CN102692512A

CN102692512A - NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒

Info

Publication number: CN102692512A
Application number: CN2012102120742A
Authority: CN
Inventors: 苏恩本; 颜彬; 陈玲; 许行尚; 严行波; 王勇; 黄力
Original assignee: NANJING EGG-BASED BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: NANJING EGG-BASED BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-06-26
Filing date: 2012-06-26
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明涉及采用特殊抗体组合测定NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，所述抗体组合为MAB(10-39)与PAB(59-71)。本发明双抗夹心快速检测试剂盒具有敏感度高、临床相关性好等优点。

Description

NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒

技术领域

本发明属于临床医学诊断领域，具体涉及一种NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒。

背景技术

心力衰竭是一种常见的临床综合征，由于其严重性和高额的治疗护理费用，该病症的早期诊断显然是十分必要的。人们一直致力于寻找预测心力衰竭症状发生前标志物。目前研究表明心肌细胞产生并分泌具有排钠利尿活性的肽：心房来源的肽，其为de Bold等人在大鼠中发现的ANP（心房钠尿肽）（Life Science 1981, vol.28(1):89-94）和专利EP 418 308的发明者及Sudoh等人(1988)Nature 332:78-81在猪和人中发现的BNP（脑钠尿肽）。

人类BNP基因片段位于1号染色体断臂，其上游与ANP基因片段相连，由1900个核苷酸组成。mRNA含900-1000个核苷酸。表达产物含信号肽。信号肽降解后的产物为前体BNP (pro-BNP)，含108个氨基酸：

HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR₇₆S₇₇PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH₁₀₈。

它在其分泌过程之前和/或之中在氨基酸Arg76和Ser77之间进行切割，从而被切割成BNP，也被称为BNP(77-108)或BNP-32或BNP(1-32)，以及该激素原的N端部分，BNP(1-76)，也被称为proBNP的N端片段或NT-proBNP。

目前，体外诊断市场中比较权威和常用的NT-proBNP测试为Roche诊断公司的全自动Elecsys®NT-proBNP检测。该检测原理是夹心反应及电化学发光检测，设计用于大规模中心实验室，并且为了进行测试，除了精确计量的液体试剂外，还需要相对复杂的仪器来定量液体和检测发光信号，操作比较繁琐和复杂。该检测的多克隆抗体（PAB）是NT-proBNP的一种非常特别的部分，能够识别包括1-21和39-50位氨基酸的NT-proBNP的表位。然而，研究表明这些多克隆抗体不适用于采用颗粒标记例如胶体金作为标记物的NT-proBNP快速检测，因为由于快速检测的组分之间的物理化学相互作用，这类抗体在信号产生方面显示出令人不满意的可变性。这导致在不同批次间测试效果具有相当大的波动性。

中国专利200410095878.4提供了一种采用特殊抗体组合的用于测定NT-proBNP的免疫快速测试，虽然解决了Elecsys®NT-proBNP检测操作繁琐的特点。然而，其所采用的最优抗体组合MAB18.4.34(27-31)与PAB(39-50)在敏感度和实际临床测试方面不尽如人意。Hughes,D.等，Clin. Sci. 96 (1999) 373-380，报道了由proBNP氨基酸37-49相应肽所产生的并与之反应的抗体并不与完整的内源proBNP反应。根据这样的测定，无法区别患有左心室功能障碍的患者和正常对照。

因此，关于心力衰竭的早期诊断，对于改善用检测N-末端proBNP的试剂盒方法总存在着需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种敏感度更高、更适宜用于临床检测的试剂盒，用于快速测定NT-proBNP。

本发明的目的可通过以下技术方案予以实现：

一种NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，包括试纸条底衬，以及试纸条底衬上顺次相互搭接粘贴的样品垫、涂覆抗体-颗粒标记物的聚酯膜、包被膜及吸水纸，包被膜上设有相互平行的包被鼠抗人IgG抗体的控制线和检测线，所述检测线包被有与待检抗原特异性结合的抗体。

本发明中采用的术语PAB(X-Y)表示一种多克隆抗体，其靶向包括X到Y位的氨基酸的NT-proBNP表位。MAB (X-Y)为一种靶向包括X至Y位氨基酸的NT-proBNP表位的单克隆抗体。

