JP6889780B2 - 遺伝子バリアントを認識する抗体 - Google Patents
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Description
軽鎖に(好ましくは両方の軽鎖に)、
配列LLDDAY(配列番号16に示される)を有するCDR1、
配列KDSを有するCDR2、および
配列LSVDSSEYSV(配列番号17に示される)を有するCDR3、
ならびに
重鎖に(好ましくは両方の重鎖に)、
配列GFSLIGEY(配列番号18に示される)を有するCDR1、
配列MASGGTI(配列番号19に示される)を有するCDR2、
配列VRSSVSPGDDRDV(配列番号20に示される)を有するCDR3
を含むことが想定される。
軽鎖に(好ましくは両方の軽鎖に)、
配列SSNVGYGNY(配列番号21に示される)を有するCDR1、
配列SATを有するCDR2、および
配列VSYDSSSKFGV(配列番号22に示される)を有するCDR3、
ならびに
重鎖に(好ましくは両方の重鎖に)、
配列GFSVTNSG(配列番号23に示される)を有するCDR1、
配列INNDGVA(配列番号24に示される)を有するCDR2、および
配列GTRDLPSDVRYGNMYINY(配列番号25に示される)を有するCDR3
を含むことが想定される。
a)i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
b)i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびii)野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
c)i)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびii)野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、
d)i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、およびiii)野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、
e)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
f)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
を含むキットまたは組成物に関する。
(i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNP、もしくはその断片、または
(ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNP、もしくはその断片、または
(iii)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNP、もしくはその断片、および43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNP、もしくはその断片
を含むキットまたは組成物に関する。
a)対象由来の試料中のNT−proBNPの量を決定するステップと、
b)ステップa)で決定されたNT−proBNPの量を参照量と比較し、それによって心不全を診断するステップと
を含む方法に関する。
(i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
(ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
(iii)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
と接触させるステップを含む。
(i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
(ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
(iii)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPを特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
に接触させるステップを含む。
(b)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体
から選択される、変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体。
2. モノクローナル抗体である、実施形態1に記載の抗体。
3. ヒツジ抗体である、実施形態1または2に記載の抗体。
4. 前記NT−proBNPが変異型ヒトNT−proBNPである、実施形態1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
5. (i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む前記変異型NT−proBNPが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、または
(ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む前記変異型NT−proBNPが、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む、
