JP2010535737A - 新規bnp(1−32)エピトープおよび前記エピトープに対する抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
H1PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108(配列番号1)
である108個のアミノ酸のポリペプチドで構成されている。
S1PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH32(配列番号2)
である32個のアミノ酸のペプチドで構成されている。
H1PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR76(配列番号3)
を有する。
NT−プロBNP(1−76)のアッセイに関して、特許文献4には、NT−プロBNP(1−76)の検出に基づいた鬱血性心不全のインビトロ診断のための方法が記載されている。しかしながら、特許文献4に記載されている方法は、血液サンプル中のNT−プロBNP(1−76)に対して、容易には実施されないようである。実際、ヒトの血清に対してではなく、合成ペプチドであるペプチドNT−プロBNP(47−64)を用いて得られた標準的な範囲に対して実施された例のみが示されている。この欠点を克服するためには、きわめて高度な自動システムが必要であることが分かっている。
a1−R1−X1−FGRKMDR−X2−R2−a2 (I)
を有するヒトBNP(1−32)エピトープを担持するポリペプチドに関するものであり、
−a1は、Hであってもよいし、チオール官能基、アルコール官能基、アミノキシ官能基、第一級アミンまたは第二級アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基およびアセチル基から選択される官能基または化学基を表していてもよく;
−a2は、OH官能基、NH2官能基またはアルコキシル基を表していてもよく(当業者には明白であろうが、a2はこのポリペプチド最後のアミノ酸の酸性官能基にあるカルボニル(−CO−)部分に結合している);
−X1は、存在しないか、または存在し、存在する場合は、CとGCの中から選択され;
−X2は、存在しないか、または存在し、存在する場合は、IとISの中から選択され;
−R1およびR2は、同一であっても異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよく、式(I)の前記ポリペプチドが、配列GCFGRKMDRIS(配列番号63)など、ヒトBNP(1−32)の11を超えるアミノ酸の部分を含まないという条件で、任意のアミノ酸または2個から15個のアミノ酸のペプチド鎖を表す。
a1−(R1)−(G)−(C)−FGRKMDR−(I)−(S)−(R2)−a2
式中、a1、a2、R1およびR2は上記の定義のとおりである。
a1−FGRKMDR−a2(II)
に相当し、式中、a1およびa2は上記に定義されたとおりである。
−免疫グロブリンを分泌するリンパ球のサンプルを、上記のポリペプチドにより免疫化されたマウス、ウサギまたはラットなどの動物から採取され、
−次いでこれらのリンパ球を、Sp2骨髄腫細胞(ATCC CRL−1581)などの骨髄腫細胞と融合させる
方法に関する。
1)生体サンプルを、好ましくは、抗原−リガンド複合体を形成させる条件下、上記に定義した少なくとも1種のリガンドに接触させること、および
2)形成した可能性のある複合体をいずれも検出すること
を含んでなる、ヒトBNP(1−32)またはヒトプロBNP(1−108)ならびに配列FGRKMDRを含有するそれら個々の断片を生体サンプル中に検出するための方法に関する。
1)個体からの生体サンプルを、好ましくは、抗原−リガンド複合体を形成可能とする条件下、上記に定義した少なくとも1種のリガンドに接触させるステップ、
2)形成した可能性のある複合体をいずれも検出するステップ、および
3)ステップ2における検出結果に基づいて、個体における病態の診断、予後、発現の危険性または治療的追跡を判定するステップ
を含んでなる、個体における心臓および/または血管の少なくとも1つの病態の診断、予後、危険性の層別化または治療的追跡の方法に関する。
−鬱血性心不全
−急性冠動脈症候群
−脳血管性発作
−腎不全
−呼吸困難
−高血圧
−じゅく状斑破裂
−未熟新生児における動脈管開存症、および/または
−糖尿病
からなる群から選択されることが好ましい。
−一般に、急性全冠動閉塞に対応するQ波壁内梗塞の形成が現れる、ST部分の持続的なアップスロープ(すなわち上昇)を伴う急性冠動脈不全、および
−プラーク破裂および不完全な血栓形成に対応しかつ異なる治療を必要とする不安定アンギナとしても知られている、非Q波梗塞に対応するST部分のアップスロープを伴わない(すなわち上昇がない)急性冠動脈不全。
t1−E1−L1−E2[−Lk−1−Ek]n−t2(III)
を有するマルチエピトープ標準物質に関するものであり、
式中
−nは、0〜8の間の整数であり;
−kは、n>0の場合、3〜n+2の間の整数であり;
−E1、E2、およびEkは互いに異なっており、1つは、R1−X1−FGRKMDR−X2−R2ペプチド配列を表し、式中、X1、X2、R1およびR2は上記で定義したとおりであり、他は、ヒトプロBNP(1−108)の配列から選択される3個から15個のアミノ酸の配列を表し;
−t1は、水素原子、アセチル基、1個から10個のアミノ酸のペプチド配列、1個から10個のN−αアセチル化アミノ酸のペプチド配列、ビオチニル基またはビオシチニル基、ビオチニル基またはビオシチニル基を担持する1個から10個のアミノ酸のペプチド配列または線状アミノアルキル(C1−C10)カルボニル鎖を表し;
−t2は、ヒドロキシル基、アミノ基、1個から10個のアミノ酸のペプチド配列、末端アミノ基を担持する1個から10個のアミノ酸のペプチド配列、または線状または分枝状のアミノアルキル(C1−C10)カルボニル鎖を表し(当業者には明白であろうが、t2は、Enペプチド鎖における最後のアミノ酸の酸性官能基のカルボニル(−CO−)部分に結合している);
−L1およびLkは、同一であっても異なっていてもよく、ペプチド鎖の結合基を表す。
t1−E1−L1−E2−L2−E3−t2(IV)
に対応することが好ましく、
式中、E1、E2、E3、L1、L2、t1およびt2は上記に定義したとおりである。
t1−E1−L1−E2−t2 (V)
に対応することが好ましく、
式中、E1、E2、L1、t1およびt2は上記に定義したとおりである。
Ac−YTLRAPRSPKMV−L1−SFGRKMDRISS−NH2;
Ac−YTLRAPRSPKMV−L1−CFGRKMDRISSSSGLGCK−NH2;
Ac−YTLRAPRSPKMVQG−L1−FGRKMDR−NH2;
Ac−FGRKMDR−L1−SGLGC*KVLRRH−OH;
Ac−FGRKMDR−L1−SGLGC*KVLR−NH2;
Ac−SPKMVQGSG−L1−FGRKMDR−NH2;
Ac−YTLRAPRSPKMV−L1−FGRKMDR−L2−SGLGC*KVLRRH−OH;
およびAc−YTLRAPRSPKMV−L1−FGRKMDR−L2−SGLGC*KVLR−NH2;
によって定義されるマルチエピトープ標準物質からなる群から選択されることが好ましく、
