KR20190116997A - 유전적 변이체를 인식하는 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이, 또는 ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 와 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명에 의해 추가로 고려되는 것은 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 돌연변이된 NT-proBNP 를 포함하는 키트이다. 본 발명은 또한 심부전의 진단 방법에 관한 것이다.

Description

유전적 변이체를 인식하는 항체
본 발명은 i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 및 ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 와 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 돌연변이된 NT-proBNP 에 관한 것이다. 본 발명에 의해 추가로 고려되는 것은 본 발명의 항체, 또는 본 발명의 돌연변이된 NT-proBNP 를 포함하는 키트이다. 본 발명은 또한 심부전의 진단 방법에 관한 것이다.
심부전 (HF) 전세계적으로 많은 국가에서 이환율과 사망률의 주요 원인이다. B-유형 나트륨이뇨 펩티드 (BNP), 또는 그의 아미노-말단 단편 N-말단 proBNP (NT-proBNP) 와 같은 나트륨이뇨 펩티드 마커의 측정은 HF 환자의 진단 및 위험 계층화를 위한 중요한 도구로 떠오르고 있다.
뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) 는 32-아미노산 폴리펩티드이다. BNP 는 134-아미노산 전-프로호르몬 ("pre-proBNP") 으로서 합성된다. 26 개 아미노산 길이를 갖는 N-말단 신호 펩티드의 제거는 프로호르몬을 생성한다 ("proBNP", 108 aa 길이). 프로호르몬은 이후 NT-proBNP (프로호르몬 뇌 나트륨이뇨 펩티드의 N-말단, 76 aa 길이) 및 생물학적 활성 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (BNP) 로 절단된다. NT-proBNP 및 BNP 는 등 몰량으로 생산된다. 여러 연구에 따르면 BNP 및 NT-proBNP 에 대한 분석은 심부전 진단에 신뢰성있게 사용될 수 있다는 것을 보여준다 (참고, 예, Prontera et al., Clinica Chimica Acta 400 (2009) 70-73).
BNP 는 혈액에서 대사된다. 이것은 생체 내 및 시험관 내에서 빠른 분해 속도로 인해 반감기가 짧다. NT-proBNP 는 혈액 내에서 온전한 분자로서 순환되고, 그대로 신장에서 제거된다. 이것은 활성 펩티드 BNP 보다 반감기가 높고 시험관 내에서 더 안정적이다. 따라서 사전분석은 NT-proBNP 로 더욱 강력해져 시료를 중앙 실험실로 쉽게 운반할 수 있다 (Mueller 2004, Clin Chem Lab Med 42: 942-4). 혈액 샘플은 실온에서 수 일 동안 저장할 수 있거나 또는 회수율 손실없이 발송 또는 수송될 수 있다. 대조적으로, 실온 또는 4 ℃ 에서 48 시간 동안 BNP 의 저장은 적어도 20% 의 농도 손실을 초래한다 (Mueller loc.cit.; Wu 2004, Clin Chem 50: 867-73).
NT-proBNP 의 장점으로 인해, 생물학적으로 비활성인 펩티드 NT-proBNP 는 현재 심부전 진단에 바람직한 마커이다. 이 마커는 실험실 시험 뿐만 아니라 현장 진단 설정에서도 일상적으로 사용된다.
현재 시판되는 모든 NT-proBNP 어세이는 포획 및 신호 항체를 사용한 샌드위치-면역어세이다. 현재 시판되는 일부 NT-proBNP 어세이는 NT-proBNP 의 아미노산 42 내지 46 을 포함하는 에피토프에 결합하는 항체를 함유한다 (참고, Saenger et al, Clinical Chemistry 63:1 351-358 (2017), 예, supplemental table 2, 또는 Clerico et al., Crit Rev Clin Lab Sci, 2015; 52(2): 56-69).
본 발명의 기초 연구에서, NT-proBNP 의 아미노산 서열에서 지점 돌연변이가 확인되었다 (Arg46His, R46H). 이 지점 돌연변이는 다양한 NT-proBNP 어세이의 신호 항체의 에피토프 내에 있다. 지점 돌연변이는 Ensembl-데이터베이스에서 발견될 수 있다 (Yates et al. Ensembl 2016, Nucleic Acids Res. 2016 44 Database issue:D710-6, release 87, Dec 2016, dbSNP Cluster ID: rs61761991. 데이터베이스의 검색은 NT-proBNP 의 아미노산 42 내지 46 내에서 제 2 지점 돌연변이 Glu43Asp (E43D) 를 나타냈다 (dbSNP Cluster ID: rs74613227).
본 발명의 목적은 NT-proBNP 의 아미노산 서열에 돌연변이를 갖는 대상체에서 심부전을 진단하기 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다. 기술적 문제는 하기 청구항 및 본 명세서에서 특징규명한 구현예에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 를 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 를 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
용어 "NT-proBNP" (프로-뇌 나트륨이뇨 펩티드의 N-말단 단편) 는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 절단 후 심장 호르몬으로서 기능하는 분비된 단백질인 프로 뇌 나트륨이뇨 펩티드 (proBNP) 의 76 개 아미노산 N-말단 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, NT-proBNP 는 인간 NT-proBNP 이다. 따라서, 상기 돌연변이된 NT-proBNP 는 돌연변이된 인간 NT-proBNP 일 것이다.
야생형 인간 NT-proBNP (본원에서 "미돌연변이된" NT-proBNP 로도 지칭됨) 의 서열은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있으며, 선행 기술에 이미 상세히 기재되어 있다, 예를 들어 WO 02/089657, WO 02/083913, Bonow 1996, New Insights into the cardiac natriuretic peptides. Circulation 93: 1946-1950. 바람직하게는, 야생형 NT-proBNP 는 SEQ ID NO: 3 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 항체는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합할 것이다. 따라서, 본 발명의 항체에 특이적으로 결합된 NT-proBNP 는 야생형 NT-proBNP 와 비교하여 돌연변이를 포함할 것이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 를 특이적으로 결합할 것이다. 따라서, 야생형 NT-proBNP 의 위치 46 에서의 아르기닌은 히스티딘으로 치환될 것이다 (즉, 이 돌연변이된 NT-proBNP 는 위치 46 에서의 히스티딘을 포함한다). 이 돌연변이는 본 명세서에서 "Arg46His" 또는 "R46H" 돌연변이로도 지칭된다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 항체는 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합한다. 따라서, 야생형 NT-proBNP 의 위치 43 에서의 글루탐산은 아스파르트산으로 치환될 것이다 (즉, 이 돌연변이된 NT-proBNP 는 위치 43 에서의 아스파르트산을 포함한다). 이 돌연변이는 본 명세서에서 "Glu43Asp" 또는 "E43D" 돌연변이로도 지칭된다.
본원에 제공된 돌연변이의 위치는 NT-proBNP 의 서열, 특히 SEQ ID NO: 3 에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 야생형 NT-proBNP 내의 아미노산 위치이다. 따라서, R46H 돌연변이는 NT-proBNP 의 위치 46 에 있다. 더 긴 전구체 폴리펩티드인, preproBNP 에서, 상응하는 돌연변이는 위치 72 에 있다. 따라서, R46H 돌연변이는 본원에서, 예를 들어 실시예 섹션에 있으며, 또한 R72H 돌연변이로도 지칭되고, E43D 돌연변이는 E69D 돌연변이로 지칭된다.
상기 언급된 돌연변이는 치환이다. 돌연변이/치환은 야생형 NT-proBNP 와 비교하여, 특히 SEQ ID NO: 3 에 나타낸 서열을 갖는 야생형 NT-proBNP 와 비교하여 돌연변이/치환인 것으로 이해된다. 예를 들어, 야생형 인간 NT-proBNP 는 위치 46 에 아르기닌 잔기를 포함하는 반면, 위치 46 에 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 는 이 위치에 히스티딘 잔기를 포함한다.
돌연변이된 NT-proBNP 에는 하나 이상의 추가 돌연변이가 존재할 수 있다. 그러나, 이들 하나 이상의 돌연변이는 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 결합된 에피토프에 위치하지 않을 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 는 SEQ ID NO: 1 에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 서열은 또한 표 A 에 제시된다. 위치 46 에서의 히스티딘 잔기는 볼드체로 표시된다.
하나의 구현예에서, 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 는 SEQ ID NO: 2 에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 서열은 또한 표 A 에 제시된다. 위치 43 에서의 아스파르트산 잔기는 볼드체로 표시된다.
용어 "항체" 는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 4 개의 폴리펩티드 사슬, 2 개의 중쇄 (H) 및 2 개의 경쇄 (L) 로 구성된 임의의 면역글로불린 (Ig) 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체" 는 또한 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 용어 "항원-결합 단편" 은 본원의 다른 곳에서 설명된다. 정의는 그에 맞춰 적용된다.
본 발명에 따른 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 용어 "모노클로날 항체" 는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어는 실질적으로 동종의 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합하며, 그 예외는, 예를 들어, 모노클로날 항체의 생산 동안 발생할 수 있는 가능한 변이체이며, 그러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 본 발명의 모노클로날 항체는 Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975) 에 기재된 잘 알려진 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체는 돌연변이된 NT-proBNP 또는 본 발명의 단편 (본원의 다른 곳에서 더 상세히 설명됨) 을 포유동물, 바람직하게는 마우스, 보다 바람직하게는 양에 적용함으로써 제조된다. 특히, NT-proBNP 또는 이의 단편은 운반체 단백질 ("운반체 단백질"이라는 용어의 정의에 대해서는 본원의 다른 곳을 참조) 에 포함되는 것으로 (따라서 작동가능하게 연결됨) 예상된다. 숙주 종에 따라, 면역학적 반응을 증가시키기 위해 다양한 보강제가 사용될 수 있다. 이러한 보강제는 바람직하게는 프로인트 보강제, 미네랄 겔, 예를 들어 수산화알루미늄 및 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀을 포함한다. 본 발명에 따른 모노클로날 항체는 이후 잘 공지된 하이브리도마 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 항체의 제조에 대한 추가 세부 사항은 하기 첨부 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 항체는 IgG 항체이다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 바람직한 항체는 단리된 항체이다. 따라서, 항체는 정제된 항체일 것이다. 항체의 정제는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 항체는 항체가 생산된 세포로부터 단리될 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 항체는 예를 들어 로리 (Lowry) 방법에 의해 결정된 바와 같이 70 중량% 초과의 항체, 일부 구현예에서, 80 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량% 또는 99 중량% 초과의 항체로 정제된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 단리된 항체는 단백질 검출을 위해 쿠마시 블루 염색을 사용하여 환원 조건 하에서 SDS-PAGE 에 의해 측정되는 바와 같이 90% 초과의 순도로 정제된다.
바람직하게는, 본원에 기술된 모노클로날 항체는 양 모노클로날 항체, 마우스 모노클로날 항체, 토끼 모노클로날 항체, 염소 모노클로날 항체, 말 모노클로날 항체, 닭 모노클로날 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 모노클로날 항체는 마우스 모노클로날 항체이다. 더욱 바람직하게는, 모노클로날 항체는 양 항체이다.
본 발명의 항체는 상이한, 즉 제 2 NT-proBNP 에피토프에 결합하는 하나 이상의 다른 항체와 조합하여 포획 또는 검출 (신호) 항체로서 샌드위치 어세이에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 제 2 항체는 본 발명의 항체가 수득된 종과 상이한 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 본 발명의 항체가 양 항체인 경우, 제 2 항체는 마우스 항체일 수 있다.
신호 및 포획 항체는 샌드위치 어세이에 사용될 수 있다. 샌드위치 어세이는 샌드위치 어세이 기술의 수많은 변형을 포괄하는 가장 유용하고 통상적으로 사용되는 어세이 중 하나이다. 예를 들어, 전형적인 어세이에서, 미표지된 (포획) 결합제가 고형 기재 상에 고정되거나 또는 고정될 수 있고, 검사하려는 샘플은 포획 결합제와 접촉된다. 인큐베이션의 적합한 기간 이후에, 결합제-바이오마커 복합체의 형성을 가능하게 하는 충분한 시간 기간 동안, 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 리포터 분자로 표지된 제 2 (검출) 결합제가 이후에 첨가되고 인큐베이션되어서, 결합제-바이오마커-표지된 결합제의 또다른 복합체의 형성을 위한 충분한 시간을 가능하게 한다. 임의의 미반응된 재료는 세척해 버릴 수 있고, 바이오마커의 존재는 검출 결합제에 결합된 리포터 분자에 의해 생성되는 신호의 관찰에 의해 결정된다. 결과는 가시적인 신호의 단순 관찰에 의해, 정성적일 수 있거나, 또는 예를 들어, 알려진 양의 돌연변이된 NT-proBNP 를 함유하는 대조군 샘플과 비교하여 정량화될 수 있다 (본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같은 표준 또는 교정기로서).