実施形態1〜4のいずれか1項に記載の抗体。
6. 野生型NT−proBNPに著しくは結合しない、実施形態1〜5のいずれか1項に記載の抗体。
7. i)抗体が、46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合し、前記抗体の軽鎖が、配列番号4のアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖が、配列番号5のアミノ酸配列を含む、または
ii)抗体が、43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合し、前記抗体の軽鎖が、配列番号12のアミノ酸配列を含み、前記抗体の重鎖が、配列番号13のアミノ酸配列を含む、
実施形態1〜6のいずれか1項に記載の抗体。
8. 実施形態1〜7のいずれか1項に記載の抗体の抗原結合断片。
9. Fab断片、Fab’断片、Facb断片、F(ab’)2断片、scFv断片、およびFv断片からなる群から選択される、実施形態8に記載の抗原結合断片。
10. 検出可能な標識に連結している、実施形態1〜7のいずれか1項に記載の抗体、または実施形態8または9に記載の抗原結合断片。
11. 前記検出可能な標識が、酵素、ビオチン、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、電気化学発光標識、金標識、または磁気標識であり、特に、前記検出可能な標識が、電気化学発光標識である、実施形態10に記載の抗体または抗原結合断片。
12. 前記検出可能な標識がルテニウムを含む、実施形態10または11に記載の抗体または抗原結合断片。
13. 実施形態1〜7のいずれか1項に記載の抗体、または実施形態8および9に記載の抗原結合断片を産生する宿主細胞。
14. a)i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
b)i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびii)野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
c)i)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびii)野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
d)i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびiii)野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
を含むキットまたは組成物。
15. a)、b)、c)、またはd)の下に言及された抗体が、検出可能な標識に、好ましくは電気化学発光標識に結合しており、特に前記抗体がルテニウム化されている、実施形態14に記載のキットまたは組成物。
16. NT−proBNP中の異なるエピトープに結合する抗体をさらに含み、特に、前記抗体が、NT−proBNPのアミノ酸1〜35に存在するエピトープに結合する、実施形態13〜15のいずれか1項に記載のキットまたは組成物。
17. i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、もしくは
ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異、
を含む変異型NT−proBNP、
または
i)前記46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、もしくは
ii)前記43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異
を含む、前記変異型NT−proBNPの断片。
18. 前記変異型NT−proBNPが、配列番号1または配列番号2に示される配列を含む、実施形態17に記載の変異型NT−proBNPまたはその断片。
19. 精製タグまたは担体タンパク質に作動可能に連結している、実施形態17または18に記載の変異型NT−proBNPまたはその断片。
20. 実施形態17〜19のいずれか1項に記載の変異型NT−proBNPまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
21. 実施形態20に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
22. 実施形態17〜19のいずれか1項に記載の変異型NT−proBNPまたはその断片、実施形態20に記載のポリヌクレオチド、または実施形態21に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
23. イムノアジュバントと、実施形態17〜19のいずれか1項に記載の変異型NT−proBNPまたはその断片とを含む組成物。
24. 抗体の産生のための、実施形態17〜19のいずれか1項に記載の変異型NT−proBNPもしくはその断片、または実施形態23に記載の組成物の使用。
25. (i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNP、もしくはその断片、または
(ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNP、もしくはその断片、または
(iii)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNP、もしくはその断片;および43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNP、もしくはその断片
