JPWO2004009640A1 - 抗菌性ペプチドに対する抗体及びその利用 - Google Patents

Abstract

「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に結合する抗体、ならびに該抗体等を用いることを特徴とする、検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定方法および細菌性肺炎の検出方法。

Description

本発明は、ヒト由来のＣＡＰ１８（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ １８ｋＤａ；抗菌性タンパク質）に存在する特定のアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体、並びにこれを用いたＣＡＰ１８等の測定方法及び測定キットに関するものである。

特表平８−５０４０８５号公報（ＷＯ９４／０２５８９）には、ヒト由来のＣＡＰ１８のシグナルペプチド部分を含む全アミノ酸配列が記載されている。
「ミノファーゲン・メディカル・レビュー（ＭＩＮＯＰＨＡＧＥＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＶＩＥＷ）」第４３巻，第１号，ｐｐ１−１５（１９９８）には、ヒト由来のＣＡＰ１８の全アミノ酸配列が記載されている。またヒト由来のＣＡＰ１８のＣ末端領域の３４、３２、３０、２７、２４又は２２アミノ酸残基からなる部分ペプチドも記載されている。
「現代医療」第２８巻（増刊ＩＩＩ）ｐｐ２３６７−２３７５（１９９６）には、ヒト由来のＣＡＰ１８の全アミノ酸配列が記載されている。またヒト由来のＣＡＰ１８のＣ末端領域の３４、３０、２７、２４又は２２アミノ酸残基からなる部分ペプチドも記載されている。
ＳＨＯＣＫ；Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌ ｔｏ Ｗｈｏｌｅ Ｂｏｄｙ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｈｏｃｋ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ−Ｓｈｏｃｋ’９５，Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ，２１−２３ Ｏｃｔｏｂｅｒ（１９９５）），Ｏｋａｄａ，Ｋ．，Ｏｇａｔａ，Ｈ．ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂ．Ｖ．ｐｐ１０９−１１５（１９９６）には、ヒト由来のＣＡＰ１８の全アミノ酸配列が記載されている。またヒト由来のＣＡＰ１８のＣ末端領域の３４、３０、２７又は２４アミノ酸残基からなる部分ペプチドも記載されている。またこれらペプチドのリポ多糖体（ＬＰＳ）への結合活性についてのデータが記載されている。
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ；Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｅｖｉｎ，Ｊ．，Ａｌｖｉｎｇ，Ｃ．Ｒ，Ｍｕｎｆｏｒｄ，Ｒ．Ｓ．，Ｒｅｄｌ，Ｈ．ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ３１７−３２６（１９９５）には、ヒト由来のＣＡＰ１８のＣ末端領域の３７又は３２アミノ酸残基からなる部分ペプチドが記載されている。
しかし、ＣＡＰ１８の部分ペプチド（配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド）に結合する抗体については記載も示唆もない。またこの抗体を用いて、ＣＡＰ１８をはじめとする「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を測定する方法や、そのためのキット等についての記載も示唆もない。
ＣＡＰ１８に特徴的なペプチドに結合する抗体が得られれば、ＣＡＰ１８の検出や測定のツールとしても利用することができる。しかもその抗体は均質性や再現性が高く、さらに大量かつ永続的に生産させうるものであることから、製造コストを大幅に低減させることもできる。
またこの抗体を利用したＣＡＰ１８等の測定方法や測定キットが提供されれば、ＣＡＰ１８等が関連する疾患の研究用試薬や診断薬等に応用することもでき、さらにこのような疾患のモニタリング等にも応用できる可能性がある。

本発明は、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に結合する抗体（以下、本発明抗体という）を提供する。
本発明抗体は「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に特異的に結合するものが好ましく、この抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。またこの抗体は、免疫グロブリンサブクラスがＩｇＧ１であるものが好ましい。
また本発明抗体は「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に特異的に結合するものが好ましく、この抗体はポリクローナル抗体であるものが好ましい。
また本発明は、「本発明抗体」を用いることを特徴とする、検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定方法（以下、本発明方法という）を提供する。
本発明方法は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程（以下、本発明方法１という）によって行われることが好ましい。
（ａ）固相と検体を接触させ、検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を固相に固着させる工程。
（ｂ）工程（ａ）で固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を、本発明抗体を用いて検出する工程。
本発明方法１で用いる「本発明抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。また、固相に固着された「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の検出は、さらに「本発明抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることも好ましい。
また本発明方法は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程（以下、本発明方法２という）によって行われることが好ましい。
（ａ）「本発明抗体（第１抗体）が固着された固相」、「検体」及び「本発明抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（ｂ）工程（ａ）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
この方法は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることがより好ましい。
（ａ）「本発明抗体（第１抗体）が固着された固相」に検体を接触させて、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」からなる複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記固相に、「本発明抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（ｃ）工程（ｂ）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
本発明方法２で用いる「第２抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。また、本発明方法２における複合体の検出は、「第２抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることも好ましい。
また本発明方法は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程（以下、本発明方法３という）によって行われることも好ましい。
（ａ）「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」、「検体」及び「本発明抗体」を接触させ、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体及び「検体中の『配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド』−本発明抗体」からなる複合体を形成させる工程。
（ｂ）工程（ａ）において形成された「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体及び「検体中の『配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド』−本発明抗体」からなる複合体の少なくともいずれか一方を検出する工程。
この方法は、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることがより好ましい。
（ａ）検体と「本発明抗体」を接触させて、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−本発明抗体」からなる複合体Ａを形成させる工程。
（ｂ）「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」に、工程（ａ）によって得られた「『複合体Ａ』と『複合体Ａを形成しなかった本発明抗体』とを含有する混合物」を接触させ、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体を形成させる工程。
（ｃ）工程（ｂ）において形成された複合体を検出する工程。
本発明方法３で用いる「本発明抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。また、本発明方法３における複合体の検出は、「本発明抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることも好ましい。
本発明方法に付される「検体」は、体液であることが好ましい。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キット（以下、本発明キット１という）を提供する。
（Ａ）固相
（Ｂ）本発明抗体
本発明キット１で用いる「本発明抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キット（以下、本発明キット２という）を提供する。
（Ａ）本発明抗体（第１抗体）が固着された固相
（Ｂ）本発明抗体（第２抗体）
本発明キット２で用いる「第２抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
また本発明は、下記の構成成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キット（以下、本発明キット３という）を提供する。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相
（Ｂ）本発明抗体
（Ｃ）本発明抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの
また本発明は「本発明抗体」又は「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」によって検出されることができる検体中の抗原を測定し、その結果から検体を採取した患者の細菌性肺炎を検出することを特徴とする細菌性肺炎の検出方法（以下、本発明検出方法という）を提供する。
