WO2014167826A1 - アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼ切断後のＣ末端側断片の切断面を特異的に認識する抗体及びその利用 - Google Patents

アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼ切断後のＣ末端側断片の切断面を特異的に認識する抗体及びその利用 Download PDF

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WO2014167826A1
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antibody
antigen
acid sequence
amino acid
peptide
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勉 清藤
瀬川　辰也
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株式会社免疫生物研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Definitions

  • the present invention relates to an antibody specifically recognizing a cleavage plane of a C-terminal fragment after cleavage of ⁇ -secretase of amyloid precursor protein (hereinafter referred to as “APP”), and an ⁇ CTF fragment of APP or p3 using the antibody.
  • APP amyloid precursor protein
  • the present invention relates to a peptide detection method.
  • amyloid precursor protein is sequentially degraded by ⁇ -secretase and ⁇ -secretase to produce amyloid ⁇ .
  • Accumulation of amyloid ⁇ is a characteristic of Alzheimer's disease (AD) and has been widely studied as a target for diagnosis and treatment of Alzheimer's disease.
  • APP is also known to be decomposed by ⁇ -secretase instead of ⁇ -secretase to produce a peptide called ⁇ C-terminal fragment ( ⁇ CTF).
  • ⁇ CTF ⁇ C-terminal fragment
  • ⁇ CTF is degraded by ⁇ -secretase to produce a peptide called p3.
  • APP degradation by ⁇ -secretase competes with ⁇ -secretase degradation and is therefore considered to inhibit A ⁇ accumulation.
  • An object of the present invention is to provide an antibody that specifically recognizes a cleavage product of amyloid precursor protein (hereinafter referred to as “APP”) by ⁇ -secretase.
  • an object of the present invention is to provide an antibody that specifically recognizes a C-terminal fragment of APP cleaved by ⁇ -secretase.
  • Such an antibody recognizes a C-terminal fragment of APP after cleavage with ⁇ -secretase (hereinafter referred to as “ ⁇ CTF”) and a p3 peptide produced by further degrading ⁇ CTF by ⁇ secretase.
  • an object of the present invention is to provide an antibody that specifically recognizes ⁇ CTF and p3 peptide, particularly an antibody that recognizes ⁇ CTF and p3 peptide but does not recognize ⁇ CTF and A ⁇ .
  • Another object of the present invention is to provide an antigen-binding fragment of such an antibody.
  • an object of the present invention is to provide a method for measuring ⁇ CTF and / or p3 peptide using such an antibody or antigen-binding fragment thereof, and a measurement kit.
  • the present inventors prepared various antigens in order to obtain antibodies specifically recognizing a cleaved surface of ⁇ CTF, including p3 and ⁇ CTF, by ⁇ -secretase (hereinafter referred to as “ ⁇ -secretase cleaved surface”).
  • a peptide having an amino acid sequence of LVFFAEC (SEQ ID NO: 12), which is a peptide in which a cysteine residue is added to the C-terminus of a peptide consisting of 6 amino acids derived from the cut surface as an antigen as a result of extensive studies by immunizing mice
  • LVFFAEC LVFFAEC
  • the present invention relates to the invention described in the following (1) to (11): (1) An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the ⁇ -secretase cleavage surface of ⁇ CTF. (2) The antibody or antigen-binding fragment thereof according to (1), which specifically recognizes ⁇ CTF and p3 peptide. (3) The antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, which does not recognize one or more proteins or peptides selected from the following i) to iii): i) ⁇ -secretase cleavage product of APP, ii) amyloid ⁇ , iii) APP.
  • VL light chain variable region
  • GKN amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 22
  • HASQNINVWLS amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23
  • QQGQS amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (1) to (6) which is the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of (i) to (iii) below: : (I) an amino acid encoded by a nucleic acid sequence in which VH hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 (or the amino acid sequence underlined in FIG. 5A) A nucleic acid sequence having a sequence and VL that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 27 (or the amino acid sequence underlined in FIG.
  • An antibody having an amino acid sequence or an antigen-binding fragment thereof (Ii) Amino acid whose VH has 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (or the amino acid sequence underlined in FIG. 5A) And VL is 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27 (or the amino acid sequence underlined in FIG. 6) An antibody having an amino acid sequence or an antigen-binding fragment thereof; (Iii) VH has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 (or the amino acid sequence underlined in FIG.
  • VL has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 (or the underline in FIG. 6) Antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • APP is a cell surface protein having a single transmembrane region, also called ⁇ -amyloid precursor protein.
  • APP695 SEQ ID NO: 1
  • APP756 SEQ ID NO: 2
  • APP770 SEQ ID NO: 3
  • the amino acids at the ⁇ -secretase cleavage site in these APPs The sequence is conserved and the APP herein may be any such isoform.
  • APP is known to undergo primary cleavage by ⁇ -secretase or ⁇ -secretase, followed by secondary cleavage by ⁇ -secretase.
  • FIG. 1 shows an outline of the cleavage of APP by each secretase and the cleavage product.
  • a soluble fragment sAPP ⁇ , not shown
  • a membrane-bound fragment ⁇ CTF
  • C-terminal fragment after cleavage of APP with ⁇ -secretase or “ ⁇ CTF” means this membrane-bound fragment on the C-terminal side, which usually consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8. .
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is characterized by specifically recognizing the ⁇ -secretase cleavage surface (N-terminal side) of ⁇ CTF, it can recognize ⁇ CTF.
  • ⁇ CTF is subsequently degraded in its membrane-bound region by ⁇ -secretase, generating a p3 peptide as an N-terminal fragment. It is known that there are multiple cleavage sites by ⁇ -secretase.
  • p3 peptide generated by degradation with ⁇ -secretase at a position corresponding to A ⁇ 40 is p3-40 (SEQ ID NO: 9) (because it consists of a sequence corresponding to amino acids 17 to 40 of A ⁇ .
  • P3 peptide (SEQ ID NO: 10) (corresponding to amino acids 17 to 42 of A ⁇ ), which is generated by degradation with ⁇ -secretase at a position corresponding to A ⁇ 42.
  • P3 peptide produced by degradation with ⁇ -secretase at a position corresponding to A ⁇ 43 is represented by p3-43 (SEQ ID NO: 11) (from 17 of A ⁇ ). Since it consists of a sequence corresponding to the 43rd amino acid, it is also expressed as “A ⁇ 17-43”.
  • the antibody and antigen-binding fragment thereof of the present invention are characterized by specifically recognizing the ⁇ -secretase cleavage plane of p3 (the N-terminus of the p3 peptide, shown as “anti ⁇ CTF antibody” in FIG. 1). Regardless of the ⁇ -secretase cleavage position (C-terminal side), any p3 peptide is recognized. Therefore, in this specification, p3 peptide includes all these p3 peptides. That is, the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention preferably recognizes all these p3 peptides.
  • C-terminal fragment after cleavage of APP with ⁇ -secretase or “ ⁇ CTF” means, for example, the membrane-bound fragment on the C-terminal side consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in humans. means. ⁇ CTF is subsequently degraded in the membrane-bound region by ⁇ -secretase to produce amyloid ⁇ (A ⁇ ) as an N-terminal fragment.
  • a ⁇ 40 (SEQ ID NO: 5) consisting of 40 peptides (also expressed as “A ⁇ 1-40” because it consists of the 1st to 40th amino acid sequences of A ⁇ ) depending on the position to be degraded by ⁇ -secretase
  • 42 A ⁇ 42 (SEQ ID NO: 6) comprising the peptides of (A ⁇ 1-42 ”because it comprises the amino acid sequences 1-42 of A ⁇ )
  • a ⁇ 43 SEQ ID NO: 7 comprising 43 peptides (A ⁇ From the 1st to 43rd amino acid sequences, it is reported that (also expressed as “A ⁇ 1-43”) is generated.
  • a ⁇ includes all these A ⁇ s. Since these A ⁇ do not have a cleavage plane of APP by ⁇ -secretase, the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof preferably does not recognize ⁇ CTF and all these A ⁇ s.
  • the origin of APP, ⁇ CTF, and p3 peptide in the present specification is not particularly limited as long as it is derived from a mammal, and may be derived from, for example, a mouse, a rat, a hamster, a rabbit, or a human.
  • mouse and rat APP have 100% identity with human APP in the amino acid sequence in the vicinity of the ⁇ -site (particularly the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13).
  • Human, mouse, and rat ⁇ CTF and p3 peptides can also be recognized. Therefore, the origin of APP, ⁇ CTF, and p3 peptide is preferably derived from mouse, rat, and human, and more preferably derived from human.
  • ⁇ -secretase refers to a proteolytic enzyme involved in primary cleavage of APP, and examples thereof include ADAM10 and ADAM17. ⁇ -secretase cleaves APP in the extracellular region near the membrane. In the present specification, the degradation site of ⁇ -secretase in APP is referred to as “ ⁇ -site”. “ ⁇ -secretase” refers to a proteolytic enzyme involved in the secondary cleavage of APP, and examples thereof include presenilin. Presenilin is located on presenilin 1 and chromosome 1 on chromosome 14, and includes presenilin 2 that causes the Bolgagerman family and the like.
  • Presenilin is a 6-8 transmembrane membrane protein. Degradation by ⁇ -secretase is induced by degradation by ⁇ -secretase. ⁇ -secretase cleaves APP ( ⁇ CTF) at the intermembrane region. In the present specification, the degradation site of ⁇ -secretase in APP ( ⁇ CTF) is referred to as “ ⁇ -site”.
  • the present invention relates to an antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the ⁇ -secretase cleavage surface of ⁇ CTF.
  • cleaved surface of ⁇ -secretase by c-terminal fragment of APP after cleaving with ⁇ -secretase meanss an amino acid near the ⁇ -secretase cleavage site ( ⁇ -site) (N-terminal) in ⁇ CTF (hereinafter, sometimes referred to as “ ⁇ CTF (N) cleavage plane”).
  • amino acid near the ⁇ -secretase cleavage site in ⁇ CTF refers to 3 (LVF: SEQ ID NO: 14) to 10 (LVFFAEDVGS: SEQ ID NO: 15) from ⁇ -site (N-terminal) in ⁇ CTF.
  • LVFFAEDVGS SEQ ID NO: 15
  • Amino acid most preferably 6 amino acids (LVFFAE: SEQ ID NO: 13).
  • the peptide having an ⁇ CTF (N) cut surface means a peptide having an amino acid sequence near the ⁇ -site.
  • an antibody that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface may be referred to as an “anti- ⁇ CTF (N) antibody”.
  • the antibody has an amino acid near the ⁇ -site. As long as it recognizes, you may couple
  • the candidate antibody or antigen-binding fragment thereof recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface may be confirmed by any of Western blotting, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, and ELISA.
  • immunoprecipitation or ELISA Preferably, immunoprecipitation or ELISA, and most preferably ELISA. Therefore, the anti- ⁇ CTF antibody of the present invention is preferably an antibody capable of detecting a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage surface by immunoprecipitation or ELISA.
  • recombinant human p3-40 or p3-42 is treated with 2% SDS, 10% glycerol. This can be confirmed by dissolving in 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM dithiothreitol solution, boiling and performing Western blot analysis with an anti-His antibody and a test antibody.
  • the tissue containing blood vessels is fixed in paraffin for 3-5 days in 4% paraformaldehyde. Embed and cut to 5 ⁇ m thickness on microtome according to conventional methods. Paraffin is removed from tissue sections, hydrated, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then treated with formic acid for a short time. In order to prevent endogenous peroxidation, the cells are allowed to stand in methanol containing 3% hydrogen peroxide, then the sections are blocked with PBS containing 10% normal goat serum, and left overnight at 4 ° C. together with the test antibody.
  • PBS phosphate buffered saline
  • an ELISA system described below is constructed and implemented using the test antibody or its antigen-binding fragment, and detected. This can be done by determining whether or not.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface.
  • the antigen-binding fragment thereof of the antibody of the present invention specifically binds to a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane (preferably ⁇ CTF and / or p3 peptide, the same applies hereinafter in this paragraph).
  • a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane preferably ⁇ CTF and / or p3 peptide, the same applies hereinafter in this paragraph.
  • “specifically recognizes a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane or specifically binds to a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane” has an ⁇ CTF (N) cleavage plane.
  • APP ⁇ -secretase eg ⁇ CTF and A ⁇
  • ⁇ -secretase uncleaved APP Means that.
  • the antibody and antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cleavage surface of the present invention preferably specifically binds to a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage surface, but the ⁇ - ⁇ of APP -An antibody or antigen-binding fragment thereof that does not bind to a peptide having a cleavage plane after cleavage by secretase (for example, ⁇ CTF and A ⁇ ), or a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane, but specifically binds to APP ( An antibody or an antigen-binding fragment thereof that does not bind to (APP not cleaved by ⁇ -secretase).
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof specifically binds to a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage surface, but has a cleavage surface after cleavage by APP ⁇ -secretase (for example, ⁇ CTF and An antibody or antigen-binding fragment thereof that does not bind to both A ⁇ ) and APP.
  • a candidate antibody or an antigen-binding fragment thereof recognizes a peptide having a cleavage plane after cleavage by ⁇ -secretase (for example, ⁇ CTF and A ⁇ ) and / or APP is determined by the above Western blotting, immunoprecipitation, immunohistochemistry Although it may be confirmed by any method of staining and ELISA, immunoprecipitation or ELISA is preferable, and ELISA is most preferable.
  • does not bind or “does not recognize” refers to a protein or peptide that is not bound or not recognized in comparison with the binding of a test antibody to a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane (APP This includes a case where the binding of a test antibody to a peptide having a cleavage plane after cleavage by ⁇ -secretase and / or APP, etc.) is sufficiently distinguishable.
  • N ⁇ CTF
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cleavage surface of the present invention has a cleavage surface after cleavage with APP ⁇ -secretase compared to a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage surface.