を含むキットまたは組成物。
26. 前記野生型NT−proBNPまたはその断片をさらに含み、前記断片が、前記野生型NT−proBNPの少なくともアミノ酸残基42〜46を含む、実施形態25に記載のキットまたは実施形態。
27. 対象における心不全を診断する方法であって、
a)対象由来の試料中のNT−proBNPの量を決定するステップと、
b)ステップa)で決定されたNT−proBNPの量を参照量と比較し、それによって心不全を診断するステップと
を含み、
前記NT−proBNPの量の決定は、少なくとも、
(i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
(ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または
(iii)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;および43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片
に前記試料を接触させるステップを含む方法。
28. 前記試料を、野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、または前記抗体の抗原結合断片とさらに接触させる、実施形態27に記載の方法。
組換えN末端proBNP(1〜76)ムテインNTproBNP(1〜76)ムテイン[R72H](すなわちR46H置換を含むムテイン)およびNTproBNP(1〜76)ムテイン[E69D](すなわちE43D置換を含むムテイン)の産生
N末端proBNP(アミノ酸配列1〜76)のヌクレオチド配列を、PCRを介した遺伝子合成によって産生し、C末端ヒスチジン−Tagを伴う発現を可能にする適した発現ベクター(pQE80)に、増幅した遺伝子をクローニングした。遺伝子の最適な発現を得るために、DNA配列を、大腸菌で最も高頻度で使用されるコドンに適合させた。翻訳されたタンパク質配列は、92アミノ酸〜なり、それは、N末端の4アミノ酸配列MRGS(配列番号29)を含み、NTproBNP(1〜76)、アミノ酸GGGS(配列番号30)、および8個のヒスチジンが続く。
NTproBNP(1〜76)ムテイン[R72H]およびNTproBNP(1〜76)ムテイン[E69D]に対するモノクローナル抗体の産生およびスクリーニング
組換えNTproBNP(1〜76)ムテイン[R72H]および組換えNTproBNP(1〜76)ムテイン[E69D]を用いて、ヒツジを免疫した。フロイント完全をアジュバントとして使用した。4回の初発免疫の後、1か月間隔で免疫を繰り返した。陽性反応の力価を有したヒツジのリンパ節を、全身麻酔および鎮痛剤の下で1つ取り出した。外科的な除去の後、リンパ節組織外で単細胞の調製を行った。リンパ節のリンパ球と永久ミエローマ細胞株1C10(Bioventix)とを、比率2:1でPEGを用いて融合し、4.5mg/mLグルコース、10%ウシ胎児血清(Hyclone)、100μmol/L非必須アミノ酸(Gibco)、5.7μMアザセリン/100μMヒポキサンチン(Sigma)、50U/mLヒトインターロイキン−6(Roche)、100IU/mLペニシリン/100μg/mLストレプトマイシン(Sigma)を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養した。融合は、KohlerおよびMillstein(Nature、256、1975、p.495〜497)の周知の方法に従って実施した。それらのそれぞれの免疫原配列に特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを、FACSAriaIIIを用いた単細胞堆積により最終的にクローニングした。
ストレプトアビジンを被覆した384ウェルマイクロタイタ−プレート(Microcoat)を、インキュベーション緩衝液(PBS緩衝液+0,5%Byco C)中、1μg/mLビオチン化MAK<NTproBNP>M−18.4.34 IgG−Bi mono(Roche)により、室温で1時間被覆した。M−18.4.34は、配列番号3のアミノ酸27〜31を含む領域に結合する。例えば、本抗体は、本明細書に規定された変異型NT−proBNPおよび野生型に結合する。洗浄溶液(0.9%NaCl+0.05%Tween20)による洗浄後、インキュベーション緩衝液中100ng/mLに希釈した抗原NTproBNP(1〜76)ムテイン[R72H]の共存下、さらに別のインキュベーションを、室温で1時間実施した。洗浄溶液によるさらに別の洗浄ステップの後、抗体試料のインキュベーション(ハイブリドーマの上清)を、50μL/ウェルで1時間、室温で実施した。洗浄緩衝液によるさらに1回の洗浄ステップの後、インキュベーション緩衝液中1:15,000に希釈したペルオキシダーゼコンジュゲートAffiniPureロバ抗ヒツジIgG(H+I)検出抗体(Jackson Imm.Research)共存下のインキュベーションを、室温で1時間実施した。洗浄緩衝液によるさらに1回の洗浄ステップの後、ペルオキシダーゼ活性を、ABTS(ready−to−use溶液、Roche)共存下、室温での20分間のインキュベーションによって検出し、ELISAリーダーを用いて、消光の差異を405nmでのmUで読み取った。
