antistofftiteret bestemmes i serum fra forsøksdyrene. Fra positivt reagerende mus fremstilles B-lymfocytter fra milten og fusjoneres med en permanent myelomcellelinje. Fusjonen skjer ifølge den kjente fremgangsmåte til Køhler og Millstein (Nature 256, 1975, s. 495 - 497). De herved dannede primærkulturer med hybridceller klones på vanlig måte, for eksempel ved anvendelse av en kommersiell cellesorterer eller ved "limiting dilution". Kun de klonkulturer som reagerer positivt med rekombinant N-terminalt proBNP i en egnet analysefremgangsmåte, for eksempel en enzymimmunanalyse (ELISA-fremgangsmåte) og som gjenkjenner naturlig N-terminalt proBNP i pasientserum (se pkt. 2) opparbeides videre. Således erholdes flere hybridom-cellelinjer som produserer monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen.

For fremstilling av aszites injiseres 5 x IO6 hybridomceller intraperitonealt i balb/c-mus som på forhånd er behandlet 1-2 ganger med 0,5 ml pristan. Etter 2-3 uker kan aszites-væske gjenvinnes fra musenes bukhule. Fra denne kan antistoffer isoleres på vanlig måte. Disse monoklonale antistoffer er spesifikt rettet mot humant N-terminat proBNP. De betegnes i det påfølgende MAK M 10.1.11 hhv. MAK M 13.4.14. Begge de monoklonale antistoffene tilhører underklassen IgGl, kappa.

På denne måte kunne de to hybridomcellelinjene klon M 10.1.11 og M 13.4.14, som er deponert hos DSMZ som beskrevet ovenfor, isoleres.

2. Gjennomsøkingsanalyse etter antistoffer mot proBNP- peptid og rekombinant NT-proBNP

For å fastslå nærvær og spesifisitet av antistoffer mot NT-proBNP i serum fra immuniserte mus, i dyrkningssupernatanter fra hybridceller eller i aszitesvæske ble klonene evaluert med følgende analyseprinsipper:

a) Reaktivitet med rekombinant N-terminalt proBNP

Mikrotiterplater (Nunc. Maxisorb) belegges med 2,5 |ig/ml rekombinant NT-proBNP som antigen i en belegningsbuffer (Boehringer, 0,2 M natriumkarbonat/- bikarbonat, pH 9,3-9,5, Kat. nr. 726559) med 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur. Påfølgende blokkering skjert i PBS-buffer (Phosphate Buffered Saline, Fa. Oxid. Kode-BR 14a) og 1 % Byco C, i 30 minutter. Deretter vaskes brønnene med vaskebuffer (0,9 % natriumkloridløsning, 0,05 % Tween 20). Deretter skjer inkubasjon med antistoffprober med 100 ul/brønn, 1 time ved romtemperatur under omristing. Deretter vaskes igjen to ganger med vaskeløsning. Så følger nok en inkubasjon med påvisningsantistoffet PAK<M-Fcy>S-Fab-peroksidasekonjugat (Boehringer Mannheim, Kat. nr. 1500 686), 100 mU/ml, 100 ul/brønn, 1 time ved romtemperatur under omristing. Etter nok et vasketrinn med vaskebuffer bestemmes peroksidaseaktiviteten på vanlig måte (for eksempel med ABTS), i 30 minutter ved romtemperatur, og ekstinksjonsforskjellen avleses i mE ved 405 nm ved hjelp av en ELISA-leser.

b) Reaktivitet med N-terminalt proBNP-peptid:

I dette tilfelle behandles streptavidinladede mikrotiterplater med NT-proBNP-peptid-biotinkonjugat med sekvensene 1-10, 8-18, 1-21, 16-30, 30-38, 39-50, 50-63 eller 64-76 som antigen, 250 ug/ml i PBS-buffer (Phosphate Buffered Saline, Oxid. Kode-BR 14a) med 0,5 % Byco C, 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur under omristing. Deretter vaskes platene med vaskebuffer (0,9 % natriumkloridløsning, 0,05 % Tween 20). Antistoffprobeinkuberingen og påvisningsreaksjonen skjer som beskrevet under a). Basert på reaktiviteten med bestemte NT-proBNP-peptider kan epitopens posisjon utledes.