本発明検出方法は、検体中の抗原が、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」及びＣＡＰ１８からなる群から選択される抗原であることが好ましい。
また、本発明検出方法は、測定が「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」、「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体」、「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体」及び「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」からなる群から選択される抗体を用いて、免疫学的に行われることが好ましい。
また、本発明検出方法は、細菌性肺炎の検出が、細菌性肺炎の罹患の有無、程度、種類の評価、またはモニタリングであることが好ましい。
また、本発明検出方法は、測定が上記本発明方法で行われることが好ましい。
本発明は、「本発明の抗体」を含む細菌性肺炎の診断キット（以下、本発明診断キットという）を提供する。
また、本発明診断キットは、本発明キット１〜３のいずれか１つからなるキットであることが好ましい。
本発明は、「本発明の抗体」を有効成分として含む細菌性肺炎の診断薬（以下、本発明診断薬という）を提供する。

第１図は、モノクロナール抗体Ｔｏｙｏ６Ｅ３による細胞の免疫染色像を示す写真である（生物の形態）。
第２図は、直接ＥＬＩＳＡ法によるペプチドの検出・定量結果を示す図である。
第３図は、間接ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）によるＣＡＰ１８の検出・定量結果を示す図である。
第４図は、ウェスタンブロット法による細胞抽出液中のＣＡＰ１８の検出結果を示す写真である。
第５図は、免疫沈降による血清中のＣＡＰ１８の検出結果を示す写真である。
第６図は、ｆＭＬＰ刺激したヒト好中球からのＣＡＰ１８の放出を、ＥＬＩＳＡで検出・定量した結果を示す図（Ａ、Ｂ）及び写真（Ｃ）である。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体を提供するに至った。さらに、この抗体を用いてＣＡＰ１８をはじめとする「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定方法及びその測定キットを提供するに至り、本発明を完成した。
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明抗体
ヒト由来のＣＡＰ１８のシグナルペプチド部分を含む全アミノ酸配列は配列番号４に示される。シグナルペプチド部分は、配列番号４の−３０番目から−１番目のアミノ酸に対応する。
本発明抗体は、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に結合する抗体である。配列番号１で示されるアミノ酸配列は、配列番号４の１０９番目から１３５番目のアミノ酸に対応する。
本発明抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１のペプチド自体）又はその部分ペプチド（以下、これらを抗原ペプチドともいう）を抗原として、通常の抗体の製造方法によって取得することができる。
部分ペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを挙げることができる。配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号４の１１８番目から１３５番目のアミノ酸に対応し、配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列番号４の１０９番目から１１７番目のアミノ酸に対応する。
このような抗原ペプチドは、その配列に基づいてペプチドの公知の化学合成法（例えば液相合成法や固相合成法等；泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典、「ペプチド合成の基礎と実験」１９８５、丸善（株）参照）により製造することができる。
またこの抗原ペプチドのアミノ酸配列に対応するポリヌクレオチド（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）を製造し、当該ポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的手法により製造することもできる。
なお、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に結合する抗体が取得できる限りにおいて、抗原ペプチドとして、ＣＡＰ１８をはじめとする「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を用いてもよい。この場合、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」以外のペプチドに結合する抗体も取得されうることから、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」を用いてこれに結合する抗体を選別すればよい。
製造した抗原ペプチドは、タンパク質化学の分野において一般に知られているタンパク質の単離、精製方法によって精製することができる。具体的には、例えば抽出、再結晶、硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、向流分配等や、これらの組合せ等の処理操作が挙げられる。
製造された抗原ペプチドのアミノ酸配列を、公知のアミノ酸配列決定法（例えばエドマン分解法等）により決定し、抗原ペプチドが正しく製造されたか否かを確認することができる。
なお、抗原として配列番号１、配列番号２又は配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドのような比較的低分子量のペプチドを用いる場合には、これにヘモシアニン、オボアルブミン、γグロブリン等の担体を結合させたものを抗原として用いることが好ましい。
本発明抗体は、モノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。本発明抗体の製造は、モノクローナル抗体とするかポリクローナル抗体とするかによって、以下の通り行うことができる。
モノクローナルな本発明抗体は、前記の抗原ペプチドを用いて、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））によって製造することができる。
例えば抗原ペプチドをマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリ等の被免疫動物の腹腔内、皮下、足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）等に投与する。これらの被免疫動物のなかでもマウスを用いることが好ましい。すなわち本発明抗体は、マウス由来の抗体であることが好ましい。
被免疫動物から脾臓細胞、リンパ細胞、末梢血液等を採取し、これらと腫瘍細胞株であるミエローマ細胞とを細胞融合させてハイブリドーマを調製する。なお細胞融合に用いるミエローマ細胞は、種々の哺乳動物の細胞株を利用することができるが、被免疫動物と同種の動物の細胞株を用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、細胞融合の後に未融合細胞と融合細胞とを区別できるようにするために、未融合のミエローマ細胞が生存できずハイブリドーマだけが増殖できるように、マーカーを有するものを用いることが好ましい。またミエローマ細胞は、固有の免疫グロブリンを分泌しない株を使用することが、ハイブリドーマの培養上清から目的の抗体を取得することが容易となる点で好ましい。
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、抗原に対して特異的に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を選別する。
こうして選別されたハイブリドーマ株を好適な培地で培養することによって、培地中にモノクローナル抗体が得られる。なお、マウスの腹腔などの生体内にて前記ハイブリドーマ株を培養し、腹水等から単離することによって、モノクローナル抗体を大量に製造することもできる。このようにして得られたモノクローナル抗体は、通常の抗体の精製方法によって精製してもよい。
またポリクローナルな本発明抗体は、前記の抗原ペプチドを用いて以下の通り製造することができる。
前記のモノクローナル抗体の製造方法と同様に、抗原ペプチドを被免疫動物に投与する。ここでは被免疫動物としてウサギを用いることが好ましい。
被免疫動物を免疫する際に、補助剤（アジュバント）を併用することは、抗体産生細胞を賦活するので望ましい。また初回免疫後、２〜３週目に常法によって追加免疫を行うと力価の高い抗血清が得られる。最終免疫から約１週間後に血液を採取し、血清を分離する。この血清を熱処理して補体を失活させた後、通常の抗体の精製方法によってイムノグロブリン画分を精製してもよい。
抗体の精製法としては、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等による塩析、低温アルコール沈殿およびポリエチレングリコールまたは等電点による選択的沈殿分別法、電気泳動法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−誘導体、ＣＭ（カルボキシメチル）−誘導体等のイオン交換体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、抗原を固定化した免疫吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過法および超遠心法等を挙げることができる。
なお本発明抗体を、抗原結合部位（Ｆａｂ）を分解しないプロテアーゼ（例えばプラスミン、ペプシン、パパイン等）で処理して、Ｆａｂを含むフラグメント等としても良い。抗体のＦａｂを含むフラグメントとしては、Ｆａｂ以外に、Ｆａｂｃ、（Ｆａｂ’）_２等が例示される。このようなものも、本明細書における「本発明抗体」の概念に包含される。
また本発明抗体をコードする遺伝子の塩基配列もしくは本発明抗体のアミノ酸配列が決定されれば、遺伝子工学的に本発明抗体のＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体（例えば本発明抗体のＦａｂ部分を含むキメラ抗体等）を作製することもできる。このような本発明抗体のＦａｂを含むフラグメントやキメラ抗体も、抗原ペプチドに結合する限り本明細書における「本発明抗体」の概念に包含される。
製造された抗体が抗原ペプチドに結合するか否か、あるいは特異的に結合するか否かは、抗原ペプチドや抗原となりうる他の物質（例えば、他の種類のペプチド）等を用い、通常の方法によって当業者が容易に決定することができる。
このようにして得られる本発明抗体は、免疫グロブリンサブクラスがＩｇＧ１であるものが好ましい。免疫グロブリンサブクラスがＩｇＧ１である抗体は、抗ＩｇＧ１抗体を用いたスクリーニング等によって取得することができる。
このような本発明抗体として特に好ましいものは、「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に特異的に結合する抗体である。この抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。またこの抗体の免疫グロブリンサブクラスは、上記の通りＩｇＧ１であることが好ましい。