式中、Acはアセチル基を表し、C*はアセトアミドメチルブロック化システインを表す。
−NH−(CH2)5−CO−
を表すことが好ましい。
−上記のリガンド;および
−上記のマルチエピトープ標準物質および/または上記のポリペプチド
を含んでなる、ヒトBNP(1−32)またはヒトプロBNP(1−108)ならびに配列FGRKMDRを含んでなるそれらそれぞれの断片を検出するためのキットに関する。
材料および方法
当業者に周知の標準的方法により合成ペプチドを調製した。本法の一例は、容易に実施できるという事実のため有利であるMerrifield合成である(Merrifield、(1963);R.C.Sheppard(1971);Athertonら(1989))。Perspectiveからの「Pioneer」シンセサイザー、またはABIからの「433」シンセサイザーを、自動シンセサイザーとして使用することができる。これらのペプチド類を、均質相合成によっても得ることができる。
配列番号4:Ac−TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVLCys−CONH2、
配列番号5:5:Ac−SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL−CysCONH2
配列番号6:Ac−SGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL−CysCONH2
配列番号7:Ac−SGCFGRKMDRIATSTAIGCKVL−CysCONH2
配列番号8: Ac−FGRKMDR−CONH2
配列番号9: Ac−GRKMDR−CONH2
配列番号10: Ac−FGRKMD−CONH2
配列番号11: Ac−RKMDRI−CONH2
これらのペプチドによりマウスを免疫化するために、ペプチドをより免疫原性にする目的で、種々の官能基(チオール、アミン、アルデヒドなど)を介して、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)、チログロブリン、またはBSA(ウシ血清アルブミン)などの担体タンパク質に前記ペプチドを結合させる必要がある。ペプチドをタンパク質に結合させるために用いられるカップリング剤は、ヘテロ二官能性であってもホモ二官能性であってもよい。最も頻繁に用いられる試薬は、BS3、sSMCC、SPDP、グルタルアルデヒドなどである。
方法:
10mg/mlの最終濃度を得るために、20mgのKLHを、2mlのリン酸緩衝生理食塩水(20mMのリン酸塩、0.9MのNaCl、pH7.2)に溶解した(ボルテックスせず)。並行して、4mgのsSMCCを、400μlの注射用水に溶解して10mg/mlの最終濃度を得た。引き続き2mlのKLH(20mg)を、200μlのsSMCC(2mg)と混合し、この混合物を、緩やかに攪拌しながら(1分当り20回転)室温(20℃)で1時間インキュベートした。
方法:
PD10 Sephadex TM G−25mカラム(Ge healthcare、米国、参照先;17−0851−01)を、リン酸緩衝生理食塩水(20mMのリン酸塩、0.9MのNaCl、pH7.2、100mMのEDTA)で平衡にした。2mlの活性化KLHを、カラムに沈着させ、引き続き0.9MのNaCl、pH7.2および100mMのEDTAで補足された20mM PBS緩衝液の3.5mlで溶出を開始し;500μlのフラクションを集めた。1/25に希釈された各フラクションに対して、光学密度(OD)を280nmで測定し、次いで活性化KLHを含有するフラクションを同定し、Beer−Lambert則:OD=εClに従って測定した、
式中ODは光学密度であり、
ε=1.499であり、
Cは濃度であり、l=1cmであり、活性化KLHの濃度を測定することができ、リン酸緩衝生理食塩水中7.4mg/mlに換算される。
方法:
10mgの凍結乾燥ペプチドを1mlのMilli−Q水に溶解し、超音波ディスインテグレータ内で脱気して10mg/mlの最終濃度を得、次いで7.4mgの活性化KLH(すなわち、2−bで得られた1mlの溶液)と混合した。この混合物を、緩やかに攪拌しながら(20rpm)室温(20℃)で2時間インキュベートした。引き続き20mMのPBS緩衝液+0.9MのNaCl pH7.2中、5mg/mlの濃度でのシステイン溶液を導入してペプチド/KLH溶液中1mMの最終濃度が得られ、全混合物を、緩やかに攪拌しながら(20rpm)室温(20℃)で20分間インキュベートした。
方法:
次に結合ペプチドの濃度を、以下のとおりBradford法(Bradford M., Anal. Biochem., 1976; 72: 248-54)により測定した:595nmでのODから当サンプルのKLH濃度を測定するために、KLHの50μg/mLから1000μg/mLの標準範囲を調製した。この標準範囲を作製し、本アッセイを実施するために、サンプルの50μLの各ポイントを、1.5mLのクーマシーブルー(Bio−Rad、#1856210)中に希釈した。
3−a)マウスの免疫化:
モノクローナル抗体を産生させるために、以下のペプチド:
Ac−TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL−Cys−CONH2、(配列番号4)
Ac− SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL−CysCONH2(配列番号5)
のうちの1つを用いて、
10匹のマウス(Balb/c株メス、5週齢、参照:SIFE055、Charles Rivers、MA、米国)を免疫化し、実施例2に従ってKLHに結合させた(各ペプチドに対して5匹のマウス)。
−PBSで1/20に希釈した1mg/mLのペプチド−KLHを200μL皮下注射、
−45分の待機、
−PBSで1/20に希釈した1mg/mLのペプチド−KLHを200μL、最初の注射とは異なった部位での皮下注射、
−45分の待機、
−PBSで1/10に希釈した1mg/mLのペプチド−KLHを200μL、前の注射とは異なった部位での皮下注射、
−30分の待機、
−PBSで1mg/mLに希釈したプロメタジン(2.5%Phenergan、注射液、UCB)の100μLを腹腔内注射、
−15分の待機、
−PBSで3/10に希釈した1mg/mLで200μLのペプチド−KLHを、前の注射とは異なった部位での腹腔内注射。
骨髄腫SP2細胞(ATCC CRL−1581)で免疫化されたマウスS2の脾臓細胞のリンパ球融合は、KohlerおよびMilstein の周知のプロトコル(1975) Nature 56:495- 497に従って実施した。
4.1材料:
以下の試薬を用いた:
−Maxisorpの96ウェル平底マイクロプレート(Nunc、デンマーク国)
−PBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液、pH7.4、Gibco錠剤。参照:18912−014(Invitrogen)
−BNP(1−32):合成ペプチド(Sigma−Aldrich、米国、#B−5900)
または
−プロBNP(1−108)(大腸菌(E.Coli)中で産生された組換えタンパク質、HyTest、フィンランド国)
−Tween(登録商標)20(Sigma−Aldrich、米国、#P1379)