c) Reaktivitet med nativt N-terminalt proBNP i pasientprøver

Mikrotiterplater (Nunc, Maxisorb) belegges med 5 ug/ml PAK<human

proBNP>S-IgG(IS,(l-21) hhv. (30-38)S-IgG i belegningsbuffer (Boehringer, 0,2 M natriumkarbonat/-bikarbonat, pH 9,3-9,5 Kat. nr. 728 559) 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur under omrysting. Blokkering skjer i PBS-buffer (Phosphate Buffered Saline, Oxid. Kode-BR 14a) og 1 % Byco C, i 30 minutter. Deretter vaskes platene med vaskebuffer (0,9 % natriumkloridløsning, 0,05 % Tween 20). Så følger inkubasjon med nativt antigen i pasientplasma, fortynnet med PBS-buffer, med 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur under omrysting. Etter et nytt vasketrinn følger inkubasjon med antistoffprober med 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur under omrysting. Så vaskes platen igjen to ganger med vaskeløsning, og det inkuberes igjen med påvisningsantistoffet PAK<M-Fcy>S-Fab-peroksidasekonjugat (Boehringer Mannheim GmbH, Kat. nr. 1500 686), 100 mU/ml, 100 ul/brønn i 1 time ved romtemperatur under omrysting. Etter et nytt vasketrinn med vaskebuffer bestemmes peroksidaseaktiviteten på vanlig måte (for eksempel med "ABTS", 30 minutter ved romtemperatur, hvoretter ekstinksjonsforskjellen avleses i mE ved 405 nm ved hjelp av en ELISA-leser).

3. Resultater: Reaksjonsmønster for monoklonale og polyklonale antistoffer mot N- terminalt proBNP

a) Reaktivitet av MAK (c = 5 ug/ml) fra immunisering med N-terminalt proBNP-peptider:

De monoklonale antistoffene som ble erholdt ved immunisering med forskjellige peptider reagerer svært kraftig med de tilsvarende peptider. Reaktivitet med rekombinant N-terminalt proBNP kan kun påvises for to monoklonale antistoffer, mens ingen reaksjon skjer med nativt N-terminalt proBNP i en blanding av pasientsera (se Tabell 1).

b) Reaktivitet av monoklonale antistoffer (MAK) fra immunisering med rekombinant N-terminalt proBNP:

De monoklonale antistoffene fra immunisering med rekombinant N-terminalt proBNP reagerer kun enkeltvis med peptider, men svært kraftig med rekombinant N-terminalt proBNP hhv. nativt N-terminalt proBNP i en blanding av pasientsera. Manglende reaksjon av enkelte monoklonale antistoffer med peptidene tyder på at disse gjenkjenner såkalte konformasjonsepitoper (se Tabell 2).

c) Reaktivitet av PAK fra immunisering med rekombinant N-terminalt proBNP:

De erholdte PAK reagerte kraftigst med peptidene 1-21 og 30-38. Av denne

grunn ble disse epitoper utvalgt og PAK positivt immunabsorbert ved hjelp av disse peptidene. PAK immunadsorbert med peptid 1-21 reagerte kraftigst med området 8-20 og tydelig svakere med den N-terminale sekvens 1-10. De således immunadsorberte PAK reagerte svært kraftig med rekombinant N-terminalt proBNP, og i PAK/PAK-"sandwich"-format med den native probe (se Tabell 3).

Eksempel 4

Høysensitiv immunanalyse for bestemmelse av NT-proBNP

Med hjelp av antistoffene erholdt i Eksempel 2 og 3 kunne en høysensitiv immunanalyse oppbygges. Generelt er alle analyseformater som benytter to antistoffer med forskjellig epitopgjenkjenning egnede. Som eksempel beskrives en såkalt<M>Sandwich"-ELISA.