また本発明抗体の別の好ましい態様は、「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に特異的に結合する抗体である。この抗体はポリクローナル抗体であることが好ましい。
また本発明抗体は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであってもよい。標識に用いることができる標識物質は、通常のタンパク質の標識に使用可能なものであれば特に限定されないが、例えば酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなど）、放射性同位元素（^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３Ｈなど）、蛍光色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リスアミンローダミンＢ（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、フィコエリスリン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；ＰＥ）、ウンベリフェロン、ユーロピウム、フィコシアニン、トリカラー、シアニンなど）、化学発光物質（ルミノールなど）、ハプテン（ジニトロフルオロベンゼン、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、２，４−ジニトロアニリンなど）、特異的結合対（ビオチンとアビジン類（ストレプトアビジンなど）、レクチンと糖鎖、アゴニストとアゴニストの受容体、ヘパリンとアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、多糖類とその結合タンパク質（ヒアルロン酸とヒアルロン酸結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）など）のいずれか一方の物質等が例示される。
本発明抗体を標識物質で標識する方法は、標識物質に適した公知の方法、例えば酵素で標識する場合にはグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸架橋法、マレイミド架橋法、カルボジイミド法、活性化エステル法など、放射性同位元素で標識する場合にはクロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法など（続生化学実験講座２「タンパク質の化学（下）」、東京化学同人（１９８７年）参照）から適宜選択することができる。例えば標識物質としてビオチンを使用する場合は、ビオチンのＮ−ヒドロキシサクシミドエステル誘導体又はヒドラジド誘導体を用いる方法（Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｐ５７−６３，ＰＩＥＲＣＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯＭＰＡＮＹ，１９９４年発行参照）を用いることができる。
また本発明抗体を保存、流通、使用等する場合には、本発明抗体の機能や作用を実質的に害さない限り他の成分を含有させてもよい。例えば通常の試薬の調製に用いられる賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を含有させることもできる。具体的には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等が例示される。
＜２＞本発明方法
本発明方法は、「本発明抗体」を用いることを特徴とする、検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定方法である。
本発明方法で用いる「本発明抗体」の説明は、前記の「本発明抗体」の説明と同様である。この本発明抗体は、検出を容易とするために標識物質で標識されているか又は標識されることが好ましい。標識に用いることができる標識物質や標識方法は、前記と同様である。
また「検体」も特に限定されず、ＣＡＰ１８をはじめとする「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を含有するか、あるいは含有する可能性があるものを用いることができる。例えば、ＣＡＰ１８の標準溶液、細胞や組織の抽出液、細胞の培養上清、体液等を用いることができるが、体液であることが好ましい。「体液」としては、例えば血液（本明細書では、血清及び血漿を含む概念として用いる）、尿、唾液、汗、涙液、関節液等を挙げることができる。
また、測定対象となる「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有する限りにおいて特に限定されず、またポリペプチドを含む概念である。例えば、ＣＡＰ１８、その部分ペプチド（配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するもの）、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド自体等を例示することができる。
検体中に存在する「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の「測定」の方法は、本発明抗体を用いて当該ペプチドを検出しうる方法である限りにおいて特に限定されない。なお、本発明方法における「測定」とは、定量的な検出のみならず、定性的な検出（存否を検出すること）をも含む概念である。従って、本発明方法における「測定」には、検体中から当該ペプチドをスクリーニングすることも含まれる。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定を、本発明抗体を用いて行う方法としては、例えば以下のものを挙げることができる。
ｉ）検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を固相に固着させ、これを直接検出する方法（いわゆる直接ＥＬＩＳＡ法）。
ｉｉ）本発明抗体（第１抗体）が固着された固相に検体を接触させ、次いでこれに本発明抗体（第２抗体）を接触させることによって、サンドイッチ状複合体を形成させ、この複合体を検出する方法（いわゆるサンドイッチ法）。
ｉｉｉ）固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」、検体及び本発明抗体（検体及び本発明抗体は、予め接触させておいてもよい）の共存下で、固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」と検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」とを競合させ、固相に結合した本発明抗体を検出することによって検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を測定する方法（いわゆる阻害法）。
ｉｖ）本発明抗体を固着させた微粒子に検体を接触させ、次いでこれに本発明抗体を接触させることによって微粒子を凝集させて、この凝集物（または沈殿物）を検出する方法（いわゆる凝集法）。
＜２＞−１ 本発明方法１
本発明方法は、なかでも直接ＥＬＩＳＡ法によって行われることが好ましい。すなわち本発明方法は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程（本発明方法１）によって行われることが好ましい。
（ａ）固相と検体を接触させ、検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を固相に固着させる工程。
（ｂ）工程（ａ）で固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を、本発明抗体を用いて検出する工程。
以下、この方法を各工程ごとに詳述する。
工程（ａ）：
工程（ａ）は、固相と検体を接触させ、検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を固相に固着させる工程である。検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を固着する「固相」は、当該ペプチドを固着させることができ、かつ、水、検体または測定反応液に不溶性である限りにおいて特に限定されない。固相の形状としては、プレート（例えばマイクロプレートのウエル等）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、微粒子状固相担体（ゼラチン粒子、カオリン粒子、ラテックス等の合成ポリマー粒子等）等を例示することができる。なかでも、正確な定量性と使用上の簡便性の点から、マイクロプレートが望ましい。
固相の材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、テフロン（登録商標）、ポリアロマー、ポリエチレン、ガラス、アガロース等が例示される。これらの中でも、ポリスチレンを材質としたプレートが好ましい。
このような固相に検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を固着させる方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法などの固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、１９７５年、講談社発行、第９〜７５頁参照）を応用することができる。
これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
物理的吸着の具体的方法を例示すると以下の通りである。
検体をｐＨ７〜１０程度の緩衝液（例えば炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＢＳ等）で希釈して固相（例えばマイクロプレート）に加え、２０〜３７℃程度で１〜２時間保存するか、４℃程度で一晩保存して固着させる。
ここで用いる「検体」や、測定対象である「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」については、前記の説明と同様である。
また、固相と検体との接触方法は、当該固相と、検体中に存在する「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」とが接触する限りにおいて特に限定されない。例えば、固相に検体を添加して接触させても良く、また検体に固相を添加して接触させても良く、別体の容器に両者を同時に添加しても良い。接触の方法はこれらに限定されるものではなく、固相の形状や材質等に応じて当業者が適宜決定することができる。
固相と検体を接触させた後、固相と液相を分離する。必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄し、非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい。
洗浄液としては、例えば、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液（例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等）を用いることが好ましい。
固相と検体を接触させることによって、検体中に存在する「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」が固相に固着される。
工程（ｂ）：
工程（ｂ）は、工程（ａ）で固相に固着された「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を、本発明抗体を用いて検出する工程である。本発明抗体の説明は、前記の説明と同様である。
