JP5412579B2 - 速度因子 - Google Patents
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Description
際だつ抗原特異性および並外れた抗原複合体安定性を有する高親和性抗体の作製は、診断および治療用抗体の開発における主目的である。
a) 抗体のセットまたは抗体の集合または多数の抗体を提供する工程、
b) 温度依存的なカイネティクスデータを測定する工程、
c) 提供された抗体のすべてについて速度因子を算出する工程、
d) 速度因子が10以下の抗体を選択する工程
を包含する。
a) 抗体産生細胞のセット/抗体産生細胞の集合/多数の抗体産生細胞を提供する工程、
b) 速度因子が10以下の抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、
c) 選択した細胞を培養する工程、
d) 選択し培養した細胞からまたはその培養培地から抗体を回収し、それによって抗体を得る工程
を包含する方法である。
a) 親抗体を提供する工程、
b) 該親抗体のヒト化型のセット/ヒト化型の集合/多数のヒト化型を提供する工程、
c) 提供されたすべての抗体の温度依存的なカイネティクスデータを測定する工程、
d) 提供されたすべての抗体について速度因子を算出する工程、
e) 親抗体の速度因子とヒト化型の速度因子を比較する工程、
f) 親抗体の速度因子の2倍未満の速度因子を有する抗体を選択することによって親抗体のヒト化型を選択する工程
を包含する、方法である。
[本発明1001]
抗体を得るための方法であって、
a) 多数の抗体を提供する工程、
b) 37℃での各抗体のその抗原に対する会合速度定数および13℃での各抗体のその抗原に対する会合速度定数を測定する工程、
c) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
d) 比が10以下の抗体を選択し、それによって抗体を得る工程
を含む、方法。
[本発明1002]
前記測定する工程が、表面プラズモン共鳴を用いる点で特徴づけられる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記選択が、比を算出しかつΔS゜‡assを測定することによる点で特徴づけられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
表面プラズモン共鳴において、抗原が表面プラズモン共鳴チップに固定されている点で特徴づけられる、本発明1002〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
200 J/mol*K未満のΔS゜‡assを有する抗体が選択される点で特徴づけられる、本発明1003または1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
抗体が各々、単一のハイブリドーマまたはB細胞により産生されたものである点で特徴づけられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
少なくとも2つの抗原に対する交差反応性を有する抗体を得るための方法であって、
a) 多数の抗体を提供する工程、
b) 37℃での各抗体の抗原に対する会合速度定数および13℃での各抗体の同じ抗原に対する会合速度定数を測定する工程、
c) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
d) 比が50以上の抗体を選択し、それによって少なくとも2つの抗原に対する交差反応性を有する抗体を得る工程
を含む、方法。
[本発明1008]
抗体を産生するための方法であって、
a) 多数の抗体産生細胞を提供する工程、
b) 各抗体産生細胞により産生される各抗体の、抗原に対する37℃および13℃での会合速度定数を測定する工程、
c) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
d) 比が10以下の抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、
e) 選択した細胞を培養する工程、
f) 選択し培養した細胞からまたはその培養培地から抗体を回収し、それによって抗体を産生する工程
を含む、方法。
[本発明1009]
工程a)の抗体産生細胞が単細胞として捕集される点で特徴づけられる、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記選択前に、捕集された単細胞を培養する追加の工程を包含する点で特徴づけられる、本発明1008または1009の方法。
[本発明1011]
ヒト化抗体を得るための方法であって、
a) 親抗体を提供する工程、
b) 該親抗体のヒト化型のセットを提供する工程、
c) 37℃および13℃での各ヒト化抗体型のその抗原に対する会合速度定数を測定する工程、
d) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
e) 親抗体の比とヒト化型の比を比較する工程、
f) 親抗体の比の2倍未満の比を有するヒト化型をヒト化抗体として選択し、それによってヒト化抗体を得る工程
を含む、方法。
[本発明1012]