  • the cross-reaction rate with peptides having (for example, ⁇ CTF and A ⁇ ) and / or APP is, for example, 1% or less, 0.5% or less, 0.3% or less, 0.1% or less, 0.05% or less, It may be 0.03% or less.
  • the cross reaction rate can be examined, for example, by the following method.
  • ELISA was performed using the labeled test antibody as a detection antibody, and a calibration curve using p3-40 peptide as the test sample And the concentration of the peptide to be compared (A ⁇ 40, etc.) measured by the ELISA and the concentration calculated by the calibration curve, ⁇ (concentration measured by ELISA for the peptide to be compared (actual value)) / (Addition sample concentration of peptide to be compared) ⁇ 100% ⁇ .
  • a plate on which an antibody specifically recognizing the C-terminus of p3-42 is immobilized ELISA is performed using the labeled test antibody as a detection antibody, and p3-42 peptide is used as a test sample.
  • ELISA is performed using the labeled test antibody as a detection antibody
  • p3-42 peptide is used as a test sample.
  • a calibration curve is prepared using ⁇ CTF as a test sample, and a peptide to be compared ( ⁇ CTF, etc.) is measured by the ELISA. After calculating the concentration using the calibration curve, ⁇ (concentration measured by ELISA for the peptide to be compared (actual value)) / (added sample concentration of the peptide to be compared) ⁇ 100% ⁇ Can be obtained.
  • the antibody of the present invention may be polyclonal or monoclonal as long as it can specifically recognize the ⁇ CTF (N) cut surface, but is preferably a monoclonal antibody.
  • “monoclonal antibody” means an antibody derived from a single clone.
  • the antibodies of the present invention include bispecific antibodies and single chain antibodies as long as they retain the binding activity to the antigen in addition to the complete antibody. Whether the antigen-binding antibody fragment of the antibody retains the binding activity with the antigen can be confirmed according to the means for confirming whether the candidate antibody recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface.
  • Complete antibodies include non-human animal antibodies, non-human animal antibody amino acid sequences and human-derived antibody amino acid sequences, and human antibodies.
  • Non-human animal antibodies include, for example, antibodies such as mice, rats, hamsters and rabbits, preferably animal antibodies capable of producing hybridomas, more preferably mouse antibodies.
  • Examples of antibodies having amino acid sequences of non-human animal antibodies and human-derived antibodies include human chimeric antibodies in which the antigen-binding domain Fv of animal-derived monoclonal antibodies is replaced with human antibodies, antigens of animal-derived antibody monoclonal antibodies
  • a humanized antibody in which CDR, which is a sequence on the Fv domain directly involved in binding, is incorporated in the frame of a human antibody can be mentioned.
  • a human antibody is a human antibody that is an expression product of a completely human-derived antibody gene.
  • the immunoglobulin class of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be any immunoglobulin class of IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, and IgY, preferably IgG.
  • the antibody of the present invention encompasses antibodies of any isotype.
  • the present invention also includes antigen-binding fragments of the antibodies of the present invention.
  • the antigen-binding fragment of an antibody means an antibody fragment that retains the activity of recognizing the ⁇ CTF (N) cleavage plane, and F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, single chain Fv (scFv) A disulfide bond Fv (dcFv) or a polymer thereof, a dimerized V region (including a dimerized V region having two or more specificities).
  • scFv single chain Fv
  • dcFv disulfide bond Fv
  • reference to an antibody of the present invention is meant to include the antigen-binding fragment, even if not explicitly stated.
  • the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof has an epitope (for example, an amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 13 to 19, preferably LVFFAE ( An antibody or antigen-binding fragment thereof that recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13) as an antigen.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24 and 25.
  • the present invention is a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24 and 25 as CDRs.
  • the present invention relates to CDRH1, CDRH2 and CDRH3, and CDRL1, CDRL2 and CDRL3 have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24 and 25, respectively, or It is a monoclonal antibody consisting of these amino acid sequences.
  • the present invention includes a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof, in which VH has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 and VL has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27.
  • the present invention includes a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof in which the H chain consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 and the L chain consists of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 31.
  • the present invention provides the following (i) or (ii) antibody or antigen-binding fragment thereof; two or three characteristics selected from the following (i) to (iii): An antibody or antigen-binding fragment thereof; and one or more characteristics selected from the following (i) to (iii) and one or more characteristics selected from (iv) to (vii): Including an antibody or antigen-binding fragment thereof:
  • VH has an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 26, and VL is in SEQ ID NO: 27
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof having an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence encoding the described amino acid sequence
  • VH has an amino acid sequence having 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% homology with
  • hybridize under stringent conditions means to hybridize under hybridization conditions usually used by those skilled in the art. For example, whether or not to hybridize can be determined by a method described in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
  • hybridization conditions are 6 ⁇ SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M trisodium citrate) or 6 ⁇ SSPE (3 M NaCl, 0.2 M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA ⁇ 2Na, pH 7.4).
  • the condition may be such that the medium is hybridized at 42 ° C. and then washed at 42 ° C. with 0.5 ⁇ SSC.
  • the homology of an amino acid sequence can be determined using well-known programs, such as BLAST and FASTA, for example.
  • the present invention also includes a nucleic acid construct encoding the amino acid sequence of the above-described antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, a vector containing the nucleic acid construct, and a host cell carrying the vector.
  • the nucleic acid construct of the present invention may contain a nucleic acid encoding a signal sequence, if necessary. Examples of such a signal sequence include the amino acid sequence (VH) described in SEQ ID NO: 32 or the amino acid sequence (VL) described in SEQ ID NO: 33.
  • the nucleic acid construct of the present invention includes a polynucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 28 (heavy chain) and / or a polynucleotide having the base sequence described in SEQ ID NO: 30 (light chain), or A polynucleotide (heavy difference variable region) having a base sequence of 133rd to 468th of SEQ ID NO: 28 (76th to 468th of SEQ ID NO: 28 when a signal sequence is included) and / or 112th of SEQ ID NO: 30
  • Examples thereof include a polynucleotide (light chain variable region) having a base sequence of ⁇ 432 (the 52nd to 432 of SEQ ID NO: 30 when a signal sequence is included).
  • the present invention is for measuring a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane, which contains an antibody or an antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cleavage plane of the present invention.
  • the kit of the present invention is a kit for measuring ⁇ CTF and / or p3 peptide, which contains an antibody that recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface or an antigen-binding fragment thereof.
  • the kit of the present invention comprises an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to a target protein (a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage surface).
  • the antibody may be of any structure, size, immunoglobulin class, origin, etc. as long as it binds to the target protein.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof included in the kit of the present invention may be monoclonal or polyclonal, but at least one contains a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the first reagent which is a monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface, and a ⁇ -site
  • a second reagent that is an antibody (eg, a monoclonal antibody or a polyclonal antibody) that binds to a nearby amino acid sequence may be included.
  • the antibody or antibody fragment contained in the kit of the present invention may be appropriately labeled.
  • the kit of the present invention comprises an isolated nucleic acid construct encoding the amino acid sequence of the antibody or an antigen-binding fragment thereof, instead of the monoclonal antibody that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface, and the nucleic acid construct.
  • the vectors to be included and the cells carrying the vectors may also be included.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface provided in the kit of the present invention, any of the above-described antibodies or antigen-binding fragments thereof can be used.
  • the kit of the present invention preferably contains a carrier selected from the group consisting of a solid phase, a hapten, and an insoluble carrier.
  • the measurement kit of the present invention can be based on a known method using an antibody molecule.
  • the kit of the present invention include a kit for enzyme immunoassay (EIA method), a kit for simple EIA method, a kit for enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method), a radioimmunoassay method (kit for RIA method), a fluorescence Labeled immunoassay kits such as immunoassay (FIA) kits; immunoblotting kits such as Western blotting kits; immunochromatography kits such as gold colloid aggregation kits; ion exchange chromatography Kits for chromatographic methods such as kits and kits for affinity chromatography; kits for turbidimetric method (TIA method); kits for specific wax method (NIA method); kits for colorimetric method; kits for latex agglutination method (LIA method); Kit for particle
  • the kit of the present invention comprises (i) an amino acid in the vicinity of the ⁇ -site of a fragment on the N-terminal side after cleavage of ⁇ CTF with ⁇ -secretase (preferably cleaved product of ⁇ CTF with ⁇ -secretase) (The C-terminal of the N-terminal side peptide), the same applies hereinafter)
  • the same is applied to the solid phase or hapten on which the first antibody is immobilized
  • the second is a labeled anti- ⁇ CTF (N) antibody It can be set as the kit of the immunochemical measurement containing an antibody.
  • the kit of the present invention may further contain a solid phase on which a substance that specifically binds to the hapten is immobilized.
  • the first antibody and the second antibody recognize different sites of the p3 peptide.
  • the first antibody to be immobilized may be an anti- ⁇ CTF (N) antibody
  • the second antibody to be labeled may be an antibody that binds to a p3 peptide.
  • the kit of the present invention comprises (i) a solid phase on which a first antibody that is an antibody that binds to a p3 peptide is immobilized, and (ii) a hapten on which a second antibody that is an anti- ⁇ CTF (N) antibody is immobilized.
  • An immunochemical measurement kit comprising The kit may further contain a labeled substance that specifically binds to the hapten.
  • the first antibody immobilized on the solid phase may be an anti- ⁇ CTF (N) antibody
  • the second antibody immobilized on the hapten may be an antibody that binds to the p3 peptide.
  • the kit of the present invention comprises (i) an insoluble carrier on which a first antibody that binds to a p3 peptide is immobilized, and (ii) an insoluble carrier on which a second antibody that is an ⁇ CTF (N) antibody is immobilized.
  • An immunochemical measurement kit comprising
  • the first antibody may be a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof
  • the second antibody may be a polyclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof
  • the first antibody may be a polyclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof
  • the second antibody may be a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof, or both the first and second antibodies may be a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the kit of the present invention include a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof, in which either the first or second antibody has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 20, 21, 22, 23, 24, and 25.
  • the other antibody specifically detects the amino acid in the vicinity of the ⁇ -site of the N-terminal fragment after cleavage of ⁇ CTF with ⁇ -secretase (the C-terminal of the N-terminal peptide of the cleaved product of ⁇ CTF with ⁇ -secretase).
  • the kit which is the monoclonal antibody or polyclonal antibody which recognizes, or those antigen binding fragments can be mentioned.
  • the solid phase is not particularly limited as long as it can be used for immunochemical measurement.
  • the insoluble carrier means a suspendable insoluble solid
  • kits of the present invention contains a labeled antibody or an antigen-binding fragment thereof, a detectable label such as a radioactive label, an enzyme, a fluorescent label, a bioluminescent label, or a chemiluminescent label metal is used as the label.
  • a detectable label such as a radioactive label, an enzyme, a fluorescent label, a bioluminescent label, or a chemiluminescent label metal is used as the label.
  • labels include, but are not limited to, radiolabels such as 32 p3H, 125 I, and 14 C; ⁇ -galactosidase, peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, lactate oxidase, alcohol oxidase, Enzymes such as monoamine oxidase and horseradish peroxidase; coenzymes or prosthetic groups such as FAD, FMN, ATP, biotin and heme; fluorescein derivatives (fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein ovalbamyl etc.), rhodamine derivatives (tetramethyl) Rhodamine, trimethylrhodamine (RITC), Texas red, rhodamine 110, etc.), Cy dyes (Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7), Cy-chrome, spectrum Fluorescent labeling such as chloroquine, spectrum orange, propidium iodide, allophyco
  • the kit of the present invention may contain a coloring reagent, a reaction stopping reagent, a standard antigen reagent, a sample pretreatment reagent, a blocking reagent and the like, if necessary.
  • a coloring reagent a reaction stopping reagent
  • a standard antigen reagent a sample pretreatment reagent
  • a blocking reagent a blocking reagent and the like.
  • the kit of the present invention may further contain a substrate that reacts with the label.
  • the kit of the present invention may include a package for storing the components of the kit such as a paper box or a plastic case, an instruction manual, and the like.
  • a tissue sample or liquid collected from a subject as a biopsy can be used.
  • the biopsy used is not particularly limited as long as it is an object of the immunological measurement of the present invention.
  • Analysis by the kit of the present invention can be performed qualitatively, quantitatively or semi-quantitatively.
  • the lanes 1 to 4 indicate ⁇ CTF 500 fmol, ⁇ CTF 500 fmol, ⁇ CTF 50 fmol, and ⁇ CTF 50 fmol in order.
  • the graph shows the results using 1A10 antibody, 44A3 antibody, and anti-APP-C antibody (Anti-APP-C) from the left.
  • the upper part of each graph is a schematic diagram showing the recognition site of each antibody.
  • HEK293 cells stably expressing Human APP Swedish mutation In the presence / absence of BACE inhibitor (KMI-574) and / or ⁇ -secretase inhibitor (DAPT), HEK293 cells stably expressing Human APP Swedish mutation, HEK293 stably expressing Human APP Wild type 4 is a graph showing the results of measuring the concentrations of p3-40 and p3-42 in the culture supernatant of cell culture using the p3-40 ELISA kit and p3-42 ELISA kit.
  • the dark gray graph shows the culture supernatant (APP sw HEK sup) of HEK293 cells stably expressing the Human APP Swedish mutation, and the light gray graph is on the culture of HEK293 cells stably expressing the Human APP Wildtype.
  • the graph shows DAPT added, KMI-574 added, DAPT and KMI-574 added, and control (DAPT not added and KMI-574 not added).
  • the vertical axis represents the respective concentrations (pg / mL) of p3-40 and p3-42.
  • the italics indicate the signal sequence
  • the underlined portion indicates the amino acid sequence of the variable region
  • the shaded area indicates the amino acid sequence of the CDR.
  • 5A It is a figure which shows the amino acid sequence and nucleic acid sequence of the light chain of 2G2 antibody.
  • the italics indicate the signal sequence
  • the underlined portion indicates the amino acid sequence of the variable region
  • the shaded area indicates the amino acid sequence of the CDR.