전형적인 샌드위치 어세이의 인큐베이션 단계는 필요에 따라서 적절하게 가변화시킬 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 동시 인큐베이션을 포함하고, 여기서 둘 이상의 결합제 및 바이오마커가 동시 인큐베이션된다. 예를 들어, 분석하려는 샘플 및 표지된 결합제 둘 모두는 고정된 포획 결합제에 동시에 첨가된다. 또한 분석하려는 샘플 및 표지된 결합제를 먼저 인큐베이션하고 그 이후에 고체상에 결합되거나 또는 고체상에 결합할 수 있는 항체를 첨가하는 것이 가능하다.
특이적 결합제 및 바이오마커 간에 형성된 복합체는 샘플에 존재하는 바이오마커의 양에 비례하게 될 것이다. 적용하려는 결합제의 특이성 및/또는 민감성은 특이적으로 결합할 수 있는 샘플에 포함된 적어도 하나의 마커의 비율 정도를 정의하는 것으로 이해하게 될 것이다. 측정을 어떻게 수행할 수 있는 지에 대한 보다 상세한 내용은 또한 본 명세서의 다른 곳에서 확인할 수 있다. 형성된 복합체의 양은 실제로 샘플에 존재하는 양을 반영하는 바이오마커의 양으로 변환될 것이다.
본원에 제시된 바와 같은 항체는 테스트 스트립에 의해 구성될 수 있다.
본 발명의 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 돌연변이된 NT-proBNP (프로-뇌 나트륨이뇨 펩티드의 N-말단 단편) 에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 는 돌연변이된 NT-proBNP 로 구성된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 용어 "에피토프" 는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 사용된 용어는 바람직하게는 본 발명의 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 돌연변이된 NT-proBNP 의 일부를 지칭한다. 그러나, 본 발명에 따른 에피토프는 또한 특정 3-차원 구조에 의해 형성될 수 있으며, 이러한 구조적 에피토프가 또한 본 명세서에서 구상된다. 하나의 구현예에서, 에피토프는 적어도 5 개, 그러나 50 개 이하의 아미노산, 특히 20 개 이하의 아미노산의 길이를 갖는다.
에피토프는 본원에 언급된 돌연변이, 즉 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함할 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 항체는 돌연변이 (및 NT-proBNP 의 위치 46 에서의 히스티딘 잔기 또는 NT-proBNP 의 위치 43 에서의 아스파르트산 잔기) 를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 의 에피토프에 결합할 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상응하는 항원 (예를 들어, 본원의 다른 곳에 정의된 돌연변이된 NT-proBNP 또는 그의 단편) 에 특이적으로 결합할 것이다. 따라서, 항원에 "결합" 또는 "특이적으로 결합" 하는 항체는 항원에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 를 말하는 것으로 의도된다. "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 이라는 표현은 잘 이해되고 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 가 다른 바이오분자와 유의하게 결합하지 않음을 나타내는 데 사용된다. 특히, 본원에 제시된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 단편) 는 바람직하게는 야생형 NT-proBNP 에 결합하지 않는다 (따라서 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이 및/또는 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하지 않는 NT-proBNP 에 결합하지 않는다). "항체가 야생형 NT-proBNP 에 결합하지 않는다" 또는 "항체의 단편이 야생형-NT-proBNP 에 결합하지 않는다" 라는 표현은 항체 (또는 이의 단편) 가 야생형 NT-proBNP 에 유의하게 결합하지 않음을 의미한다. 예를 들어, 하기 본원에 기술된 바와 같이, 야생형 NT-proBNP 에 대한 본 발명의 항체 (또는 이의 단편) 의 KD 는 본 명세서에서 언급된 돌연변이된 NT-proBNP 에 대한 그의 KD 보다 적어도 100 배 낮다는 것으로 구상된다.
따라서, 야생형 NT-proBNP 에 대한 결합 수준은 ELISA 또는 예를 들어 Biacore T200 기기를 사용한 친화도 측정에 의해 무시할 수 있는 결합 친화도를 초래한다. 실시예에 도시된 바와 같이, 동역학적 측정은 심지어 높은 분석물 농도에서도 이러한 항체 대 야생형 NT-proBNP 의 결정가능한 회합 속도 상수 ka (1M) 를 나타내지 않는다.
KD 는 표면 플라즈몬 공명 기법 (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 과 같은 결합 어세이로 결정할 수 있는 해리 상수이다. 실시예 섹션에 기재된 바와 같이, S-22.2.195 및 S-23.4.66 으로 명명된 2 개의 모노클로날 항체가 본 발명의 기초 연구에서 생성되고 시험되었다. 항체 S-22.2.195 는 R46H 돌연변이를 갖고 NT-proBNP 에 결합한다. 항체 S-23.4.66 은 E43D 돌연변이를 갖고 NT-proBNP 에 결합한다. 야생형 NT-proBNP, R46H 돌연변이를 갖는 NT-proBNP, 및 E43D 돌연변이를 갖는 NT-proBNP 에 대한 이들 항체의 KD, ka 및 kd 값은 실시예 섹션의 실시예 3 에서 측정되었다.
특히, 본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP R46H 에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 바람직하게는 13℃ 에서 0.05 nM 이하, 특히 25℃ 에서 0.08 nM 이하 및/또는 37℃ 에서 0.15 nM 이하의 항원 (즉, 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 NT-proBNP) 에 대한 KD 값을 갖는다.
특히, 본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP E43D 에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 바람직하게는 13℃ 에서 0.4 nM 이하, 특히 25℃ 에서 3 nM 이하 및/또는 37℃ 에서 20 nM 이하의 항원 (위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 NT-proBNP) 에 대한 KD 값을 갖는다.
특히, 본 발명의 항체 (또는 항원 결합 단편) 는 그의 진짜 항원에 특이적으로 결합하고 SPR (Surface Plasmon Resonance: 표면 플라즈몬 공명) 에 의해 조사된 바와 같이 검출가능한 표적-외 상호작용을 나타내지 않는 것으로 생각된다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 는 (이의 항원, 즉 돌연변이된 NT-proBNP 대비 상호작용과 비교하여) 야생형 NT-proBNP 를 인식하는 것에 비해 낮은 친화성 상호작용을 나타낸다. 보다 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 단편의 야생형 NT-proBNP 에 대한 친화성 KD 는 항원 (즉, 돌연변이된 NT-proBNP) 에 대한 이의 결합보다 적어도 백배, 특히 적어도 삼백 배 낮다.
항체의 이의 항원에 대한 동역학적 결합 특성을 설명하는 또다른 수단은 회합 속도 ka 상수 및 해리 속도 상수 kd 가 있기 때문에, 해리 상수를 그의 동역학적 속도 기여로 분해하는 것이다. 결합 속도 ka 상수는 항체/항원 복합체 형성 속도를 특징으로하며 시간 및 농도 의존적이다.
바람직하게는 본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP R46H 에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 의 회합 속도 상수는 바람직하게는 13℃ 에서 4.0E+05 1/M 초과, 특히 25℃ 에서 7.5E+05 1/Ms 초과 및/또는 37℃ 에서 1.0E+06 1/Ms 초과의 (그의 항원에 대한) ka 값을 갖는다.
바람직하게는 본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP E43D 에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 의 회합 속도 상수는 바람직하게는 13℃ 에서 6.0E+04 1/M 초과, 특히 25℃ 에서 5.5E+04 1/Ms 초과 및 37℃ 에서 1.0E+05 1/Ms 초과의 ka 값을 갖는다.
본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 25℃ 에서 야생형 NT-proBNP 에 비해 적어도 1.6 배 느린 회합 속도 상수를 나타낸다.
해리 속도 상수는 항체의 그의 항원으로부터의 해리 속도를 나타낸다. 따라서, 해리 속도 상수는 복합체가 시간 단위로 분해될 확률을 나타낸다. 해리 속도 상수가 낮을수록, 항체가 그의 항원에 더 밀접하게 결합된다.
바람직하게는 본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP R46H 에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 의 해리 속도 상수는 바람직하게는 13℃ 에서 1.0E-05 1/s 미만, 특히 25℃ 에서 3E-05 1/s 미만 및 37℃ 에서 9E-05 1/s 미만의 kd 값을 갖는다.
바람직하게는 본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP E43D 에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 의 해리 속도 상수는 바람직하게는 13℃ 에서 1.0E-05 1/s 미만, 특히 25℃ 에서 1.5E-04 1/s 미만 및/또는 37℃ 에서 2.0E-03 1/s 미만의 kd 값을 갖는다.
본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체는 바람직하게는 25℃ 에서 야생형 NT-proBNP 에 비해 적어도 100 배 더 빠른 해리 속도 상수를 나타낸다 (돌연변이된 NT-proBNP 대비 해리 속도 상수와 비교하여).
동역학적 속도 상수는 온도 구배에서 변화하고 있다. 13℃ 및 37℃ 에서의 온도-의존적 결합 동역학은 항체 항원 상호작용을 특성화하기 위해 사용될 수 있다. ka 37℃ 및 ka 13℃ 에서의 회합율 속도 (rate velocities) 의 몫 (Velocity Factor, US20140256915) 은 항체 상호작용을 특성화하는 수단이다. 몫이 10 의 값 미만이면, 항체 항원 결합은 엔탈피 지배되는 반면, 속도 인자 VF > 10 은 엔트로피-구동 동역학의 가능성을 증가시킨다.
바람직하게는 야생형 NT-proBNP 또는 이의 단편 또는 뮤테인에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 의 몫은 10 미만이다.
본 발명의 항체는 적어도 하나의 경쇄, 특히 2 개의 경쇄, 및 적어도 하나의 중쇄, 특히 2 개의 중쇄를 포함할 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체는 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체의 경쇄 (특히 두 경쇄) 는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 (특히 두 중쇄) 는 SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 4 에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 바람직하게는 SEQ ID NO: 10 에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. SEQ ID NO: 5 에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 바람직하게는 SEQ ID NO: 11 에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 항체는 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체의 경쇄 (특히 두 경쇄) 는 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 중쇄 (특히 두 중쇄) 는 SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 12 에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄는 바람직하게는 SEQ ID NO: 14 에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. SEQ ID NO: 13 에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄는 바람직하게는 SEQ ID NO: 15 에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
상기 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체는 본 발명의 기초 연구에서 생성되었다:
항체 S-22.2.195 은 R46H 돌연변이를 갖는 NT-proBNP 에 특이적으로 결합한다. 이 항체는 SEQ ID NO: 4 에 나타낸 서열을 갖는 경쇄 및 SEQ ID NO: 5 에 나타낸 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.
항체 S-23.4.66 은 E43D 돌연변이를 갖는 NT-proBNP 에 특이적으로 결합한다. 이 항체는 SEQ ID NO: 12 에 나타낸 서열을 갖는 경쇄 및 SEQ ID NO: 13 에 나타낸 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.
생성된 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 또한 표 A 에 제시되어 있다.
표 A 는 항체의 결합 친화성을 주로 담당하는 상보성 결정 영역 (CDR) 을 추가로 보여준다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 3 개의 CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3) 을 갖는다. 따라서, 각각의 항체는 총 6 개의 상이한 CDR 을 갖는다.
본 발명의 연구에서 생성된 2 개의 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR 은 하기 표 A 에 볼드체로 표시되어 있다 (N-말단에서 C-말단으로의 순서로). CDR 은 인 실리코 (in silico) 주석이 있었다 (Lefranc, M.-P., IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System Cold Spring Harb Protoc. 2011 Jun 1;2011(6)).
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 S-22.2.195 로 구성된 6 개의 CDR 또는 S-23.4.66 으로 구성된 6 개의 CDR (바람직하게는 각각의 항체의 경쇄/중쇄와 동일한 순서로) 을 포함한다.
따라서, 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 하기를 포함하는 것으로 구상된다:
경쇄 중에 (바람직하게는 두 경쇄 중에):
서열 LLDDAY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 16 에 나타낸 바와 같음)
서열 KDS 를 갖는 CDR2, 및
서열 LSVDSSEYSV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 17 에 나타낸 바와 같음),
및
중쇄 중에 (바람직하게는 두 경쇄 중에):
서열 GFSLIGEY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 18 에 나타낸 바와 같음)
서열 MASGGTI 를 갖는 CDR2 (SEQ ID NO: 19 에 나타낸 바와 같음), 및
서열 VRSSVSPGDDRDV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 20 에 나타낸 바와 같음).