−ウサギ中で産生され、ペルオキシダーゼに結合された抗マウスIgG二次抗体(Sigma、米国、#A9044)
−H2O2(0.1Mのクエン酸緩衝液中0.04%、pH4)
−OPD(オルト−フェニレンジアミン、Sigma、米国#P8412)
−硫酸(H2SO4、4N)
−実施例3で免疫化されたマウスからの血清
マウス血清サンプル中の抗BNP(1−32)抗体の存在を検出するために、ELISA試験を固体支持上で実施した。
幾つかの抗原を、96ウェルマイクロプレートの腔内での吸着により固定化した。残りの空の部位を飽和してブロックし、免疫血清をインキュベートし、存在していると考えられる抗体(《Ac》)を抗原(《Ag》)に結合させ、Ag−Ac複合体を形成した。この複合体を、酵素に結合させた免疫複合体(抗マウスIgG抗体)を用いて検出した。この場合の酵素は、無色の基質を所望の抗体の存在を示す着色産物に変換するHRP(西洋わさびペルオキシダーゼ)であった。最終着色産物の形成は、490nmにおける光学密度(OD)の読取りを実施することによって定量化した。当業者に周知であるこの方法に従って、得られたODは、試験したマウス血清サンプル中の抗体の存在(高いOD)または非存在(低いOD)を示す。この試験には、当業者によく知られている多くの変型(抗原捕捉、競合アッセイなど)がある。
BNP(1−32)またはプロBNP(1−108)の各抗原を、PBS中、0.5μg/mLの最終濃度になるように溶解し、次いで4℃で一晩インキュベートすることによって、Maxisorpマイクロプレート上で1ウェル当り100μLを基準に固定化した。PBS0.1%のTween(登録商標)20(PBS−T)で3回洗浄後、マイクロプレートを、1%ミルク(半脱脂乳)を含有する0.1%PBS−Tの溶液(100μL/ウェル)で飽和し、次いで37℃で1時間インキュベートした。
マイクロプレートを、0.1%PBS−Tで3回洗浄した。先に免疫化したマウスからの各血清を、引き続き0.1%ミルク(半脱脂乳)を含有する0.1%PBS−Tで10倍希釈し、次いで1ウェル当り100μLを基準に沈着させ、37℃で2時間インキュベートした。このマイクロプレートを再び0.1%PBS−Tで3回洗浄し、次いで1ウェル当り100μLを基準に、0.1%ミルク(半脱脂乳)を含有する0.1%PBS−T中で1/3,000に希釈したペルオキシダーゼに結合した複合体の存在下、37℃で1時間インキュベートした。最後に、このマイクロプレートを0.1%PBS−Tで3回洗浄し、次いでペルオキシダーゼ基質を、1ウェル当り100μLを基準に沈着させた。このマイクロプレートを、室温で20分間暗所に置いた。この酵素反応は、1ウェル当り50μLの硫酸(H2SO4、4N)を添加することによって中止させ、引き続き490nmでのODを各ウェルごとに測定した。
5.1《Spot》技法によるエピトープの特徴付け
5.1.1材料:
装置および試薬は全て、C. Granier, S. Villard, D. Laune(Mapping and Characterization of Epitopes using the SPOT method. Cells/Cell Biology: A Laboratory Handbook, third edition (Volume 1), chapter 62, editor: Julio Celis, Elsevier, 2005)に記載されている。
「SPOT」または「エピトープマッピング」法を用いて、20G7モノクローナル抗体のエピトープを特徴付けした。Frank(Tetrahedron, 1992; 48: 9217-32)により記載されたこの方法は、官能化された支持体(アミノポリエチレングリコール−セルロース)上で、予め決められた配列を有する多数のペプチド類をセルロース膜上で合成することを可能にし、またこの場合、20G7抗体である可溶性リガンドに対するそれらの反応性の試験を可能にする。
ペプチド合成の全工程(アミノ酸の活性化、化学反応など)は、Molinaら(Pept Res. 1996, Vol. 9: p 151-5)、およびC. Granier, S. Villard, D. Laune (Mapping and Characterization of Epitopes using the SPOT method. Cells/Cell Biology: A Laboratory Handbook, third Edition (Volume 1), chapter 62, Editor: Julio Celis, Elsevier, 2005)に詳述されている。
配列番号12 SPKMVQGSGCFGRKM
配列番号13 KMVQGSGCFGRKMDR
配列番号14 VQGSGCFGRKMDRIS
配列番号15 GSGCFGRKMDRISSS
配列番号16 GCFGRKMDRISSSSG
配列番号17 FGRKMDRISSSSGLG
配列番号18 RKMDRISSSSGLGCK
配列番号19 MDRISSSSGLGCKVL
配列番号20 RISSSSGLGCKVLRR
の形態で全体的に合成された。
配列番号21 VQGSGCFGR
配列番号22 SPKMVQGSGC
配列番号23 MDRISSSSGLG
配列番号24 RKMDRI
配列番号25 RKMDRISS
もまた合成された。
配列番号26 SPKMVQGSGC
配列番号27 PKMVQGSGCF
配列番号28 KMVQGSGCFG
配列番号29 MVQGSGCFGR
配列番号30 VQGSGCFGRK
配列番号31 QGSGCFGRKM
配列番号32 GSGCFGRKMD
配列番号33 SGCFGRKMDR
配列番号34 GCFGRKMDRI
配列番号35 CFGRKMDRIS
配列番号36 FGRKMDRISS
配列番号37 GRKMDRISSS
配列番号38 RKMDRISSSS
配列番号39 KMDRISSSSG
配列番号40 MDRISSSSGL
配列番号41 DRISSSSGLG
配列番号42 RISSSSGLGC
配列番号43 ISSSSGLGCK
配列番号44 SSSSGLGCKV
配列番号45 SSSGLGCKVL
配列番号46 SSGLGCKVLR
配列番号47 SGLGCKVLRR
配列番号48 GLGCKVLRRH
の形態で合成された。
配列番号49 GCFGRKM
配列番号50 CFGRKMD
配列番号51 FGRKMDR
配列番号52 GRKMDRI
配列番号53 RKMDRIS
もまた合成された。
免疫活性に関する以下の試験は、Launeら(J. Immunol. Methods, 2002, Vol. 267(1), p 53-70)に詳細に記載されている。手短に言うと、この原理は以下のとおりであった。膜を、各々10分間づつ3回、TBS浴(トリス緩衝生理食塩水、pH7.0)により再水和させ、引き続き15mlの10%飽和緩衝液(「ブロック用緩衝液」、Roche)およびTBS0.1%のTween(登録商標)20(TBS−T)中5%のショ糖の存在下、攪拌しながら室温で一晩インキュベートすることにより飽和させた。この膜を10分間、0.1%のTBS−Tにより3回洗浄した後、この膜を、試験する抗体(この場合20G7)および飽和緩衝液で希釈したアルカリホスファターゼに結合した複合体の存在下、攪拌しながら37℃で90分間インキュベートした。この膜を各浴10分間づつ0.1%のTBS−Tで2回、次いでCBS(クエン酸緩衝生理食塩水)で2回の洗浄後、アルカリホスファターゼ基質を添加し、膜を室温で、シグナルが出現する速度に依って1分間から30分間インキュベートした。