  • the antibody of the present invention for example, a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 as necessary, an immunostimulant (for example, mineral oil or aluminum precipitate and heat-killed bacteria or lipopolysaccharide, Freund's complete adjuvant, Alternatively, it can be prepared by immunizing non-human mammals or birds together with Freund's incomplete adjuvant or the like.
  • the immunogen used for the production of the antibody of the present invention is to introduce an expression vector containing cDNA encoding a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 into E. coli, yeast, insect cells, animal cells, etc. for expression. Can be obtained.
  • the peptide which has an amino acid sequence of sequence number 12 can be produced by chemical synthesis using Fmoc method or Boc method. Moreover, the peptide which has an amino acid sequence of sequence number 12 can also be synthesize
  • the animal is immunized with the antigen by dissolving the antigen in a sodium phosphate buffer (PBS) and, if necessary, an immunostimulant (eg, mineral oil or aluminum precipitate and heat-killed bacteria or lipopolysaccharide, Freund's).
  • an immunostimulant eg, mineral oil or aluminum precipitate and heat-killed bacteria or lipopolysaccharide, Freund's.
  • Immunization of a non-human mammal for example, rabbit, rat, mouse, etc.
  • a bird together with a complete adjuvant or Freund's incomplete adjuvant.
  • Administration of the immunogen to the animal can be performed, for example, by subcutaneous and intradermal injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, or footpad injection.
  • the amount of the immunogen used is not particularly limited as long as it is an amount capable of producing an antibody, but is preferably 0.1 to 1000 ⁇ g, more preferably 1 to 500 ⁇ g, and still more preferably 10 to 100 ⁇ g. Immunization can be performed once or several times at appropriate intervals. Preferably, immunization once per 1 to 5 weeks can be performed a plurality of times (preferably 2 to 5 times in total). Polyclonal antibodies can be obtained by purification from the sera of animals that exhibit a sufficient antibody titer.
  • Monoclonal antibodies can be produced by culturing hybridomas obtained by fusing antibody-producing cells obtained from the spleen or the like of an immunized animal immunized by the above method with myeloma cells (myeloma cells). It can. Examples of the fusion method include the method of Milstein et al. (Galfre, G. & Milstein, C., Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981). Monoclonal antibodies should be purified using protein A or protein G columns (IgG), mercaptopyridine ligand columns (IgY and IgM), antigen-immobilized columns, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, etc. You can also.
  • VH has an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26, and VL
  • VH is the amino acid of SEQ ID NO: 26 Having an amino acid sequence having 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, or 99% homology with the sequence, and VL is 80%, 85%, 90 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27
  • CDRH1, CDRH And CDRH3, and CDRL1, CDRL2 and CDRL3 have the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO:
  • the antibody of the present invention comprises a DNA encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 26 (which may have the signal sequence shown in SEQ ID NO: 32) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 27 (SEQ ID NO: 33). Or a DNA having the nucleic acid sequence described in SEQ ID NOs: 28 and 30 and synthesizing DNA having the signal sequence described in SEQ ID NO: 29. And an H chain and an L chain having the amino acid sequence described in 31 can be obtained.
  • DNA encoding VH and VL of a non-human animal monoclonal antibody (for example, 2G2 monoclonal antibody) that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface is prepared, It can be obtained by binding to a constant region cDNA of human immunoglobulin and incorporating it into an expression vector, introducing the vector into an appropriate host cell and expressing it (Morrison, SL, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984).
  • the antibody of the present invention is a humanized antibody
  • the amino acid sequence encoding the CDRs of VH and VL of a non-human animal monoclonal antibody (for example, 2G2 monoclonal antibody) that specifically recognizes the ⁇ CTF (N) cut surface is human antibody.
  • DNA encoding the V region transplanted into the VH and VL FRs of the above is constructed, the constructed DNA is combined with a human-derived immunoglobulin constant region cDNA and incorporated into an expression vector, and the vector is introduced into an appropriate host cell.
  • the CDR of the non-human animal monoclonal antibody includes the amino acid sequence predicted from the DNA sequence encoding the VH and VL of the non-human animal monoclonal antibody obtained by the above-described method, the entire amino acid sequence of VH and VL of the known antibody, Can be obtained by comparing.
  • the amino acid sequence of a known antibody can be obtained from the amino acid sequence of an antibody registered in a database such as a protein data bank.
  • the FR of the humanized antibody is not particularly limited as long as the antibody after transplantation exerts the effects of the present invention, but preferably the variable region of the humanized antibody (hereinafter referred to as “V region”). It is a human antibody FR having a three-dimensional structure similar to the V region of the non-human animal monoclonal antibody from which the CDR is derived, or a human antibody FR highly homologous to the amino acid sequence of the FR of the non-human animal monoclonal antibody to be used. In humanized antibodies, some of the amino acids constituting FRs derived from human antibodies (particularly, amino acids present sterically close to CDRs) are non-human animal monoclonal antibodies from which CDRs are derived as necessary.
  • the DNA sequence encoding the V region of the humanized antibody to be used is designed as a DNA sequence corresponding to the amino acid sequence obtained by combining the CDR amino acid sequence of the non-human animal monoclonal antibody and the FR amino acid sequence of the human antibody.
  • DNA encoding the V region of a humanized antibody can be prepared by a method well known to those skilled in the art based on the designed DNA sequence.
  • Human antibodies can be obtained, for example, by using a human antibody phage library or a human antibody-producing transgenic mouse (Tomitsuka et al., Nature Genet., 15, 146-156 (1997)).
  • a human antibody phage library for example, a peptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is immobilized on a solid phase, reacted with the phage antibody library, washed away and removed unbound phage, and then bound.
  • the desired clone can be obtained by panning the recovered phage.
  • a human antibody-producing transgenic mouse is a mouse in which an Ig gene of a human antibody is introduced into a mouse in which an endogenous immunoglobulin (Ig) gene is knocked out.
  • an antigen preferably a peptide having an epitope sequence recognized by the antibody of the present invention
  • ⁇ CTF N
  • a human antibody that specifically recognizes the cut surface can be obtained.
  • F (ab ′) 2 fragments (antibody fragments having an antigen binding activity with a molecular weight of about 100,000) can be obtained by treating the IgG antibody of the present invention (for example, 2G2 monoclonal antibody) with pepsin.
  • the Fab ′ fragment can be obtained by treating F (ab ′) 2 obtained by the above-described method with dithiothreitol.
  • the Fab ′ fragment of the present invention can be obtained from DNA encoding Fab ′ of the antibody of the present invention.
  • the Fab fragment can be obtained by treating the antibody of the present invention with papain.
  • the scFv can be obtained by inserting a DNA encoding a linker sequence between cDNAs encoding the VH and VL of the antibody of the present invention to construct a DNA encoding scFv.
  • the length of the linker is not particularly limited as long as VH and VL can associate with each other, but is preferably 10 to 20 residues, and more preferably 15 residues.
  • the linker sequence is not particularly limited as long as it does not inhibit the folding of the polypeptide chains of the two domains of VH and VL, but is preferably a linker consisting of glycine and / or serine, more preferably , GGGGS (G: glycine, S: serine) (SEQ ID NO: 34) or a repetitive sequence thereof.
  • dsFv can be obtained by substituting one cysteine residue in each of VH and VL with a cysteine residue and connecting the cysteine residues with a disulfide bond.
  • Diabody can be obtained by constructing the above-mentioned scFv-encoding DNA such that the amino acid sequence of the linker is 8 residues or less (preferably 5 residues).
  • Bispecific diabody can be obtained by preparing scFv by combining VH and VL DNAs of two different types of scFv.
  • the nucleic acid of the present invention is obtained by cloning from the above-obtained antibody-producing hybridoma, or by appropriately designing the nucleic acid sequence based on the amino acid sequence of the antibody or antigen-binding fragment obtained above. be able to.
  • the vector of the present invention can be obtained by appropriately incorporating the obtained nucleic acid into a vector suitable for expression.
  • the vector of the present invention may contain a region (promoter, enhancer, terminator, etc.) necessary for expression in addition to the nucleic acid of the present invention.
  • the host cell of the present invention can be obtained by introducing the vector of the present invention into an appropriate cell line (for example, animal cells, insect cells, plant cells, yeast, microorganisms such as E. coli).
  • the label can be bound to the antibody or the antigen-binding fragment thereof by a method generally used in the art. For example, when fluorescently labeling a protein or peptide, after washing the protein or peptide with a phosphate buffer, a dye adjusted with DMSO, buffer, etc. is added, mixed, and then allowed to bind at room temperature for 10 minutes. be able to.
  • a biotin labeling kit (Biotin Labeling Kit-NH2, Biotin Labeling Kit-SH: Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.), an alkaline phosphatase labeling kit (Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2, Alkaline Phosphatase Kit-NH2).
  • the present invention also relates to a p3 peptide or ⁇ CTF measurement kit containing an anti- ⁇ CTF (N) antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the kit of the present invention uses an antibody or antigen-binding fragment thereof (or labeled antibody or antigen-binding fragment thereof) prepared according to the above-described method, and is used for enzyme immunoassay (EIA method), simplified EIA method, enzyme-linked immunosorbent.
  • Labeled immunoassay methods such as solvent assay method (ELISA method), radioimmunoassay method (RIA method), fluorescence immunoassay method (FIA method); immunoblotting method such as Western blotting method; immunochromatography method such as colloidal gold aggregation method; Chromatographic methods such as ion exchange chromatography and affinity chromatography; turbidimetric method (TIA method); specific wax method (NIA method); colorimetric method; latex aggregation method (LIA method); particle counting method (CIA method); Luminescence measurement method (CLIA method, CLEIA method); precipitation reaction method; surface plasmon resonance method (SPR method) Resonant Mirror Detector method (RMD method); it may be prepared using conventional techniques known to those skilled in the art as a kit for comparison interferometry.
  • ELISA method solvent assay method
  • RIA method radioimmunoassay method
  • FFA method fluorescence immunoassay method
  • immunoblotting method such as Western blotting method
  • the kit of the present invention comprises a plate on which a polyclonal antibody that binds to p3 peptide or ⁇ CTF or an antigen-binding fragment thereof is immobilized, a biotin-labeled anti- ⁇ CTF (N) antibody solution, a streptavidin POD solution, a washing solution, TMB It can be produced as a kit comprising a reagent, 2M HCl, and a standard substance (p3 peptide, ⁇ CTF peptide or a peptide consisting of an amino acid sequence recognized by the antibody contained in the kit).
  • the kit of the present invention includes an anti- ⁇ CTF (N) antibody or an antigen-binding fragment thereof, a monoclonal antibody (or antigen-binding fragment thereof) binding gold colloid that binds to p3 peptide or ⁇ CTF, a rabbit immunoglobulin-binding gold. It can be manufactured as a kit comprising a colloid and a test plate.
  • the test plate comprises a specimen collecting part for inserting a specimen, a sensitized gold colloid coating part containing a monoclonal antibody (or antigen-binding fragment thereof) binding gold colloid specifically recognizing the ⁇ CTF (N) cut surface, p3 It comprises a determination part (test line) containing a monoclonal antibody (or antigen-binding fragment thereof) that binds to a peptide or ⁇ CTF, a determination part (reference line) containing an anti-rabbit immunoglobulin polyclonal antibody, an absorbent, and a membrane filter. Also good.
  • a monoclonal antibody that binds to p3 peptide or ⁇ CTF and an anti- ⁇ CTF antibody may be used for the reverse purpose.
  • the present invention comprises a step of contacting a sample with the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, and measuring a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage surface bound to the antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof. And a method for measuring a peptide having an ⁇ CTF (N) cut surface in a specimen.
  • the peptide having a cleavage plane after cleavage with ⁇ -secretase is not particularly limited as long as it is a peptide having an amino acid sequence near the ⁇ -site defined above. Examples include p3 peptide and ⁇ CTF.
  • the measurement method of the present invention may be performed in vitro or in vivo, but is preferably performed in vitro.
  • “measurement of a peptide having an ⁇ CTF (N) cut surface” can be performed based on a known method using an antibody molecule.
  • examples of such methods include enzyme immunoassay (EIA method), simplified EIA method, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method), radioimmunoassay (RIA method), fluorescent immunoassay (FIA method) and the like.
  • immunoblotting method such as Western blotting method
  • immunochromatography method such as colloidal gold aggregation method
  • chromatography method such as ion exchange chromatography method and affinity chromatography method
  • TIA method turbidimetric method
  • TIA method turbidimetric method
  • Colorimetric method Colorimetric method
  • Latex aggregation method LIA method
  • Particle counting method CIA method
  • Chemiluminescence measurement method CLIA method, CLEIA method
  • Precipitation reaction method SPR method
  • SPR method Surface plasmon resonance method
  • RMD method Resonant Mirror detector method
  • the method for measuring a peptide having an ⁇ CTF (N) cut surface in a specimen of the present invention can be performed by, for example, the following steps: (A) preparing a sample suitable for detection by an antibody; (B) contacting the sample with an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes at least one ⁇ CTF (N) cut surface; (C) measuring the binding of the peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage surface to the antibody or antigen-binding fragment thereof to detect or quantify the peptide having the ⁇ CTF (N) cleavage surface in the sample; (D) determining the presence or level of a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane in the specimen;
  • the step of contacting the sample with an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes at least one ⁇ CTF (N) cleavage plane and “binding of the protein to the antibody or antigen-binding fragment thereof”
  • the step of measuring or detecting or quantifying a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage surface in a sample is performed on an antibody that binds to a p3 peptide immobilized on a solid phase, for example, when performed by sandwich ELISA.
  • the test sample can be contacted, and after washing, labeled anti- ⁇ CTF antibody is added to remove unbound antibody by washing, and then the labeling of the antibody is measured.
  • the test sample is brought into contact with a labeled antibody that specifically recognizes a non-immobilized ⁇ CTF (N) cleavage surface, and then the mixture is combined with another antibody that binds to the p3 peptide in advance.