상기 항체는 R46H 돌연변이를 갖는 NT-proBNP 에 특이적으로 결합한다. 따라서, R46H 돌연변이를 갖는 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체는 경쇄 가변 도메인이 서열 LLDDAY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 16), 서열 KDS 를 갖는 CDR2, 및 서열 LSVDSSEYSV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 17) 을 포함하고, 중쇄 가변 도메인이 서열 GFSLIGEY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 18), 서열 MASGGTI 를 갖는 CDR2 (SEQ ID NO: 19), 및 서열 VRSSVSPGDDRDV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 20) 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 하기를 포함하는 것으로 구상된다:
경쇄 중에 (바람직하게는 두 경쇄 중에):
서열 SSNVGYGNY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 21 에 나타낸 바와 같음)
서열 SAT 를 갖는 CDR2, 및
서열 VSYDSSSKFGV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 22 에 나타낸 바와 같음).
및
중쇄 중에 (바람직하게는 두 경쇄 중에):
서열 GFSVTNSG 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 23 에 나타낸 바와 같음)
서열 INNDGVA 를 갖는 CDR2 (SEQ ID NO: 24 에 나타낸 바와 같음), 및
서열 GTRDLPSDVRYGNMYINY 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 25 에 나타낸 바와 같음).
상기 기재된 항체는 E43D 돌연변이를 갖는 NT-proBNP 에 특이적으로 결합한다. 따라서, E43D 돌연변이를 갖는 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체는 경쇄 가변 도메인이 서열 SSNVGYGNY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 21), 서열 SAT 를 갖는 CDR2, 및 서열 VSYDSSSKFGV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 22) 을 포함하고, 중쇄 가변 도메인이 서열 GFSVTNSG 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 23), 서열 INNDGVA 를 갖는 CDR2 (SEQ ID NO: 24), 및 서열 GTRDLPSDVRYGNMYINY 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 25) 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 언급된 CDR 은 바람직하게는 표 A 에 나타낸 순서대로, 각각의 장쇄 또는 단쇄의 가변 영역으로 구성될 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 (본원에서 또한 "항체 단편"으로 지칭됨) 에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 항체의 항원-결합 단편은 항원 (특히 상기 기술된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP, 즉 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 또는 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이된 NT-proBNP 돌연변이) 에 특이적으로 결합할 수 있을 것이다. 따라서, 항체의 항원 결합 단편은 항원 (예를 들어, 돌연변이된 NT-proBNP) 에 특이적으로 결합하는 (전체-길이) 항체의 능력을 보유하는 단편이다.
항체 단편은 바람직하게는 전체 길이 항체의 일부, 바람직하게는 이의 가변 도메인, 또는 적어도 이의 항원 결합 부위를 포함한다. 하나의 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, Facb 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편 및 Fv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 항원-결합 단편은 F(ab')2 단편이다.
어떻게 항원-결합 단편을 생성하는 지는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 단편은 본 발명의 항체의 효소적 절단에 의해 생성될 수 있다. 또한, 단편은 합성 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 바람직하게는 항체의 파파인 소화, 펩신 분해 및 부분 환원에 의한 Fab' 단편, 펩신 분해에 의한 F(ab')2 단편, 및 플라스민 소화에 의한 facb 단편에 의해 생성된다. Fv 또는 scFv 단편은 바람직하게는 분자 생물학 기술에 의해 생성된다.
항체의 항원 결합 단편은 또한 2 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편인 디아바디일 수 있다. 디아바디는 바람직하게는 동일한 폴리펩티드 사슬에서 경쇄 가변 도메인에 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 신호 항체 또는 신호 단편 (여기서는 검출 항체 또는 검출 단편으로도 지칭됨) 으로서 사용된다. 신호 항체 또는 신호 단편이라는 용어는 직접적으로 또는 검출 수단에 의해 증폭된 표지를 통해 검출될 수 있는 항체 또는 단편을 지칭한다. 본 발명의 대안적인 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 포획 항체 또는 포획 단편으로서 사용된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 검출가능한 표지에 연결된다. 본원에 기재된 검출가능한 표지는 바람직하게는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 자연적으로 연결되지 않은 표지이다. 따라서, 검출가능한 표지는 바람직하게는 항체에 대해 이종성이다. 적합한 표지는 적절한 검출 방법에 의해 검출가능한 임의의 표지이다. 하나의 구현예에서, 상기 검출가능한 표지는 효소, 비오틴, 방사성 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 전기화학발광 표지, 금 표지 또는 자성 표지이다. 바람직한 구현예에서, 표지는 전기화학발광 표지이다.
효소적 표지는 예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 및 루시퍼라제를 포함한다. 이들 효소에 대한 기질은 당업계에 익히 공지되어 있다. 검출에 적합한 기질은 디-아미노-벤지딘 (DAB), 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지딘, NBT-BCIP (4-니트로 블루 테트라졸륨 클로라이드 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트) 를 포함한다. 적합한 효소-기질 조합은 색상 반응 생성물, 형광 또는 화학발광을 산출할 수 있으며, 이것은 당업계에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다. 형광 표지는 예를 들어 5-카르복시플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 테트라메틸로다민, Cy2, Cy3 및 Cy5, 형광 단백질, 예컨대 GFP (Green Fluorescent Protein: 녹색 형광 단백질), 텍사스 레드 (Texas Red) 및 알렉사 (Alexa) 염료를 포함한다. 방사성 표지는 예를 들어 요오다이드, 코발트, 셀레늄, 트리튬, 탄소, 황 및 인의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 표지는 공지되고 적합한 임의의 방법, 예를 들어, 감광성 필름 또는 인광체 이미지화기에 의해 검출될 수 있다. 자성 표지는 예를 들어 상자성 및 초상자성 표지를 포함한다. 사용되는 화학발광 표지는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 또는 옥살레이트 에스테르를 포함할 수 있다.
특히, 본원에 기재된 항체는 전기화학발광 표지 (특히 신호 항체) 를 포함하는 것으로 구상된다.
가장 일반적으로 사용되는 전기화학발광 화합물은 루테늄이다. 따라서, 전기화학발광 표지는 바람직하게는 루테늄을 포함한다. 특히, 전기화학발광 표지는 비피리딘-루테늄(II) 착물을 포함할 것이다. 따라서, 항체가 루테닐화된 항체인 것이 특히 구상된다. 항체를 루테닐화하는 방법은 예를 들어 실시예 섹션에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체를 생산하는 숙주 세포, 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체를 생산하는 숙주는 하이브리도마 세포이다. 게다가, 숙주 세포는 본 발명에 따른 항체를 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 동물 세포, 특히 포유동물 세포일 수 있다. 하나의 구현예에서, HEK293 세포 및 CHO 세포가 숙주 세포로서 사용된다. 또다른 구현예에서, 숙주 세포는 비-인간 동물 또는 포유동물 세포이다.
예를 들어, 본 발명의 기초가 되는 연구에서 생성된 항체 S-23.4.66 은 하이브리도마에 의해 생성되었다. 항체 rS-22.2.195 는 항체가 재조합적으로 발현된 CHO 세포의 풀 (Chinese Hamster Ovary cells) 및 하이브리도마에 의해 생성되었다. 이어서, 이 항체의 대규모 생산을 위해 안정한 CHO 라인이 생성되었다.
본 발명에 따른 숙주 세포는 단리된 세포일 것이다. 따라서, 숙주 세포는 세포 배양물에, 즉 유기체 외부에 존재할 것이다.
숙주 세포는 바람직하게는 본 발명의 항체의 경쇄를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 본 발명의 항체의 중쇄를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결될 것이다.
본 발명에 따르면, 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 와 함께, 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체와 조합으로 사용하는 것이 추가로 구상된다. 이들 항체의 병용은 R46H 돌연변이를 포함하는 대상체 및 E43D 돌연변이를 포함하는 대상체에서 NT-proBNP 의 검출을 허용할 것이다.
또한, R46H 항체 (또는 이의 항원 결합 단편), 또는 E43D 항체 (또는 이의 항원 결합 단편), 또는 R46H 및 E43D 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 를 야생형 NT-proBNP (또는 이의 항원-결합 단편) 에 특이적으로 결합하는 항체와 조합으로 사용하는 것이 구상된다. 본원에 사용된 바와 같이, "야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체" 는 바람직하게는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 을 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합한다. 따라서, 상기 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 42 내지 46 내에 포함된 에피토프에 결합할 것이다. 따라서 이 항체의 에피토프는 E43D 및 R46H 돌연변이를 포함하지 않을 것이다. 바람직하게는 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체는 E43D 또는 R46H 돌연변이를 갖는 돌연변이된 NT-proBNP 에 유의하게 결합하지 않는다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 성분을 포함하는 키트 또는 조성물에 관한 것이다:
a) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 및 ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
b) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
c) i) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편,
d) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 iii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편,
e) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 또는
f) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편.
바람직하게는, 키트에 포함된 항체는 모노클로날 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체는 모노클로날 양 항체이다.
바람직하게는, 키트 또는 조성물의 a), b), c), d), e) 또는 f) 에서 언급된 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 검출가능한 표지를 포함할 것이다 (이 용어의 정의에 대해서는, 본원의 다른 곳을 참고함). 따라서, a), b), c), d), e) 또는 f) 에서 제시된 각각의 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 검출가능한 표지에 작동가능하게 연결될 것이다. 특히, 항체는 동일한 표지에 결합되는 것으로 구상된다. 바람직하게는, 각각의 항체 (또는 이의 항원 결합 단편) 는 루테닐화된다.
바람직하게는, 본 발명의 키트 또는 조성물은 돌연변이된 NT-proBNP 및 야생형 NT-proBNP 둘 다에 결합하는 추가의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 따라서, 상기 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 는 NT-proBNP 의 상이한 영역, 특히 NT-proBNP 의 아미노산 42 내지 46 을 포함하지 않는 영역에 특이적으로 결합할 것이다. 바람직하게는, 상기 추가 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 는 NT-proBNP (특히 SEQ ID NO: 3 에 나타낸 서열을 갖는 NT-proBNP) 의 아미노산 1 내지 35 에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 더욱 바람직하게는, 상기 추가 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 는 NT-proBNP (특히 SEQ ID NO: 3 에 나타낸 서열을 갖는 NT-proBNP) 의 아미노산 27 내지 31 내에 포함되는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 바람직하게는, 그러나 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 하나의 구현예에서, 이 단락에 기재된 추가의 항체는 모노클로날 마우스 항체이다.
전술한 추가의 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 는 바람직하게는 포획 항체 (단편) 로서 사용된다. 상기 항체 (또는 이의 항원-결합 단편) 는 고체 지지체 (예를 들어, 플레이트, 비드 또는 튜브) 상에 고정될 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 추가의 항체는 돌연변이된 NT-proBNP(들) (본 명세서의 다른 곳에 제시된 바와 같음) 및 야생형 NT-proBNP 를 포획할 것이다. 바람직한 구현예에서, 추가의 항체 (또는 이의 단편) 는 비오티닐화된다. 이에 의해, 항체 (또는 이의 단편) 는 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 고체 지지체에 결합할 수 있다.
상기 본 명세서에 제공된 정의 및 설명은 다음에 따라서 (달리 명시한 경우 제외) 준용하여 적용된다.