この場合、BNP(1−32)配列は、2つのアミノ酸のオフセットを有する重なりペンタデカペプチド(配列番号12から20)の形態で全体的に合成された。図1に示されるように、これらのペプチドを、精製20G7抗体と接触させると、5種の連続ペプチドだけが抗体と反応し、それらの共通配列は、F11GRKMDR17(図1)である:
配列番号13 KMVQGSGCFGRKMDR
配列番号14 VQGSGCFGRKMDRIS
配列番号15 GSGCFGRKMDRISSS
配列番号16 GCFGRKMDRISSSSG
配列番号17 FGRKMDRISSSSGLG
第二のステップにおいて、F11GRKMDR17ペプチドが、実際に20G7抗体のエピトープであったことを確かめるために、このペプチドとBNP(1−32)との間の競合アッセイを実施する目的で、この配列を可溶性形態で合成した。並行して20G7抗体への結合におけるF11残基の寄与の高さを確認するために、他の2種の追加ペプチド(1つは、FをAにより置換したもの、他方は、Fを単に欠失させたもの)もまた、可溶性形態で合成した。さらに、同様の競合アッセイをHytestの24C5抗体と実施して、この残基の重要性が20G7抗体に特異的であることを立証した。
1−配列番号51:天然エピトープの配列:F11GRKMDR17
2−配列番号62:エピトープの変異配列:A11GRKMDR17
3−配列番号9:F11残基の欠失した配列:G12RKMDR17
−Maxisorpの96ウェル平底マイクロプレート(Nunc、デンマーク国)、
−PBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液、pH7.4、Gibco錠剤。照会先:18912−014(Invitrogen)、
−BNP(1−32):合成ペプチド(Sigma−Aldrich、米国、#B−5900)、
−Tween(登録商標)20(Sigma−Aldrich、米国、#P1379)、
−モノクローナル20G7抗体(Bio−Rad)、
−モノクローナル24C5抗体(HyTest、Turku、フィンランド国)、
−ウサギ中で産生され、ペルオキシダーゼに結合された抗マウスIgG二次抗体(Sigma、米国、#A9044)、
−H2O2(0.1Mのクエン酸緩衝液中0.04%、pH4)、
−OPD(オルト−フェニレンジアミン、Sigma、米国#P8412)、
−硫酸(H2SO4、4N)。
免疫アッセイの原理は、4.2に記載されたものと同一であった。手短に言うと、合成BNP(1−32)を、PBS緩衝液中で希釈して0.5μg/mlでMaxisorpマイクロプレート上で直接固定化した。各可溶性ペプチドAA11−AA17(天然、変異、または欠失)の20ng/mlから10,000ng/mlの標準範囲を、緩衝液/血清中に調製し、0.1%のミルク(半脱脂乳)を含有するPBS0.1%のTween(登録商標)20(PBS−T)中0.5μg/mlの最終濃度で、100μlのモノクローナル抗体液(20G7抗体または24C5抗体)に混合した。次に抗体の結合を、ペルオキシダーゼで標識された抗マウス複合体により検出した。20G7抗体の応答強度を、HyTestからのモノクローナル24C5抗体の1つと比較した。1)配列F11GRKMDR17が、実際に20G7抗体エピトープであることを表し、および2)F11残基が、20G7によるBNP(1−32)の認識にとって必須であることを判定するために、可溶性ペプチドの存在下、BNP(1−32)の認識の減少に相当する阻害パーセントを各可溶性ペプチドに関して測定した。
図3は、濃度を増加させた可溶性ペプチド(天然;配列番号51、変異;配列番号62、欠失:配列番号9)の存在下、BNP(1−32)に対するモノクローナル抗体(20G7または24C5)結合の阻害パーセントを示している。
6.1材料、方法およびプロトコル:
実施例5に記載されたものと同じニトロセルロース膜および同じ反応性条件を用いて、これらの抗体を試験した。
本発明者らは、以下の特徴付けされた一連のモノクローナル抗体:20G7、11A8、17F10、Mab1、Mab2およびMab3を得た。表1に示されるように、他のモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル20G7と同じエピトープすなわち、FGRKMDRを有するが、20G7と比較して異なった必須のアミノ酸を有する。
7.1材料:
−BIAcore(登録商標)2000および3000の分析器(Pharmacia、Uppsala、スウェーデン国)、
−BNP(1−32)(合成ペプチド、Sigma、米国、#B−5900)、
−プロBNP(1−108)(大腸菌(E.Coli)中で産生された組換えタンパク質、HyTest、フィンランド国)、
−抗Fc断片抗体(Sigma、米国)、
−モノクローナル抗体20G7、11A8、17F10(Bio−Rad、Marnes la Coquette、仏国)、
−PBS緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水)、pH7.4。
7.2.1.原理:
BIAcore(登録商標)2000および3000の分析器(その原理は、表面プラスモン共鳴技術(SPR)に基づく)を用いて、20G7モノクローナル抗体および他のモノクローナル抗体と、BNP(1−32)またはプロBNP(1−108)との相互作用の反応速度論および親和性を明らかにした。本発明者らは製造元の取扱説明書に従った。
表2は、モノクローナル抗BNP抗体(20G7を含む)と、2つの組換え抗原BNP(1−32)およびプロBNP(1−108)との間の相互作用の特性を示す。
8.1材料:
−Maxisorpの96ウェル平底マイクロプレート(Nunc、デンマーク国)、
−PBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液、pH7.4、Gibco錠剤。照会先:18912−014(Invitrogen)、
−BNP(1−32):合成ペプチド(Sigma−Aldrich、米国、#B−5900)、
−プロBNP(1−108)(大腸菌(E.Coli)中で産生された組換えタンパク質、HyTest、フィンランド国)、
−Tween(登録商標)20(Sigma−Aldrich、米国、#P1379)、
−ウサギを、BNP(1−32)の1−10の領域を標的とする免疫原で免疫化することにより得られたL21016ウサギポリクローナル抗体、そのエピトープは、BNP(1−32)の配列S1PKMV5(配列番号54)である、
−20G7モノクローナル抗体(Bio−Rad)、
−24C5および26E2モノクローナル抗体(HyTest、Turku、フィンランド国)、
−ウサギ中で産生され、ペルオキシダーゼに結合された抗マウスIgG抗体複合体(Sigma、米国、#A9044)、
−0.1Mのクエン酸緩衝液中、0.04%のH2O2、pH4、
−OPD(オルト−フェニレンジアミン、Sigma、米国、#P8412)、
−硫酸(H2SO4、4N)。
最初に、BNP(1−32)の20pg/mlから10,000pg/mlまでの標準範囲を、合成BNP(1−32)から緩衝液/血清中で調製した。
9.1.材料:
−BNP(1−32)の配列S1PKMV5(配列番号54)を認識するL21016ウサギポリクローナル抗体(Bio−Rad)によりプライムされたMaxisorpの96ウェル平底マイクロプレート(Nunc、デンマーク国)、
−PBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液、pH7.4、Gibco錠剤。参照:18912−014(Invitrogen)、
−Tween(登録商標)20(Sigma−Aldrich、米国、#P1379)、
−BNP(1−32)の合成ペプチド(Sigma−Aldrich、米国、#B−5900)、
−プロBNP(1−108)(大腸菌(E.Coli)中で産生された組換えタンパク質、HyTest、フィンランド国)、
−20G7抗体(0.001μg/mlから1μg/mlまでの種々の濃度に調製されたエピトープF11GRKMDR17(配列番号8)に対して特異的)、
−0.5μg/mlの単一濃度でBNP(1−32)のC−末端部分を認識する50B7モノクローナル抗体(HyTest、フィンランド国)、
−ウサギ中で産生され、ペルオキシダーゼに結合させた抗マウスIgG二次抗体(Sigma、米国、#A9044)、
−0.04%のH2O2(0.1Mのクエン酸緩衝液中、pH4、Sigma、米国)、
−OPD(オルト−フェニレンジアミン、Sigma、米国、#P8412)、
−硫酸(H2SO4、4N)。
9.2.1原理:
このアッセイは、固相上での捕捉にL21016のウサギポリクローナル抗体(Bio−Rad)を用い、マイクロプレート上のサンドイッチELISA原理に基づいた。そのエピトープは、受動的吸着により固定されたBNP(1−32)の配列S1PKMV5(配列番号54)であり(実施例8参照)、検出用には2種のモノクローナル抗体(エピトープF11GRKMDR17(配列番号8)に対する20G7モノクローナル抗体およびBNP(1−32)のC−末端部分を標的とする50B7モノクローナル抗体(HyTest、フィンランド国))の組合わせであった。しかしながら、20G7抗体は、濃度を変えて使用し、一方、50B7モノクローナル抗体は、0.5μg/mlの一定濃度で使用した。
5ng/mlのBNP(1−32)溶液100μlを各マイクロプレートウェルに添加し、そこでL21016のポリクローナル抗体を吸着させ、37℃で2時間インキュベートした。このマイクロプレートを0.1%PBS−Tで3回洗浄し、次いで50B7抗体および20G7抗体希釈物の1つを含有する100μlの混合物をそれに配分し、37℃で2時間インキュベートした。0.1%PBS−Tで3回洗浄した後、1ウェル当り100μLを基準にペルオキシダーゼ−ウサギ抗マウスIgG抗体複合体(0.1%ミルク(半脱脂乳)を含有する0.1%PBS−T中で1/3,000に希釈)を、37℃で1時間インキュベートした。最後に、0.1%PBS−Tで3回洗浄した後、100μL/ウェルを基準に、H2O2+OPD溶液を沈着させた。このマイクロプレートを、室温で20分間暗所に置いた。この酵素反応は、1ウェル当り50μLの硫酸(H2SO4、4N)を添加することによって中止させ、引き続き490nmでのODを各ウェルで測定した。
表4は、20G7および50B7モノクローナル抗体を用いて、490nmでの光学密度で表されたBNPの分析アッセイ結果を示している。
10.1.材料:
−BNP(1−32)の合成ペプチド(Sigma−Aldrich、米国、#B−5900)、
−プロBNP(1−108)(大腸菌(E.Coli)中で産生された組換えタンパク質、HyTest、フィンランド国)、
−プロBNP(1−108)のヒンジ配列:エピトープRAPR76S77P(配列番号55)(Giulianiら、Clin. Chem., 52: 6, 1054-1061, 2006)を認識するモノクローナル抗体(例えば、Bio−Radからのヒンジ76抗体)によりプライムされたMaxisorpの96ウェル平底マイクロプレート(Nunc、デンマーク国)、
−ペルオキシダーゼに結合した20G7モノクローナル抗体(Bio−Rad)、
−ペルオキシダーゼに結合した24C5モノクローナル抗体(HyTest、フィンランド国)、
−ペルオキシダーゼに結合した26E2モノクローナル抗体(HyTest、フィンランド国)、
−PBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液、pH7.4、Gibco錠剤。照会先:18912−014(Invitrogen)、
−Tween(登録商標)20(Sigma−Aldrich、米国、#P1379)。
10.2.1.プロBNP(1−108)の分析アッセイの原理
最初に、プロBNP(1−108)の20pg/mlから10,000pg/mlまでの標準範囲を、0.1%PBS−T緩衝液中、組換えプロBNP(1−108)から調製した。
表6は、11A8および17F10モノクローナル抗体を用い、実施例8および10からの2つのELISAプロトコルに従って生じた結果を示す。
12.1.サンプル:
−民間供給源(ProMedex、NY、米国)に由来し、NYHA(New York Heart Association)クラスのIからIIIのうちの1つに属し、志願者の同意文書に署名した鬱血性心不全被験者からの55検体のEDTA血漿。被験集団は以下のとおりである:NYHAクラスIが10人の患者、NYHAクラスIIが21人の患者およびNYHAクラスIIIが24人の患者。
−正常被験者(健常志願者、ProMedex、NY、米国)からの48検体のEDTA血漿。
使用される材料と方法は、BNP(1−32)に関しては上記8.2に記載されたもの、プロBNP(1−108)に関しては上記10.2に記載されたものと同一であった。
12.3.1.鬱血性心不全患者におけるBNP(1−32)アッセイおよびプロBNP(1−108)のアッセイの結果
8.2に開示されたBNP(1−32)アッセイにより、鬱血性心不全患者の血漿から得られたBNP(1−32)の値は、本発明によるプロBNP(1−108)アッセイの値と相関性があることが判明した(r2=0.935、図7)。
固相におけるモノクローナルヒンジ76抗体および検出用に20G7抗体−ペルオキシダーゼ複合体を用いるプロBNP(1−108)アッセイによって、健常被験者からの血漿より得られたプロBNP(1−108)の値は、検出に20G7抗体を用いるBNP(1−32)アッセイの値と相関性が高い(r2=0.702)ことが判明した(図9)。
13.1サンプル:
Lapeyronie病院、Montpellier、仏国に由来し、志願者の同意文書に署名した33人の腎不全患者からのEDTA血漿。
使用される材料と方法は、BNP(1−32)に関しては上記8.2に記載されたもの、およびプロBNP(1−108)に関しては上記10.2に記載されたものと同一であった。
固相におけるヒンジ76抗体および検出に20G7抗体−ペルオキシダーゼ複合体を用いるプロBNP(1−108)アッセイによって、腎不全患者の血漿より得られたプロBNP(1−108)の値は、本発明の20G7抗体を用いるBNP(1−32)アッセイの値と相関性が高い(r2=0.899)ことが判明した(図10)。本発明による20G7抗体は、腎不全患者におけるBNP(1−32)アッセイおよびプロBNP(1−108)アッセイに極めて適切である。
14.1.患者サンプル:
−脳卒中発症の3時間以内に救急診療部に入院した虚血性脳卒中患者から32のクエン酸塩添加血漿サンプルを試験した。脳卒中の重症度は、National Institutes of Health Stroke Scale(NIHSS)により評価した。
−脳卒中集団からの患者に性別および年令を適合させた、明らかに健常の血液供与者から42のクエン酸塩添加血漿サンプルを試験した。
クエン酸塩添加血漿サンプルの全てを−80℃に保存した。分析前に、サンプルを解凍し、4℃で15分間3000gで遠心分離した。
サンプルの全てを、BioPlex(商標)2200プロBNPアッセイ(Bio−Rad)により試験した。
BioPlex(商標)2200は、マルチプレックスの磁気ビーズ技術とフローサイトメトリー技術とを組合わせて、完全自動化ランダムアクセスプラットフォーム上でマルチ検体検出を提供する。磁気粒子(直径8μm、カルボキシル修飾表面)を、互いに異なる波長で放射し、635nmで有意に吸着する2つの蛍光体で染色する(クラス染料CL1およびCL2)。レポーター蛍光体であるβ−フィコエリトリン(PE)は、高モルの吸光係数、量子収率、耐光退色性があり、自己消光が無く安定性であるため選択された。この検出器により、3つの波長:2つのクラス染料およびレポーター染料での光が同時に測定される。
BioPlex(商標)2200のプロBNPアッセイは、二段階サンドイッチ蛍光免疫学的アッセイである。第一ステップにおいて、BioPlex(商標)2200システムにより、反応器内に50μLの患者サンプル、抗プロBNP(1−108)モノクローナル抗体(エピトープRAPR76S77P(配列番号58)を認識するヒンジ76モノクローナル抗体、Bio−Rad)でコーティングされた磁気染色ビーズおよびアッセイ用緩衝液が組合わされる。次いで、11分のインキュベーションおよび洗浄サイクル後、フィコエリトリン(PE)に結合した抗ヒトBNPモノクローナル抗体20G7複合体を添加し、2分間インキュベートした。過剰の複合体を除去後、ビーズ混合物は、PEの蛍光により染色ビーズおよびビーズ上に捕捉された抗原量を識別する検出器を通過させる。6つの異なる標準物質の1組を用いて較正後、3つのレベルの品質管理および患者のサンプル結果を、pg/mLで表す。
対照および虚血性脳卒中集団に関するBioPlex(商標)2200のプロBNP値の分布を、表8および図11に示している。プロBNP(1−108)のレベルは、対照群と比較して虚血性脳卒中群において有意に高い(Mann−Whitney、p<0.0001)。この結果は、プロBNP(1−108)もまた、虚血性脳卒中の早期の診断のための有用な血漿バイオマーカーであることを立証している。
15.1.サンプル:
−民間供給源(ProMedex、NY、米国)に由来する27人の急性冠動脈障害患者(Troponine I血漿平均値は12.5±6.9ng/mlに達する)からのEDTA血漿、
−48人の健常被験者(健常志願者、ProMedex、NY、米国)からのEDTA血漿。
BNP(1−32)アッセイに関して使用される材料と方法は、上記8.2に記載されたもの、およびプロBNP(1−108)に関しては上記10.2に記載されたものと同一であった。
救急医療部に入院し、上記のプロBNP(1−108)アッセイにより急性冠動脈障害と診断された患者の血漿から得られたプロBNP(1−108)の値は、本発明による20G7抗体を用いるBNP(1−32)アッセイにより得られた値と相関性が高い(r2=0.956)ことが判明した(図12)。急性冠動脈障害患者のBNP(1−32)およびプロBNP(1−108)のレベル(プロBNP(1−108)およびBNP(1−32)に関してそれぞれ668±619および1,518±1,533pg/mlで、本発明によりアッセイされた)は、健常被験者のレベル(プロBNP(1−108)およびBNP(1−32)に関してそれぞれ37±32および227±172pg/mlで、本発明によりアッセイされた)よりも高かった。
16.1.材料:
−プロBNP(1−108)(非グリコシル化形態に関しては大腸菌(E.Coli)で産生された組換えタンパク質、およびグリコシル化形態に関して再プログラム化されたHEK293細胞からの組換えタンパク質、HyTest、フィンランド国)、
−Maxisorpの96ウェル平底マイクロプレート(Nunc、デンマーク国)、
−PBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液、pH7.4、Gibco錠剤。参照:18912−014(Invitrogen)、
−Tween(登録商標)20(Sigma−Aldrich、米国、#P1379)、
−プロBNP(1−108)のヒンジ配列:エピトープRAPR76S77P(配列番号55)を認識するヒンジ76モノクローナル抗体(Giuliani ら、Clin. Chem., 52: 6, 1054-1061, 2006)、
−ペルオキシダーゼに結合した20G7モノクローナル抗体(Bio−Rad)。
16.2.1.グリコシル化プロBNPの分析アッセイの原理:
グリコシル化プロBNP(1−108)の20pg/mlから10,000pg/mlの標準範囲を、0.1%のPBS−T緩衝液中で調製した。非グリコシル化プロBNP(1−108)の20pg/mlから10,000pg/mlの標準範囲を、同じ方法で0.1%のPBS−T緩衝液中で調製した。
表9および図13に示された結果は、固定化ヒンジ76抗体および検出に20G7抗体を用いる免疫アッセイによりグリコシル化プロBNP(1−108)および非グリコシル化プロBNP(1−108)アッセイに対応する。
17.1.材料:
−ProteOn XPR36分析器(表面プラスモン共鳴SPR技術、Bio−Rad、米国)
−グリコシル化形態および非グリコシル化形態(13nMから200nM)でのプロBNP(1−108)(組換えタンパク質、HyTest、フィンランド国)、
−抗Fc断片抗体(Sigma、米国)
−エピトープRAPR76S77P(配列番号55)を認識し、0.1%のPBS−T中30μg/mlの濃度で使用されるモノクローナルヒンジ76抗体(Bio−Rad)、
−PBS(リン酸緩衝生理食塩水)緩衝液、pH7.4。
17.2.1.原理:
ProteOn XPR36分析器(その原理は、表面プラスモン共鳴技術(SPR)に基づく)を用いて、20G7モノクローナル抗体とグリコシル化および非グリコシル化プロBNP(1−108)形態との相互作用の速度論および親和性を確定する。本発明者らは製造元の取扱説明書に従った。モノクローナル抗体は、抗Fc断片抗体を用いることによりバイオセンサー(固体表面)上に固定し、一方、グリコシル化または非グリコシル化可溶性抗原プロBNP(1−108)は、室温でバイオセンサーの表面上に一定流量で濃度を増加させて(13nMから200nMまで)循環させた。SPRシグナルが検出される角度は、消滅波が伝播する媒体の屈折率に直接比例した。屈折率の変化は、共鳴単位(RU、1000共鳴単位は、表面領域の1mm2当り1ngの固定化タンパク質に相当する)で表される。抗原とモノクローナル抗体との間の相互作用および親和性の定量化は、デバイスのソフトウェア(Bio−Rad)を用いて全体的なデータ処理により会合速度定数(ka)および解離速度定数(kd)を算出することによって評価される。mol/lでの平衡解離定数(KD=kd/ka)は、モノクローナル抗体に関してグリコシル化および非グリコシル化プロBNP(1−108)抗原の親和性を反映する。