  • a labeled antibody that specifically recognizes a non-immobilized ⁇ CTF (N) cleavage surface
  • the mixture is combined with another antibody that binds to the p3 peptide in advance.
  • a monoclonal antibody that binds to p3 peptide or ⁇ CTF and an anti- ⁇ CTF antibody may be used for the opposite purpose.
  • a calibration curve is prepared using a peptide standard substance having an ⁇ CTF (N) cut surface that is serially diluted to a known concentration as appropriate in advance, and ⁇ CTF ( N) You may obtain
  • the level means an index that is quantified, for example, an index that can be used as a concentration or instead. Therefore, the level may be a measured value itself such as fluorescence, or may be a value converted into a concentration.
  • the sample used in the present invention is not particularly limited as long as it is a sample that can detect a peptide having an ⁇ CTF (N) cut surface, and is a cell culture supernatant, cell lysate, subject-derived body fluid, subject tissue lysis. Things can be used.
  • the body fluid derived from the subject include human body fluids such as blood, plasma, serum, lymph, urine, serous fluid, cerebrospinal fluid, joint fluid, aqueous humor, tears, and saliva, or fractions or processed products thereof. be able to.
  • the analysis in the prediction method of the present invention can be performed qualitatively, quantitatively or semi-quantitatively.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can also be used for measurement of a peptide having an ⁇ CTF (N) cleavage plane in vivo.
  • the present invention includes a step of administering the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention labeled with a fluorescent or radioactive substance in vivo, and a step of detecting (or measuring) the label in vivo.
  • N A method for detecting (or measuring) a peptide having a cut surface is included.
  • the present invention includes a step of administering the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention labeled with a fluorescent or radioactive substance into a living body, and detecting the site of the label in the living body (optionally A method for detecting an accumulation site of a peptide having an ⁇ CTF (N) cut surface in a living body (when the intensity of the label is measured, the amount of accumulation is measured) Method).
  • Example 1 Production of an antibody specifically recognizing the cleavage surface of the C-terminal fragment after cleavage of APP with ⁇ -secretase Mice were treated with artificial peptide LVFFAEC (SEQ ID NO: 12) and carrier protein bovine cyclo Immunized with globulin conjugate. Lymph node lymphocytes obtained from immunized mice were fused with melanoma cell line X63-Ag8.653. Anti-APP-C antibody was immobilized on the solid phase, and an antibody in the supernatant of a hybridoma cell that was positive for human ⁇ CTF and negative for human ⁇ CTF was selected. Several positive clones were selected by limiting dilution, and the resulting single clone 2G2 was established.
  • LVFFAEC artificial peptide LVFFAEC
  • Example 2 Western blotting Western blotting was performed to confirm the binding specificity of the obtained clone 2G2.
  • Recombinant ⁇ CTF (500 fmol or 50 fmol) or recombinant ⁇ CTF (500 fmol or 50 fmol) is dissolved in 2% SDS, 10% glycerol, 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 100 mM dithiothreitol solution and boiled.
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting of recombinant ⁇ CTF (500 fmol or 50 fmol) or recombinant ⁇ CTF (500 fmol or 50 fmol).
  • the results of Western blot confirmed that UT18 antibody binds to both ⁇ CTF and ⁇ CTF, whereas 2G2 binds to ⁇ CTF but does not bind to ⁇ CTF.
  • Example 3 Construction of ELISA kit and cross-reactivity test of 2G2 (construction of ELISA kit) 100 ⁇ L of 100 mM carbonate buffer (pH 9.5) containing 0.5 ⁇ g of purified 1A10 antibody, 44A3 antibody, or Anti-APP-C antibody was added to each well of a microtiter plate (96 wells) at 4 ° C. And the plate was coated overnight.
  • the 1A10 antibody, 44A3 antibody, or Anti-APP-C antibody is a monoclonal antibody that recognizes the C-terminus of A ⁇ 40 and p3-40, the C-terminus of A ⁇ 42 and p3-42, or the C-terminus of APP, respectively. Specific recognition sites of these antibodies are as shown in FIG.
  • the plate was washed with PBS-T, and PBS containing 200 ⁇ L of 1% (w / v) bovine serum albumin (BSA) and 0.05% NaN 3 was added to each well and allowed to stand at 4 ° C. overnight. And blocked.
  • PBS-T a serially diluted solution of PBS-T containing 1% BSA of the test sample was added to a microtiter plate coated with 100 ⁇ L / well and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
  • the ELISA system using the “p3-42 ELISA kit” is a plate coated with Anti-APP-C antibody and an ELISA system using horseradish peroxidase (HRP) -conjugated 2G2 antibody is called “ ⁇ -CTF ELISA kit”. did.
  • the average cross-reaction rate of this ELISA system is 0.23% for p3-42 (A ⁇ 17-42), 0.06% for A ⁇ 40 (1-40), and A ⁇ 42 (1- For 42), it was 0.05%.
  • the cross-reaction rate (%) was determined by the following formula: Concentration (actual value) / (addition concentration of peptide to be compared) ⁇ 100 (%) calculated from a calibration curve prepared using the p3-40 peptide from the measured value of the peptide to be compared by ELISA Therefore, since the cross-reaction rate for A ⁇ 40 (1-40), which is a peptide having the same C-terminus as p3-40 (A ⁇ 17-40), was 0.06%, 2G2 had a cross-reaction of 0.1% or less. It was shown to show the rate.
  • the cross-reaction rate (%) was determined by the following formula: Concentration (actual measured value) / (addition concentration of comparison target peptide) ⁇ 100 (%) calculated from a calibration curve prepared using p3-42 peptide from the measurement value of the comparison target peptide by ELISA Therefore, the cross-reaction rate for A ⁇ 42 (1-42), which is a peptide having the same C-terminus as p3-42 (A ⁇ 17-42), was 0.05%. Again it was shown to show rates.
  • the cross-reaction rate (%) was determined by the following formula: Concentration (actual measured value) / (addition concentration of peptide to be compared) ⁇ 100 (%) calculated from a calibration curve prepared using ⁇ CTF peptide from the measured value of the peptide to be compared by ELISA Therefore, since the cross-reaction rate for ⁇ CTF, which is a peptide having the same C-terminus as ⁇ CTF, was 0.03%, it was again shown that 2G2 exhibits a cross-reaction rate of 0.1% or less.
  • Example 4 Examination of p3-40 ELISA kit, p3-42 ELISA kit ELISA kit using cultured cell line p3-40 ELISA kit using commercially available BACE ( ⁇ -secretase) inhibitor and ⁇ -secretase inhibitor for cells And the p3-42 ELISA kit.
  • HEK293 cells stably expressing the Swedish mutation of Human APP and HEK293 cells stably expressing the Human APP Wild type were seeded in a 6-well microplate at 4.0 ⁇ 1 ⁇ 10 5 cells / mL and contained 10% FBS.
  • the cells were cultured in TIL medium (IBL # 33640) for 16 hours. After the culture, the culture solution was collected and centrifuged (1500 rpm, 5 minutes), and the obtained supernatant was measured using the p3-40 ELISA kit and the p3-42 ELISA kit constructed in Example 3.
  • the effect of the BACE inhibitor (KMI-574, Wako) was measured using the 6-well microplate in the same manner, separating and centrifuging the culture solution after 16 hours of drug treatment, and measuring the obtained supernatant in the same manner. did.
  • the effect of a ⁇ -secretase inhibitor (DAPT, Wako) was also examined under the same conditions.

Abstract

　本発明は、ＡＰＰのα－セクレターゼによる切断物を特異的に認識する抗体を提供することを目的とする。特に、本発明は、αＣＴＦ及びｐ３ペプチドを認識する抗体、特には、βＣＴＦ及びＡβを認識しない抗体を提供する。また、本発明はこのような抗体の抗原結合断片をも提供する。更に、本発明は、このような抗体又はその抗原結合断片を用いたαＣＴＦ及び／又はｐ３ペプチドの測定方法、並びに測定キットを提供するものである。

Description

アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼ切断後のＣ末端側断片の切断面を特異的に認識する抗体及びその利用 クロスリファレンス
　本出願は、２０１３年４月８日に日本国において出願された特願２０１３－０８０４８４に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。
　本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（以下、「ＡＰＰ」という）のα－セクレターゼ切断後のＣ末端側断片の切断面を特異的に認識する抗体、及び該抗体を利用したＡＰＰのαＣＴＦ断片又はｐ３ペプチドの検出方法に関する。
　アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、β－セクレターゼ及びγ－セクレターゼにより順に分解されて、アミロイドβを生成する。アミロイドβ（Ａβ）の蓄積はアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＤ）の特徴であり、アルツハイマー病の診断及び治療の標的として広く研究されている。一方、ＡＰＰは、β－セクレターゼの代わりにα－セクレターゼにより分解されて、αＣ末端断片（αＣＴＦ）と呼ばれるペプチドを生成することも知られている。α－セクレターゼによるＡＰＰの分解は、β－セクレターゼと同様にγ－セクレターゼによる更なる分解を誘導する。αＣＴＦは、γ－セクレターゼにより分解され、ｐ３と呼ばれるペプチドを生成する。α－セクレターゼによるＡＰＰの分解はβ－セクレターゼによる分解と競合することから、Ａβの蓄積を阻害すると考えられているが、α－セクレターゼによるＡＰＰの分解物であるαＣＴＦ及びｐ３の機能についてはあまり知られていない。
　このようにｐ３ペプチドの機能があまり知られていない一因として、ｐ３ペプチドを特異的に認識する抗体が得られていないことがあった。ＡＰＰのβ－セクレターゼ切断物を特異的に認識する抗体、並びにＡＰＰのα－セクレターゼ切断後のＮ末端側断片の切断面を認識する抗体については報告がある（非特許文献１～４参照）にもかかわらず、ＡＰＰのα－セクレターゼ切断後のＣ末端側断片の切断面を特異的に認識する抗体については未だ報告が無い。ＡＰＰがα－セクレターゼにより分解されｐ３を生成することについては既に１９９２～１９９３年頃には報告があったにもかかわらず、ｐ３を特異的に認識する抗体の作製について成功したとの報告はない（非特許文献５～７参照）。