또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 돌연변이, 또는 그의 단편을 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 관한 것이다. 돌연변이된 NT-proBNP 는 본 발명의 항체와 관련하여 상기 본원에서 정의되었다
하나의 구현예에서, 본 발명은 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편에 관한 것이다. 상기 단편은 46 위치에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함할 것이다. 따라서, 상기 단편은 SEQ ID NO: 1 의 위치 46 (또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 46) 에 상응하는 위치에 히스티딘을 포함할 것이다. 바람직하게는, 단락에서 언급된 돌연변이된 NT-proBNP 는 SEQ ID NO: 1 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 본 발명은 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편에 관한 것이다. 상기 단편은 43 위치에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함할 것이다. 따라서, 상기 단편은 SEQ ID NO: 2 의 위치 43 (또는 SEQ ID NO: 3 의 위치 43) 에 상응하는 위치에 아스파르트산을 포함할 것이다. 바람직하게는, 단락에서 언급된 돌연변이된 NT-proBNP 는 SEQ ID NO: 2 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편은 예를 들어 본 발명의 항체의 생성에 사용될 수 있다. 또한, 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편은 본 발명의 항체 (또는 이의 단편) 가 본원에 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP 의 양을 결정하기 위해 사용되는 분석을 위한 표준 또는 교정기로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 상기 언급된 키트는 a) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편, 또는 b) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 단편에 의해 포함된 돌연변이는 단편이 돌연변이된 NT-proBNP 보다 짧기 때문에 보통 단편의 위치 43 또는 46 에 있지 않을 것으로 이해된다. 오히려, 단편에 의해 포함된 돌연변이는 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이 또는 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이에 상응하는 돌연변이일 수 있다. 따라서, 단편은 야생형 NT-proBNP 의 위치 46 에 상응하는 위치에 히스티딘 잔기, 또는 야생형 NT-proBNP 의 위치 43 에 상응하는 위치에 아스파르트산 잔기를 포함할 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 단편은 적어도 7 개의 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 10 개의 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 15 개의 아미노산의 길이를 갖는다. 또한 바람직하게는, 상기 단편은 적어도 20 개의 아미노산의 길이를 가질 것이다.
단편은 상기 언급된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP 보다 짧을 것이다, 즉, 76 개 아미노산보다 짧을 것이다.
바람직한 구현예에서, 돌연변이된 NT-proBNP 의 상기 단편은 75 개 이하의 아미노산, 특히 70 개 이하의 아미노산의 길이를 갖는다. 또다른 바람직한 구현예에서, 단편은 50 개 이하의 아미노산의 길이를 갖는다. 추가로 상기 단편은 30 개 이하의 아미노산의 길이를 갖는 것이 구상된다. 따라서, 상기 단편은 바람직하게는 7 내지 70 개 아미노산 (또는 7 내지 75 개 아미노산), 10 내지 70 개 아미노산 (또는 10 내지 75 개 아미노산), 또는 20 내지 70 개 아미노산 (또는 20 내지 75 개 아미노산) 의 길이를 갖는다. 또한 바람직하게는, 상기 단편은 10 내지 30 개의 아미노산의 길이를 갖는다.
돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편은 본 발명의 항체의 생성을 위한 항원으로서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 돌연변이된 NT-proBNP 또는 단편은 본 발명의 키트에서 양성 대조군으로 사용될 수 있다 (상기 참조).
바람직한 구현예에서, 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 단편은 SEQ ID NO: 6 에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 또다른 바람직한 구현예에서, 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 단편은 SEQ ID NO: 7 에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
바람직한 구현예에서, 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 단편은 SEQ ID NO: 8 에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 또다른 바람직한 구현예에서, 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 단편은 SEQ ID NO: 9 에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편은 정제 태그를 추가로 포함한다. 태그는 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편에 작동가능하게 연결될 것이다.
태그는 NT-proBNP 또는 이의 단편의 정제를 허용할 것이다. 이러한 태그는 당분야에 잘 공지되어 있다. 본원에 사용된 용어 "정제 태그" 는 바람직하게는 본 발명의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편을 정제할 수 있는 추가의 아미노산 서열 (폴리펩티드의 펩티드) 을 지칭한다. 하나의 구현예에서, 정제 태그는 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편에 자연적으로 연결되지 않은 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 따라서, 정제 태그는 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편에 대해 이종성일 것이다.
바람직하게는, 정제 태그는 폴리히스티딘 태그, 폴리아르기닌 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 말토오스 결합 단백질 (MBP), 인플루엔자 바이러스 HA 태그, 티오레독신, 포도상구균 단백질 A 태그, FLAG™ 에피토프, 및 c-myc 에피토프로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 정제 태그는 폴리히스티딘 태그이고, 바람직하게는, 상기 폴리히스티딘 태그는 적어도 6 개의 연속 히스티딘 잔기를 포함한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편은 운반체 단백질을 추가로 포함한다. 운반체 단백질은 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편에 작동가능하게 연결될 것이다.
운반체 단백질은 바람직하게는 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편에 대해 이종성이다. 운반체 단백질은 바람직하게는 면역 반응을 유발하는 단백질이다. 따라서, 운반체 단백질은 높은 수준의 면역원성을 가질 것이다. 이러한 운반체 단백질은 당분야에 잘 공지되어 있다. 바람직하게는, 운반체 단백질은 키홀 림펫 하에모시아닌 (KLH), 파상풍 톡소이드 및 디프테리아 독소, 소 혈청 알부민 (BSA), 난백알부민 및 티로글로불린, 특히 KLH 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 i) 본 발명의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 ii) 본 발명의 단편을 포함하고, 면역보강제를 추가로 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "면역보강제" 는 항원성 물질과 함께 유기체에 투여될 때 항원성 물질에 대한 면역반응을 향상시킬 수 있는 물질 또는 조성물을 지칭한다. 바람직한 보강제는 상기에 기재되어 있다. 하나의 구현예에서, 면역보강제는 알룸 (alum), 프로인트 (Freund) 의 불완전 보강제, 특히 프로인트의 완전 보강제로부터 선택된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체의 생성을 위한 본 발명의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체는 본원의 다른 곳에 정의된 바와 같이 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합할 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다. 대안적으로, 이전 단락에서 정의된 조성물은 항체의 생성에 사용된다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이된 NT-proBNP 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 단편에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 선형 또는 원형 핵산 분자를 지칭한다. 그것은 RNA 분자뿐만 아니라 DNA 를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 단리된 폴리뉴클레오티드 (즉, 천연 환경으로부터 단리된) 또는 유전자 변형된 형태로 제공될 것이다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 글리코실화 또는 메틸화 폴리뉴클레오티드와 같은 자연 발생 변형된 폴리뉴클레오티드 또는 비오티닐화 폴리뉴클레오티드와 같은 인공 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 화학 변형된 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 상기 언급된 바와 같은 특정 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 인트론 서열을 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 상기 프로모터는 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용할 것이다. 하나의 구현예에서, 상기 프로모터는 이종 프로모터이다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 터미네이터에 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 언급된 폴리뉴클레오티드 중 하나를 포함하는 벡터를 고려한다. 하나의 구현예에서, 상기 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 프로모터, 특히 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된 발현 벡터이다.
용어 "벡터" 는 바람직하게는 파지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 뿐만 아니라 박테리아 또는 효모 인공 염색체와 같은 인공 염색체를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 발현 벡터이다. 이러한 발현 벡터에서, 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포 또는 이의 단리된 분획에서의 발현을 허용하는 상기 명시된 바와 같은 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 더하여, 전사 및 번역 인핸서를 포함하는 추가 조절 요소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 또한 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다. 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 소 유두종 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 발현 벡터는 표적 세포 집단 내로의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전달에 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 재조합 바이러스 벡터를 구축 할 수 있다; 예를 들어 Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. and Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). 에 설명된 기술을 참조한다.
본 발명은 또한 본 발명의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
이전 단락에서 언급된 용어 "숙주 세포" 는 원핵 또는 진핵 세포일 것이다. 진핵 세포는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 또다른 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 세포주 E. Coli; 포유 동물 세포주 CHO, HEK293, COS, NSO, SP2 및 PER.C6; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명과 관련하여, 숙주 세포가 비-인간 숙주 세포인 것이 또한 구상된다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포에 의해 포함된 돌연변이된 NT-proBNP, 단편, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포와 관련하여 이종성이다. 예를 들어, 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 트랜스펙션된 것으로 구상된다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 성분을 포함하는 키트 또는 조성물에 관한 것이다:
(i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 그의 단편, 또는
(ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 그의 단편, 또는
(iii) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편, 및 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편.
용어 "단편" 은 본원의 다른 곳에서 설명되었다. 정의 및 설명은 그에 맞춰 적용된다.
상기 언급된 키트 (또는 조성물) 의 하나의 구현예에서, 키트 (또는 조성물) 는 야생형 NT-proBNP, 또는 이의 단편을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 단편은 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 을 적어도 포함한다. 하나의 구현예에서, 단편은 적어도 10 개의 아미노산의 길이를 갖는다.
따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 심부전을 진단하는 방법에 관한 것이다:
a) 대상체 유래 샘플에서 NT-proBNP 의 양을 결정하는 단계, 및
b) 단계 a) 에서 결정된 NT-proBNP 의 양을 참조량과 비교함으로써 심부전을 진단하는 단계.
상기 언급된 방법의 바람직한 구현예에서, NT-proBNP 의 양의 결정은 샘플을 본 발명의 적어도 하나의 항체 (또는 항체의 적어도 하나의 항원 결합 단편) 와 접촉시키는 단계를 포함한다. 특히, NT-proBNP 의 결정은 샘플을 적어도 다음과 접촉시키는 단계를 포함한다:
(i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는
(ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는
(iii) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
상기 언급된 방법 단계 a) 의 하나의 구현예에서, 샘플은 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편과 추가로 접촉된다.
따라서, NT-proBNP 의 결정은 샘플을 적어도 다음과 접촉시키는 단계를 포함한다:
(i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
(ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
(iii) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편.
본 발명의 방법에 따른 대상체는 바람직하게는 인간이다.
하나의 구현예에서, 대상체는 위치 46 의 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 NT-proBNP 에서의 돌연변이에 대해 이형접합성, 특히 동형접합성이다. 바람직하게는, 상기 언급한 i) 또는 iii) 의 항체/항원 결합 단편이 사용된다.
대안적인 구현예에서, 대상체는 위치 43 의 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 NT-proBNP 에서의 돌연변이에 대해 이형접합성, 특히 동형접합성이다. 바람직하게는, 상기 언급한 ii) 또는 iii) 의 항체/항원 결합 단편이 사용된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 샘플은 혈액, 혈청 또는 혈장 샘플이다. 예를 들어, 현장 진단 설정에서 혈액 샘플, 즉 전혈 샘플을 사용하여 NT-proBNP 를 결정할 수 있다. 가장 바람직한 샘플은 혈장 및 혈청이다. 이러한 유형의 샘플은 일상적으로 실험실 시험에 사용된다.
더욱이, 본 발명은 심부전 진단을 위한 대상체의 샘플 (본 명세서에 정의된 바와 같음) 에서 본 발명의 적어도 하나의 항체 (또는 이의 적어도 하나의 항원-결합 단편) 의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 심부전 진단 방법의 단계 a) 와 관련하여 i), ii), iii) 에 제시된 항체 (또는 항체들) 가 사용된다. 상기 항체 (또는 항체들), 또는 이의 항원 결합 단편(들) 외에도, 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편이 사용되는 것이 구상된다.
본 발명의 사용 또는 방법에 적용되는 항체 또는 항원 결합 단편은 다른 곳에 기술된 바와 같이 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.
하기에, 본 발명의 바람직한 구현예가 요약된다. 상기 설명 및 청구범위에 제공된 정의가 그에 따라 적용된다.
1. 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체로서, 하기로부터 선택되는 항체:
(a) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 및
(b) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체.
2. 구현예 1 에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인, 항체.
3. 구현예 1 또는 2 에 있어서, 상기 항체가 양 항체인, 항체.
4. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 NT-proBNP 는 돌연변이된 인간 NT-proBNP 인, 항체.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 항체:
(i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 상기 돌연변이된 NT-proBNP 가 SEQ ID NO: 1 에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
(ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 상기 돌연변이된 NT-proBNP 는 SEQ ID NO: 2 에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함함.
6. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 야생형 NT-proBNP 에 상당히 결합하지 않는, 항체.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 하기와 같은 항체:
i) 항체는 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 4 의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 5 의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
ii) 항체는 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 13 의 아미노산 서열을 포함한다.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 항체의 항원-결합 단편.
9. 구현예 8 에 있어서, 항원-결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, Facb 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, 및 Fv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항원-결합 단편.
10. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나 또는 구현예 8 또는 9 에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항원-결합 단편이 검출가능한 표지에 연결되어 있는, 항체 또는 항원-결합 단편.
11. 구현예 10 에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 효소, 비오틴, 방사성 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 전기화학발광 표지, 금 표지 또는 자성 표지이고, 특히 상기 검출가능한 표지가 전기화학발광 표지인, 항체 또는 항원-결합 단편.
12. 구현예 10 또는 11 에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 루테늄을 포함하는, 항체 또는 항원-결합 단편.
13. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나의 항체, 또는 구현예 8 및 9 의 항원-결합 단편을 생산하는 숙주 세포.