本発明1001〜1007のいずれかの方法により得られた抗体の、治療剤または診断剤としての使用。
[本発明1013]
本発明1001〜1012のいずれかの方法により得られた抗体を含む、薬学的組成物。
本明細書で報告する方法は、速度因子の測定に基づくものである。速度因子に基づき抗体を分類することができる、すなわち、抗体をそれらの結合特性に従い、例えばエントロピーまたはエンタルピー的な抗原結合体として特徴づけることができる。速度因子に基づく分類は、詳細な熱力学の測定および/または算出を必要とせず、したがって、測定するパラメーターの量およびなすべき計算の数を減らすことができることが見出された。速度因子は、37℃および13℃で別個に測定された抗原・抗体複合体の会合速度定数(ka)の比である。この速度因子を算出するのに2つの実験的測定しか必要としないため、本発明は高速・高スループットに適した方法である。
− 高スループット処理が可能である点、
− サンプル消費量が少ない点、
− 結合性(avidity)ではなく親和性(affinity)を測定する点、および
− 粗細胞上清または複合的な培養混合物を使用する点。
− 自由標準結合エンタルピーΔG゜
− 標準結合エンタルピーΔH゜
− 標準結合エントロピーΔS゜
および以下の遷移状態パラメーター
− 自由標準会合エンタルピーΔG゜‡ass
− 標準会合エンタルピーΔH゜‡ass
− 標準会合エントロピーΔS゜‡ass
− 活性化エネルギーEaass
− 自由標準解離エネルギーΔG゜‡diss
− 標準解離エンタルピーΔH゜‡diss
− 標準解離エントロピーΔS゜‡diss、および
− 解離エネルギーEadiss
の算出をすることができる。非線形ファントホッフ式を使用する場合はΔCp値も測定できる。
a)アレニウス式:
(I) k = A*e(-Ea/R*T)
b)ファントホッフの計算:
(II) ΔG゜ = ΔH゜-T*ΔS゜
(III) ΔG゜ = -R*T*lnKD
(IV) lnKD = -1/T*(ΔH゜/R)/傾き - (ΔS゜/R)/切片
(V) R*T*lnKD = ΔH゜T0 - T*ΔS゜T0 + ΔC゜p(T-T0) - T*ΔCp゜ln(T/T0)
c)アイリングの会合フェーズ:
(VI)ka = (kb*T/h)*e(-ΔG゜‡/R*T)
(VII)lnka/T = -1/T*(ΔH゜‡/R)/傾き + (ΔS゜‡*R+lnkb/h)/切片
(VIII)ka = A*e-Ea/R*T
(IX) lnka = lnA/切片 - (1/T*Ea/R)/傾き
d)アイリングの解離フェーズ:
(X)kd = (kb*T/h)*e(-ΔG゜‡/R*T)
(XI)lnkd/T = -1/T*(ΔH゜‡/R)/傾き + (ΔS゜‡/R+lnkb/h)/切片
(XII)kd = A*e-Ea/R*T
(XIII)lnkd = lnA/切片 - (1/T*Ea/R)/傾き
ここで、
ΔH゜ − 標準結合エンタルピー、
ΔS゜ − 標準結合エントロピー、
ΔG゜ − 自由標準結合エンタルピー、
T*ΔS゜ - エントロピー項、
ΔH゜‡ass − 標準会合結合エンタルピー、
ΔS゜‡ass − 標準会合結合エントロピー、
ΔG゜‡ass − 標準会合自由結合エンタルピー、
Eaass - 会合アレニウスパラメーター、
ΔH゜‡diss − 標準解離結合エンタルピー、
ΔS゜‡diss − 標準解離結合エントロピー、
ΔG゜‡diss − 標準解離自由結合エンタルピー、
Eadiss - 解離アレニウスパラメーター、
KD − 親和性定数、
ka − 会合速度定数、
kb − ボルツマン定数 = (1.3806503 X 10-23 m2kgs-2K-1)、
kd − 解離速度定数、
h − プランク定数、
Cp − モル熱容量。
a) 多数の抗体を提供する工程、
b) 37℃での各抗体の抗原に対する会合速度定数および13℃での各抗体の抗原に対する会合速度定数を測定する工程、
c) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
d) 比が10以下かつΔS゜‡ass値が100 J/mol*K以下の抗体を選択することにより特異的結合抗体を選択する工程
を包含する方法を報告する。
a) 多数の抗体を提供する工程、
b) 37℃での各抗体の抗原に対する会合速度定数および13℃での各抗体の抗原に対する会合速度定数を測定する工程、
c) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
d) 比が50以上かつΔS゜‡ass値が200 J/mol*K以上の抗体を選択することによって交差反応性の抗体を選択する工程
を包含する方法を報告する。
マウスの免疫
8〜12週齢のBalb/cマウスを、完全フロイントアジュバント中にKLH(キーホールリンペットヘモシアニン)融合体として配合した100μgの抗原による腹腔内免疫に供した。
CM5センサーチップの準備
ソフトウェアV.1.1制御のBIAcore A100システムを以下のように準備した:BIAcore CM5センサー(シリーズS)をシステムに取り付け、製造元の推奨に従い流体力学的に設定した。
初代ハイブリドーマ培養上清のカイネティクスクリーニング
実施例1で行った異なる免疫刺激由来のハイブリドーマ培養上清を以下のとおりに処理した。