固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の検出方法は、本発明抗体を用いて検出する限りにおいて特に限定されない。例えば本発明抗体が標識物質で標識されている場合には、固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」にその本発明抗体を結合させた後、当該標識物質を検出することによって、当該ペプチドを検出することができる。
標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。例えば、標識物質として特異的結合対の一方の物質（例えばビオチン）を使用した場合には、これに特異的に結合する他方の物質（例えばストレプトアビジン）を結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加して、特異的結合対を形成せしめる。次いで、これに該酵素の基質（例えば過酸化水素（酵素がペルオキシダーゼの場合））及び発色物質（例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）や、ジアミノベンチジン等）を添加して、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度で測定することによって、標識物質を検出することができる。
また、例えば標識物質として放射性同位元素、蛍光色素又は化学発光物質を使用した場合には、放射能のカウント、蛍光強度、蛍光偏光、発光強度等を測定する方法などが例示される。
このような標識物質の検出を介して、固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を検出することができ、これによって検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を測定することができる。この方法は直接ＥＬＩＳＡ法であることから、標識物質が多く検出されたとすれば、それだけ固相に固着された「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の量が多いこと、すなわち検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の量が多いことを意味することになる。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の定性的な測定（存否の検出）を所望する場合には、標識物質の検出の有無をそのまま測定結果とすることができる。
また、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の定量的な測定（濃度の測定など）を所望する場合には、吸光度、放射能のカウント、蛍光強度、発光強度などをそのまま「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の量の指標とすることができる。また、既知濃度の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の標準溶液を用いて、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」と標識物質の検出結果（例えば吸光度）との関係について予め検量線又は関係式を作成しておき、これを用いて検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の濃度を求めることもできる。また検体として尿を用いた場合には、求められた濃度を、尿中に含まれるクレアチニンなどの他の成分の濃度を基準に補正をしてもよい。
また、固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の検出は、「本発明抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることも好ましい。
「本発明抗体に特異的に結合する抗体」は、本発明抗体に特異的に結合するものである限りにおいて特に限定されない。例えば、本発明抗体の由来動物や免疫グロブリンクラス等に応じて、当該動物の当該免疫グロブリンクラスに特異的に結合する抗体等が例示される。例えば、本発明抗体が免疫グロブリン（マウス由来のＩｇＧ１）である場合には、「本発明抗体に特異的に結合する抗体」として抗マウスＩｇＧ１抗体を用いることができる。また、「本発明抗体に特異的に結合する抗体」の標識に用いることができる標識物質、標識方法、標識物質を検出する方法等については、前記の説明と同様である。
＜２＞−２ 本発明方法２
また本発明方法は、サンドイッチ法によって行われることも好ましい。すなわち本発明方法は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程（本発明方法２）によって行われることも好ましい。
（ａ） 「本発明抗体（第１抗体）が固着された固相」、「検体」及び「本発明抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（ｂ） 工程（ａ）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
この工程（ａ）は、「本発明抗体（第１抗体）が固着された固相」、「検体」及び「本発明抗体（第２抗体）」の３者を同時に接触させてもよく、前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させてもよく、また、後２者を接触させた後にこれを前１者に接触させてもよい。なかでも前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させることが好ましい。すなわち、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることがより好ましい。
（ａ）「本発明抗体（第１抗体）が固着された固相」に検体を接触させて、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」からなる複合体を形成させる工程。
（ｂ）前記固相に、「本発明抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
（ｃ）工程（ｂ）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
以下、この方法を各工程ごとに詳述する。
工程（ａ）：
工程（ａ）は、「本発明抗体（第１抗体）が固着された固相」に検体を接触させて、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」からなる複合体を形成させる工程である。
「本発明抗体（第１抗体）」の説明は、前記の説明と同様である。
また、本発明抗体（第１抗体）を固着する「固相」についての説明も、本発明方法１と同様である。また、固相に本発明抗体（第１抗体）を固着させる方法も、本発明方法１と同様であって、物理的吸着法、共有結合法、包括法などの一般的な方法を採用することができる。なかでも物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
物理的吸着の具体的方法を例示すると以下の通りである。
本発明抗体（第１抗体）をｐＨ７〜９程度の緩衝液（例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等）に溶解して固相（例えばマイクロプレート）に加え、２０〜３７℃程度で１〜２時間保存するか、４℃程度で一晩保存して固着させる。
また、本発明抗体（第１抗体）を固着させた固相の表面には、これらが固着していない表面部分が残存している場合があり、そこに検体中に存在する「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」が非特異的に固着すると正確な測定結果が得られなくなるおそれがある。よって、検体を固相と接触させる前にブロッキング物質を添加して、本発明抗体（第１抗体）が固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、血清、血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン、プルロニック等が挙げられ、また、ブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。
ブロッキングの方法として具体的には、ブロッキング物質を添加して、３７℃程度で３０分〜２時間保存するか、常温（１５〜２５℃）で１〜２時間保存する方法を例示することができる。
ここで用いる「検体」は、前記の説明と同様である。
また、固相と検体との接触方法は、当該固相に固着された本発明抗体（第１抗体）と、検体中に存在する「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」とが接触する限りにおいて特に限定されない。「固相と検体との接触方法」に関する他の説明は、本発明方法１と同様である。
これら両者を接触させた後、本発明抗体（第１抗体）と検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」とを十分に結合させるために、例えば４〜３７℃、好ましくは２０〜３７℃で１〜４時間程度反応させることが好ましい。
この反応後に固相と液相を分離する。必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄し、非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい。ここで用いることができる洗浄液の説明は、本発明方法１における説明と同様である。
本発明抗体（第１抗体）が固着された固相に検体を接触させることによって、「固相に固着された本発明抗体（第１抗体）−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」からなる複合体が形成される。
工程（ｂ）：
工程（ｂ）は、工程（ａ）を経た前記固相に、「本発明抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程である。
「本発明抗体（第２抗体）」の説明は、前記の説明と同様である。
この第２抗体は、検出を容易とするために標識物質で標識されているか又は標識されることが好ましい。標識に用いることができる標識物質や標識方法は、前記と同様である。
工程（ａ）を経た前記固相と本発明抗体（第２抗体）との接触は、前記の「固相と検体との接触方法」と同様に行うことができる。反応後に固相と液相を分離する点、及び必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄して非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい点についても同様である。また、用いることができる洗浄液についても同様である。
工程（ａ）を経た前記固相（「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」からなる複合体が形成されている）に、第２抗体を接触させることによって、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体が形成される。
工程（ｃ）：
工程（ｃ）は、工程（ｂ）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程である。
サンドイッチ状複合体の検出方法は特に限定されない。例えば第２抗体が標識物質で標識されている場合には、当該標識物質を検出することによって、当該複合体を検出することができる。
標識物質を検出する方法は、標識物質の種類に応じた公知の検出手段を適宜選択することができる。その他の説明も、本発明方法１と同様である。