NTproBNP(1〜76)ムテイン[E69D]を抗原として用いて、上記の記載と同様に、初発のELISAスクリーニングを実施した。陽性反応を示したハイブリドーマ上清を、次いで、NTproBNP(1〜76)ムテイン[R72H]および野生型NTproBNP(1〜76)に対する交差反応性についてスクリーニングした。
モノクローナル抗体のカイネティック属性の特性解析
T200機器にBiacoreシリーズSセンサーチップCM5を装填した。系緩衝液を1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4 pH7.4、500mM NaCl、2.7mM KCl、0.05%Tween20とした。速度因子を決定するために、系を13℃および37℃でインキュベーションした。試料緩衝液を系緩衝液とし、追加的に1mg/mL CMD(カルボキシメチルデキストラン、Fluka)を補充した。抗体捕捉系を確立した。5000RUのウサギ抗ヒツジポリクローナル抗体(Id.:313−005−045、Dianova)を、製造業者による記載の通りに、25℃、10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0中30μg/mLで、EDC/NHSカップリングによって固定化した。捕捉系は、20μL/分で15秒の濃縮HBS緩衝液[100mM HEPES pH7.4、1.5M NaCl、0.05%(w/v)Tween20]を用いた洗浄と、20μL/分で30秒の100mM HClの注入に続いて、20μL/分で1分間の10mMグリシン緩衝液pH1.5の注入により、再生した。捕捉される抗体を、それぞれの系緩衝液pH7.4中に40nMの濃度で希釈し、10μL/分で1分間注入した。抗体の捕捉後、2.5倍濃縮した系緩衝液によって60μL/分で30秒、系を洗浄した後、2分間、ベースラインを安定化した。濃度依存的な分析物のシリーズを、0.4nM、1.1nM、3.3nMから1:3希釈ステップで注入し、10nM、30nM、および90nMでは2回注入した。別の実施形態では、分析物NTproBNPE69Dを、1.1nM、3.3nM、10nMからの濃度シリーズで注入し、30nM、90nM、および270nMでは2回注入した。分析物接触時間を5分とし、解離時間を10分とした。分析物カイネティクスを60μL/分で実施した。ヒツジ抗体をセンサー表面上にリガンドとして捕捉した:mAb<NTproBNP(E69D)>S−23.4.66−IgG、mAb<NTproBNP(R72H)>rS−22.2.195−IgG。Roche製の分析物を溶液中に注入した:NT−proBNP(アミノ酸1〜76)(MW8.5kDa);proBNP(アミノ酸27〜102)(MW9.9kDa);NT−proBNP E69D(MW10.2kDa);NT−proBNP R72H(MW10.2kDa);対照として系緩衝液;0−血清SB150610−001。製造業者GEHCの説明書に従って、BiaevaluationソフトウェアV.3.0を使用した。RMAX localを伴う1:1結合モデルを適用して、カイネティック速度を決定した。
抗体のサンドイッチ特性解析
抗体サンドイッチSPR測定を25℃で実施した。実施例3に記載されたように、T200機器を、同じ緩衝液条件およびセンサー器材の下で使用した。12000RUのRbAMFcg(ウサギ抗マウスFcガンマ、PAK<M−Fcg>Rb−IgG(IS)、コード:315−005−046、Jackson Immuno Research)を、製造業者による記載の通りに、25℃、10mM酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0中40μg/mLで、EDC/NHSカップリングによって固定化した。捕捉系は、20μL/分で15秒の濃縮HBS緩衝液[100mM HEPES pH7.4、1.5M NaCl、0.05%(w/v)Tween20]を用いた洗浄と、20μL/分で1分間の10mMグリシン緩衝液pH1.5の注入に続いて、20μL/分で1分間の10mMグリシン緩衝液pH1.7の注入により、再生した。150nMの一次マウス抗proBNP抗体M−18.4.34(27〜31)を、10μL/分で1分間捕捉した。捕捉系のフリーの結合価を、ブロッキング溶液によって飽和させた。ブロッキング溶液を30μL/分で3分間注入した後、2分間、ベースラインを安定化した。分析物のNT−proBNP(アミノ酸1〜76)(MW8.5kDa);proBNP(アミノ酸27〜102)(MW9.9kDa)、およびNT−proBNP R72H(MW10.2kDa)を90nMで、3分間、30μL/分で注入した。分析物NT−proBNP E69D(MW10.2kDa)を180nMで、3分間、30μL/分で注入した。別の実施形態では、組換えproBNP分析物の代わりに、ヒト血清を、溶液中で分析物として適用した。血清を試料緩衝液で1:5に希釈して、5μL/分で20分間注入し、それにより、提示された一次抗体M−18.4.34(27〜31)が患者血清由来の生来のproBNP抗原誘導体によって飽和するようにした。血清分析物は、:0−血清SB150610−001;NT−proBNP R72H血清;27.39ng/mL proBNPを含むNT−proBNP野生型血清SE 1053 DI 0580とした。サンドイッチの性能を評価するために、250nMの各二次抗体mAb<NTproBNP(E69D)>S−23.4.66−IgGおよびmAb<NTproBNP(R72H)>rS−22.2.195−IgG SP/Q)を、30μL/分で、3分間の会合時間および3分間の解離時間で注入した。製造業者GEHCの説明書に従って、BiaevaluationソフトウェアV.3.0を使用した。
モノクローナル抗体rS−22.2.195およびS−23.4.66の精製およびルテニウム化