表10は、抗ヒンジ抗体(エピトープRAPR76S77P(配列番号55)を有するヒンジ76抗体、Bio−Rad)と、グリコシル化および非グリコシル化プロBNP(1−108)との間の相互作用の特性を示す。抗ヒンジ抗体と非グリコシル化プロBNP(1−108)との間の親和性定数(1.73.10−10)は、グリコシル化プロBNP(1−108)に関するもの(2.35.10−8)よりも大きかったが、プロBNP(1−108)のヒンジ領域を標的とする抗体は、グリコシル化および非グリコシル化双方の形態を高親和性で認識した。
18.1.組み込まれるエピトープの免疫活性が保存されるという条件で、本発明によるバイエピトープおよびトリエピトープの標準物質全ての構造は、線状であっても分枝状であってもよい。
配列番号56:PRSPKMVQG
配列番号57:APRSPKMV
配列番号58:SGLGCKLV
配列番号59:SPKMVQGSG
配列番号60:YTLRAPRSPKMVG
よりなる群から選択することができる。
本発明者らは、以下の標準物質を合成した。
CaliproBNP1:Ac−YTLRAPRSPKMV−Ahx−SFGRKMDRISS−CONH2
CaliproBNP2:Ac−YTLRAPRSPKMV−Ahx−CFGRKMDRISSSSGLGCK−CONH2
CaliProBNP3:Ac−YTLRAPRSPKMVQG−Ahx−FGRKMDR−CONH2。
CaliproBNP4b:Ac−FGRKMDR−Ahx−SGLGC*KVLR−CONH2
これら2つのバイエピトープ標準物質を使用して、例えば、モノクローナル抗体50B7または50E1(HyTest、フィンランド国)など、BNP(1−32)のC−末端に特異的なモノクローナル抗体の固相での固定化、ならびに検出の際には、例えば、モノクローナル20G7抗体−ペルオキシダーゼに基づき、BNP(1−32)アッセイを検量することができる。
このバイエピトープ標準物質を使用して、ポリクローナル抗体L21016(Bio−Rad)の固相での固定化、ならびに、検出の際には、例えば、モノクローナル20G7抗体−ペルオキシダーゼに基づき、上記8.2の通りにBNP(1−32)アッセイを検量することができる。
CaliproBNP6:Ac−YTLRAPRSPKMV−Ahx−FGRKMDR−Ahx−SGLGC*KVLRRH−COOH、
CAliproBNP6b:Ac−YTLRAPRSPKMV−Ahx−FGRKMDR−Ahx−SGLGC*KVLR−CONH2。
これら標準物質の有用性を示すために、検量および安定性の結果を、2つの異なる様式、すなわちBioPex(商標)アッセイおよびELISAアッセイにおいて表示する。
−プロBNP(1−108)バイエピトープ、CaliproBNP1およびCaliproBNP3化合物を、実施例14に記載されたBioPex(商標)2200プロBNPアッセイにより試験した。
−BNP(1−32)バイエピトープ、CaliproBNP5化合物は、実施例8.2に記載されたアッセイにより試験し、トリエピトープ、CaliproBNP6化合物は、実施例10.2に記載されたアッセイにより試験した。
種々の化合物を、5%のBSA、2mMのCaCl2、10%のアンチプロテーゼのカクテル(Sigma参照P2714)、0.1%のプロクリン、0.095%のNaN3および0.1%の安息香酸ナトリウムを含有する0.1Mのコハク酸緩衝液、pH7.6で希釈した種々の濃度で試験した。
18.5.1.BioPlex(商標)2200プロBNPアッセイにおけるCaliproBNP1およびCaliproBNP3の標準物質
**室温:20℃±5℃
***5%のBSA、2mMのCaCl2、10%のアンチプロテーゼのカクテル(Sigma参照P2714)、0.1%のプロクリン、0.095%のNaN3および0.1%の安息香酸ナトリウムを含有する0.1Mのコハク酸緩衝液、pH7.6。
種々の濃度範囲におけるCaliproBNP5およびCaliproBNP6の化合物の試験結果を、それぞれ図16および17に表示してある。
**室温:20℃±5℃
***5%のBSA、2mMのCaCl2、10%のアンチプロテーゼのカクテル(Sigma参照P2714)、0.1%のプロクリン、0.095%のNaN3および0.1%の安息香酸ナトリウムを含有する0.1Mのコハク酸緩衝液、pH7.6。
Claims (29)
- 式(I):
a1−R1−X1−FGRKMDR−X2−R2−a2 (I)
を有するヒトBNP(1−32)エピトープを担持するポリペプチドであって、
式中
−a1は、Hであってもよいし、チオール官能基、アルコール官能基、アミノキシ官能基、第一級アミンまたは第二級アミン官能基、アミノカルボキシル基、ビオチニル基およびアセチル基から選択される官能基または化学基を表していてもよく;
−a2は、OH官能基、NH2官能基またはアルコキシル基を表していてもよく;
−X1は、存在しないかまたは存在し、存在する場合はCとGCの中から選択され;
−X2は、存在しないかまたは存在し、存在する場合はIとISの中から選択され;
−R1およびR2は、同一であっても異なっていてもよく、存在しても存在しなくてもよく、式(I)の前記ポリペプチドが、配列GCFGRKMDRISを含むヒトBNP(1−32)の11個を超えるアミノ酸の部分を含まないという条件で、任意のアミノ酸、または2個から15個のアミノ酸のペプチド鎖を表す、ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、a1−SGCFGRKMDR−a2(配列番号33)、a1−GCFGRKMDRI−a2(配列番号34)、a1−CFGRKMDRIS−a2(配列番号35)およびa1−FGRKMDRISS−a2(配列番号36)よりなる群から選択され、式中、a1およびa2が、請求項1に定義されているとおりである請求項1に記載のポリペプチド。
- 式(II):
a1−FGRKMDR−a2 (II)
を有し、
式中
a1およびa2が、請求項1に定義されているとおりである請求項1に記載のポリペプチド。 - ヒトBNP(1−32)またはヒトプロBNP(1−108)ならびに配列FGRKMDRを含んでなるそれらの個々の断片に対するリガンドの調製のための請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- 抗体の調製のための請求項4に記載の使用。
- ヒトBNP(1−32)またはヒトプロBNP(1−108)ならびに配列FGRKMDRを含んでなるそれらの個々の断片に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの調製のための請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドの使用。
- ヒトBNP(1−32)またはヒトプロBNP(1−108)ならびに配列FGRKMDRを含んでなるそれらの個々の断片に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する方法であって、ハイブリドーマを得るために、
−免疫グロブリンを分泌するリンパ球のサンプルを、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチドにより免疫化された動物から採取し、
−前記リンパ球を骨髄腫細胞と融合させる、