このような標識物質の検出を介してサンドイッチ状複合体を検出することができ、これによって検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を測定することができる。この方法はサンドイッチ法であることから、標識物質が多く検出されたとすれば、それだけサンドイッチ状複合体の量が多いこと、すなわち検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の量が多いこと意味することになる。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の定性的な測定（存否の検出）や定量的な測定（濃度の測定など）に関する説明も、本発明方法１と同様である。
また、本発明方法２における複合体の検出は、「第２抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることも好ましい。
「第２抗体（本発明抗体）に特異的に結合する抗体」に関する説明も、本発明方法１における「本発明抗体に特異的に結合する抗体」の説明と同様である。
＜２＞−３ 本発明方法３
本発明方法は、阻害法によって行われることも好ましい。すなわち本発明方法は、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程（本発明方法３）によって行われることも好ましい。
（ａ）「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」、「検体」及び「本発明抗体」を接触させ、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体及び「検体中の『配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド』−本発明抗体」からなる複合体を形成させる工程。
（ｂ）工程（ａ）において形成された「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体及び「検体中の『配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド』−本発明抗体」からなる複合体の少なくともいずれか一方を検出する工程。
この工程（ａ）では、「本発明抗体」、「検体」及び「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」の３者を同時に接触させてもよく、前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させてもよく、また、後２者を接触させた後にこれを前１者に接触させてもよい。なかでも、前２者を接触させた後にこれを後１者に接触させることが好ましい。
またこの工程（ｂ）では、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体及び「検体中の『配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド』−本発明抗体」からなる複合体の、前者のみを検出してもよく、後者のみを検出してもよく、またこれらの両方を検出してもよい。この本発明方法は、なかでも前者のみを検出することが好ましい。すなわち、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることがより好ましい。
（ａ）検体と「本発明抗体」を接触させて、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−本発明抗体」からなる複合体Ａを形成させる工程。
（ｂ）「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」に、工程（ａ）によって得られた「『複合体Ａ』と『複合体Ａを形成しなかった本発明抗体』とを含有する混合物」を接触させ、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体を形成させる工程。
（ｃ）工程（ｂ）において形成された複合体を検出する工程。
以下、この方法を各工程ごとに詳述する。
工程（ａ）：
工程（ａ）は、検体と本発明抗体とを接触させて、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−本発明抗体」からなる複合体Ａを形成させる工程である。
「検体」については前記の説明と同様である。また「本発明抗体」の説明も、前記の説明と同様である。検体と本発明抗体との接触方法も、本発明抗体と、検体中に存在する「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」とが接触する限りにおいて特に限定されない。
検体と本発明抗体とを接触させることによって、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−本発明抗体」からなる複合体Ａが形成される。その結果、工程（ａ）によって「『複合体Ａ』と『複合体Ａを形成しなかった本発明抗体』とを含有する混合物」が得られる。
工程（ｂ）：
工程（ｂ）は、「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」に、工程（ａ）によって得られた「『複合体Ａ』と『複合体Ａを形成しなかった本発明抗体』とを含有する混合物」を接触させ、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体を形成させる工程である。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」を固着する固相についての説明は、本発明方法１と同様である。
また、固相に固着する「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」についても前記の説明と同様である。なお、このペプチドの代わりに「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」又は「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」も使用しうる。
固相に「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」を固着させる方法も、本発明方法１と同様であって、物理的吸着法、共有結合法などの一般的な方法を採用することができる。なかでも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」と、工程（ａ）によって得られた混合物との接触も、前記と同様に行うことができる。反応後に固相と液相を分離する点、及び必要に応じて固相の表面を洗浄液で洗浄して非特異的吸着物や反応しなかった検体中の成分を除去することが好ましい点についても前記と同様である。また、用いることができる洗浄液についても前記と同様である。
「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」と、工程（ａ）によって得られた混合物とを接触させることによって、「複合体Ａを形成しなかった本発明抗体」が「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に結合し、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−本発明抗体」からなる複合体が形成される。
工程（ｃ）：
工程（ｃ）は、工程（ｂ）において形成された複合体を検出する工程である。複合体の検出方法も特に限定されないが、「本発明抗体」として標識物質で標識されているか又は標識されるものを用いた場合には、本発明方法１と同様の方法で標識物質を検出することによって、当該複合体の検出をすることができる。また、複合体の検出は、「本発明抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることも好ましい。
「本発明抗体に特異的に結合する抗体」や、その標識に用いることができる標識物質、標識方法、標識物質を検出する方法等についても、本発明方法１における説明と同様である。ただし、この方法は阻害法であることから、標識物質が多く検出されたとすれば、それだけ「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−本発明抗体」からなる複合体Ａを形成しなかった本発明抗体」の量が多いこと（その分、当該複合体Ａの量が少ないこと）、すなわち検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の量が少ないこと意味することになる。
＜３＞−１ 本発明キット１
本発明キット１は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キットである。
（Ａ）固相
（Ｂ）本発明抗体
本発明キット１で用いる本発明抗体は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
本発明キット１における「固相」、「本発明抗体」、「標識物質」、標識物質による抗体の標識方法、及び測定対象である「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」等の説明は、いずれも前記の「＜２＞本発明方法」における説明と同様である。この本発明キットは、直接ＥＬＩＳＡ法による「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定に用いることができる。
＜３＞−２ 本発明キット２
本発明キット２は、下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キットである。
（Ａ）本発明抗体（第１抗体）が固着された固相
（Ｂ）本発明抗体（第２抗体）
本発明キット２で用いる「第２抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
本発明キット２における「本発明抗体（第１抗体、第２抗体）」、「本発明抗体（第１抗体）が固着された固相」、「標識物質」、標識物質による抗体の標識方法、及び測定対象である「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」等の説明は、いずれも前記の「＜２＞本発明方法」における説明と同様である。この本発明キットは、サンドイッチ法による「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定に用いることができる。
＜３＞−３ 本発明キット３
本発明キット３は、下記の構成成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キットである。
（Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相
（Ｂ）本発明抗体
（Ｃ）本発明抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの
この本発明キットにおける「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」、「本発明抗体」、「本発明抗体に特異的に結合する抗体」、「標識物質」、標識物質による抗体の標識方法、及び測定対象である「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」等の説明は、いずれも前記の「＜２＞本発明方法」における説明と同様である。この本発明キットは、阻害法による「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定に用いることができる。
本発明キット１を用いた測定は本発明方法１に従って、本発明キット２を用いた測定は本発明方法２に従って、本発明キット３を用いた測定は本発明方法３に従って、それぞれ行うことができる。
＜４＞ 本発明検出方法