所述抗体-颗粒标记物，优选MAB（10-39）被固定于颗粒标记物。

所述颗粒标记物为彩色的乳胶、金属溶胶标记物、聚合物标记物或半导体纳米微晶体，优选金标记物。

所述包被膜抗体，优选PAB(59-71)包被在包被膜上。

所述PAB（59-71）来源于免疫哺乳动物，尤其是绵羊、山羊或兔子。

所述MAB（10-39）购自南京强欣生物技术有限公司。

所述PAB（59-71）的制备方法，步骤如下：

1）克隆如SEQ ID NO:1所示的基因片段；

2）利用步骤1）所得的基因片段构建重组质粒，转化大肠杆菌，培养，诱导，裂解，纯化，得到重组人NT-proBNP蛋白；

3）以步骤2）所得的重组人NT-proBNP蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，所得血清即抗人NT-proBNP蛋白总多克隆抗体；

4）采用固相合成法合成如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

5）将步骤4）所得的多肽偶联到NHS-4柱子上，制得亲和层析柱；

6）将步骤3）所得抗人NT-proBNP蛋白总多克隆抗体加入步骤5)制备好的亲和层析柱上，纯化，即得PAB(59-71)。

所述颗粒如金、生物素等来标记抗体的方法，采用本领域熟练技术人员已知的方法，例如在中国专利201110044877.7中详细描述了采用金标记的过程。

本发明有益效果

本发明采用抗体组合MAB(10-39)与PAB(59-71)制得的NT-proBNP快速诊断试剂盒，具有敏感度高、临床相关性好等优点。

附图

图1 PAB(59-71)亲和层析洗脱记录图；

图2 间接ELISA法测定PAB(59-71)效价图；

图3 SDS-PAGE电泳检测亲和层析得到的PAB(59-71)电泳图。

图4 NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒优选实施例。

图5 NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒的抗体组合MAB(10-39)/PAB(59-71)与专利200410095878.4中抗体组合MAB18.4.34 (27-31) /PAB (39-50)的函数曲线。

图6 显示采用抗体组合MAB(10-39)/PAB(59-71)的NT-proBNP诊断试剂盒与Elecsys®NT-proBNP测试试剂盒的相关性。

其中，图1中，M为蛋白Marker，HC-PAB(59-71)为PAB(59-71)的重链，LC-PAB（59-71）为PAB(59-71)的轻链；图4中，1、底衬；2、样品垫；3、聚酯膜；4、包被膜；5、吸水纸；6、检测线；7、控制线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1 重组NT-proBNP（1-76）的制备方法

1. 重组NT-proBNP（1-76）的克隆

我们提供需要扩增NT-proBNP的基因序列SEQ ID NO1, 委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成该基因的核苷酸序列。所述基因序列SEQ ID NO1的5′端和3′端分别有BamH I酶切位点5′GGATCC 3′和Sal I酶切位点5′GTCGAC 3′，并克隆连接在pUC57载体上。

所述需要扩增的目的基因序列SEQ ID NO1：

ggatcccacc cgctgggcag cccgggtagc gccagcgacc tggaaacgag cggcctgcag 60

gagcagcgca accatctgca gggcaaactg agcgagctgc aggtggagca gaccagcctg 120

gagccgctgc aggagagccc gcgtccgacc ggtgtctgga agagccgcga ggtggccacc 180

gagggcatcc gtggccaccg caaaatggtc ctgtacaccc tgcgcgcacc gcgctaagtc 240

gac 243

将连接有NT-proBNP基因的pUC57和载体pET-32a用BamH I和Sal I双酶切后，分别回收酶切产物。在T4 DNA连接酶作用下定向将NT-proBNP基因片段连接。连接反应：PCR产物3μl, pET-32a空载体1μl，2×ligation buffer 5μl, T4 ligase 1μl。混匀后16℃连接过夜，即得表达质粒pET-32a-proBNP。

2. NT-proBNP在大肠杆菌中表达及纯化

将上述表达质粒pET-32a-proBNP，采用CaCl₂法转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取菌落接种于50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，220r/min震荡培养过夜，用菌液做PCR鉴定，阳性克隆送测序验证。

将上述测序正确的表达质粒pET-32a-proBNP，采用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，复苏后转接到含50μg/mL氨苄青霉素LB培养基过夜培养，次日以1:100转接到新鲜的含有50μg/mL氨苄青霉素的的LB培养基中，于37℃，220r/min震荡培养至A600=0.4～0.6时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L的，37℃诱导表达4h。4℃，10000r/min，离心3min，收集沉淀，用PBS重悬，用超声波裂解菌体，并高速离心分离细菌上清和沉淀，上清使用HisTrap HP层析柱纯化重组蛋白。

将获得的纯化重组蛋白用HisTrap Desalting置换缓冲体系为EK切割buffer（50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）,按EK酶与蛋白4μg/IU加入EK酶，25℃低速摇床（60r/min）切割6h左右。切割后用切割Buffer平衡柱子，再用His-Binding buffer稀释后His Trap HP纯化，收集重组NT-proBNP蛋白，SDS-PAGE电泳进行鉴定。