Som fast fase ble en mikrotiterplate (MTP) belagt med streptavidin benyttet. 10 jlxI ubehandlet prøve eller kalibrator ble sammen med 100 ul buffer som inneholdt de to epitop-spesifikke antistoffer pipetert over i MTP-brønnene og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Som antistoff ble 1 ug/ml biotinylert PAK < rek. NT-proBNP>S-IgG(IS,l-21) og 0,5 ug/ml digoksigenylert PAK < rek. NT-proBNP>S-IgG(IS,30-38) benyttet. Deretter ble løsningen avsugd og brønnene vasket 3 x med 350 :ml vaskebuffer. Deretter tilsettes 100 ul konjugatløsning, og det inkuberes igjen 1 time ved romtemperatur. Som konjugat anvendes et anti-digoksin-antistoff-POD-konjugat i en konsentrasjon på 100 mIU/ml. Deretter avsuges konjugatløsningen og brønnene vaskes 3x med 350 ug vaskebuffer. Til slutt utpipetteres "ABTS"-substratløsning over i brønnene og det inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur. Etter 30 minutters substratreaksjon avleses mikrotiterplatene straks i en MTP-leser ved en bølgelengde på 405 nm mot en referansebølgelengde på 495 nm.

For bestemmelse av sensitiviteten ble det fremstilt en standardkurve, og presisjonen av nullstandardene (n = 21) ble bestemt. Som kalibratorer ble det anvendt humant EDTA-plasma som var tilsatt rekombinant N-terminalt proBNP i de påkrevde konsentrasjoner. Som nullstandard ble storfeplasma anvendt. Resultatene er angitt i Tabell 4.

Ut fra standardkurvens vinkelkoeffisient på 22,5 mE x ml/fmol og et standardavvik på 5,7 mE erholdes ut fra formelen til Kaiser følgende nedre påvisningsgrense: UNG = 3 S<D>nuilstandard/vinkelkoeffisient = 3 x 5,7/22,5 = 0,76 fmol/ml.

Eksempel 5

Måling av prøvestabiliteten til N-terminalt proBNP

Ved hjelp av den i Eksempel 4 beskrevne "Sandwich"-ELISA ble analyttstabiliteten av N-terminalt proBNP målt. For dette ble blod tappet fra 4 pasienter med NYHA klasse II-III-blod i EDTA-holdige mottakterrør og oppbevart ved romtemperatur i 3 dager. Hver dag ble det tatt ut en prøve, og innholdet av N-terminalt proBNP ble målt. Referanseprøven samt prøvene for stabilitetsmåling i EDTA-plasma ble straks avkjølt til 4 °C - 8 °C og sentrifugert i løpet av 15 minutter. EDTA-plasma oppbevares ved 4 °C og romtemperatur og måles ved forskjellige tidspunkter innenfor en 24 timers belastningstid. Resultatene er gjengitt i Tabell 5.

Disse resultater viser at N-terminalt proBNP er fullstendig stabilt innenfor de analyserte tidspunkter og således kan anvendes som et rutinereagens. Dette resultat står i motsetning til litteraturen (Hunt et al, Clinical Endocrinology, 47, 287 (1997)) og understøtter antagelsen om at analyttstabiliteten kan påvirkes ved utvelgelse og utforming av dette analyseformat med to spesifikke antistoffer hvis epitoper ikke ligger i de ytre ender av analytten.

Eksempel 6

Undersøkelse av den diagnostiske sensitivitet til de N-terminale proBNP-analyser

For undersøkelse av den diagnostiske sensitivitet ble igjen analysen beskrevet i Eksempel 4 benyttet. For dette ble 114 friske personer og 235 pasienter med en NYHA- klassifisering mellom I og IV målt. Det er normalt spesielt viktig å skille mellom friske personer og pasienter i NYHA-klasse I.

Med denne høysensitive analyse ble det hos de 110 friske blodgiverne funnet en medianverdi på 6,6 fmol/ml NT-proBNP med et standardavvik på 7,3 fmol/ml. Den laveste verdi ble målt til 0,2 fmol/ml. Dette viser tydelig at det er nødvendig med en sensitivitet < 1,0 fmol/ml for å omfatte referanseområdet med nøyaktighet. Ved hjelp av denne fordeling ble det øvre normalverdiområde (97,5 % percentil) målt til 26,6 fmol/ml.