14. 다음을 포함하는 키트 또는 조성물:
a) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 및 ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
b) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
c) i) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
d) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 iii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편.
15. 구현예 14 에 있어서, a), b), c) 또는 d) 에 언급된 항체가 검출가능한 표지, 바람직하게는 전기화학발광 표지에 결합된, 특히 항체가 루테닐화된, 키트 또는 조성물.
16. 구현예 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, NT-proBNP 에서 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 포함하고, 특히 상기 항체가 NT-proBNP 의 아미노산 1 내지 35 에 존재하는 에피토프에 결합하는, 키트 또는 조성물.
17. 다음을 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP:
i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이, 또는
ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이,
또는 상기 돌연변이된 NT-proBNP 의 단편으로서, 상기 단편은 하기를 포함함:
i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이, 또는
ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이.
18. 구현예 17 에있어서, 상기 돌연변이된 NT-proBNP 가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 에 나타낸 서열을 포함하는, 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편.
19. 구현예 17 또는 18 에 있어서, 상기 돌연변이된 NT-proBNP 또는 단편이 정제 태그 또는 운반체 단백질에 작동가능하게 연결된, 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편.
20. 구현예 17 내지 19 중 어느 하나의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
21. 구현예 20 의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
22. 구현예 17 내지 19 중 어느 하나의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편, 구현예 20 의 폴리뉴클레오티드, 또는 구현예 21 의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
23. 구현예 17 내지 19 중 어느 하나의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편 및 면역보강제를 포함하는 조성물.
24. 항체의 생성을 위한, 구현예 17 내지 19 중 어느 하나의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편, 또는 구현예 23 의 조성물의 용도.
25. 다음을 포함하는 키트 또는 조성물:
(i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 그의 단편, 또는
(ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 그의 단편, 또는
(iii) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편, 및 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편.
26. 구현예 25 에 있어서, 야생형 NT-proBNP 또는 이의 단편을 추가로 포함하며, 상기 단편은 야생형 NT-proBNP 의 적어도 아미노산 잔기 42 내지 46 을 포함하는, 키트 또는 구현예.
27. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서의 심부전의 진단 방법으로서:
a) 대상체 유래 샘플에서 NT-proBNP 의 양을 결정하는 단계, 및
b) 단계 a) 에서 결정된 NT-proBNP 의 양을 참조량과 비교함으로써, 심부전을 진단하는 단계,
이때, NT-proBNP 의 양의 결정은 샘플을 적어도 다음과 접촉시키는 단계를 포함한다:
(i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는
(ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는
(iii) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
28. 구현예 27 에 있어서, 샘플이 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편과 추가로 접촉되는 진단 방법.
상기 언급된 모든 참고는 전체 기재 내용 뿐 아니라 상기 설명에 정확하게 언급된 구체적인 설명 내용에 대해 참고로서 본원에 인용된다.
도 1 및 2 및 하기 실시예 섹션에서, NT-proBNP 의 돌연변이 R72H 및 E69D 가 참조된다. 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, R72H 돌연변이는 R46H 돌연변이와 동일한 돌연변이이고, E69D 돌연변이는 E46D 돌연변이와 동일한 돌연변이이다.
도면에 있어서:
도 1: 항체 S-23.4.66 및 항체 rS-22.2.195 에 대한 농도 의존적 항체 동역학 (실시예 3 참조)
도 2: 1 차 항체로서 재조합 proBNP 및 M-18.4.34-IgG 및 2 차 항체로서 S-23.4.66-IgG 또는 rS-22.2.195-IgG 를 사용한 항체 샌드위치 실험. M-18.4.34-IgG 를 상동 2 차 항체 대조군으로 적용하였다 (실시예 4 참조).
도 3: NT-proBNP-R46H 에 대한 항체 rS-22.2.195 의 특이성
도 4: NT-proBNP-E43D 에 대한 항체 S-23.4.66 의 특이성.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명할 것이다. 그러나 이들은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1: 재조합 N-말단 proBNP (1-76) 뮤테인 NTproBNP (1-76) 뮤테인 [R72H] (즉, R46H 치환을 포함하는 뮤테인) 및 NTproBNP (1-76) 뮤테인 [E69D] (즉, E43D 치환을 포함하는 뮤테인) 의 생성.
PCR 을 통한 유전자 합성에 의해 N-말단 proBNP (아미노산 서열 1-76) 의 뉴클레오티드 서열을 생성하고, 증폭된 유전자를 C-말단 히스티딘-태그로 발현시킬 수 있는 적합한 발현 벡터 (pQE80) 에 클로닝하였다. 유전자의 최적 발현을 얻기 위해, DNA 서열은 E. 콜라이에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 적합하였다. 번역된 단백질 서열은 N-말단 4 개 아미노산 서열 MRGS (SEQ ID NO: 29) 에 이어서, NTproBNP (1-76), 아미노산 GGGS (SEQ ID NO: 30) 및 8 개의 히스티딘을 포함하는 92 개의 아미노산으로 이루어진다:
NTproBNP(1-76)뮤테인[R72H]: MRGS-NTproBNP(1-76)[R72H]-GGGSHHHHHHHH (참고, SEQ ID NO: 27)
NTproBNP(1-76)뮤테인[E69D]:MRGS-NTproBNP(1-76)[E69D]-GGGSHHHHHHHH (참고, SEQ ID NO: 28)
플라스미드를 E. 콜라이에서 형질전환시켰다. 재조합 E. 콜라이 클론에 Super Broth (100 ㎍/ml 암피실린) 에 0,2 의 OD 600 으로 접종하고 IPTG (이소프로필티오갈락토시드; 0.5 mM 최종 농도) 로 1,0 - 1,5 의 OD600 으로 유도하였다. 유도 후 배양물을 37℃ 에서 3 시간 동안 추가로 배양하였다. 이어서 배양물을 원심분리하고 세포 펠렛을 20 mM Na-포스페이트 완충액, pH 7,5, 500 mM NaCl 에 모았다. 고압을 통한 세포 현탁액의 분해 후, 현탁액을 원심분리하고 상청액을 Ni-NTA (니트릴로-트리아세테이트) 컬럼에 적용하였다. 50 mM Na-포스페이트 완충액, pH 7,5, 500 mM NaCl, 20 mM 이미다졸로의 세척 단계 후, 50 mM Na-포스페이트 완충액, pH 7,5, 500 mM NaCl 완충액 중의 증가된 농도의 이미다졸 (20 mM 에서 500 mM 까지) 의 선형 구배를 사용하여 히스티딘-태그된 NT-pro BNP 단백질을 용리시켰다.
실시예 2: NTproBNP (1-76) 뮤테인 [R72H] 및 NTproBNP (1-76) 뮤테인 [E69D] 에 대한 모노클로날 항체의 생산 및 스크리닝
양을 재조합 NTproBNP(1-76)뮤테인[R72H] 및 재조합 NTproBNP(1-76)뮤테인[E69D] 으로 면역화시켰다. 프로인트 완전물을 보강제로 사용하였다. 4 회의 초기 면역화 후, 면역화를 매월 간격으로 반복하였다. 양성 반응 역가를 갖는 양의 하나의 림프절을 전신 마취 및 진통제 하에서 제거하였다. 외과적 제거 후 림프절 조직으로부터 단일 세포 제제를 제조하였다. 림프절 림프구 및 영구 골수종 세포주 1C10 (Bioventix) 을 2 : 1 의 비로 PEG 와 융합시키고, 4,5 mg/ml 글루코오스, 10% 우태 혈청 (Hyclone), 100 ㎛ol/L 비 필수 아미노산 (Gibco), 5.7 μM 아자세린/100 μM 하이포잔틴 (Sigma), 50 U/ml 인간 인터루킨-6 (Roche), 100 IU/ml 페니실린/100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (Sigma) 이 보충된 둘베코 변형 이글 배지에서 배양하였다. 융합은 잘 알려진 Kφhler and Millstein 의 방법에 따라 수행되었다 (Nature 256, 1975, p. 495-497). 각각의 면역원 서열에 특이적인 하이브리도마 분비 항체는 최종적으로 FACSAria III 을 사용하는 단일 세포 침착에 의해 클로닝되었다.
하이브리도마 세포의 배양 상청액에서 NTproBNP(1-76)뮤테인[R72H] 또는 NTproBNP(1-76)뮤테인[E69D] 에 대한 항체의 존재 및 특이성을 확인하기 위해, 클론을 하기 시험 원리에 따라 ELISA 에 의해 평가하였다:
a) NTproBNP(1-76)뮤테인[R72H] 와의 반응성
스트렙타비딘 코팅된 384-웰 마이크로티터 플레이트 (Microcoat) 는 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 완충액 (PBS 완충액 + 0.5 % Byco C) 중의 1 ㎍/ml 비오티닐화 MAK <NTproBNP> M-18.4.34 IgG-Bi mono (Roche) 로 코팅하였다. M-18.4.34 는 SEQ ID NO: 3 의 아미노산 27 내지 31 을 포함하는 영역에 결합하고, 예를 들어 항체는 본원에 제시된 돌연변이된 NT-proBNP 및 야생형에 결합한다. 세척 용액 (0,9% NaCl + 0.05% Tween 20) 으로 세척한 후, 인큐베이션 완충액 중에 100 ng/ml 로 희석된 항원 NTproBNP(1-76)뮤테인[R72H] 과의 추가 인큐베이션이 실온에서 1 시간 동안 수행되었다. 세척 용액으로 추가 세척 단계 후, 항체 샘플 인큐베이션 (하이브리도마 상청액) 을 실온에서 1 시간 동안 50 ㎕/웰로 수행하였다. 세척 완충액으로의 추가 세척 단계 후 인큐베이션 완충액에 1 : 15,000 로 희석된 퍼옥시다아제-공액된 AffiniPure Donkey 항-양-IgG (H + I) 검출 항체 (Jackson Imm. Research) 로의 인큐베이션을 실온에서 1 시간 동안 수행하였다. 세척 완충액으로 추가 세척 단계 후, 퍼옥시다아제 활성을 실온에서 20 분 동안 ABTS (즉시 사용 가능한 용액, Roche) 와 함께 인큐베이션함으로써 검출하였고, ELISA 판독기를 사용하여 405 nm 에서 소광 차이를 mU 으로 판독하였다.
이어서, 양성 반응 하이브리도마 상청액을 NTproBNP(1-76)뮤테인[E69D] 및 야생형 NTproBNP(1-76) 에 대한 교차-반응성에 대해 유사하게 스크리닝하였다.
b) NTproBNP(1-76)뮤테인[E69D] 와의 반응성
초기 ELISA 스크리닝은 항원으로서 NTproBNP(1-76)뮤테인[E69D] 을 사용하여 상기 기재된 바와 유사한 방식으로 수행되었다. 이어서, 양성 반응 하이브리도마 상청액을 NTproBNP(1-76)뮤테인[R72H] 및 야생형 NTproBNP(1-76) 에 대한 교차-반응성에 대해 유사하게 스크리닝하였다.
실시예 3: 모노클로날 항체의 동역학적 특성의 특징분석
T200 기기는 Biacore Series S Sensor Chip CM5 와 함께 고정되었다. 시스템 완충제는 1 mM KH2PO4, 10 mM Na2HPO4 pH 7.4, 500 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05% Tween 20 이었다. 속도 인자를 결정하기 위해, 시스템을 13℃ 및 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 샘플 완충액은 1 mg/ml CMD (카르복시메틸덱스트란, Fluka) 가 추가로 보충된, 시스템 완충액이었다. 항체 포획 시스템이 확립되었다. 5000 RU 토끼 항-양 폴리클로날 항체 (Id.: 313-005-045, Dianova) 를 제조자에 의해 기술된 바와 같이 EDC/NHS 커플링에 의해, 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 pH 5.0 에서 30 ㎍/ml 로 25℃ 에서 고정시켰다. 포획 시스템은 농축된 HBS 완충액 (100 mM HEPES pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05 % (w/v) Tween 20) 으로의 20 ㎕/분에서 15 초 세척 100 mM HCl 의 30 초 주입에 이어, 20 ㎕/분에서 1 분 동안 10 mM 글리신 완충제 pH 1.5 주입에 의해 재생되었다. 포획될 항체는 각각의 시스템 완충제 pH 7.4 에 희석된 40 nM 농도에서 10 ㎕/분으로 1 분 동안 주사하였다. 항체 포획 후, 시스템을 60 ㎕/분으로 30 초 동안 2.5 배 농축된 시스템 완충제로 세척한 후 2 분 기준선 안정화시켰다. 농도-의존성 분석 연속물을 0.4 nM, 1.1 nM, 3.3 nM 의 1 : 3 희석 단계로, 10 nM, 30 nM 및 90 nM 에서 두 번의 주입으로 주입하였다. 또다른 구현예에서, 분석물 NTproBNP E69D 를 1.1 nM, 3.3 nM, 10 nM 로부터의 농도 연속물로, 30 nM, 90 nM 및 270 nM 에서 두 번의 주입으로 주입하였다. 분석물 접촉 시간은 5 분이고, 해리 시간은 10 분이었다. 분석 동역학을 60 ㎕/분에서 수행하였다. 양 항체는 센서 표면에서 리간드로서 포착되었다: mAb<NTproBNP(E69D)>S-23.4.66-IgG, mAb<NTproBNP(R72H)>rS-22.2.195-IgG. Roche 제조 분석물을 용액에 주입하였다: NT-proBNP (aa 1-76) (MW 8.5 kDa) ; proBNP (aa 27-102) (MW 9.9 kDa); NT-proBNP E69D (MW 10.2kDa); NT-proBNP R72H (MW 10.2 kDa); 대조로서의 시스템 완충액; 0-혈청 SB150610-001. Biaevaluation 소프트웨어 V.3.0 은 제조업체 GEHC 의 지침에 따라 사용되었다. 운동 속도를 결정하기 위해 RMAX 로컬을 갖는 1 : 1 결합 모델을 적용하였다.