Ｍａｓａｓｈｉ　Ａｓａｉら、Ｔｈｅ　ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２０１１　Ｏｃｔ　２５：３７２０－３０． Ｔｏｓｈｉｈｉｋｏ　Ｔｏｄａら、Ｊ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１　２０１１　Ａｒｔｉｃｌｅ　ＩＤ：６１７９７４． Ｔａｋａｓｈｉ　Ｍｏｒｉら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２０１２　Ｆｅｂ　２４；２８７（９）：６９１２－２７ Ｂａｌｍｉｋｉ　Ｒａｙら、ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ．　２０１１；６（６）：ｅ２０４０５ Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　１９９３　Ｆｅｂ　１５；２６８（５）：３０２１－４． Ｎａｔｕｒｅ．　１９９２　Ｓｅｐ　２４；３５９（６３９３）：３２２－５． Ｖａｌｅｒｉｅ　Ｖｉｎｇｔｄｅｕｘら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０１２；１２０（Ｓｕｐｐｌ．１）：３４－４５．
　本発明は、アミロイド前駆体タンパク質（以下、「ＡＰＰ」という）のα－セクレターゼによる切断物を特異的に認識する抗体を提供することを目的とする。特に、本発明はＡＰＰがα－セクレターゼにより切断されたＣ末端側の断片を特異的に認識する抗体を提供することを目的とする。このような抗体は、ＡＰＰのα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片（以下、「αＣＴＦ」という）及び、αＣＴＦが更にγセクレターゼにより分解されて生じるｐ３ペプチドを認識するが、ＡＰＰのβ－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片（以下、「βＣＴＦ」という）、及び、βＣＴＦが更にγ－セクレターゼにより分解されて生じるＡβは認識しない。よって、別の側面において本発明は、αＣＴＦ及びｐ３ペプチドを特異的に認識する抗体、特には、αＣＴＦ及びｐ３ペプチドを認識するが、βＣＴＦ及びＡβを認識しない抗体を提供することを目的とする。また、本発明はこのような抗体の抗原結合断片をも提供することを課題とする。更に、本発明は、このような抗体又はその抗原結合断片を用いたαＣＴＦ及び／又はｐ３ペプチドの測定方法、並びに測定キットを提供することを目的とする。
　本願発明者らは、ｐ３やαＣＴＦを含む、αＣＴＦのα－セクレターゼによる切断面（以下、「α－セクレターゼ切断面」という）を特異的に認識する抗体を得るべく、種々の抗原を作成してマウスを免疫することで鋭意検討を重ねた結果、抗原として切断面由来の６アミノ酸からなるペプチドのＣ末端にシステイン残基を付与したペプチドである、ＬＶＦＦＡＥＣ（配列番号１２）のアミノ酸配列を有するペプチドを使用することにより、初めてαＣＴＦのα－セクレターゼ切断面を特異的に認識し、α－セクレターゼによる切断を受けていないＡＰＰや、ＡＰＰのβ－セクレターゼ切断物は認識しない抗体の取得に成功し、本願発明を完成させた。
　具体的な態様において、本発明は、以下の（１）～（１１）に記載の発明に関する：
（１）　αＣＴＦのα－セクレターゼ切断面を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片。
（２）　αＣＴＦ、及びｐ３ペプチドを特異的に認識する、（１）に記載の抗体又はその抗原結合断片。
（３）　以下のｉ）～ｉｉｉ）から選択される１以上のタンパク質又はペプチドを認識しないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片：
　ｉ）ＡＰＰのβ－セクレターゼ切断物、
　ｉｉ）アミロイドβ、
　ｉｉｉ）ＡＰＰ。
（４）　配列番号１３に記載のアミノ酸配列（ＬＶＦＦＡＥ）を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片。
（５）　配列番号１３に記載のアミノ酸配列（ＬＶＦＦＡＥ）を特異的に認識する、（１）～（３）のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
（６）　重鎖可変領域（以下、「ＶＨ」という）の相補性決定領域（以下、「ＣＤＲ」という）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２０（ＳＹＷＩＨ）、配列番号２１（ＮＩＹＰＧＳＧＤＴＮＹＤＥＲＦＫＳ）、及び配列番号２２（ＧＫＮ）に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖可変領域（以下、「ＶＬ」という）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３（ＨＡＳＱＮＩＮＶＷＬＳ）、配列番号２４（ＫＶＳＮＬＨＴ）、及び配列番号２５（ＱＱＧＱＳ）に記載のアミノ酸配列を有する、（１）～（５）のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
（７）　以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片である、（１）～（６）のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）ＶＨが、配列番号２６に記載されたアミノ酸配列（又は、図５Ａの下線を引いたアミノ酸配列）をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号２７に記載されたアミノ酸配列（又は、図６の下線を引いたアミノ酸配列）をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片；
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号２６のアミノ酸配列（又は、図５Ａの下線を引いたアミノ酸配列）と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号２７のアミノ酸配列（又は、図６の下線を引いたアミノ酸配列）と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）ＶＨが配列番号２６に記載のアミノ酸配列（又は、図５Ａの下線を引いたアミノ酸配列）を有し、かつ、ＶＬが配列番号２７に記載のアミノ酸配列（又は、図６の下線を引いたアミノ酸配列）を有する抗体又はその抗原結合断片。
（８）　（１）～（７）のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を備える、αＣＴＦのα－セクレターゼ切断面を有するペプチドの測定用キット。
（９）　αＣＴＦのα－セクレターゼ切断面を有するペプチドが、αＣＴＦ、又はｐ３ペプチドである、（８）に記載のキット。
（１０）　サンプルと（１）～（７）のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を接触させるステップ、及び、
（１）～（７）のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片に結合したαＣＴＦのα－セクレターゼ切断面を有するペプチドを測定するステップを備える、
検体中のαＣＴＦのα－セクレターゼ切断面を有するペプチドの測定方法。
（１１）　αＣＴＦのα－セクレターゼ切断面を有するペプチドが、αＣＴＦ、又はｐ３ペプチドである、（１０）に記載の測定方法。
　本明細書において、「アミロイド前駆体タンパク質」又は「ＡＰＰ」とは、β－アミロイド前駆体タンパク質とも呼ばれる、１か所の膜貫通領域を有する細胞表面タンパク質である。例えば、ヒトではＡＰＰのアイソフォームとして、ＡＰＰ６９５（配列番号１）、ＡＰＰ７５６（配列番号２）、及びＡＰＰ７７０（配列番号３）等が報告されているが、これらのＡＰＰにおけるα－セクレターゼ切断部のアミノ酸配列は保存されており、本明細書におけるＡＰＰは、このようなアイソフォームのいずれであってもよい。ＡＰＰは、α－セクレターゼ又はβ－セクレターゼによる一次切断を受けた後、γ－セクレターゼによる二次切断を受けることが知られている。ＡＰＰの各セクレターゼによる切断及び切断物の概略を図１に示す。ＡＰＰの細胞外領域がα－セクレターゼで分解されると、Ｎ末端側の可溶性断片（ｓＡＰＰα、非図示）と、Ｃ末端側の膜結合断片（αＣＴＦ）を生じる。本明細書において、「ＡＰＰのα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片」又は「αＣＴＦ」は、通常配列番号８に記載のアミノ酸配列からなる、このＣ末端側の膜結合断片を意味する。本発明の抗体又はその抗原結合断片は、αＣＴＦのα－セクレターゼ切断面（Ｎ末端側）を特異的に認識することを特徴とすることから、αＣＴＦを認識することができる。αＣＴＦは、続いてγ－セクレターゼによりその膜結合領域内が分解され、Ｎ末端側の断片としてｐ３ペプチドを生じる。γ－セクレターゼによる切断位置は複数個所に存在することが知られている。本明細書においては、Ａβ４０に対応する位置でγ－セクレターゼによる分解を受けて生じたｐ３ペプチドをｐ３－４０（配列番号９）（Ａβの１７～４０番目のアミノ酸に対応する配列からなることから、「Ａβ１７－４０」とも表記される）、Ａβ４２に対応する位置でγ－セクレターゼによる分解を受けて生じたｐ３ペプチドをｐ３－４２（配列番号１０）（Ａβの１７～４２番目のアミノ酸に対応する配列からなることから、「Ａβ１７－４２」とも表記される）、Ａβ４３に対応する位置でγ－セクレターゼによる分解を受けて生じたｐ３ペプチドをｐ３－４３（配列番号１１）（Ａβの１７～４３番目のアミノ酸に対応する配列からなることから、「Ａβ１７－４３」とも表記される）と表記する。本発明の抗体及びその抗原結合断片は、ｐ３のα－セクレターゼ切断面（ｐ３ペプチドのＮ末端、図１において「ａｎｔｉ　αＣＴＦ　ａｎｔｉｂｏｄｙ」と示す）を特異的に認識することを特徴とすることから、このようなγ－セクレターゼ切断の位置（Ｃ末端側）に関わらず、いずれのｐ３ペプチドをも認識するものである。よって、本明細書においてｐ３ペプチドとは、これらの全てのｐ３ペプチドを含む。即ち、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、これらの全てのｐ３ペプチドを認識する。
　一方で、ＡＰＰの細胞外領域がβ－セクレターゼで分解されると、Ｎ末端側の可溶性断片（ｓＡＰＰβ、非図示）と、Ｃ末端側の膜結合断片（βＣＴＦ）を生じる。本明細書において、「ＡＰＰのβ－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片」又は「βＣＴＦ」は、例えばヒトでは配列番号４に記載のアミノ酸配列からなる、このＣ末端側の膜結合断片を意味する。βＣＴＦは、続いてγ－セクレターゼによりその膜結合領域内が分解され、Ｎ末端側の断片としてアミロイドβ（Ａβ）を生じる。γ－セクレターゼにより分解される位置により、４０個のペプチドからなるＡβ４０（配列番号５）（Ａβの１～４０番目のアミノ酸配列からなることから、「Ａβ１－４０」とも表記される）、４２個のペプチドからなるＡβ４２（配列番号６）（Ａβの１～４２番目のアミノ酸配列からなることから、「Ａβ１－４２」とも表記される）、４３個のペプチドからなるＡβ４３（配列番号７）（Ａβの１～４３番目のアミノ酸配列からなることから、「Ａβ１－４３」とも表記される）等が生成されることが報告されている。本明細書においてＡβとは、これらの全てのＡβを含む。これらのＡβは、ＡＰＰのα－セクレターゼによる切断面を持たないことから、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、βＣＴＦ及びこれらの全てのＡβを認識しない。
　本明細書におけるＡＰＰ、αＣＴＦ、及びｐ３ペプチドの由来は、哺乳動物由来であれば特に限定されるものではなく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビット又はヒト由来であってよい。特に、マウス及びラットのＡＰＰは、ヒトのＡＰＰとの間で、α－サイト近辺のアミノ酸配列（特には、配列番号１３に記載のアミノ酸配列）が１００％一致することから、本願発明の抗体はヒト、マウス、及びラットのαＣＴＦ及びｐ３ペプチドも認識することができる。よって、ＡＰＰ、αＣＴＦ、及びｐ３ペプチドの由来として、好ましくは、マウス、ラット、及びヒト由来であり、より好ましくは、ヒト由来である。
　本明細書において、「α－セクレターゼ」とは、ＡＰＰの一次切断に関与するタンパク質分解酵素のことであり、例えば、ＡＤＡＭ１０又はＡＤＡＭ１７を挙げることができる。α－セクレターゼは、膜近傍部位の細胞外領域においてＡＰＰを切断する。本明細書においては、ＡＰＰにおけるα－セクレターゼの分解部位を「α－サイト」という。また、「γ－セクレターゼ」とは、ＡＰＰの二次切断に関与するタンパク質分解酵素のことであり、例えば、プレセニリンを挙げることができる。プレセニリンは、第１４染色体上にあるプレセニリン１及び第１染色体に位置し、ボルガジャーマン家系等の原因となるプレセニリン２が含まれる。プレセニリンは、６～８回膜貫通型膜タンパク質である。γ－セクレターゼによる分解は、α－セクレターゼによる分解により誘導される。γ－セクレターゼは、膜間部においてＡＰＰ（αＣＴＦ）を切断する。本明細書においては、ＡＰＰ（αＣＴＦ）におけるγセクレターゼの分解部位を「γ－サイト」という。
　本発明は、αＣＴＦのα－セクレターゼ切断面を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片に関する。本明細書において、「ＡＰＰのα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片のα－セクレターゼによる切断面」、「αＣＴＦのα－セクレターゼによる切断面」及び「αＣＴＦのα－セクレターゼ切断面」とは、αＣＴＦにおけるα－セクレターゼ切断部位（α－サイト）（Ｎ末端）近辺のアミノ酸を意味する（以下、本明細書において、「αＣＴＦ（Ｎ）切断面」ということがある）。本明細書において、「αＣＴＦにおけるα－セクレターゼ切断部位近辺のアミノ酸」とは、αＣＴＦにおける、α－サイト（Ｎ末端）から３個（ＬＶＦ：配列番号１４）～１０個（ＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳ：配列番号１５）のアミノ酸、好ましくは４個（ＬＶＦＦ：配列番号１６）～８個（ＬＶＦＦＡＥＤＶ：配列番号１７）のアミノ酸、より好ましくは５個（ＬＶＦＦＡ：配列番号１８）～７個（ＬＶＦＦＡＥＤ：配列番号１９）のアミノ酸、最も好ましくは６個のアミノ酸（ＬＶＦＦＡＥ：配列番号１３）を意味する。また、本明細書において、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドとは、前記α－サイト近辺のアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。以下、本明細書において、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する抗体を「抗αＣＴＦ（Ｎ）抗体」と呼ぶことがあるが、上述の通り、当該抗体はα－サイト近辺のアミノ酸を認識する限り、αＣＴＦ以外のペプチドに結合してもよい。
　候補抗体又はその抗原結合断片がαＣＴＦ（Ｎ）切断面を認識するか否かは、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びＥＬＩＳＡのいずれの方法により確認されるものであってもよいが、好ましくは、免疫沈降又はＥＬＩＳＡであり、最も好ましくはＥＬＩＳＡである。よって、本発明の抗αＣＴＦ抗体として、好ましくは、免疫沈降又はＥＬＩＳＡによりαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドを検出可能な抗体である。
　候補抗体又はその抗原結合断片がαＣＴＦ（Ｎ）切断面を認識するか否かをウェスタンブロッティングにより確認する場合、例えば、組換ヒトｐ３－４０、又はｐ３－４２を、２％　ＳＤＳ、１０％　グリセロール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ　ジチオスレイトール溶液中に溶解し、煮沸して抗Ｈｉｓ抗体及び被検抗体によりウェスタンブロット分析を行うことにより確認することができる。
　候補抗体又はその抗原結合断片がαＣＴＦ（Ｎ）切断面を認識するか否かを免疫沈降により確認する場合、免疫沈降ウェスタンブロッティング分析により確認することができる。具体的には、ｐ３－４０、又はｐ３－４２ペプチドを被検抗体又はその抗原結合断片と共にインキュベートし、共にプロテインＧ　セファロース（ＧＥヘルスケアジャパン）を添加する、更にインキュベートした後、遠心分離を行い、得られたペレットを三回洗浄した。次いでペレットを溶解し、それぞれのｐ３ペプチドのγ－セクレターゼ切断面（Ｃ末端）特異的抗体を用いてウェスタンブロット分析を行うことにより、確認することができる。
　候補抗体又はその抗原結合断片がαＣＴＦ（Ｎ）切断面を認識するか否かを免疫組織化学染色により確認する場合、血管を含む組織を４％パラホルムアルデヒド中で３～５日間固定化し、パラフィンに包埋し、常法に従ってミクロトーム上で５μｍ厚に切断する。組織切片からパラフィンを除去し、水和させ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、ギ酸で短時間処理する。内因性の過酸化を防ぐため、３％過酸化水素含有メタノール中で静置後、１０％正常ヤギ血清含有ＰＢＳで切片をブロックし、被検抗体と共に４℃で一晩静置する。その後、ビオチン化第二抗体と共に室温で３０分間静置する。免疫反応性は、ＡＢＣ　Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）などを用いて製造者のプロトコルに従って可視化する。３，３’－ジアミノベンジジンを色原体として使用し、切片はヘマトキシリンで対比染色することにより確認することができる。
　候補抗体又はその抗原結合断片がαＣＴＦ（Ｎ）切断面を認識するか否かをＥＬＩＳＡにより確認する場合、被検抗体又はその抗原結合断片を用いて後述のＥＬＩＳＡ系を構築、実施して、検出の可否を判断することにより行うことができる。
　本発明の抗体又はその抗原結合断片は、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する。特に、本発明の抗体その抗原結合断片は、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチド（好ましくは、αＣＴＦ及び／又はｐ３ペプチド、本段落において以下同じ）と特異的に結合する。本明細書において、「αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドを特異的に認識する又は、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドと特異的に結合する」とは、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドと結合するが、その他のタンパク質又はペプチドとは結合しないことを意味し、特には、ＡＰＰのβ－セクレターゼにより生じるペプチド（例えば、βＣＴＦ及びＡβ）又はα－セクレターゼ未切断のＡＰＰとは結合しないことを意味する。よって、例えば、本発明のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する抗体及びその抗原結合断片は、好ましくは、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドと特異的に結合するが、ＡＰＰのβ－セクレターゼによる切断後の切断面を有するペプチド（例えば、βＣＴＦ及びＡβ）とは結合しない抗体又はその抗原結合断片、あるいは、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドと特異的に結合するが、ＡＰＰ（α－セクレターゼにより切断されていないＡＰＰ）とは結合しない抗体又はその抗原結合断片である。特には、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドと特異的に結合するが、ＡＰＰのβ－セクレターゼによる切断後の切断面を有するペプチド（例えば、βＣＴＦ及びＡβ）及びＡＰＰの両方と結合しない抗体又はその抗原結合断片である。候補抗体又はその抗原結合断片がβ－セクレターゼによる切断後の切断面を有するペプチド（例えば、βＣＴＦ及びＡβ）及び／又はＡＰＰを認識しないか否かは、上述のウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びＥＬＩＳＡのいずれの方法により確認されるものであってもよいが、好ましくは、免疫沈降又はＥＬＩＳＡであり、最も好ましくはＥＬＩＳＡである。