实施例2 抗原表位的分析及多肽的合成

以DNAstar软件分析NT-proBNP蛋白的原始氨基酸序列（共76个氨基酸）的抗原表位。主要采用4个参数，即Hopp&Woods亲水性（hydrophilicity）、Welling抗原性（antigenicity）、可及性（accessibility）和抗原表位（epitope）进行分析，然后综合各参数预测的结果确定采用本发明所用的抗原表位，即第59-71位氨基酸。采用固相法合成多肽，所述多肽序列SEQ ID NO2:Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr。

实施例3 抗NT-proBNP的总多克隆抗体的制备

用重组NT-proBNP（参见实施例1）以及完全弗氏佐剂免疫绵羊。剂量为每只动物0.1mg。在10个月内，按4周的间隔重复免疫。第一次免疫后6周和其后每月一次，获取血清样品，测定其敏感性和效价。

实施例4 亲和层析法制备PAB（59-71）

1．亲和层析住的制备

1）将合成的多肽(59-71)溶于偶联缓冲液（pH 8.3、0.2M NaHCO₃、0.5M NaCl）；

2）使用前用10-15柱体积预冷的1mM HCL洗NHS-4；

3）用偶联缓冲液洗柱，使NHS-4达到最佳的结合环境；

4）将处理好的填料与溶解好的多肽混合均匀（填料与溶解好的多肽体积比为0.5:1），在室温下结合2～4h或者4℃过夜；

5）封闭：用pH 8.5、0.1M 的Tris-HCL缓冲液封闭，室温2～4h，或者4℃过夜；

6）酸碱缓冲液交替洗柱：以pH 8.5、0.1M的Tris-HCL缓冲液和pH 4.0、0.1M的醋酸盐、0.5M的NaCl缓冲液交替洗柱，3个柱体积，3-6次；

7） 20%的乙醇保存。

2.PAB(59-71)的纯化

将抗NT-proBNP血清用结合缓冲液10mM PBS（2.9g Na₂HPO4·12H₂O、0.2g KH₂PO₄、8.0g NaCl、0.2g KCl、1000ml水）稀释10倍，缓缓加入上述制备好的亲和层析住。洗脱前，再用10～15柱体积的结合缓冲液洗去不吸附的杂蛋白和非特异性结合的蛋白。然后用pH 2.5、0.1M的 Gly-HCl 洗脱缓冲液洗脱，同时收集样品洗脱液。将收集的样品洗脱液用pH9.0、1M Tris-HCl中和至中性，最后将中和的样品洗脱液用10mM的PBS透析。将含目的蛋白的洗脱液分部收集并进行SDS-PAGE检测。

3. 效价测定

将纯化的PAB（59-71）进行倍比稀释，用间接ELISA测定效价，方法同血清抗体效价测定。PAB（59-71）抗体效价均达到10⁶。

实施例5

如图4所示，NT-proBNP双抗夹心快速诊断试剂盒，包括底衬1，以及底衬1上顺次相互搭接粘贴的样品垫2、涂覆有金标抗体的聚酯膜3、包被膜4及吸水纸5，包被膜4上包被有检测线6和控制线7，包被膜4中部平行设有一条包被PAB(59-71)的检测线6和一条包被兔抗鼠IgG抗体的控制线7，金标抗体为胶体金颗粒标记的MAB（10-39）。

双抗夹心快速诊断试剂盒具体制作方法：

1. 包被膜制备：

1）包被缓冲液的制备：将0.025M、pH7.4的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期7天；

2）封闭液的制备：将含1%BSA，1%蔗糖，0.025M、pH7.5的PBS，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期3天；

3）PAB(59-71)检测线的制备：将上述亲和层析制得的PAB(59-71)按2mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min,划线速度50m/20min，在干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；

4）控制线的制备：将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量0.4ml/min，划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜上划线，该线与检测线平行，放入干燥箱内20℃鼓风干燥12小时；

5）用上述封闭液将含有检测线和控制线的硝酸纤维素膜于37℃封闭60分钟，取出后置37℃下烘干处理两个小时，封袋备用。

2. 涂覆金标抗体的聚酯膜制备

1）金标抗体保存液配制：将15g的蔗糖，20μl的叠氮化钠，在100ml的pH 7.4、1%BSA溶解，用0.22μ膜过滤，置于4℃备用，有效期7天；

2）胶体金颗粒的制备：用三蒸水将1%氯金酸稀释成0.01%，置于95℃反应10分钟，加入1ml的1%柠檬酸三钠溶液，继续反应15分钟，待胶体金溶液颜色由蓝经紫变红后，冷却后加入2ml的1%碳酸钾溶液备用。外观应纯净，透亮，无沉淀和漂浮物；