方法。 - 請求項7に記載の方法から得ることができるハイブリドーマ。
- 登録番号CNCM I−3746でCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、Institut Pasteur、25、rue du Docteur Roux、75 724 Paris Cedex 15、仏国)に2007年4月13日に寄託されたハイブリドーマ。
- 配列FGRKMDRのエピトープに特異的なリガンド。
- 前記エピトープ、アプタマーを認識する抗体または前記抗体の断片、およびファージディスプレイにより得ることができる前記エピトープを特異的に認識するポリペプチドによって構成される群から選択される請求項10に記載のリガンド。
- 配列FGRKMDRのエピトープを特異的に認識する抗体、または前記エピトープを特異的に認識する前記抗体の断片によって構成される請求項10または11に記載のリガンド。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項12に記載のリガンド。
- 前記モノクローナル抗体が、請求項8または9に記載のハイブリドーマにより産生される請求項13に記載のリガンド。
- 登録番号CNCM I−3746の下でCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、Institut Pasteur、25、rue du Docteur Roux、75 724 Paris Cedex 15、仏国)に2007年4月13日に寄託されたハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体によって構成される請求項10〜14のいずれか一項に記載のリガンド。
- 請求項15に記載のリガンドの少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を有する請求項10〜14のいずれか一項に記載のリガンド。
- 生体サンプルにおいて、ヒトBNP(1−32)またはヒトプロBNP(1−108)ならびに配列FGRKMDRを含んでなるそれらの個々の断片を検出するための、請求項10〜16のいずれか一項に記載のリガンドの使用。
- 生体サンプルにおいて、ヒトBNP(1−32)、または配列FGRKMDRを含有するヒトプロBNP(1−108)の誘導体を検出する方法であって:
1)抗原−リガンド複合体の形成を可能にする条件下、請求項10〜16のいずれか一項に記載の少なくとも1つのリガンドと前記生体サンプルとを接触させること、および
2)形成した可能性のある複合体をいずれも検出すること、
を含んでなる方法。 - ヒトBNP(1−32)、ヒトプロBNP(1−108)またはそれらの個々の断片に特異的であり、かつ請求項10〜16のいずれか一項に記載のリガンドとは異なる特異性を有する少なくとも1つの追加リガンドと前記生体サンプルとを接触させる少なくとも1つの追加ステップを含んでなる請求項18に記載の方法。
- 前記追加リガンドが抗体である請求項19に記載の方法。
- 個体における少なくとも1つの心臓病態および/または血管病態の診断、予後、危険性の層別化または治療的追跡の方法であって、
1)抗原−リガンド複合体の形成を可能にする条件下、請求項10〜16のいずれか一項に記載の少なくとも1つのリガンドと前記個体からの生体サンプルとを接触させるステップと、
2)形成した可能性のある複合体をいずれも検出するステップと、
3)ステップ2における検出結果に基づいて、前記個体における前記病態の診断、予後、発現の危険性または治療的追跡を判定するステップと、
を含んでなる方法。 - ヒトBNP(1−32)、ヒトプロBNP(1−108)またはそれらの個々の断片に特異的であり、かつ請求項10〜16のいずれか一項に定義されたリガンドの特異性とは異なる特異性を有する少なくとも1つの追加リガンドと前記生体サンプルとを接触させる少なくとも1つの追加ステップを含んでなる請求項21に記載の方法。
- 前記追加リガンドが抗体である請求項22に記載の方法。
- 前記病態が、
−鬱血性心不全、
−急性冠動脈症候群、
−脳血管性発作、
−腎不全、
−呼吸困難、
−高血圧、
−じゅく状斑破裂、
−未熟新生児における動脈管開存症、および/または
−糖尿病、
を含んでなる群から選択される請求項21〜23のいずれか一項に記載の方法。 - 以下の一般式(III):
t1−E1−L1−E2[−Lk−1−Ek]n−t2 (III)
を有するマルチエピトープ標準物質であって、
式中:
−nは、0〜8の間の整数であり;
−kは、n>0の場合、3〜n+2の間の整数であり;
−E1、E2、およびEkは、互いに異なり、1つは、R1−X1−FGRKMDR−X2−R2ペプチド配列を表し、式中X1、X2、R1およびR2は、請求項1に定義されたとおりであり、他は、ヒトプロBNP(1−108)の配列から選択される3個から15個のアミノ酸の配列を表し;
−t1は、水素原子、アセチル基、1個から10個のアミノ酸のペプチド配列、1個〜10個のN−αアセチル化アミノ酸のペプチド配列、ビオチニル基またはビオシチニル基、ビオチニル基またはビオシチニル基を担持する1個から10個のアミノ酸のペプチド配列、または線状アミノアルキル(C1−C10)カルボニル鎖を表し;
−t2は、ヒドロキシル基、アミノ基、1個から10個のアミノ酸のペプチド配列、末端アミノ基を担持する1個から10個のアミノ酸のペプチド配列、または線状または分枝状アミノアルキル(C1−C10)カルボニル鎖を表し;
−L1およびLkは、同一であっても異なっていてもよく、ペプチド鎖の結合基を表す、
マルチエピトープ標準物質。 - 以下の一般式(IV):
t1−E1−L1−E2−t2(V)
に対応し、
式中、E1、E2、L1、t1およびt2は、請求項25に定義されたとおりである請求項25に記載のマルチエピトープ標準物質。 - L1およびL2が:
−NH−(CH2)5−CO−
を表す請求項25または26に記載のマルチエピトープ標準物質。 - 以下の式:
Ac−YTLRAPRSPKMV−L1−SFGRKMDRISS−NH2;
Ac−YTLRAPRSPKMV−L1−CFGRKMDRISSSSGLGCK−NH2;
Ac−YTLRAPRSPKMVQG−L1−FGRKMDR−NH2;
Ac−FGRKMDR−L1−SGLGC*KVLRRH−OH;
Ac−FGRKMDR−L1−SGLGC*KVLR−NH2;
Ac−SPKMVQGSG−L1−FGRKMDR−NH2;
Ac−YTLRAPRSPKMV−L1−FGRKMDR−L2−SGLGC*KVLRRH−OH;
およびAc−YTLRAPRSPKMV−L1−FGRKMDR−L2−SGLGC*KVLR−NH2;
により定義されるマルチエピトープ標準物質よりなる群から選択され、
式中、Acは、アセチル基を表し、C*は、アセトアミドメチルブロック化システインを表す請求項27に記載のマルチエピトープ標準物質。 - ヒトBNP(1−32)またはヒトプロBNP(1−108)ならびに配列FGRKMDRを含んでなるそれらの個々の断片を検出するためのキットであって、少なくとも
−請求項10〜16のいずれか一項に記載のリガンド;および
−請求項25〜28のいずれか一項に記載のマルチエピトープ標準物質、
を含んでなるキット。
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