(XIV)(1 - [BL(RU) - SL(RU)/BL(RU)])
を用いて抗原複合体の安定性を算出した(図2を参照のこと)。例えば、丸で囲まれたデータスポットは十分な抗原反応シグナルおよび100%の複合体安定性を示し、四角で囲まれたデータスポットは不十分な抗原反応を示す。
ハイブリドーマのクローニングおよび抗体の生成
実施例3に従い選択した抗体産生ハイブリドーマ初代培養物を、コントロールソフトウェアV4.1.2の下でセルソーターFACSAria(Becton Dickinson)を用いてサブクローニングした。捕集した単クローンを24ウェルプレート中でさらなる増殖のために適当な条件下でインキュベートし、続いて、製造元の指示に従うELISA法を用いて溶液中の抗体濃度を測定した後、実施例5に従う熱力学的スクリーニングプロセスに移した。
熱力学的スクリーニング
選択した抗体を、抗原・抗体複合体の熱安定性を測定するためおよび熱力学的特性を算出するために温度依存的なカイネティクスの測定を行う熱力学的スクリーニングによって特徴づけた。
RUMAX値を均一にする調整の効果についての実施例
BIAcore T100デバイスにCM5シリーズS BIAcoreセンサーを取り付け、6000 RUの<IgGFCyM>R(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA)を製造元の指示に従い各フローセルに固定した。非最適化実験では、HBS-EPバッファー(0.05% P20)中、40nMの捕捉抗体を20μl/分で使用した。サンプルバッファーは1 mg/ml CMD(カルボキシメチルデキストラン)を補充したシステムバッファーとした。
速度因子の測定および算出
CM5センサーシリーズSをBIAcore T100システムに取り付けた。
高スループット速度因子分析
CM5センサーシリーズSをBIAcore A100システムに取り付け、検出スポットを製造元の指示に従い流体力学的に設置した。
Claims (11)
- 抗体を得るための方法であって、
a) 多数の抗体を提供する工程、
b) 37℃での各抗体のその抗原に対する会合速度定数および13℃での各抗体のその抗原に対する会合速度定数を測定する工程、
c) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
d) 比が10以下の抗体を選択し、それによって抗体を得る工程
を含む、方法。 - 前記測定する工程が、表面プラズモン共鳴を用いる点で特徴づけられる、請求項1記載の方法。
- 前記選択が、比を算出しかつΔS゜‡assを測定することによる点で特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 表面プラズモン共鳴において、抗原が表面プラズモン共鳴チップに固定されている点で特徴づけられる、請求項2〜3のいずれか一項記載の方法。
- 200 J/mol*K未満のΔS゜‡assを有する抗体が選択される点で特徴づけられる、請求項3または4のいずれか一項記載の方法。
- 抗体が各々、単一のハイブリドーマまたはB細胞により産生されたものである点で特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも2つの抗原に対する交差反応性を有する抗体を得るための方法であって、
a) 多数の抗体を提供する工程、
b) 37℃での各抗体の抗原に対する会合速度定数および13℃での各抗体の同じ抗原に対する会合速度定数を測定する工程、
c) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
d) 比が50以上の抗体を選択し、それによって少なくとも2つの抗原に対する交差反応性を有する抗体を得る工程
を含む、方法。 - 抗体を産生するための方法であって、
a) 多数の抗体産生細胞を提供する工程、
b) 各抗体産生細胞により産生される各抗体の、抗原に対する37℃および13℃での会合速度定数を測定する工程、
c) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
d) 比が10以下の抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、
e) 選択した細胞を培養する工程、
f) 選択し培養した細胞からまたはその培養培地から抗体を回収し、それによって抗体を産生する工程
を含む、方法。 - 工程a)の抗体産生細胞が単細胞として捕集される点で特徴づけられる、請求項8記載の方法。
- 前記選択前に、捕集された単細胞を培養する追加の工程を包含する点で特徴づけられる、請求項8または9記載の方法。
- ヒト化抗体を得るための方法であって、
a) 親抗体を提供する工程、
b) 該親抗体のヒト化型のセットを提供する工程、
c) 37℃および13℃での各ヒト化抗体型のその抗原に対する会合速度定数を測定する工程、
d) 13℃での会合速度定数に対する37℃での会合速度定数の比を算出する工程、
e) 親抗体の比とヒト化型の比を比較する工程、
f) 親抗体の比の2倍未満の比を有するヒト化型をヒト化抗体として選択し、それによってヒト化抗体を得る工程
を含む、方法。
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