Med antagelse av et referanseverdiområde på fra 0 - 26,6 fmol/ml ble det blant de 233 pasientene med NYHA-klassifisering I-l V kun funnet 16 pasienter med en verdi innenfor normalområdet. Dette tilsvarer en klinisk sensitivitet på 93,3 %. Dersom man kun ser på pasientene med en NYHA-klassifisering på I ble 30 av de 37 pasientene ansett som positive, dette tilsvarer en sensitivitet på 81,1 %.

Dette resultat understøtter at en tydelig differensiering mellom pasienter med hjertesvikt i NYHA-klasse II og den friske normalbefolkning kan oppnås ved denne høysensitive N-terminale proBNP-analyse. Dette kan ikke oppnås med de til nå tilgjengelige analyser innen teknikkens stand (Dagubatti et al, Cardiovascular Research 36 (1997), 246.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for påvisning av nativt N-terminalt proBNP i en prøve som utførers i "sandwich"-format ved anvendelse av minst to antistoffer som gjenkjenner forskjellige epitoper i det native N-terminale proBNP, og som samtidig kan bindes til nativt N-terminalt proBNP, karakterisert vedat de minst to antistoffene binder i området til aminosyrene 10-50 i N-terminalt proBNP og antistoffene erholdes ved immunisering av en egnet organisme med rekombinant NTproBNP.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat påvisningsgrensen for N-terminalt proBNP ligger under 1 fmol/ml av den anvendte prøve.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat verdiene erholdt kan anvendes for differensiering mellom prøver fra friske individer og prøver fra pasienter med hjertesvikt i NYHA-klassene I til IV.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de tidligere krav, karakterisert vedat en differensiering mellom prøver fra friske individer og prøver fra pasienter i NYHA-klasse I kan utføres på bakgrunn av de oppnådde verdier.

5. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge ethvert av de foregående krav for differensiering mellom prøver fra friske individer og prøver fra pasienter i NYHA-klassene I til IV.

6. Anvendelse av rekombinant N-terminalt proBNP som standard i en fremgangsmåte for påvisning av N-terminalt proBNP ifølge kravene 1 til 4.

7. Antistoffer mot N-terminalt proBNP fremstilt ved immunisering av en egnet organisme med rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP, karakterisert vedat de spesifikt binder til aminosyre 10 til 50 i N-terminalt proBNP.

8. Antistoffer ifølge krav 7, karakterisert vedat de kan erholdes fra cellelinjene M 10.1.11 (DSM ACC 2386) eller M 13.4.14 (DSM ACC 2387) deponert 26.01.1999 ved DSMZ.

9. Antistoffer ifølge krav 8, karakterisert vedat de er fremstilt på en ekvivalent måte ved anvendelse av N-terminalt proBNP som antistoffene som er fremstilt ved hjelp av cellelinjene M 10.1.11 (DSM ACC 2386) eller M 13.4.14 (DSM ACC 2387).

10. Cellelinje, karakterisert vedat den er cellelinjen M 10.1.11 (DSM ACC 2386) eller M 13.4.14 (DSM ACC 2387) deponert 26.01.1999 ved DSMZ.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av polyklonalt antistoff ifølge kravene 7 eller 9,karakterisert vedat den omfatter trinnene: immunisering av en egnet organisme med rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP, isolering av antistoffet, gjennomsøking etter de mest reaktive epitoper og opprensing av antistoffet ved immunadsorpsjon til et egnet peptid.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av monoklonalt antistoff ifølge kravene 7-9,karakterisert vedat den omfatter trinnene: immunisering av en egnet organisme med rekombinant fremstilt N-terminalt proBNP, og utvelgelse av kloner ut fra antistoffets reaktivitet med nativt N-terminalt proBNP i forskjellige porsjoner av pasientsera.

13. Fremgangsmåte for påvisning ifølge ethvert av kravene 1 -4,karakterisert vedat prøven er en urinprøve.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert vedat fremgangsmåten er ment for differensiering mellom prøver fra friske individer og prøver fra pasienter med NYHA-klassene I til IV.