本発明検出方法は、「本発明抗体」又は「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」によって検出されることができる検体中の抗原を測定し、その結果から検体を採取した患者の細菌性肺炎を検出することを特徴とする細菌性肺炎の検出方法である。
本発明検出方法で用いる「本発明抗体」及び「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
本発明検出方法における「本発明抗体」、「標識物質」、標識物質による抗体の標識方法、「検体」及び測定対象である「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」等の抗原の説明は、いずれも前記の「＜２＞本発明方法」における説明と同様である。
ＣＡＰ１８は、哺乳動物のＣＡＰ１８が好ましく、特にヒトのＣＡＰ１８が好ましい。
「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」は、ＣＡＰ１８に特異的に結合可能であれば特に限定されず、また、結合部位も特に限定されない。
本発明検出方法は、「本発明抗体」または「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」を用いて免疫学的に行われることが好ましく、具体的には、前記の「＜２＞本発明方法」があげられる。「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」は、「本発明抗体」に置き換えることにより用いられる。
本発明検出方法において、細菌性肺炎の検出が、好ましくは細菌性肺炎の罹患の有無、程度、種類の評価、またはモニタリングで行われる。具体的には、これらの検出は、「本発明抗体」又は「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」によって検出されることができる抗原を含有する検体の測定結果と、該抗原を含有しない検体の測定結果を比較することによって、行うことが可能である。
ＣＡＰ１８の検出は上記方法に限定されず、ペプチドの通常の検出方法、例えば高速液体クロマトグラフィー等で検出することも可能である。
＜５＞ 本発明診断キット
本発明診断キットは、「本発明の抗体」を含む細菌性肺炎の診断キットである。
本発明診断キットで用いる「本発明抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
本発明診断キットにおける「本発明抗体」、「標識物質」および標識物質による抗体の標識方法は、いずれも前記の「＜２＞本発明方法」における説明と同様である。
また、本発明診断キットは、本発明キット１〜３のいずれか１つからなるキットであることが好ましく、本発明キット１を用いた測定は本発明方法１に従って、本発明キット２を用いた測定は本発明方法２に従って、本発明キット３を用いた測定は本発明方法３に従って、それぞれ行うことができる。
＜６＞ 本発明診断薬
本発明診断薬は、「本発明の抗体」を含む細菌性肺炎の診断薬である。
本発明診断薬で用いる「本発明抗体」は、標識物質で標識されているか又は標識されるものであることが好ましい。
本発明診断薬における「本発明抗体」、「標識物質」および標識物質による抗体の標識方法は、いずれも前記の「＜２＞本発明方法」における説明と同様である。
本発明診断薬は、製薬上許容される担体を含有してもよい。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１ 本発明抗体の製造
（１）モノクローナル抗体の製造
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（ＦＲ ＫＳＫＥＫ ＩＧＫＥＦ ＫＲＩＶＱ ＲＩＫＤＦ ＬＲＮＬＶ；以下、「２７アミノ酸ペプチド」という）を合成し、これにヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｄ Ｌｙｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を結合させたものをマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）（日本クレア株式会社、８週齢）の腹腔内に初回２５μｇ、２回目以降１０μｇ、計４回投与して免疫した（この際、アジュバントとして初回はフロインド完全アジュバンド（和光純薬工業社製）、以後はフロインド不完全アジュバンド（和光純薬工業社製）を用いた）。免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、これとマウス由来のミエローマ細胞（細胞株名：Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（６５３；ＡＴＣＣＮｏ．ＣＲＬ １５８８））とをポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００）を用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを調製した。
得られたハイブリドーマを連続増殖させ、２７アミノ酸ペプチドに対して特異的に結合する抗体を継続的に産生するハイブリドーマ株を選別した。
選別されたハイブリドーマ株を、無血清培地（商品名：ＣＤハイブリドーマ、インビトロジェン製）を用いて中空糸型細胞培養装置で培養し、その培養上清を採取してＰＢＳで透析後、モノクローナル抗体（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）を取得した。この抗体のサブクラスはＩｇＧ１であった。
（２）ポリクローナル抗体の製造
２７アミノ酸ペプチドをコードする遺伝子をｐＥＴ１７ｂベクターにクローニングし（ｐＥＴ１７ｂ−ＣＡＰ１８）、これからさらに、シグナルペプチドを除いた配列をコードする領域（９１−５１０の４２０ｂｐ，１４０アミノ酸）をｐＥＴ１９ｂ−ＣＡＰ１８に挿入して再クローニングし、大腸菌ＤＨ５αで、形質転換を行った。挿入された遺伝子配列を確認後、再度、タンパク質発現用の大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換を行い、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）で誘導してタンパクを発現させた。このタンパクをＮｉ−ＮＴＡ（ノバジェン社製）を用いてアフィニティー精製することで、リコンビナントＣＡＰ１８を得た。
このヒト由来のリコンビナントのＣＡＰ１８（ｒＣＡＰ１８）をウサギの皮下に０．１μｇ投与して免疫した（この際、アジュバントとして初回はフロインド完全アジュバンド（和光純薬工業社製）、以後はフロインド不完全アジュバンド（和光純薬工業社製）を用いた）。初回免疫後、２〜３週目に常法によって追加免疫（０．１−０．２ミリグラム／ウサギで４〜６回免役）し、最終免疫から約１週間後に血液を採取して血清を分離した。この血清を熱処理して補体を失活させた後、３３％飽和硫酸アンモニウム沈殿させることによってポリクローナル抗体を取得した。
実施例２ モノクロナール抗体Ｔｏｙｏ６Ｅ３による細胞の免疫染色
一次抗体として実施例１（１）で製造したモノクロナール抗体（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）を、二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）それぞれ用いて、常法によってヒト末梢血好中球を染色した。その蛍光顕微鏡像（倍率：１０００倍）を第１図のＡに示す。
また、一次抗体としてＴｏｙｏ６Ｅ３を、二次抗体として２０ｎｍ金粒子（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｃｅｌｌ社製）で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）をそれぞれ用いて、ヒト末梢血好中球を染色した免疫電子顕微鏡像を第１図のＢ（倍率：５０００倍）及びＣ（倍率：１００００倍）に示す。
第１図より、モノクロナール抗体Ｔｏｙｏ６Ｅ３は細胞染色に用いることができることが示された。
また第１図のＡより、Ｔｏｙｏ６Ｅ３によって好中球の細胞質と思われる領域が染色されることが示された。また第１図のＢ及びＣより、Ｔｏｙｏ６Ｅ３によって好中球の顆粒が染色されることが示された。
実施例３ 直接ＥＬＩＳＡ法によるペプチドの検出・定量
２７アミノ酸ペプチド及び「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」（ＫＥＦ ＫＲＩＶＱ ＲＩＫＤＦ ＬＲＮＬＶ；以下、「１８アミノ酸ペプチド」という）をそれぞれ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に種々の濃度で溶解させ、これら溶液をそれぞれポリスチレン製のマイクロタイタープレートのウエルに添加した。その後、２２℃程度で１時間保存することによってペプチドをプレートに物理的に吸着させた。その後、溶液を除去して、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてプレートの表面を洗浄した。このプレートに固着されている各ペプチドを、以下の（イ）又は（ロ）の方法で測定した。
（イ）一次抗体として実施例１（１）で製造したモノクロナール抗体（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）を反応させ、次いで二次抗体としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を反応させた後、ＴＭＢ発色基質（日本バイオラッド社製）を用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することによって固相に固着されているペプチドを測定する方法。
（ロ）一次抗体として実施例１（２）で製造したポリクローナル抗体を反応させ、次いで二次抗体としてＨＲＰで標識したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させた後、ＴＭＢ発色基質を用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定することによって固相に固着されているペプチドを測定する方法。
（イ）の結果を第２図のＡに、（ロ）の結果を第２図のＢにそれぞれ示す。なお、図中の「Ｂ」で示される曲線は２７アミノ酸ペプチドが固着されたプレートを、図中の「Ｊ」で示される曲線は１８アミノ酸ペプチドが固着されたプレートを用いた結果をそれぞれ示す。
第２図のＡより、「モノクロナール抗体Ｔｏｙｏ６Ｅ３」を用いた直接ＥＬＩＳＡ法によって、２７アミノ酸ペプチドと１８アミノ酸ペプチドの双方の検出及び定量が可能であることが示された。またＴｏｙｏ６Ｅ３は、１８アミノ酸ペプチドに対しても２７アミノ酸ペプチドと同程度の反応性を有することから、１８アミノ酸ペプチドに特異的に反応することが示唆された。
また第２図のＢより、「実施例１（２）で製造したポリクローナル抗体」を用いた直接ＥＬＩＳＡ法によっても、２７アミノ酸ペプチドと１８アミノ酸ペプチドの双方の検出及び定量が可能であることが示された。ただし１８アミノ酸ペプチドに対する反応性は低いことから、このポリクローナル抗体は２７アミノ酸ペプチドの検出・定量に用いられることが好ましいことが示された。
またこの結果から、このポリクローナル抗体は、２７アミノ酸ペプチドに含有され、かつ、１８アミノ酸ペプチドに含有されていない領域（配列番号３；ＦＲＫＳＫＥＫＩＧ）を主として認識することが示唆された。
実施例４ 間接ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）によるＣＡＰ１８の検出・定量