도 1 은 37℃ 에서 수행된 농도 의존적 항체 동역학을 보여준다. 항체 S-23.4.66 은 NT-proBNP E69D 에 결합하지만, 전체 길이 야생형 NT-proBNP (aa 1-76), 야생형 proBNP (aa27-102) 및 NT-proBNP R72H 에 대한 검출가능한 상호작용을 나타내지 않았다. 재조합 양 항체 rS-22.2.195 는 NT-proBNP (aa 1-76), proBNP (aa27-102) 및 NT-proBNP E69D 에 대해 측정가능한 상호작용을 나타내지 않지만, NT-proBNP R72H 에 특이적으로 결합한다. 동역학 데이터를 표 1 에 요약한다.
Figure pct00001
ka : 회합 속도 상수 [M-1s-1]; kd : 해리 속도 상수 [s-1]; KD : 해리 상수 [M]; t/2diss : 복합체 해리의 반감기 [분] (ln(2)/(kd * 60)) [분]; Rmax : 최대 분석물 결합능 [RU], Chi2: 통계 피팅 모델 품질; MR: 몰비, 항체에 대한 분석물 결합 비율, MW (항체)/ MW (항원) * 반응 (분석물-항체 결합 (RU) / 항체 포획 (RU). n. d. 는 검출할 수 없음을 의미한다.
양 항체의 열역학적 결합 특성을 추정하기 위해, 13℃ 및 37℃ 에서의 온도-의존적 결합 동역학 데이터를 사용하여 속도 인자를 계산하였다 (US20140256915, 표 2). 요컨대, 속도 인자는 ka 37℃ 및 ka 13℃ 에서의 회합율 속도의 몫이다. 몫이 10 의 값 미만, VF < 10 이면, 항체 항원 결합은 엔탈피 지배되는 반면, 속도 인자 VF > 10 은 엔트로피-구동 동역학의 가능성을 증가시킨다. 특이성 및 생물리학적 안정성의 문제에 대해, 바람직하게는 엔탈피-지배 항체 결합 상호작용이 면역학적 시험에서 NT-proBNP 야생형 및 NT-proBNP 돌연변이체의 검출을 위해 사용된다.
표 2
Figure pct00002
실시예 4: 항체 샌드위치 특징분석
항체 샌드위치 SPR 측정은 25℃ 에서 수행되었다. 동일한 완충 조건 및 센서 장비 하에서 실시예 3 에 기재된 바와 같이 T200 기기를 사용하였다. 12000 RbAMFcg (토끼 및 마우스 Fc 감마, PAK<M-Fcg>Rb-IgG(IS), code: 315-005-046, Jackson Immuno Research) 를 제조자에 의해 기술된 바와 같이 EDC/NHS 커플링에 의해, 10 mM 소듐 아세테이트 완충액 pH 5.0 중의 40 ㎍/ml 로 25℃ 에서 고정시켰다. 농축 HBS 완충액 (100 mM HEPES pH 7.4, 1.5 M NaCl, 0.05% (w/v) Tween 20) 으로 20 ㎕/분에서 15 초 세척, 20 ㎕/분에서 10 mM 글리신 완충액 pH 1.5 1 분 주입 후, 20 ㎕/분에서 10 mM 글리신 완충제 pH 1.7 의 1 분 동안 2 회 주사하여 포획 시스템을 재생시켰다. 1 차 뮤린 항-proBNP 항체 M-18.4.34 (27-31) 150 nM 을 10 ㎕/분에서 1 분 동안 포획하였다. 포획 시스템의 자유 결합 원자가는 차단 용액에 의해 포화되었다. 차단 용액을 30 ㎕/분으로 3 분 동안 주입한 후 2 분 동안 기준선 안정화시켰다. 분석물 NT-proBNP (aa 1-76) (MW 8.5 kDa); proBNP (aa 27-102) (MW 9.9 kDa) 및 NT-proBNP R72H (MW 10.2 kDa) 를 30 ㎕/분에서 3 분 동안 90 nM 에서 주입하였다. 분석물 NT-proBNP E69D (MW 10.2kDa) 를 30 ㎕/분에서 3 분 동안 180 nM 에서 주입하였다. 재조합 proBNP 분석물 대신에 또다른 구현예에서, 인간 혈청은 용액에서 분석물로서 적용되었다. 혈청을 샘플 완충제로 1 : 5 로 희석하고 20 분 동안 5 ㎕/분으로 주사하여, 표시된 1 차 항체 M-18.4.34 (27-31) 가 환자 혈청-유래, 천연 proBNP 항원 유도체에 의해 포화되었다. 혈청 분석물은 다음과 같았다: 0-혈청 SB150610-001; NT-proBNP R72H 혈청; 27.39 ng/mL proBNP 를 갖는 NT-proBNP 야생형 혈청 SE 1053 DI 0580; 샌드위치 성능을 평가하기 위해, 각각의 2 차 항체 mAb<NTproBNP(E69D)>S-23.4.66-IgG 및 mAb<NTproBNP(R72H)>rS-22.2.195-IgG SP/Q) 의 250 nM 를 3 분의 회합 시간 및 3 분의 해리 시간 동안 30 ㎕/분으로 주입하였다. Biaevaluation 소프트웨어 V.3.0 은 제조업체 GEHC 의 지침에 따라 사용되었다.
1 차 항체로서 재조합 proBNP 및 M-18.4.34-IgG 및 2 차 항체로서 S-23.4.66-IgG 또는 rS-22.2.195-IgG 를 사용한 항체 샌드위치 실험이 도 2 에 제시된다. M-18.4.34-IgG 를 상동 2 차 항체 대조군으로 적용하였다. 모든 센서그램은 1 차 항체 M-18.4.34-IgG 의 분석물 포화에 이은, 2 차 항체 주입을 나타낸다. 1 차 항체는 높은 복합체 안정성으로 항원에 결합한다. rS-22.2.195-IgG 는 NT-proBNP R72H 를 사용한 특이적 복합체 형성을 보여준다. NT-proBNP E69D 에 대한 항체 S-23.4.66-IgG 특이적 복합체 형성.
재조합 분석물 대신에 인간 혈청을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 도 2 는 오버레이 데이터로서 2 차 항체 주사에 초점을 맞춘다. 음성 혈청 (0-혈청 SB150610-001) 을 참조하였다. 항체 rS-22.2.195-IgG 는 NT-proBNP R72H 혈청과 특이적으로 항체 샌드위치 복합체를 형성하고, 야생형 NT-proBNP 혈청과 복합체 형성은 형성하지 않는다. S-23.4.66-IgG 는 혈청 샘플 내에서 복잡한 형성을 나타내지 않았다 (NT-proBNP E69D 혈청은 이용할 수 없음).
실시예 5: 모노클로날 항체 rS-22.2.195 및 S-23.4.66 의 정제 및 루테닐화
MAK<NTproBNP>S-23.4.66-IgG 의 정제
무-세포 양 하이브리도마 배양 상청액 (CELLine, INTEGRA Biosciences AG) 을 pH 4.75 로 조정하고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 후, IgG 함유 상청액에 0.5 M 암모늄 술페이트 및 150 mM NaCl 을 보충하고 pH 를 8.5 로 상승시켰다. 용액을 Protein A-컬럼 (ProSep® Ultra Plus, Merck Millipore) 에 적용하고 결합된 IgG 를 100 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 5.5 로 용리시켰다. 50 mM K-포스페이트에 대한 투석 후, 배양 배지에서 FCS 로부터 유래된 150 mM NaCl pH 7.5 미량의 소 IgG 를 소 IgG 에 특이적으로 결합하는 면역친화성 수지를 사용하여 제거한다. 최종 생성물을 농축하고 (Amicon Ultra-30, Merck Millipore), 여과하고 (0.22 ㎛) -80℃ 에서 저장한다.
MAK<NTproBNP>rS-22.2.195-IgG 의 정제
재조합 항체를 발현하는 CHO 세포주의 무-세포 배양 상청액을 pH 4.75 로 조정하고 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 원심분리 후, IgG 함유 상청액에 0.5 M 암모늄 술페이트 및 150 mM NaCl 을 보충하고 pH 를 8.5 로 상승시켰다. 용액을 Protein A-컬럼 (ProSep® Ultra Plus, Merck Millipore) 에 적용하고 결합된 IgG 를 100 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 5.5 로 용리시켰다. 50 mM K-포스페이트, 150 mM NaCl pH 7.5 에 대한 투석 후, 최종 생성물을 농축시키고 (Amicon Ultra-30, Merck Millipore), 여과하고 (0.22 ㎛), -80℃ 에서 저장한다.
MAK<NTproBNP>S-23.4.66-IgG 및 MAK<NTproBNP>rS-22.2.195 의 루테닐화
단백질 A-정제된 항체를 루테닐화 완충액 (100 mM K-포스페이트 pH 8.5) 에 대해 투석한 다음, 용액을 단백질 농도 1 mg/ml 로 조정한다. 루테늄(II) 트리스(비피리딜)-UEEK-N-히드록시숙신이미드 에스테르를 > 5 mg/ml 의 농도로 DMSO 에 용해시킨다. 15 배 몰 과량의 BPRu-UEEK-DDS 를 IgG 용액에 첨가하고, 격렬하게 혼합하면서 25℃ 에서 45 분 동안 반응을 수행한다. L-리신을 최종 농도 10 mM 로 첨가하여 반응을 중단시켰다. 과량의 표지 시약을 100 mM K-포스페이트, 150 mM KCl pH 7.5 를 주행 완충액으로 사용하여 Superdex 200 (GE Healthcare Life Sciences) 상의 겔 투과 크로마토그래피에 의해 제거한다. 컨쥬게이션된 IgG 를 함유하는 분획을 모으고 최종 생성물을 6.5% 사카로오스로 안정화시키고 -80℃ 에서 저장한다.
실시예 6: 돌연변이된 NT-proBNP 검출 방법
NT-proBNP 를 탐지하는 한 가지 방법은 전기화학발광을 기반으로 하는 잘-성립된 Roche Elecsys® 어세이 기술이다. Elecsys® 어세이는 이종 면역어세이이고 샌드위치 원리에 따라 기능한다: 항체-항원-항체 복합체는 분석물의 상이한 에피토프에 대해 발생된 포획 및 검출 (신호) 항체를 사용하여 형성된다. 돌연변이된 NT-proBNP 를 검출하기 위한 Elecsys® 어세이는 다음 단계 및 구성요소를 포함한다:
a) 샘플을 방부제 (Oxy-Pyrion 0.1%, N-메틸이소티아졸론 0.1%), 세제 (0.1%), 안정화 및 간섭-방지 단백질 (예를 들어, 알부민, 스트렙타비딘-폴리) 을 함유하는 포스페이트-완충 (100 mM, pH 5.8) 매트릭스 중의, 모노클로날 포획 항체, 예를 들어 M-18.4.34, 및 rS-22.2.195, 또는 S-23.4.66, 또는 모노클로날 항체로서 모두와 함께 인큐베이션한다.
b) 비오티닐화 포획 항체 (예를 들어, M-18.4.34) 및 NT-proBNP-R46H 에 특이적인 루테늄-표지 검출 항체 rS-22.2.195 또는 NT-proBNP-E43D 에 특이적인 S-23.4.66 중 하나가 분석물과 샌드위치 복합체를 형성한다.
c) 샌드위치 복합체는 스트렙타비딘-코팅된 마이크로입자에 결합된 후 전극 표면 상에 자기적으로 포획된다.
d) 미결합한 물질을 ProCell 로 제거하였다.
e) 화학발광 방출은 전극에 전압을 인가함으로써 유도되고 광전자증 배기로 측정된다.
f) NT-proBNP 값은 기기-특이적인 보정 곡선을 통해 계산된다.