3）金标抗体的制备：用1%碳酸钾溶液调节胶体金pH值至7.5，按照10μg链亲和素溶液/ml胶体金的量加入链亲和素溶液充分混匀，置于25℃水浴30分钟后再加入5%BSA,封闭20分钟后，离心取沉淀，用BSA恢复其终浓度1%，4℃保存备用。按50μg单抗-生物素/ml胶体金的量将MAB(10-39)-生物素加入胶体金中，37℃搅拌反应40分钟，加入5%BSA，封闭搅拌20分钟，6000r/min离心20分钟，弃上清，沉淀以金标抗体保存液恢复体积，4℃保存；

4）将混合好的胶体金均匀的铺在聚酯膜上，干燥，封袋，备用。

3. 胶体金试纸条组装

底衬1、样品垫2、吸水纸5、涂覆金标抗体的聚酯膜3、包被膜4按本领域技术人员通用做法将其粘贴在试纸板，最后将试纸板切割成相应宽度的试纸条即可。

实施例6

按照实施例5的方法制备NT-proBNP双抗夹心快速诊断试剂盒，将含有NT-proBNP的血清等分，取120μl的样品加样至试纸条上，并利用FIA8000系列免疫定量分析仪检测。从同一等分样品离心获得血浆，通过中国专利200410095878.4中抗体组合MAB18.4.34(27-31)/PAB(39-50)制得的夹心试纸条，利用CADRIAC Reader®(Roche诊断公司)检测。通过这种方式获得的两种测试试纸条的函数曲线于图5中。其中本发明系统MAB(10-39)/PAB(59-71)具有相当陡峭的标准曲线，因此测试更加灵敏。

实施例7

按照实施例5的方法制备NT-proBNP双抗夹心快速诊断试剂盒，将含有NT-proBNP的血清等分，取120μl的样品加样至试纸条上，并利用FIA8000系列免疫定量分析仪检测。从同一等分样品离心获得血浆，并采用Elecsys®NT-proBNP试剂盒（Roche诊断公司）在Elecsys®1010分析系统进行检测。采用这种方式制备了46份样品并采用两个系统检测。图6显示了两个系统的测量值，其相关性很好r=0.9832，P>0.05，两种方法间无统计学差异。

实施例8

临床选取阳性样本31例，阴性样本69例。按照实施例5的方法制备NT-proBNP双抗夹心快速诊断试剂盒，利用FIA8000系列免疫定量分析仪检测，并与Elecsys®NT-proBNP试剂盒（Roche诊断公司）在Elecsys®1010分析系统进行检测结果对照。表1显示了本发明试剂盒良好的临床诊断符合率。

表1

诊断符合率=(31+68)/(31+0+1+68)×100%=99%

阳性符合率=31/(31+0)×100%=100%

阴性符合率=68/(1+68)×100%=98.55%

假阳性符合率=1/(1+68)×100%=1.45%

假阴性符合率=0/(0+31)×100%=0

序列表

<110>南京基蛋生物科技有限公司

<120>NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒

<160>2

<210>1

<211>243

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>钠尿肽N端76个氨基酸与终止密码子230个核苷酸序列，5′端有BamHI酶切位点，3′端连接SalI酶切位点。

<400>

ggatcccacc cgctgggcag cccgggtagc gccagcgacc tggaaacgag cggcctgcag 60

gagcagcgca accatctgca gggcaaactg agcgagctgc aggtggagca gaccagcctg 120

gagccgctgc aggagagccc gcgtccgacc ggtgtctgga agagccgcga ggtggccacc 180

gagggcatcc gtggccaccg caaaatggtc ctgtacaccc tgcgcgcacc gcgctaagtc 240

gac 243

<210>2

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>能与B型钠尿肽BNP抗体结合，用于纯化抗体

<400>

Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr

1 5 10 13

Claims

1.一种NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，其特征在于：它采用如下的抗体组合：MAB (10-39)与PAB(59-71)。

2.根据权利要求1所述NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，其特征在于所述的抗体之一以抗体-颗粒标记物的形式存在。

3.根据权利要求1所述NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒，其特征在于所述的抗体之一以抗体-金标记物的形式存在。

4.根据权利要求1所述NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒,其特征在于所述PAB(59-71)的制备方法，包括如下步骤：

1）克隆如SEQ ID NO:1所示的基因片段；

4）采用固相合成法合成如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

6）将步骤3）所得抗人NT-proBNP蛋白总多克隆抗体加入步骤5)制备好的亲和层析柱上，纯化，即得。

5.权利要求1所述的NT-proBNP双抗夹心快速检测试剂盒在检测人NT-proBNP中的应用。