実施例１（２）で製造したポリクローナル抗体（第１抗体）をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、この溶液をポリスチレン製のマイクロタイタープレートのウエルに添加した。その後２２℃程度で１時間保存することによって抗体をプレートに物理的に吸着させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を添加したリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でプレートを洗浄後、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加したリン酸緩衝液でブロッキングした。このプレートに種々の濃度のペプチドやリコンビナントＣＡＰ１８（ｒＣＡＰ１８；ヒト由来）を添加して、２２℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをリン酸緩衝液で洗浄した。
次いで、このプレートに実施例１（１）で製造したモノクロナール抗体（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）（第２抗体）を添加して、２２℃で２時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをリン酸緩衝液で洗浄した。
次いでＨＲＰで標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加して同様に反応させた後、ＴＭＢ発色基質を用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０）を測定することによってペプチドまたはｒＣＡＰ１８を定量した。結果を第３図に示す。
第３図より、「モノクロナール抗体Ｔｏｙｏ６Ｅ３」や「実施例１（２）で製造したポリクローナル抗体」を用いた間接ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）によっても、ＣＡＰＴ８の検出及び定量が可能であることが示された。
実施例５ ウェスタンブロット法による細胞抽出液中のＣＡＰ１８の検出
ヒト末梢血単核球（モノサイト（ｍｏｎｏｃｙｔｅ））、ヒト末梢血好中球（ＰＭＮ）、ヒト単核球由来の細胞株（ＴＨＰ−１）及びマウスのマクロファージ様細胞株（Ｊ７７４．１）の細胞抽出液中のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、これをニトロセルロース膜に電気的に転写した。この膜を３％スキムミルクでブロッキングした後、実施例１（１）で製造したモノクロナール抗体（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）と反応させた。次いで二次抗体としてＨＲＰで標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を添加して同様に反応させて、ＥＣＬで発色したバンドを検出した。結果を第４図に示す。
第４図より、「モノクロナール抗体Ｔｏｙｏ６Ｅ３」を用いたウエスタンブロット法によっても、ＣＡＰ１８の検出が可能であることが示された。
また、ヒト末梢血好中球分画には１８ｋＤａサイズのＣＡＰ１８が多量に存在すること、及び、わずかではあるが低分子の抗体結合タンパク質（ＣＡＰ１８分子中のリポポリサッカライド結合領域（ＬＰＳ結合領域）が酵素によって切断されたものと考えられる）も存在することが示された。ヒト末梢血単核球分画においても１８ｋＤａのＣＡＰ１８がわずかに検出できたが、ヒト単核球由来ＴＨＰ−１細胞株及びマウスマクロファージ様Ｊ７７４．１細胞株の分画においてはＴｏｙｏ６Ｅ３と結合するものは検出できなかった。
実施例６ 免疫沈降による血清中のＣＡＰ１８の検出
実施例１（１）で製造したモノクロナール抗体（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）を用いて、健常人（ｎ＝５）の血清中に含まれるＣＡＰ１８を免疫沈降させた。免疫沈降物を、同モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法により検出した。結果を第５図に示す。なお、ウエスタンブロット法の要領は実施例５と同様である。
第５図より、「モノクロナール抗体 Ｔｏｙｏ６Ｅ３」は免疫沈降にも用いることができること、及び、この抗体を用いた免疫沈降法によってＣＡＰ１８の検出が可能であることが示された。
実施例７ ｆＭＬＰ刺激したヒト好中球からのＣＡＰ１８の放出
ヒト末梢血好中球（ＰＭＮ）または単核球（モノサイト（ｍｏｎｏｃｙｔｅ））を、０ｎＭ、１ｎＭ又は１０ｎＭのホルミルメチオニルロイシルフェニルアラニン（ｆＭＬＰ）存在下で３７℃、９０分間培養した（２×１０^６／ウェル／２００ｍｌ）。その後、培養上清分画（１５０ｍｌ）と細胞が多く含まれている分画（５０ｍｌ）をそれぞれ回収し、後者の分画については細胞を溶解させて抽出液を調製した。
この上清分画と細胞抽出液のそれぞれに含まれるＣＡＰ１８量を、実施例１（１）で製造したモノクロナール抗体（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）を用いた間接ＥＬＩＳＡ法によって測定した。結果を第６図のＢに示す。また、Ｂのデータをもとにして「放出されたＣＡＰ１８量」と「細胞内のＣＡＰ１８量」を推定した結果を第６図のＡに示す。また、Ｂで回収した分画をモノクロナール抗体（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）を用いたウェスタンブロットで検出した結果を第６図のＣに示す。なおウエスタンブロット法の要領は実施例５と同様であり、また、細胞が多く含まれている分画は３倍に希釈して用いた。
第６図から、「モノクロナール抗体Ｔｏｙｏ６Ｅ３」を用いたＥＬＩＳＡ法によって、ｆＭＬＰ刺激により培養上清中にＣＡＰ１８が放出されること、及び、その放出はｆＭＬＰの刺激（濃度）に依存することが検出できた（第６図のＡ及びＢ）。また、放出されるＣＡＰ１８のサイズは１８ｋＤａであって、低分子のフラグメントは検出されなかった（第６図のＣ）。

実施例４に記載の間接ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）で、以下の起炎菌の異なる重症肺炎患者の喀痰中に存在するＣＡＰ１８を測定した。結果は以下の通りであった。
測定対象者 ＣＡＰ１８測定値
患者Ａ（疾患名：クレブシエラ肺炎） １．４８６μｇ／ｍｌ
患者Ｂ（疾患名：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌肺炎） １．６８２μｇ／ｍｌ
以下に示す比較例（コントロール）に比し、いずれの患者も喀痰中に存在するＣＡＰ１８濃度が顕著に増加していた。
比較例として、上記と同様に実施例４に記載の間接ＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）で、とくに炎症所見を認めない長期臥床患者の喀痰中、もしくは健常人の喀痰中に存在するＣＡＰ１８濃度を測定した。結果は以下の通りであった。
測定対象者 ＣＡＰ１８測定値
患者Ｃ（緑膿菌ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，発熱なし、白血球増加なし）
検出されず
患者Ｄ（緑膿菌・ブドウ球菌ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ，発熱なし、
白血球増加なし） ０．６７４μｇ／ｍｌ
健常人Ｅ（喫煙者・健常）
サンプル１： 検出されず
サンプル２： 検出されず
比較例ではいずれの患者においてもＣＡＰ１８は全く検出されないか、あるいは軽度上昇を認めた程度であった。また、健常人においてはＣＡＰ１８は全く検出されなかった。
以上の結果より、喀痰中のＣＡＰ１８は、ヒト好中球由来で、肺胞および肺間質に生じる炎症所見を鋭敏に反映する指標となり、喀痰等の検体中のＣＡＰ１８を測定することにより、細菌性肺炎の早期診断およびモニタリングが可能である。
実施例９ 本発明キットの作製
（１）下記の構成からなる本発明キット１を作製した。
１．９６ウェルのイムノプレート １枚
２．実施例１（１）で製造したモノクローナル抗体 １本（一次抗体）
（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）
３．ＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体 １本（二次抗体）
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．過酸化水素水 １本
６．反応停止液（１Ｍ ＨＣｌ） １本
（２）下記の構成からなる本発明キット２を作製した。
１．「実施例１（２）で製造したポリクローナル抗体」 １枚
が固着された９６ウェルのイムノプレート
２．実施例１（１）で製造したモノクローナル抗体 １本
（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）
３．ＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体 １本（二次抗体）
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．過酸化水素水 １本
６．反応停止液（１Ｍ ＨＣｌ） １本
（３）下記の構成からなる本発明キット３を作製した。
１．２７アミノ酸ペプチドが固着された９６ウェルの １枚
イムノプレート
２．実施例１（１）で製造したモノクローナル抗体 １本（一次抗体）
（Ｔｏｙｏ６Ｅ３）
３．ＨＲＰ標識したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体 １本（二次抗体）
４．ＴＭＢ溶液 １本
５．過酸化水素水 １本
６．反応停止液（１Ｍ ＨＣｌ） １本
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである
本出願は、２００２年７月２２日および２００３年３月１４日出願の日本特許出願２００２−２２１３０４０および２００３−７０９３２に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

本発明抗体はＣＡＰ１８に特徴的なペプチドに結合する抗体であり、ＣＡＰ１８の検出や測定のツールとしても利用することができることから極めて有用である。本発明抗体は均質性や再現性が高く、さらに大量かつ永続的に生産させうるものであることから、製造コストを大幅に低減させることもでき極めて有用である。また本発明抗体は、本発明方法や本発明キットの製造に用いることができ、極めて有用である。
本発明方法は、ＣＡＰ１８等が関連する疾患の研究用試薬や診断薬等に応用することもでき、さらにこのような疾患のモニタリング等にも応用できる可能性があることから極めて有用である。例えば、生体サンプル中のＣＡＰ１８の量を測定し、その測定結果と呼吸器疾患、例えば慢性肺疾患、慢性気道性疾患、急性肺疾患、炎症性肺疾患、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、細菌性肺炎、間質性肺炎、上気道性の気管支炎などの疾患とを関連づけるステップを少なくとも含む、これらの疾患の評価方法等において用いることができる。
また本発明キットは、本発明方法をさらに迅速かつ簡便に実施することができることから極めて有用である。

配列番号１−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号３−人工配列の説明：合成ペプチド

【配列表】

Claims (32)

1. 「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に結合する抗体。
2. 「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に特異的に結合する、請求の範囲１に記載の抗体。
3. モノクローナル抗体である請求の範囲１又は２に記載の抗体。
4. 免疫グロブリンサブクラスがＩｇＧ１である請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