Elecsys 어세이가 돌연변이 및 야생형 NT-proBNP 를 검출해야 하는 경우, 야생형 NT-proBNP 에 특이적인 부가적인 신호 항체, 예를 들어 S-1.21.3 이 어세이 혼합물에 포함될 수 있다.
실시예 7: 항체 rS-22.2.195 및 S-23.4.66 은 돌연변이된 NT-proBNP 에 대해 매우 특이적이다
2 개의 새롭게 생성된 항체, rS-22.2.195 및 S-23.4.66 의 특이성을 실시예 5 에 기재된 바와 같이 NT-proBNP-특이적 Elecsys® 어세이로 평가하였다. 인간 NT-proBNP-무 혈청은 일련의 재조합 야생형 및 돌연변이된 펩티드로 스파이킹되어 심부전 환자에서 관찰된 NT-proBNP 농도의 범위를 커버한다. 샘플 중의 NT-proBNP 는 NT-proBNP-R46H 에 특이적인 rS-22.2.195 (도 3) 또는 NT-proBNP-E43D 에 특이적인 S-23.4.66 (도 4) 으로 검출되었다.
도 3 및 4 의 결과는 rS-22.2.195 및 S-23.4.66 항체 둘 모두가 야생형 NT-proBNP 에 전혀 결합하지 않으나, 돌연변이된 펩티드를 높은 강도로 인식한다는 것을 보여준다. 또한, 두 항체는 신호 대 분석물 농도의 광범위한 선형 상관관계를 나타내므로, 심부전 환자에서 일반적으로 발견되는 전체 농도 범위에 걸쳐 NT-proBNP 의 정량이 가능하다.
실시예 8: 환자 샘플에서 돌연변이된 NT-proBNP (R46H) 와의 반응성
고유의 돌연변이된 NT-proBNP 에 대한 새로운 항체의 반응성을 심부전의 명백한 증상을 나타내는 것으로 알려진 8 명의 환자로부터의 혈청 또는 혈장 샘플에서 평가하였다 (표 4, 환자 1-8). R46H 돌연변이를 가진 환자 만이 이용가능하였다. 3 명의 환자의 경우, R46H 돌연변이의 존재가 또한 서열분석에 의해 확인되었다. NT-proBNP 는 신호 항체로서 NT-proBNP-R46H 에 특이적인 rS-22.2.195 및 포획 항체로서 M-18.4.34 를 갖는 실시예 5 에 기재된 Elecsys® 어세이 시스템을 사용하여 정량화되었다. 비교를 위해, 동일한 환자 샘플을 신호 항체로서 NT-proBNP-E43D 에 특이적인 S-23.4.66 및 포획 항체로서 M-18.4.34 를 함유하는 Elecsys® 키트로 측정하였다. 재조합 돌연변이된 NT-proBNP (각각, R46H 또는 E43D) 에 기초한 교정기로 두 어세이 시스템의 교정을 수행하였다.
표 3:
Figure pct00003
* R46H 돌연변이를 서열분석에 의해 확인하였다.
rS-22.2.195 항체를 함유하는 어세이 키트는 모든 환자 샘플에서 NT-proBNP-R46H 를 명확하게 검출하였다. 신호 항체로서 S-23.4.66 을 사용한 대조군 키트는 상당한 양의 NT-proBNP (≤ 7 pg/mL) 를 검출하지 않았다. 이 결과는 각각 2 점 돌연변이 R46H 및 E43D 에 대해 rS-22.2.195 및 S-23.4.66 의 높은 특이성을 나타내지만, 이제는 또한 고유의 샘플에서도 나타난다. rS-22.2.195 로 정량화된 NT-proBNP 농도는 202 내지 22321 pg/mL 의 범위이다. 과거에는, 심장 기능장애 진단을 위한 결정 임계값이 125 pg/mL 의 (야생형) NT-proBNP (Roche Elecsys® proBNP II 어세이) 인 것으로 결정되었다. 따라서, 돌연변이된 NT-proBNP 의 측정 농도가 모두> 125 pg/mL 이면 환자의 심부전 증상을 반영할 것이다.
본원에 언급된 서열은 서열 목록 및 하기 표에 제시되어 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Antibodies recognizing genetic variants <130> RD11936EP <160> 30 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> NT-proBNP with R46H mutation <400> 1 His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly 1 5 10 15 Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln 20 25 30 Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro His Pro Thr 35 40 45 Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His 50 55 60 Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg 65 70 75 <210> 2 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> NT-proBNP with E43D mutation <400> 2 His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly 1 5 10 15 Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln 20 25 30 Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Asp Ser Pro Arg Pro Thr 35 40 45 Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His 50 55 60 Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg 65 70 75 <210> 3 <211> 76 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> wild-type NT-proBNP <400> 3 His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly 1 5 10 15 Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln 20 25 30 Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro Arg Pro Thr 35 40 45 Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His 50 55 60 Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg 65 70 75 <210> 4 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of antibody S-22.2.195 <400> 4 Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Thr Ser Val Ser Val Ala Leu Glu Gln Thr 1 5 10 15 Ala Glu Ile Thr Cys Gln Gly Asp Leu Leu Asp Asp Ala Tyr Val Ala 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Met Lys Leu Ile Tyr Lys 35 40 45 Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Leu Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser 50 55 60 Ser Gly Lys Ile Ala Thr Leu Ile Ile Ser Gly Ala Arg Thr Glu Asp 65 70 75 80 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Val Asp Ser Ser Glu Tyr Ser Val 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Ser Gln Pro Lys Ser Ala 100 105 110 Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Lys Glu Glu Leu Asp Thr Asn 115 120 125 Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Val 130 135 140 Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile Asn Gln Asn Val Lys 145 150 155 160 Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys Tyr Ala Ala Ser Ser 165 170 175 Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser Lys Ser Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr Lys Thr Val Lys Pro 195 200 205 Ser Glu Cys Ser 210 <210> 5 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of antibody S-22.2.195 <400> 5 Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Glu 20 25 30 Tyr Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Thr Met Ala Ser Gly Gly Thr Ile Phe Tyr Asn Pro Thr Leu Lys 50 55 60 Ala Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Ser Thr Lys Ser Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Ser Val Ser Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val 85 90 95 Arg Ser Ser Val Ser Pro Gly Asp Asp Arg Asp Val Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Leu Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Pro Pro Lys Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ile Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Ile Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ala 180 185 190 Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro 210 215 220 Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro 260 265 270 Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val Arg Thr Ala 275 280 285 Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 290 295 300 Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu 340 345 350 Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys 355 360 365 Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln 385 390 395 400 Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp 405 410 415 Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of NT-proBNP with R46H mutation <400> 6 Glu Ser Pro His Pro Thr Gly 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of NT-proBNP with R46H mutation <400> 7 Gln Glu Ser Pro His Pro Thr Gly Val Trp 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of NT-proBNP with E43D mutation <400> 8 Pro Leu Gln Asp Ser Pro Arg 1 5 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fragment of NT-proBNP with E43D mutation <400> 9 Glu Pro Leu Gln Asp Ser Pro Arg Pro Thr 1 5 10 <210> 10 <211> 636 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence for light chain of antibody S-22.2.195 <400> 10 tatgaactga cccagccgac ttcagtgtcg gtggccttgg aacagacggc cgaaatcacc 60 tgccagggag atttgttgga tgatgcatat gtggcttggt accagcagaa gccgggccag 120 gctccgatga aactcattta taaagacagt gagcggcctt cagggatcct tgaccggttc 180 tctggctcca gctcaggcaa aatagccacc ctaatcatca gcggggcccg gaccgaggac 240 gaggccgact attactgtct gtcagttgac agcagcgaat attctgtttt cggcagcggg 300 accaggttga ccgttttgag tcagcccaag tccgcaccct cggtcaccct gttcccgcct 360 tccaaggagg agctcgatac caacaaggcc accgtggtgt gtctcatcag cgacttctac 420 ccgggtagcg tgaacgtggt ctggaaggca gatggcagca ccatcaatca gaacgtgaag 480 accacccagg cctccaaaca gagcaacagc aagtacgcgg ccagcagcta cctgaccctg 540 acgggcagcg agtggaagtc taagagcagt tacacctgcg aggtcacgca cgaggggagc 600 accgtgacga agacagtgaa gccctcagag tgttct 636 <210> 11 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence for heavy chain of antibody S-22.2.195 <400> 11 caggtgcggc tgcaggagtc gggacccagc ctggtgaagc cctcacagac cctctccctc 60 acctgcacgg tctctggatt ctcattaatc ggcgagtatg taacctgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg cgccggagtg gctgagtacg atggccagtg gtggaaccat attttataat 180 ccgaccctga aggcccgact cagcatcacc aaggacagca ccaagagcca attctccctg 240 tcagtgagca gcgtgacatc tgaggacacg gccatgtatt actgtgtaag atcttccgtt 300 tcaccgggcg atgatagaga tgtctggggc cgaggactcc tggttaccgt ctcctcggcc 360 tccaccacac ccccgaaagt ctaccctctg acttcttgct gcggggacac gtccagctcc 420 atcgtgaccc tgggctgcct ggtctccagc tatatgcccg agccggtgac cgtgacctgg 480 aactctggtg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ccatcctgca gtcctccggg 540 ctctactctc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccggccagca cctcaggagc ccagaccttc 600 atctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagcgtgt tgagcccgga 660 tgcccggacc catgcaaaca ttgccgatgc ccaccccctg agctccccgg aggaccgtct 720 gtcttcatct tcccaccgaa acccaaggac acccttacaa tctctggaac gcccgaggtc 780 acgtgtgtgg tggtggacgt gggccaggat gaccccgagg tgcagttctc ctggttcgtg 840 gacaacgtgg aggtgcgcac ggccaggaca aagccgagag aggagcagtt caacagcacc 900 ttccgcgtgg tcagcgccct gcccatccag caccaagact ggactggagg aaaggagttc 960 aagtgcaagg tccacaacga aggcctcccg gcccccatcg tgaggaccat ctccaggacc 1020 aaagggcagg cccgggagcc gcaggtgtac gtcctggccc caccccagga agagctcagc 1080 aaaagcacgc tcagcgtcac ctgcctggtc accggcttct acccagacta catcgccgtg 1140 gagtggcaga aaaatgggca gcctgagtcg gaggacaagt acggcacgac cacatcccag 1200 ctggacgccg acggctccta cttcctgtac agcaggctca gggtggacaa gaacagctgg 1260 caagaaggag acacctacgc gtgtgtggtg atgcacgagg ctctgcacaa ccactacaca 1320 cagaagtcga tctctaagcc tccgggtaaa 1350 <210> 12 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of antibody S-23.4.66 <400> 12 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Arg Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Ser Ile Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Val Gly Tyr Gly 20 25 30 Asn Tyr Val Gly Trp Phe Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Arg Ala Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Ser Tyr Asp Ser Ser 85 90 95 Ser Lys Phe Gly Val Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Thr Glu 115 120 125 Glu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Thr Val Val Cys Leu Ile Asn Asp Phe 130 135 140 Tyr Pro Gly Ser Val Asn Val Val Trp Lys Ala Asp Gly Ser Thr Ile 145 150 155 160 Asn Gln Asn Val Lys Thr Thr Gln Ala Ser Lys Gln Ser Asn Ser Lys 165 170 175 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Gly Ser Glu Trp Lys Ser 180 185 190 Lys Ser Ser Tyr Thr Cys Glu Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Thr 195 200 205 Lys Thr Val Lys Pro Ser Glu Cys Ser 210 215 <210> 13 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of antibody S-23.4.66 <400> 13 Gln Val Arg Met Gln Glu Leu Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Ser 20 25 30 Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Asn Asp Gly Val Ala Gly Tyr Asn Pro Ala Leu Lys 50 55 60 Thr Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Ser Leu Ser Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly 85 90 95 Thr Arg Asp Leu Pro Ser Asp Val Arg Tyr Gly Asn Met Tyr Ile Asn 100 105 110 Tyr Trp Gly Pro Gly Arg Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr 115 120 125 Pro Pro Lys Val Tyr Pro Leu Thr Ser Cys Cys Gly Asp Thr Ser Ser 130 135 140 Ser Ile Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Ser Ser Tyr Met Pro Glu Pro 145 150 155 160 Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 165 170 175 Phe Pro Ala Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 180 185 190 Val Thr Val Pro Ala Ser Thr Ser Gly Ala Gln Thr Phe Ile Cys Asn 195 200 205 Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro 210 215 220 Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro Glu Leu 225 230 235 240 Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val 275 280 285 Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 290 295 300 Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr 305 310 315 320 Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr 355 360 365 Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly 385 390 395 400 Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser 405 410 415 Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr Ala 420 425 430 Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 440 445 Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys 450 455 <210> 14 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence for light chain of antibody S-23.4.66 <400> 14 caggctgtgc tgactcagcc gtcctccgtg tccaggtccc cgggccagag tgtctccatc 60 acctgctctg gaagcagcag caacgttgga tatggtaatt atgtgggctg gttccaacaa 120 gtcccaggat cagcccccaa actcctcatc tatagtgcga ccagtcgagc ctcgggggtc 180 cccgaccgat tctccggctc cagggctggc aacacagcga ccctgaccat cacttcgctc 240 caggctgagg acgaggccga ttattattgt gtatcttatg acagtagtag caaatttggt 300 gttttcggca gcgggaccag gctgaccgtc ctgggtcagc ccaagtccgc accctcggtc 360 accctgttcc cgccttccac ggaggagctc agtaccaaca aggccaccgt ggtgtgtctc 420 atcaacgact tctacccggg tagcgtgaac gtggtctgga aggcagatgg cagcaccatc 480 aatcagaacg tgaagaccac ccaggcctcc aaacagagca acagcaagta cgcggccagc 540 agctacctga ccctgacggg cagcgagtgg aagtctaaga gcagttacac ctgcgaggtc 600 acgcacgagg ggagcaccgt gacgaagaca gtgaagccct cagagtgttc t 651 <210> 15 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid sequence for heavy chain of antibody S-23.4.66 <400> 15 caggtgcgga tgcaggagtt gggacccagc ctggtgaagc cctcacagac cctctccctc 60 acgtgcacgg tctctggatt ctcagtaacc aacagtggtg taggctgggt ccgccaggct 120 ccaggaaagg ccctggagtg gcttggtatt ataaataatg atggagtcgc aggctataac 180 ccagccctta agacccggct cagcatcacc agggacacct ccaagaacca agtctccctg 240 tcattgagca gcgtgacaac tgaggacacg gccgtgtact actgtggaac acgagatttg 300 cccagtgatg ttcgttatgg gaacatgtat atcaactact ggggcccagg acgaatggtc 360 accgtctcct cagcctccac cacacccccg aaagtctacc ctctgacttc ttgctgcggg 420 gacacgtcca gctccatcgt gaccctgggc tgcctggtct ccagctatat gcccgagccg 480 gtgaccgtga cctggaactc tggtgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggccatc 540 ctgcagtcct ccgggctcta ctctctcagc agcgtggtga ccgtgccggc cagcacctca 600 ggagcccaga ccttcatctg caacgtagcc cacccggcca gcagcaccaa ggtggacaag 660 cgtgttgagc ccggatgccc ggacccatgc aaacattgcc gatgcccacc ccctgagctc 720 cccggaggac cgtctgtctt catcttccca ccgaaaccca aggacaccct tacaatctct 780 ggaacgcccg aggtcacgtg tgtggtggtg gacgtgggcc aggatgaccc cgaggtgcag 840 ttctcctggt tcgtggacaa cgtggaggtg cgcacggcca ggacaaagcc gagagaggag 900 cagttcaaca gcaccttccg cgtggtcagc gccctgccca tccagcacca agactggact 960 ggaggaaagg agttcaagtg caaggtccac aacgaaggcc tcccggcccc catcgtgagg 1020 accatctcca ggaccaaagg gcaggcccgg gagccgcagg tgtacgtcct ggccccaccc 1080 caggaagagc tcagcaaaag cacgctcagc gtcacctgcc tggtcaccgg cttctaccca 1140 gactacatcg ccgtggagtg gcagaaaaat gggcagcctg agtcggagga caagtacggc 1200 acgaccacat cccagctgga cgccgacggc tcctacttcc tgtacagcag gctcagggtg 1260 gacaagaaca gctggcaaga aggagacacc tacgcgtgtg tggtgatgca cgaggctctg 1320 cacaaccact acacacagaa gtcgatctct aagcctccgg gtaaa 1365 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1 , light chain, antibody S-22.2.195 <400> 16 Leu Leu Asp Asp Ala Tyr 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3, light chain, antibody S-22.2.195 <400> 17 Leu Ser Val Asp Ser Ser Glu Tyr Ser Val 1 5 10 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1, heavy chain, antibody S-22.2.195 <400> 18 Gly Phe Ser Leu Ile Gly Glu Tyr 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2, heavy chain, antibody S-22.2.195 <400> 19 Met Ala Ser Gly Gly Thr Ile 1 5 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3, heavy chain, antibody S-22.2.195 <400> 20 Val Arg Ser Ser Val Ser Pro Gly Asp Asp Arg Asp Val 1 5 10 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1, light chain, antibody S-23.4.66 <400> 21 Ser Ser Asn Val Gly Tyr Gly Asn Tyr 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3, light chain, antibody S-23.4.66 <400> 22 Val Ser Tyr Asp Ser Ser Ser Lys Phe Gly Val 1 5 10 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR1, heavy chain, antibody S-23.4.66 <400> 23 Gly Phe Ser Val Thr Asn Ser Gly 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR2, heavy chain, antibody S-23.4.66 <400> 24 Ile Asn Asn Asp Gly Val Ala 1 5 <210> 25 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR3, heavy chain, antibody S-23.4.66 <400> 25 Gly Thr Arg Asp Leu Pro Ser Asp Val Arg Tyr Gly Asn Met Tyr Ile 1 5 10 15 Asn Tyr <210> 26 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP with R46H mutation with additional sequences such as His tag <400> 26 Met Arg Gly Ser His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu 1 5 10 15 Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu 20 25 30 Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser 35 40 45 Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly 50 55 60 Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His 85 90 <210> 27 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP with R46H mutation with additional sequences such as His tag <400> 27 His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly 1 5 10 15 Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln 20 25 30 Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Glu Ser Pro His Pro Thr 35 40 45 Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly Ile Arg Gly His 50 55 60 Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 His His His His His His His His 85 <210> 28 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NT-proBNP with E43D mutation with additional sequences such as His tag <400> 28 Met Arg Gly Ser His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu 1 5 10 15 Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu 20 25 30 Ser Glu Leu Gln Val Glu Gln Thr Ser Leu Glu Pro Leu Gln Asp Ser 35 40 45 Pro Arg Pro Thr Gly Val Trp Lys Ser Arg Glu Val Ala Thr Glu Gly 50 55 60 Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro Arg 65 70 75 80 Gly Gly Gly Ser His His His His His His His His 85 90 <210> 29 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal sequence in fusion proteins <400> 29 Met Arg Gly Ser 1 <210> 30 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal sequence in fusion proteins <400> 30 Gly Gly Gly Ser 1

Claims (16)

  1. 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체로서, 하기로부터 선택되는 항체:
    (a) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 및
    (b) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체, 예컨대 모노클로날 양 항체인, 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 NT-proBNP 가 돌연변이된 인간 NT-pro BNP 이고, 및/또는
    (i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 상기 돌연변이된 NT-proBNP 가 SEQ ID NO: 1 에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    (ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 상기 돌연변이된 NT-proBNP 는 SEQ ID NO: 2 에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 야생형 NT-proBNP 에 결합하지 않는, 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기와 같은 항체:
    i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티틴으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 및 여기서 항체는 경쇄 가변 도메인이 서열 LLDDAY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 16), 서열 KDS 를 갖는 CDR2, 및 서열 LSVDSSEYSV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 17) 을 포함하고, 중쇄 가변 도메인이 서열 GFSLIGEY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 18), 서열 MASGGTI 를 갖는 CDR2 (SEQ ID NO: 19), 및 서열 VRSSVSPGDDRDV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 20) 를 포함하는 것을 특징으로 함, 또는
    ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 및 여기서 항체는 경쇄 가변 도메인이 서열 SSNVGYGNY 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 21), 서열 SAT 를 갖는 CDR2, 및 서열 VSYDSSSKFGV 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 22) 을 포함하고, 중쇄 가변 도메인이 서열 GFSVTNSG 를 갖는 CDR1 (SEQ ID NO: 23), 서열 INNDGVA 를 갖는 CDR2 (SEQ ID NO: 24), 및 서열 GTRDLPSDVRYGNMYINY 를 갖는 CDR3 (SEQ ID NO: 25) 를 포함하는 것을 특징으로 함.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 항체의 항원-결합 단편으로서, 특히 Fab 단편, Fab' 단편, Facb 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, 및 Fv 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원-결합 단편.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 항체 또는 상기 항원-결합 단편이 검출가능한 표지에 연결되어 있는, 항체 또는 항원-결합 단편.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 효소, 비오틴, 방사성 표지, 형광 표지, 화학발광 표지, 전기화학발광 표지, 금 표지 또는 자성 표지이고, 특히 상기 검출가능한 표지가 루테늄 포함 전기화학발광 표지인, 항체 또는 항원-결합 단편.
  9. 하기를 포함하는 키트 또는 조성물:
    a) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편 및 ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
    b) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
    c) i) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는
    d) i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 및 iii) 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 이의 항원-결합 단편, 및
    임의로 여기서 a), b), c) 또는 d) 에 언급된 키트 또는 조성물이 NT-proBNP 에서 상이한 에피토프에 결합하는 항체를 추가로 포함하고, 특히 상기 항체는 NT-proBNP 의 아미노산 1 내지 35 에 존재하는 에피토프에 결합함.
  10. 하기를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP:
    i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이, 또는
    ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이,
    또는 상기 돌연변이된 NT-proBNP 의 단편으로서, 상기 단편은 하기를 포함함:
    i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이, 또는
    ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이,
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 NT-proBNP 또는 단편은 정제 태그 또는 운반체 단백질에 작동가능하게 연결됨.
  11. 제 10 항의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된, 폴리뉴클레오티드.
  12. 하기와 같은 숙주 세포:
    i) 제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제 6 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 항원-결합 단편을 제조하는 숙주 세포, 또는
    ii) 제 10 항의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편, 제 11 항의 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. 제 10 항의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편 및 면역보강제를 포함하는 조성물.
  14. 항체의 생성을 위한, 제 10 항 중 어느 하나의 돌연변이된 NT-proBNP 또는 이의 단편, 또는 제 13 항의 조성물의 용도.
  15. 하기를 포함하는 키트 또는 조성물:
    (i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 그의 단편, 또는
    (ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 그의 단편, 또는
    (iii) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편, 및 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP, 또는 이의 단편,
    이때 임의로, 상기 키트 또는 조성물은 야생형 NT-proBNP 또는 이의 단편을 추가로 포함하며, 상기 단편은 야생형 NT-proBNP 의 적어도 아미노산 잔기 42 내지 46 을 포함함.
  16. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서의 심부전의 진단 방법으로서:
    a) 대상체 유래 샘플에서 NT-proBNP 의 양을 결정하는 단계, 및
    b) 단계 a) 에서 결정된 NT-proBNP 의 양을 참조량과 비교함으로써, 심부전을 진단하는 단계,
    이때, NT-proBNP 의 양의 결정은 샘플을 적어도 다음과 접촉시키는 단계를 포함함:
    (i) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는
    (ii) 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는
    (iii) 위치 46 에서 아르기닌을 히스티딘으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 및 위치 43 에서 글루탐산을 아스파르트산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 돌연변이된 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편,
    및 임의로, 샘플이 야생형 NT-proBNP 에 특이적으로 결합하는 항체, 여기서 항체는 야생형 NT-proBNP 의 아미노산 잔기 42 내지 46 를 포함하는 야생형 NT-proBNP 의 영역에 특이적으로 결합함, 또는 상기 항체의 항원-결합 단편과 추가로 접촉되는, 진단 방법.
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