　ここで、「結合しない」又は「認識しない」とは、被検抗体のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドへの結合との比較において、結合しない又は認識しないとされるタンパク質又はペプチド（ＡＰＰのβ－セクレターゼによる切断後の切断面を有するペプチド、及び／又はＡＰＰなど）への被検抗体の結合が十分区別可能な程度低い場合を含む。例えば、本発明のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片は、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドと比較した、ＡＰＰのβ－セクレターゼによる切断後の切断面を有するペプチド（例えば、βＣＴＦ及びＡβ）及び／又はＡＰＰとの交差反応率が、例えば、１％以下、０．５％以下、０．３％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０３％以下であってもよい。交差反応率は、例えば、以下の方法により調べることができる。ｐ３－４０のＣ末端を特異的に認識する抗体を固定化したプレートを使用し、標識化された被験抗体を検出抗体として用いてＥＬＩＳＡを行い、ｐ３－４０ペプチドを被験サンプルとして用いて検量線を作成し、比較対象となるペプチド（Ａβ４０等）を該ＥＬＩＳＡで測定して該検量線により濃度を算出した上で、｛（比較対象となるペプチドについてＥＬＩＳＡで測定された濃度（実測値））／（比較対象となるペプチドの添加サンプル濃度）×１００％｝として計算して得ることができる。あるいは、ｐ３－４２のＣ末端を特異的に認識する抗体を固定化したプレートを使用し、標識化された被験抗体を検出抗体として用いてＥＬＩＳＡを行い、ｐ３－４２ペプチドを被験サンプルとして用いて検量線を作成し、比較対象となるペプチド（Ａβ４２等）を該ＥＬＩＳＡで測定して該検量線により濃度を算出した上で、｛（比較対象となるペプチドについてＥＬＩＳＡで測定された濃度（実測値））／（比較対象となるペプチドの添加サンプル濃度）×１００％｝として計算して得ることができる。あるいは、αＣＴＦのＣ末端を特異的に認識する抗体を固定化したプレートを使用し、αＣＴＦを被験サンプルとして用いて検量線を作成し、比較対象となるペプチド（βＣＴＦ等）を該ＥＬＩＳＡで測定して該検量線により濃度を算出した上で、｛（比較対象となるペプチドについてＥＬＩＳＡで測定された濃度（実測値））／（比較対象となるペプチドの添加サンプル濃度）×１００％｝として計算して得ることができる。
　本発明の抗体は、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識することができる限り、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。ここで、「モノクローナル抗体」は、単一クローンに由来する抗体であることを意味する。本発明の抗体は、完全抗体の他、抗原との結合活性を保持する限り、バイスペシフィック抗体、及び一本鎖抗体を含む。抗体の抗原結合抗体断片が抗原との結合活性を保持するか否かは、上述の候補抗体がαＣＴＦ（Ｎ）切断面を認識するか否かを確認する手段に準じて確認することができる。完全抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどの抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト抗体に動物由来のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインＦｖを入れ替えたヒト型キメラ抗体、動物由来抗体モノクローナル抗体の抗原結合に直接関わるＦｖドメイン上の配列であるＣＤＲをヒト抗体のフレームに組み込んだヒト化抗体を挙げることができる。また、ヒト抗体とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことである。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
　また、本発明は、本発明の抗体の抗原結合断片も含む。本発明において、抗体の抗原結合断片とは、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を認識する活性を保持する抗体断片を意味し、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｃＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（２又はそれ以上の特異性を有する二量体化Ｖ領域を含む）を含む。本明細書において、特にそのように解釈することが不整合である場合を除き、明示されていない場合にも本発明の抗体に関する言及は該抗原結合断片をも含むことを意味するものとする。
　別の態様において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、αＣＴＦ（Ｎ）切断面に存在するエピトープ（例えば、配列番号１３～１９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列、好ましくは、ＬＶＦＦＡＥ（配列番号１３）で表わされるアミノ酸配列）を抗原として認識する抗体又はその抗原結合断片である。別の態様において、本発明は、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５に記載のアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片に関する。好ましくは、本発明は、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５に記載のアミノ酸配列をＣＤＲとして有する、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。より具体的には、本発明は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びに、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５に記載のアミノ酸配列を有するか、又はこれらのアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体である。例えば、本発明は、ＶＨが配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む。より具体的には、本発明は、Ｈ鎖が、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ鎖が配列番号３１に記載のアミノ酸配列からなるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む。
　また、本発明は、上記モノクローナル抗体に加えて、以下の（ｉ）又は（ｉｉ）の抗体又はその抗原結合断片；以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）から選択される２つ又は３つの特徴を有する抗体又はその抗原結合断片；並びに、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）から選択される１以上の特徴を有し、かつ、（ｉｖ）～（ｖｉｉ）から選択される１以上の特徴を有する抗体又はその抗原結合断片を含む：
（ｉ）ＶＨが、配列番号２６に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号２７に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片；
（ｉｉ）ＶＨが、配列番号２６のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号２７のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びに、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５に記載のアミノ酸配列を有するか、又はこれらのアミノ酸配列からなる抗体又はその抗原結合断片；
（ｉｖ）　αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片；
（ｖ）　αＣＴＦ及びｐ３ペプチドを特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片；
（ｖｉ）　以下のｉ）～ｉｉｉ）から選択される１以上のタンパク質又はペプチドを認識しない抗体又はその抗原結合断片：
　ｉ）ＡＰＰのβ－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片（βＣＴＦ）、
　ｉｉ）アミロイドβ、
　ｉｉｉ）ＡＰＰ；
（ｖｉｉ）　配列番号１３～１９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列（好ましくは、ＬＶＦＦＡＥ（配列番号１３）で表わされるアミノ酸配列）を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片。
　本明細書において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば、ハイブリダイズの条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ　ＮａＣｌ，０．０９Ｍ　クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ　ＮａＣｌ，０．２Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。また、アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて決定することができる。
　また、本発明は上述の本発明の抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする核酸構築物、当該核酸構築物を含有するベクター、並びに当該ベクターを保有する宿主細胞をも包含する。本発明の核酸構築物は、必要に応じてシグナル配列をコードする核酸を含んでいてもよい。このようなシグナル配列としては、例えば、配列番号３２に記載のアミノ酸配列（ＶＨ）又は配列番号３３に記載のアミノ酸配列（ＶＬ）を挙げることができる。例えば、本発明の核酸構築物としては、配列番号２８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（重鎖）、及び／又は、配列番号３０に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド（軽鎖）、あるいは、配列番号２８の１３３番目～４６８番目（シグナル配列を含む場合、配列番号２８の７６番目～４６８番目）の塩基配列を有するポリヌクレオチド（重差可変領域）、及び／又は、配列番号３０の１１２番目～４３２番目（シグナル配列を含む場合、配列番号３０の５２番目～４３２番目）の塩基配列を有するポリヌクレオチド（軽鎖可変領域）を挙げることができる。
　以上において説明された本発明の抗体又はその抗原結合断片、核酸構築物、ベクター、及び宿主細胞に関する説明の全ては、以下において説明する本発明のキットが含有する抗体又はその抗原結合断片及び測定方法についても同様に適用される。
　更に、別の態様において、本発明は、本発明のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片を含有する、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドを測定するためのキットに関する。好ましくは、本発明のキットは、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を認識する抗体又はその抗原結合断片を含有する、αＣＴＦ及び／又はｐ３ペプチド測定用キットである。
　一の態様において、本発明のキットは、目的のタンパク質（αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチド）と結合する抗体又はその抗原結合断片を備える。当該抗体は、目的のタンパク質と結合する限りその構造、大きさ、イムノグロブリンクラス、由来等を問わない。また、本発明のキットが包含する抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナルであってもよいし、ポリクローナルであってもよいが、少なくとも１つはモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む。例えば、本発明のキットがｐ３ペプチドを測定することを目的とする場合、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である第一の試薬、及び、γ－サイト近辺アミノ酸配列に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）である第二の試薬を含んでいてもよい。また、本発明のキットが含有する抗体又は抗体の断片は、適宜標識されていてもよい。また、本発明のキットは、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識するモノクローナル抗体に代えて、当該抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする単離された核酸構築物、当該核酸構築物を包含するベクター、当該ベクターを保有する細胞も包含していてもよい。本発明のキットが備えるαＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片としては、上述の任意の本発明の抗体又はその抗原結合断片を用いることができる。
　本発明のキットは、好ましくは、固相、ハプテン、及び不溶性担体からなる群より選択される担体を含む。本発明の測定キットは、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。本発明のキットとしては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）用キット、簡易ＥＩＡ法用キット、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）用キット、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法用キット）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）用キット等の標識化免疫測定法用キット；ウェスタンブロッティング法用キット等のイムノブロッティング法用キット；金コロイド凝集法用キット等のイムノクロマト法用キット；イオン交換クロマトグラフィ法用キット、アフィニティクロマトグラフィ法用キット等のクロマトグラフィ法用キット；比濁法（ＴＩＡ法）用キット；比ろう法（ＮＩＡ法）用キット；比色法用キット；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）用キット；粒子計数法（ＣＩＡ法）用キット；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）用キット；沈降反応法用キット；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）用キット；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）用キット；比較干渉法用キット等を挙げることができる。本発明のキットが、所望の測定を実施することが可能であるか否かは、当該サンプル又は当該濃度のサンプルを用いて、各測定法を当業者周知の方法により実施することにより、検出可能であるか否かを測定することにより確認することができる。
　例えば、本発明のキットは、（ｉ）ｐ３ペプチドと結合する（好ましくは、αＣＴＦのγ－セクレターゼによる切断後のＮ末端側の断片のγ－サイト近辺のアミノ酸（αＣＴＦのγ－セクレターゼによる切断物のうちＮ末端側ペプチドのＣ末端）を特異的に認識する、以下同じ）第一抗体が固定化した固相又はハプテン、及び（ｉｉ）標識化された抗αＣＴＦ（Ｎ）抗体である第二抗体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、本発明のキットがハプテンを含む場合、更にハプテンと特異的に結合する物質が固定化した固相をさらに含んでいてもよい。前記第一抗体と前記第二抗体はｐ３ペプチドの異なる部位を認識する。また、前記固定化する第一抗体を抗αＣＴＦ（Ｎ）抗体とし、標識化する第二抗体をｐ３ペプチドと結合する抗体としてもよい。
　または、本発明のキットは、（ｉ）ｐ３ペプチドと結合する抗体である第一抗体が固定化した固相、及び、（ｉｉ）抗αＣＴＦ（Ｎ）抗体である第二抗体が固定化したハプテンを含む免疫化学測定のキットとすることができる。また、当該キットは更に、ハプテンと特異的に結合する、標識された物質を含んでいてもよい。また、前記固相に固定化する第一抗体を抗αＣＴＦ（Ｎ）抗体とし、ハプテンに固定化する第二抗体をｐ３ペプチドと結合する抗体としてもよい。
　あるいは、本発明のキットは、（ｉ）ｐ３ペプチドと結合する抗体である第一抗体が固定化した不溶性担体、及び、（ｉｉ）αＣＴＦ（Ｎ）抗体である第二抗体が固定化した不溶性担体を含む免疫化学測定のキットとすることができる。
　上記のいずれのキットの例においても、第一抗体をモノクローナル抗体又はその抗原結合断片とし、第二抗体をポリクローナル抗体又はその抗原結合断片としてもよいし、第一抗体をポリクローナル抗体又はその抗原結合断片とし、第二抗体をモノクローナル抗体又はその抗原結合断片としてもよいし、あるいは、第一及び第二の両方の抗体をモノクローナル抗体又はその抗原結合断片としてもよい。本発明のキットとしては、例えば、第一又は第二のいずれかの抗体が配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５に記載のアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であり、もう一方の抗体がαＣＴＦのγ－セクレターゼによる切断後のＮ末端側の断片のγ－サイト近辺のアミノ酸（αＣＴＦのγ－セクレターゼによる切断物のうちＮ末端側ペプチドのＣ末端）を特異的に認識するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体あるいはそれらの抗原結合断片であるキットを挙げることができる。
　本発明のキットにおいて、固相は免疫化学測定に使用できる固相であれば特に限定されないが、例えば、ニトロセルロース、セファロース、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、アクリル、ポリオレフィン、ポリウレタン、レーヨン、ポリノジック、キュプラ、リヨセル、アセテート、ポリビニリデンジフルオリド、シリコンラバー、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素加工樹脂、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、アクリル樹脂、ポリマーアロイ、ガラス繊維、炭素繊維、ガラス、ゼラチン、ポリアミノ酸及び／又は磁気感応性素材等を含有する、プレート、チューブ、チップ（例えば、プロテインチップ、ラボチップ等）、ビーズ、膜、吸収体及び／又は粒子等を挙げることができ、好ましくは、プレート及び磁気ビーズである。本明細書において不溶性担体とは、ビーズ等の懸濁可能な不溶性の固相を意味し、例えば、ラテックスビーズや磁気ビーズを挙げることができる。
　本発明のキットが標識化された抗体又はその抗原結合断片を含む場合、当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、３２ｐ３Ｈ、１２５Ｉ、１４Ｃ等の放射能標識；βガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ－クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ－フィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ－（４－アミノブチル）－Ｎ－エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ－メチルアクリジニウムエステル、Ｎ－メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