細胞不含のヒツジハイブリドーマの培養上清(CELLine、INTEGRA Biosciences AG)をpH4.75に調整して、RTで30分インキュベーションする。遠心分離後、IgGを含有する上清に0.5M硫酸アンモニウムおよび150mM NaClを補い、pHを8.5に上げる。溶液をプロテインAカラム[ProSep(登録商標)Ultra Plus、Merck Millipore]にアプライし、結合したIgGを100mMクエン酸塩、100mM NaCl、pH5.5で溶出する。50mMリン酸K、150mM NaCl pH7.5に対する透析の後、ウシIgGを特異的に結合する免疫アフィニティーレジンを用いて、培養培地のFCSに由来する痕跡量のウシIgGを除去する。最終産物を濃縮し(Amicon Ultra−30、Merck Millipore)、濾過して(0.22μm)−80℃で保管する。
組換え抗体を発現するCHO細胞株の細胞不含の培養上清を、pH4.75に調整して、RTで30分インキュベーションする。遠心分離後、IgGを含有する上清に0.5M硫酸アンモニウムおよび150mM NaClを補い、pHを8.5に上げる。溶液をプロテインAカラム[ProSep(登録商標)Ultra Plus、Merck Millipore]にアプライし、結合したIgGを100mMクエン酸塩、100mM NaCl、pH5.5で溶出した。50mM リン酸K、150mM NaCl pH7.5に対する透析の後、最終産物を濃縮し(Amicon Ultra−30、Merck Millipore)、濾過して(0.22μm)−80℃で保管する。
プロテインAにより精製された抗体を、ルテニウム化緩衝液(100mMリン酸K pH8.5)に対して透析し、次いで、溶液をタンパク質濃度1mg/mLに調整する。ルテニウム(II)トリス(ビピリジル)−UEEK−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、濃度>5mg/mLでDMSOに溶解する。15倍モル過剰のBPRu−UEEK−DDSをIgG溶液に添加し、勢いよく混合しながら反応を25℃で45分間実施する。L−リジンを最終濃度10mMで添加することによって、反応を停止した。ゲル浸透クロマトグラフィーによって、Superdex 200(GE Healthcare Life Sciences)上で、100mMリン酸K、150mM KCl pH7.5をランニング緩衝液として用いて、過剰の標識化試薬を除去する。コンジュゲートされたIgGを含有する画分をプールし、6.5%サッカロースを用いて最終産物を安定化し、−80℃で保管する。
変異型NT−proBNPを検出するための方法
NT−proBNPを検出するための1つの方法は、電気化学発光に基づくよく確立されたRoche Elecsys(登録商標)アッセイ技術である。Elecsys(登録商標)アッセイは、不均一なイムノアッセイであり、サンドイッチの原理に従って機能する。すなわち、分析物である異なるエピトープに対し発生させた捕捉抗体および検出(シグナル)抗体を使用することによって、抗体−抗原−抗体複合体を形成する。変異型NT−proBNPを検出するためのElecsys(登録商標)アッセイは、以下のステップおよび構成要素を含む。
a)リン酸により緩衝された(100mM、pH5.8)マトリックス含有保存剤(Oxy−Pyrion 0.1%、N−メチルイソチアゾロン0.1%)、界面活性剤(0.1%)、安定化および干渉回避タンパク質(例えばアルブミン、ストレプトアビジン−ポリ)中、モノクローナル捕捉抗体、例えばM−18.4.34と共に、およびモノクローナルシグナル抗体としてrS−22.2.195またはS−23.4.66またはその両方と共に、試料をインキュベーションする。
b)ビオチン化された捕捉抗体(例えばM−18.4.34)と、ルテニウム標識された検出抗体であるNT−proBNP−R46Hに特異的なrS−22.2.195またはNT−proBNP−E43Dに特異的なS−23.4.66のうち1つとが、分析物と共にサンドイッチ複合体を形成する。
c)サンドイッチ複合体を、ストレプトアビジン被覆微粒子に結合し、次いで、電極の表面上に磁気により捕捉する。
d)ProCellを用いて未結合の基質を除去する。
e)電圧を電極に印加することによって化学発光の放出を誘導し、光電子増倍管によって測定する。
f)機器特異的な較正曲線を介して、NT−proBNP値を算出する。
抗体rS−22.2.195およびS−23.4.66は、変異型NT−proBNPに対し特異性が高い。
新たに作製された2種の抗体rS−22.2.195およびS−23.4.66の特異性を、実施例5に記載されるように、NT−proBNP−特異的なElecsys(登録商標)アッセイを用いて評価した。心不全患者に観察されるNT−proBNP濃度の範囲をカバーするように組換えの野生型ペプチドおよび変異型ペプチドのシリーズを用いて、ヒトNT−proBNP不含の血清をスパイクした。次いで、NT−proBNP−R46Hに特異的なrS−22.2.195(図3)またはNT−proBNP−E43Dに特異的なS−23.4.66(図4)のどちらかを用いて、試料中のNT−proBNPを検出した。
患者試料中の変異型NT−proBNP(R46H)との反応性