5. 「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチド」に特異的に結合する、請求の範囲１に記載の抗体。
6. ポリクローナル抗体である請求の範囲１又は５に記載の抗体。
7. 請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体を用いることを特徴とする、検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定方法。
8. 「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定が、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることを特徴とする、請求の範囲７に記載の方法。
   （ａ）固相と検体を接触させ、検体中の「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を固相に固着させる工程。
   （ｂ）工程（ａ）で固相に固着させた「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」を、「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」を用いて検出する工程。
9. 「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」が標識物質で標識されているか又は標識されるものであることを特徴とする、請求の範囲８に記載の方法。
10. 固相に固着された「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の検出が、さらに「『請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体』に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることを特徴とする、請求の範囲８に記載の方法。
11. 「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定が、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることを特徴とする、請求の範囲７に記載の方法。
    （ａ）「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体（第１抗体）が固着された固相」、「検体」及び「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
    （ｂ）工程（ａ）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
12. 「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定が、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることを特徴とする、請求の範囲１１に記載の方法。
    （ａ）「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体（第１抗体）が固着された固相」に検体を接触させて、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」からなる複合体を形成させる工程。
    （ｂ）前記固相に、「請求の範囲１〜６のいずれが１項に記載の抗体（第２抗体）」を接触させ、「固相に固着された第１抗体−配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−第２抗体」からなるサンドイッチ状複合体を形成させる工程。
    （ｃ）工程（ｂ）において形成されたサンドイッチ状複合体を検出する工程。
13. 第２抗体が標識物質で標識されているか又は標識されるものであることを特徴とする、請求の範囲１１又は１２に記載の方法。
14. 複合体の検出が、「第２抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることを特徴とする、請求の範囲１１又は１２に記載の方法。
15. 「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定が、下記（ａ）及び（ｂ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることを特徴とする、請求の範囲７に記載の方法。
    （ａ）「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」、「検体」及び「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」を接触させ、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」からなる複合体及び「検体中の『配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド』−請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」からなる複合体を形成させる工程。
    （ｂ）工程（ａ）において形成された「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」からなる複合体及び「検体中の『配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド』−請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」からなる複合体の少なくともいずれか一方を検出する工程。
16. 「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定が、下記（ａ）〜（ｃ）の工程を少なくとも含む工程によって行われることを特徴とする、請求の範囲１５に記載の方法。
    （ａ）検体と「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」を接触させて、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド−請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」からなる複合体Ａを形成させる工程。
    （ｂ）「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相」に、工程（ａ）によって得られた「『複合体Ａ』と『複合体Ａを形成しなかった請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体』とを含有する混合物」を接触させ、「固相に固着された『配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド』−請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」からなる複合体を形成させる工程。
    （ｃ）工程（ｂ）において形成された複合体を検出する工程。
17. 「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」が標識物質で標識されているか又は標識されるものであることを特徴とする、請求の範囲１５又は１６に記載の方法。
18. 複合体の検出が、「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの」を用いて行われることを特徴とする、請求の範囲１５又は１６に記載の方法。
19. 検体が、体液である、請求の範囲７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キット。
    （Ａ）固相
    （Ｂ）請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体
21. 「請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体」が標識物質で標識されているか又は標識されるものであることを特徴とする、請求の範囲２０に記載のキット。
22. 下記の構成成分（Ａ）及び（Ｂ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キット。
    （Ａ）請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体（第１抗体）が固着された固相
    （Ｂ）請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体（第２抗体）
23. 第２抗体が標識物質で標識されているか又は標識されるものであることを特徴とする、請求の範囲２２に記載のキット。
24. 下記の構成成分（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を少なくとも含む、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」の測定キット。
    （Ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドが固着された固相
    （Ｂ）請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体
    （Ｃ）請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体に特異的に結合する抗体であって、標識物質で標識されているもの又は標識されるもの
25. 請求の範囲１〜６のいずれかに記載の抗体又は「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」によって検出されることができる検体中の抗原を測定し、その結果から検体を採取した患者の細菌性肺炎を検出することを特徴とする細菌性肺炎の検出方法。
26. 検体中の抗原が、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」、「配列番号２で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」、「配列番号３で示されるアミノ酸配列を少なくとも含有するペプチド」及びＣＡＰ１８からなる群から選択される抗原である請求の範囲２５に記載の方法。
27. 測定が「配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体」、「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体」、「配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体」及び「ＣＡＰ１８に特異的に結合する抗体」からなる群から選択される抗体を用いて、免疫学的に行われる請求の範囲２５に記載の方法。
28. 細菌性肺炎の検出が、細菌性肺炎の罹患の有無、程度、種類の評価、またはモニタリングである請求の範囲２５記載の方法。
29. 測定が請求の範囲７〜１９のいずれか１項に記載の方法で行われる、請求の範囲２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体を含む細菌性肺炎の診断キット。
31. 請求の範囲２０〜２４のいずれか１項に記載のキットからなる請求の範囲３０記載のキット。
32. 請求の範囲１〜６のいずれか１項に記載の抗体を有効成分として含む細菌性肺炎の診断薬。

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