　本発明のキットは、必要に応じて、発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んでいてもよい。また、本発明のキットが標識化された抗体を含む場合、更に標識と反応する基質を含んでいてもよい。更に、本発明のキットは、紙箱又はプラスチックケース等のキットの構成物を格納するパッケージ、及び取扱い説明書等を含んでいてもよい。
　本発明のキットに用いる検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、本発明の免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液、脳組織またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明のキットによる分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
ＡＰＰの各セクレターゼによる切断部位、並びにＡβ（上）及びｐ３ペプチド（下）のアミノ酸配列を示した図である。Ａβの配列の下にこれまでに報告されている抗体（これらはいずれもα－サイトを特異的には認識しない）の認識部位を示す。「ＴＭ」は膜貫通領域を示す。各セクレターゼと共に示される矢印は、各セクレターゼが分解する位置を示す。また、ｐ３ペプチドの下に本発明の抗体の認識部位を示す。 ２Ｇ２抗体及びＵＴ１８抗体（抗ＡＰＰ抗体）を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。１～４の各レーンは、順に、βＣＴＦ　５００ｆｍｏｌ、αＣＴＦ　５００ｆｍｏｌ、βＣＴＦ　５０ｆｍｏｌ、αＣＴＦ　５０ｆｍｏｌを示す。 １Ａ１０抗体、４４Ａ３抗体、又は抗ＡＰＰ－Ｃ抗体（Ａｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ）と２Ｇ２抗体とを組み合わせたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによる、Ａβ４２（１－４２）、Ａβ４０（１－４０）、ｐ３－４２（１７－４２）、及びｐ３－４０（１７－４０）、あるいは、αＣＴＦ及びβＣＴＦの測定結果を示すグラフである。グラフは左から、１Ａ１０抗体、４４Ａ３抗体、抗ＡＰＰ－Ｃ抗体（Ａｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ）を用いた結果を示す。各グラフの上の図は、各抗体の認識部位を示す模式図である。 ＢＡＣＥ阻害剤（ＫＭＩ－５７４）及び／又はγ－セクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ）の存在下／非存在下で、Ｈｕｍａｎ　ＡＰＰ　Ｓｗｅｄｉｓｈ変異を安定発現させたＨＥＫ２９３細胞、Ｈｕｍａｎ　ＡＰＰ　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅを安定発現させたＨＥＫ２９３細胞を培養した培養上清中のｐ３－４０及びｐ３－４２の濃度をｐ３－４０ＥＬＩＳＡキット、ｐ３－４２ＥＬＩＳＡキットで測定した結果を示すグラフである。濃いグレーのグラフは、Ｈｕｍａｎ　ＡＰＰ　Ｓｗｅｄｉｓｈ変異を安定発現させたＨＥＫ２９３細胞の培養上清（ＡＰＰ　ｓｗ　ＨＥＫ　ｓｕｐ）を示し、薄いグレーのグラフは、Ｈｕｍａｎ　ＡＰＰ　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅを安定発現させたＨＥＫ２９３細胞の培養上清（ＡＰＰ　ＷＴ　ＨＥＫ　ｓｕｐ）を示す。グラフは左から、ＤＡＰＴ添加、ＫＭＩ－５７４添加、ＤＡＰＴ及びＫＭＩ－５７４添加、コントロール（ＤＡＰＴ無添加、かつＫＭＩ－５７４無添加）を示す。縦軸は、ｐ３－４０及びｐ３－４２の其々の濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。 ２Ｇ２抗体の重鎖のアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。図中、イタリック体はシグナル配列を示し、下線部は可変領域のアミノ酸配列を示し、網掛はＣＤＲのアミノ酸配列を示す。 図５Ａに続く２Ｇ２抗体の重鎖のアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。 ２Ｇ２抗体の軽鎖のアミノ酸配列及び核酸配列を示す図である。図中、イタリック体はシグナル配列を示し、下線部は可変領域のアミノ酸配列を示し、網掛はＣＤＲのアミノ酸配列を示す。
（抗体作製）
　本発明の抗体は、例えば、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物又は鳥類に免疫することにより作製することができる。本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。あるいは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ法又はＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製できる。また、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。
　上記抗原を用いた動物の免疫は、上記抗原をリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）と共に、非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス等）又は鳥類に免疫することにより行われる。動物への免疫原の投与は、例えば、皮下および皮内注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができる。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１～１０００μｇであり、より好ましくは、１～５００μｇであり、より更に好ましくは、１０～１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１～５週間に１回の免疫を複数回（好ましくは、合計２～５回）行うことができる。ポリクローナル抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。
　モノクローナル抗体の作製は、上記方法により免疫した免疫感作動物の脾臓等から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：３－４６，１９８１）を挙げることができる。また、モノクローナル抗体は、プロテインＡ又はプロテインＧカラム（ＩｇＧ）、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラム（ＩｇＹ及びＩｇＭ）、抗原固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィ、疎水相互作用クロマトグラフィ等を用いて精製することもできる。
　あるいは、本発明の抗体は、ＶＨが、配列番号２６に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが配列番号２７に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片；ＶＨが、配列番号２６のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ＶＬが、配列番号２７のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片；ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３、並びに、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、それぞれ、配列番号２０、２１、２２、２３、２４及び２５に記載のアミノ酸配列を有するか、又はこれらのアミノ酸配列からなる抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列をデザインし、当該デザインされたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる。例えば、本発明の抗体は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列（配列番号３２に記載のシグナル配列を有していてもよい）をコードするＤＮＡ及び配列番号２７に記載のアミノ酸配列（配列番号３３に記載のシグナル配列を有していてもよい）をコードするＤＮＡを合成し、あるいは、配列番号２８及び３０に記載の核酸配列を有するＤＮＡを合成し、当該ＤＮＡからぞれぞれ配列番号２９及び３１に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖及びＬ鎖を得ることにより製造することができる。
（ヒト型キメラ抗体作製）
　本発明の抗体がヒト型キメラ抗体の場合、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する非ヒト動物モノクローナル抗体（例えば、２Ｇ２モノクローナル抗体）のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１－６８５５，１９８４）。
（Ｈ鎖とＬ鎖の特定の相補認識領域（ＣＤＲ）を有する抗体（ヒト化抗体）作製）
　本発明の抗体がヒト化抗体の場合は、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する非ヒト動物モノクローナル抗体（例えば、２Ｇ２モノクローナル抗体）のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Ｌ．Ｒｉｅｏｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８：Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．，４，７７３－７８３，１９９１；Ｃｌａｒｋ　Ｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ．，２１，３９７－４０２，２０００参照）。非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較して得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。また、ヒト化抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体の可変領域（以下、「Ｖ領域」という）がＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。ヒト化抗体において、ヒト抗体に由来するＦＲを構成するアミノ酸の一部（特には、立体的にＣＤＲと近接した位置に存在するアミノ酸）は、必要に応じてＣＤＲが由来する非ヒト動物モノクローナル抗体のＦＲ配列に置換されていてもよい（Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５５８５０８９号参照）。使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。
（ヒト抗体）
　ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１５，１４６－１５６（１９９７））。ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するペプチドを固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の本発明の抗体作製方法に準じて抗原（好ましくは、本発明の抗体が認識するエピトープ配列を有するペプチド）を免疫することにより、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識するヒト抗体を得ることができる。
（抗体断片の作製）
　Ｆ（ａｂ’）２断片（分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片）は、本発明のＩｇＧ抗体（例えば、２Ｇ２モノクローナル抗体）をペプシンで処理することにより得ることができる。Ｆａｂ’断片は、上述の方法により得られたＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明の抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡから得ることができる。Ｆａｂ断片は、本発明の抗体をパパインで処理することにより得ることができる。ｓｃＦｖは、本発明の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入して、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築することにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０～２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）（配列番号３４）又はその繰り返し配列である。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換し、当該システイン残基間をジスルフィド結合により結合させることにより得ることができる。Ｄｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築することにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。
　（核酸、ベクター、宿主細胞）
　本発明の核酸は、上述において得られた抗体を産生するハイブリドーマからクローニングするか、あるいは、上述において得られた抗体またはその抗原結合断片のアミノ酸配列を基に、適宜核酸配列を設計することにより得ることができる。本発明のベクターは、得られた核酸を適宜発現に適したベクターに組み込むことにより得ることができる。本発明のベクターは、本発明の核酸の他、発現に必要な領域（プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）を含んでいてもよい。また、本発明の宿主細胞は、本発明のベクターを適切な細胞株（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、大腸菌等の微生物）に導入することにより得ることができる。
（標識）
　抗体又はその抗原結合断片への標識の結合は当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｒｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｒｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ、Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　５５５　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ－Ｌａｂｅｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
（キット）
　また、本発明は、抗αＣＴＦ（Ｎ）抗体又はその抗原結合断片を含有するｐ３ペプチド又はαＣＴＦ測定キットに関する。本発明のキットは、上述の方法に従って作製した抗体又はその抗原結合断片（又は標識化した抗体又はその抗原結合断片）を用いて、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法用のキットとして当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。
　例えば、本発明のキットは、ｐ３ペプチド又はαＣＴＦと結合するポリクローナル抗体又はその抗原結合断片が固相化されたプレート、ビオチン標識された抗αＣＴＦ（Ｎ）抗体溶液、ストレプトアビジンＰＯＤ溶液、洗浄液、ＴＭＢ試薬、２Ｍ　ＨＣｌ、標準物質（ｐ３ペプチド、αＣＴＦペプチド又はそれらのペプチドのうち、キットが含有する抗体が認識するアミノ酸配列からなるペプチド）を備えるキットとして製造することができる。また、別の例として、本発明のキットは、抗αＣＴＦ（Ｎ）抗体又はその抗原結合断片、ｐ３ペプチド又はαＣＴＦと結合するモノクローナル抗体（又はその抗原結合断片）結合金コロイド、ウサギ免疫グロブリン結合金コロイド、及び、テストプレートを備えるキットとして製造することができる。当該キットにおいて、テストプレートは、検体を挿入する検体採取部、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識するモノクローナル抗体（又はその抗原結合断片）結合金コロイドを含む感作金コロイド塗布部、ｐ３ペプチド又はαＣＴＦと結合するモノクローナル抗体（又はその抗原結合断片）を含む判定部（テストライン）、抗ウサギ免疫グロブリンポリクローナル抗体を含む判定部（リファレンスライン）、吸収剤、及び、メンブレンフィルターを備えていてもよい。上記キットにおいて、ｐ３ペプチド又はαＣＴＦと結合するモノクローナル抗体と抗αＣＴＦ抗体を逆の目的で使用してもよい。
（α－セクレターゼによる切断後の切断面を有するペプチドの測定方法）
　別の態様において、本発明は、サンプルと本願発明の抗体又はその抗原結合断片を接触させるステップ、及び、本願発明の抗体又はその抗原結合断片に結合したαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドを測定するステップを備える、検体中のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの測定方法に関する。本発明の方法において、α－セクレターゼによる切断後の切断面を有するペプチドとは、上述において定義されるα－サイト近辺のアミノ酸配列を有するペプチドであれば特に限定されるものではなく、その具体的な例として、ｐ３ペプチド及びαＣＴＦを含む。また、本発明の測定方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏのいずれで行われるものであってもよいが、好ましくは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで行われる。
　本発明の方法において、「αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの測定」は、抗体分子を用いた公知の方法に基づき行うことができる。このような方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、簡易ＥＩＡ法、酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）等の標識化免疫測定法；ウェスタンブロッティング法等のイムノブロッティング法；金コロイド凝集法等のイムノクロマト法；イオン交換クロマトグラフィ法、アフィニティクロマトグラフィ法等のクロマトグラフィ法；比濁法（ＴＩＡ法）；比ろう法（ＮＩＡ法）；比色法；ラテックス凝集法（ＬＩＡ法）；粒子計数法（ＣＩＡ法）；化学発光測定法（ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法）；沈降反応法；表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）；レゾナントミラーディテクター法（ＲＭＤ法）；比較干渉法等を挙げることができる。
　よって、より具体的には、本発明の検体中のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの測定方法は、例えば、以下のステップにより行うことができる：
（ａ）抗体による検出に適した試料を調製するステップ；
（ｂ）少なくとも１つのαＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片と該試料とを接触させるステップ、
（ｃ）αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの該抗体又はその抗原結合断片への結合を測定して試料中のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドを検出又は定量するステップ；