生来の変異型NT−proBNPとの新しい抗体の反応性を、明瞭な心不全の症状を示すことが既知であった8名の患者由来の血清または血漿の試料中で評価した(表4、患者1〜8)。R46H変異を有する患者のみを利用することができた。3名の患者について、R46H変異の存在をシークエンシングでも確認した。NT−proBNP−R46Hに特異的なrS−22.2.195をシグナル抗体として、およびM−18.4.34を捕捉抗体として用いて、実施例5に記載されたElecsy(登録商標)アッセイ系を使用して、NT−proBNPを定量した。比較のために、NT−proBNP−E43Dに特異的なS−23.4.66をシグナル抗体として、およびM−18.4.34を捕捉抗体として含有するElecsys(登録商標)キットを用いて、同じ患者試料を測定した。組換え変異型NT−proBNP(それぞれR46HまたはE43D)に基づく較正物質を用いて、両アッセイ系の較正を行った。
Claims (21)
- (a)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、および、
(b)配列番号3に示される配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、
から選択される、変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体。 - ヒツジモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- (i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む前記変異型NT−proBNPが、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含む、もしくは、
(ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む前記変異型NT−proBNPが、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項1または2に記載の抗体。 - 野生型NT−proBNPに結合しない、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- i)46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合し、軽鎖可変ドメインが、配列LLDDAY(配列番号16)を有するCDR1、配列KDSを有するCDR2、および配列LSVDSSEYSV(配列番号17)を有するCDR3を含むこと、ならびに重鎖可変ドメインが、配列GFSLIGEY(配列番号18)を有するCDR1、配列MASGGTI(配列番号19)を有するCDR2、および配列VRSSVSPGDDRDV(配列番号20)を有するCDR3を含むことを特徴とする、または、
ii)43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合し、軽鎖可変ドメインが、配列SSNVGYGNY(配列番号21)を有するCDR1、配列SATを有するCDR2、および配列VSYDSSSKFGV(配列番号22)を有するCDR3を含むこと、ならびに重鎖可変ドメインが、配列GFSVTNSG(配列番号23)を有するCDR1、配列INNDGVA(配列番号24)を有するCDR2、および配列GTRDLPSDVRYGNMYINY(配列番号25)を有するCDR3を含むことを特徴とする、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の抗体。 - Fab断片、Fab’断片、Facb断片、F(ab’)2断片、scFv断片、およびFv断片からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体の抗原結合断片。
- 検出可能な標識に連結している、請求項1〜5のいずれか1項に記載の抗体、または請求項6に記載の抗原結合断片。
- 前記検出可能な標識が、酵素、ビオチン、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、電気化学発光標識、金標識、または磁気標識である、請求項7に記載の抗体または抗原結合断片。
- 前記検出可能な標識が、ルテニウムを含む電気化学発光標識である、請求項8に記載の抗体または抗原結合断片。
- a)i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型NT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または、
b)i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または、
c)i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、または、
d)i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;およびiii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、
を含むキットまたは組成物であって、
任意選択で、a)、b)、c)、またはd)の下に規定された前記キットまたは組成物が、NT−proBNP中の異なるエピトープに結合する抗体をさらに含む、
前記キットまたは組成物。 - 前記NT−proBNP中の異なるエピトープに結合する抗体が、NT−proBNPのアミノ酸1〜35に存在するエピトープに結合する抗体である、請求項10に記載のキットまたは組成物。
- i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、もしくは、
ii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異、
を含む変異型ヒトNT−proBNP、
または、
i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの前記46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、もしくは、
ii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの前記43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異
を含む、前記変異型ヒトNT−proBNPの断片。 - 前記変異型NT−proBNPまたは断片が、精製タグまたは担体タンパク質に作動可能に連結している、請求項12記載の変異型ヒトNT−proBNPまたはその断片。
- 請求項12に記載の変異型ヒトNT−proBNPまたはその断片をコードするポリヌクレオチドであって、
前記断片が、
i)前記46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異、または、
ii)前記43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異、
を含む、
ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドが異種プロモーターに作動可能に連結している、請求項14記載の変異型ヒトNT−proBNPまたはその断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜5、7、および8のいずれか1項に記載の抗体、もしくは請求項6〜8のいずれか1項に記載の抗原結合断片を産生する、
宿主細胞。 - 請求項12に記載の変異型ヒトNT−proBNPもしくは請求項12に記載の断片、請求項14に記載のポリヌクレオチド、もしくは前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、宿主細胞。
- イムノアジュバントと、請求項12に記載の変異型ヒトNT−proBNPまたは請求項12に記載の断片とを含む組成物。
- 非ヒト動物を使用した抗体の産生のための、請求項12に記載の変異型ヒトNT−proBNPもしくは請求項12に記載の断片、または請求項18に記載の組成物の使用。
- (i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNP、もしくはその断片であって、前記断片が46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含むものである、または、
(ii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNP、もしくはその断片であって、前記断片が43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含むものである、または、
(iii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNP、もしくはその断片であって、前記断片が46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含むものである、および配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNP、もしくはその断片であって、前記断片が43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含むものである、
を含むキットまたは組成物であって、
任意選択で、前記キットまたは組成物が、野生型NT−proBNPもしくはその断片をさらに含み、前記断片が、前記野生型NT−proBNPの少なくともアミノ酸残基42〜46を含む、
前記キットまたは組成物。 - 対象における心不全を診断するための指標を提供する方法であって、
a)対象由来の血液、血清、または血漿の試料中のNT−proBNPの量を決定するステップと、
b)ステップa)で決定されたNT−proBNPの量を参照量と比較し、それによって心不全を診断するための指標を提供するステップと
を含み、
ステップa)における前記NT−proBNPの量の決定は、前記試料を少なくとも、
(i)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくは前記抗体の抗原結合断片、または、
(ii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片、および野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくは前記抗体の抗原結合断片、または、
(iii)配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの46位のアルギニンをヒスチジンに置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;および配列番号3に示されるアミノ酸配列を有する野生型NT−proBNPの43位のグルタミン酸をアスパラギン酸に置換する変異を含む変異型ヒトNT−proBNPに特異的に結合する抗体、もしくはその抗原結合断片;および野生型NT−proBNPに特異的に結合する抗体であって、前記野生型NT−proBNPのアミノ酸残基42〜46を含む野生型NT−proBNPの領域に特異的に結合する抗体、もしくは前記抗体の抗原結合断片、
と接触させるステップを含む、前記方法。
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