（ｄ）検体中のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの存否又はレベルを決定するステップ。
　本明細書において、「少なくとも１つのαＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片に該試料を接触させるステップ」及び「該タンパク質の該抗体又はその抗原結合断片への結合を測定して試料中のαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドを検出又は定量するステップ」は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにより実施する場合には、固相に固定化されたｐ３ペプチドに結合する抗体に被験試料を接触させ、洗浄後標識抗αＣＴＦ抗体を添加して非結合抗体を洗浄により除去した後、当該抗体の標識を測定することにより行うことができる。また、イムノクロマトにより行う場合には、固定化されていないαＣＴＦ（Ｎ）切断面を特異的に認識する標識抗体に被験試料を接触させた後、当該混合物を、予めｐ３ペプチドに結合する別の抗体を特定部位に固定化した担体と接触させ、当該部位における標識抗体の集積を測定することにより行うことができる。また、上記方法において、ｐ３ペプチド又はαＣＴＦと結合するモノクローナル抗体と抗αＣＴＦ抗体を逆の目的で使用してもよい。
　これらの方法においては、予め適宜既知の濃度に段階希釈されたαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチド標準物質を用いて検量線を作成し、検体中の測定値から当該検量線を基にαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの濃度を計算して求めてもよい。なお、本明細書において、レベルとは、数値化される指標を意味し、例えば、濃度あるいはその代わりとして用いることができる指標を意味する。よって、レベルは蛍光等の測定値そのものであってもよいし、濃度に換算された値であってもよい。
　本発明において使用する試料としては、αＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドを検出することができる試料であれば特に限定されず、細胞培養上清、細胞溶解物、被験者由来の体液、被験者組織溶解物等を使用することができる。被験者由来の体液としては、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液等のヒト体液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明の予測方法における分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。
　あるいは、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの測定に使用することもできる。例えば、本発明は、蛍光又は放射性物質で標識した本発明の抗体又はその抗原結合断片を生体内に投与するステップ、生体内における前記標識を検出（又は測定）するステップを備える、生体内におけるαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの検出方法（又は測定方法）を含む。例えば、その応用された態様として、本発明は、蛍光又は放射性物質で標識した本発明の抗体又はその抗原結合断片を生体内に投与するステップ、生体内における前記標識の部位を検出する（任意で、当該部位の前記標識の強度を測定する）ステップを備える、生体内におけるαＣＴＦ（Ｎ）切断面を有するペプチドの集積部位の検出方法（標識の強度を測定した場合には、その集積量を測定する方法）であってもよい。
　以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
（実施例１）ＡＰＰのα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片の切断面を特異的に認識する抗体の作製
　マウスを人工ペプチドであるＬＶＦＦＡＥＣ（配列番号１２）とキャリアタンパク質であるウシサイクログロブリンの結合物で免疫した。免疫マウスから得られたリンパ節のリンパ球をメラノーマ細胞株Ｘ６３－Ａｇ８．６５３と融合させた。Ａｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ抗体を固相し、ＥＬＩＳＡの結果がヒトαＣＴＦに対し陽性、ヒトβＣＴＦに対し陰性を示すハイブリドーマ細胞の上清の抗体を選択した。幾つかの陽性クローンを限界希釈法により選択を行い、得られた単一クローン２Ｇ２を樹立した。
（実施例２）ウェスタンブロッティング
　得られたクローン２Ｇ２の結合特異性を確認するため、ウェスタンブロッティングを行った。組換βＣＴＦ（５００ｆｍｏｌ又は５０ｆｍｏｌ）、又は組換αＣＴＦ（５００ｆｍｏｌ又は５０ｆｍｏｌ）は、２％　ＳＤＳ、１０％　グリセロール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ　ジチオスレイトール溶液中に溶解し、煮沸して２Ｇ２抗体及びＵＴ１８抗体（抗ＡＰＰ抗体）によるウェスタンブロット分析に使用した。
　組換βＣＴＦ（５００ｆｍｏｌ又は５０ｆｍｏｌ）、又は組換αＣＴＦ（５００ｆｍｏｌ又は５０ｆｍｏｌ）をウェスタンブロッティングした結果を図２に示す。ウェスタンブロットの結果から、ＵＴ１８抗体がβＣＴＦ及びαＣＴＦの両方と結合しているのに対し、２Ｇ２は、αＣＴＦとは結合するがβＣＴＦとは結合しないことが確認された。
（実施例３）ＥＬＩＳＡキットの構築、及び２Ｇ２の交差反応性試験
（ＥＬＩＳＡキットの構築）
　マイクロタイタープレート（９６穴）の各穴に、０．５μｇの精製１Ａ１０抗体、４４Ａ３抗体、又はＡｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ抗体を含有する１００ｍＭのカーボネート緩衝液（ｐＨ９．５）を１００μＬ添加し、４℃で一晩静置して該プレートをコートした。１Ａ１０抗体、４４Ａ３抗体、又はＡｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ抗体は、それぞれ、Ａβ４０及びｐ３－４０のＣ末端、Ａβ４２及びｐ３－４２のＣ末端、又はＡＰＰのＣ末端を認識するモノクローナル抗体である。これらの抗体の具体的な認識部位は図１に示した通りである。その後、プレートをＰＢＳ－Ｔで洗浄し、２００μＬの１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％　ＮａＮ３を含むＰＢＳを各穴に加えて、４℃で一晩静置してブロックした。ＰＢＳ－Ｔにより二度洗浄後、被験サンプルの１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ－Ｔによる段階希釈溶液を１００μＬ／穴でコートされたマイクロタイタープレートに加え、４℃で１晩静置した。
　１Ａ１０抗体でコートしたプレート及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－結合２Ｇ２抗体を用いたＥＬＩＳＡ系を「ｐ３－４０　ＥＬＩＳＡキット」とし、４４Ａ３抗体抗体でコートしたプレート及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－結合２Ｇ２抗体を用いたＥＬＩＳＡ系を「ｐ３－４２　ＥＬＩＳＡキット」とし、Ａｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ抗体でコートしたプレート及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－結合２Ｇ２抗体を用いたＥＬＩＳＡ系を「α－ＣＴＦ　ＥＬＩＳＡキット」とした。
（２Ｇ２の交差反応性試験）
　被験サンプルとしては、１Ａ１０抗体、及び４４Ａ３抗体を用いた実験においては、ｐ３－４０（Ａβ１７－４０）、ｐ３－４２（Ａβ１７－４２）、Ａβ４０（１－４０）、及びＡβ４２（１－４２）を使用し、Ａｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ抗体を用いた実験においては、α－ＣＴＦ及びβ－ＣＴＦを使用した。また、本試験はデュプリケートで行った。ＰＢＳ－Ｔで４回洗浄後、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－結合２Ｇ２抗体を各穴に添加し、４℃で１時間静置した。ＰＢＳ－Ｔで穴を５回洗浄後、１００μＬの新たに調製したテトラメチルベンジジン試薬を各穴に基質として添加し、暗室、室温で３０分間静置した。１００μＬの１Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた。溶液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
　結果を図３に示す。いずれのＣ末特異的抗体と組み合わせた場合においても、２Ｇ２はα－セクレターゼ切断面であるＮ末端を有するペプチドとしか結合しないことが示された。具体的には、１Ａ１０抗体と２Ｇ２抗体とを組み合わせたＥＬＩＳＡ系（図３、左グラフ）においては、１Ａ１０が認識するＡβの４０番目のアミノ酸で切断されたＣ末端及びα－セクレターゼ切断面であるＮ末端を有するペプチドであるｐ３－４０（Ａβ１７－４０）が特異的に検出された。本ＥＬＩＳＡ系の交差反応率の平均値は、ｐ３－４２（Ａβ１７－４２）に対しては、０．２３％、Ａβ４０（１－４０）に対しては、０．０６％、Ａβ４２（１－４２）に対しては、０．０５％であった。ここで、交差反応率（％）は、以下の式により求めた：
　ＥＬＩＳＡで比較対象のペプチドについての測定値からｐ３－４０ペプチドを用いて作成した検量線により算出した濃度（実測値）／（比較対象のペプチドの添加濃度）×１００（％）
　よって、ｐ３－４０（Ａβ１７－４０）と同じＣ末端を有するペプチドであるＡβ４０（１－４０）に関する交差反応率は０．０６％であったことから、２Ｇ２は０．１％以下の交差反応率を示すことが示された。
　また、同様に、４４Ａ３抗体と２Ｇ２抗体とを組み合わせたＥＬＩＳＡ系（図３、中央グラフ）においては、４４Ａ３が認識するＡβの４２番目のアミノ酸で切断されたＣ末端及びα－セクレターゼ切断面であるＮ末端を有するペプチドであるｐ３－４２（Ａβ１７－４２）が特異的に検出された。本ＥＬＩＳＡ系の交差反応率の平均値は、ｐ３－４０（Ａβ１７－４０）に対しては、０．２５％、Ａβ４０（１－４０）に対しては、０．０５％、Ａβ４２（１－４２）に対しては、０．０５％であった。ここで、交差反応率（％）は、以下の式により求めた：
　ＥＬＩＳＡで比較対象のペプチドについての測定値からｐ３－４２ペプチドを用いて作成した検量線により算出した濃度（実測値）／（比較対象のペプチドの添加濃度）×１００（％）
　よって、ｐ３－４２（Ａβ１７－４２）と同じＣ末端を有するペプチドであるＡβ４２（１－４２）に関する交差反応率は０．０５％であったことから、２Ｇ２は０．１％以下の交差反応率を示すことが再度示された。
　更に、Ａｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ抗体と２Ｇ２抗体とを組み合わせたＥＬＩＳＡ系（図３、右グラフ）においては、Ａｎｔｉ－ＡＰＰ－Ｃ抗体は両方のＣＴＦ（αＣＴＦ及びβＣＴＦ）と結合するにも拘らず、α－セクレターゼ切断面であるＮ末端を有するαＣＴＦが特異的に検出された。本ＥＬＩＳＡ系の交差反応率の平均値は、βＣＴＦに対しては、０．０３％であった。ここで、交差反応率（％）は、以下の式により求めた：
　ＥＬＩＳＡで比較対象のペプチドについての測定値からαＣＴＦペプチドを用いて作成した検量線により算出した濃度（実測値）／（比較対象のペプチドの添加濃度）×１００（％）
　よって、αＣＴＦと同じＣ末端を有するペプチドであるβＣＴＦに関する交差反応率は０．０３％であったことから、２Ｇ２は０．１％以下の交差反応率を示すことが再度示された。
　以上の結果から、２Ｇ２が、β－セクレターゼ切断面とは結合しないことが示された。また、β－セクレターゼ切断物であるＡβは、未切断のα－サイトを含んでいることから、以上の結果は、２Ｇ２が未切断のα－サイトとも結合しないことを示すものである。特に、２Ｇ２は、β－セクレターゼ切断面、及び未切断のα－サイトを含むペプチドに対して、０．１％以下の交差反応率でα－セクレターゼ切断面と結合することが示された。
（実施例４）ｐ３－４０　ＥＬＩＳＡキット、ｐ３－４２　ＥＬＩＳＡキットＥＬＩＳＡキットの培養細胞系による検討
　細胞に対する市販のＢＡＣＥ（β－セクレターゼ）阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤を用いてｐ３－４０　ＥＬＩＳＡキット及びｐ３－４２　ＥＬＩＳＡキットについて検討した。
　Ｈｕｍａｎ　ＡＰＰのＳｗｅｄｉｓｈ変異を安定発現させたＨＥＫ２９３細胞、Ｈｕｍａｎ　ＡＰＰ　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅを安定発現させたＨＥＫ２９３細胞を６ｗｅｌｌマイクロプレ－トに１×１０５細胞／ｍＬで４．０ｍＬを播種し、１０％ＦＢＳ含有ＴＩＬ培地（ＩＢＬ社＃３３６４０）で１６時間培養した。培養後、培養液を分取・遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）し、得られた上清について、実施例３で構築したｐ３－４０　ＥＬＩＳＡキット、及びｐ３－４２　ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
　ＢＡＣＥ阻害剤（ＫＭＩ－５７４、Ｗａｋｏ社）による効果は、同様に６ｗｅｌｌマイクロプレ－トを使用し、薬剤処理１６時間後に培養液を分取・遠心分離し、得られた上清について同様に測定した。また、同様の条件下で、γ－セクレターゼ阻害剤（ＤＡＰＴ、Ｗａｋｏ社）の効果も検討した。
　その結果、ＡＰＰ　Ｓｗｅｄｉｓｈ変異を安定発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いた実験においては、ＤＡＰＴ処理によって培養上清中のｐ３－４０及びｐ３－４２が減少した。また、ＫＭＩ－５７４で処理することにより、培養上清中のｐ３－４０及びｐ３－４２が上昇した。ＡＰＰ　Ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅを安定発現させたＨＥＫ２９３細胞を用いた実験においては、ＤＡＰＴ処理によって培養上清中のｐ３－４０及びｐ３－４２が減少した。また、ＫＭＩ－５７４で処理することにより、培養上清中のｐ３－４０が上昇した（図４）。また、樹立細胞株を用いた実験においても、同様にｐ３－４０及びｐ３－４２を測定することができた。
　また、マウス及びラットの血漿及び血清を用いて同様に測定した結果、ｐ３－４０を検出することができた（非図示）。

Claims (14)

  1. 　アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片の切断面を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片。
  2. 　アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼ切断物のうちＣ末端側の断片（αＣＴＦ）、及びｐ３ペプチドを特異的に認識する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  3. 　以下のｉ）～ｉｉｉ）から選択される１以上のタンパク質又はペプチドを認識しないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片：
    　ｉ）アミロイド前駆体タンパク質のβ－セクレターゼ切断物、
    　ｉｉ）アミロイドβ、
    　ｉｉｉ）アミロイド前駆体タンパク質。
  4. 　配列番号１３に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体又はその抗原結合断片。
  5. 　配列番号１３に記載のアミノ酸配列を特異的に認識する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  6. 　重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２０、２１、及び２２に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号２３、２４、及び２５に記載のアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  7. 　以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載の抗体又はその抗原結合断片である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片：
    （ｉ）重鎖可変領域が、配列番号２６に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖可変領域が配列番号２７に記載されたアミノ酸配列をコードする核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片；
    （ｉｉ）重鎖可変領域が、配列番号２６のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖可変領域が、配列番号２７のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片；
    （ｉｉｉ）重鎖可変領域が配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有し、かつ、軽鎖可変領域が配列番号２７に記載のアミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列をコードする核酸構築物。
  9. 　請求項８に記載の核酸構築物を含有するベクター。
  10. 　請求項９に記載のベクターを保有する宿主細胞。
  11. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項８に記載の核酸構築物、請求項９に記載のベクター、あるいは、請求項１０に記載の細胞を備える、アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片の切断面を有するペプチドの測定用キット。
  12. 　アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片の切断面を有するペプチドが、アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼ切断物のうちＣ末端側の断片（αＣＴＦ）、又はｐ３ペプチドである、請求項１１に記載のキット。
  13. 　サンプルと請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を接触させるステップ、及び、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片に結合したアミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片の切断面を有するペプチドを測定するステップを備える、
    検体中のアミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片の切断面を有するペプチドの測定方法。
  14. 　アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼによる切断後のＣ末端側の断片の切断面を有するペプチドが、アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼ切断物のうちＣ末端側の断片（αＣＴＦ）、又はｐ３ペプチドである、請求項１３に記載の測定方法。
PCT/JP2014/001982 2013-04-08 2014-04-07 アミロイド前駆体タンパク質のα－セクレターゼ切断後のＣ末端側断片の切断面を特異的に認識する抗体及びその利用 WO2014167826A1 (ja)

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