CN102040660B

CN102040660B - 用作bnp免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用

Info

Publication number: CN102040660B
Application number: CN2009101911345A
Authority: CN
Inventors: 黄洪涛; 李鹏; 胡川闽; 易维京; 石延宾; 姚静; 张宪
Original assignee: CHONGQING ZIHE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Chongqing Novegent Biotech Co ltd
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2009-10-16
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2029-10-16
Also published as: CN102040660A

Abstract

本发明涉及一种BNP重组蛋白，其具有选自于下列a)或b)的氨基酸序列：a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后仍具有所述BNP重组蛋白活性的氨基酸序列；本发明还涉及编码上述BNP重组蛋白的核苷酸序列及上述BNP重组蛋白的制备方法。上述的BNP重组蛋白具有与天然BNP蛋白相同的免疫原性，而且纯度高，有更好的稳定性，可代替天然BNP多肽，用作BNP免疫诊断试剂标准品，并为下一步研究开发BNP检测试剂盒奠定了基础。

Description

用作BNP免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种用作BNP免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用。

背景技术

心脏病在许多国家已成为头号杀手，因其早期症状隐蔽，患者往往被延误治疗。近年的研究报告指出，病人心脏开始出现代偿功能不全或衰竭时，人体血液中的一种激素——促尿钠排泄肽的浓度就会明显升高。在心房、心室和血管里生成的促尿钠排泄肽又被分别称为ANP、BNP和CNP。研究发现，心脏病患者左心房收缩无力会造成血液在心脏内潴留，使人体分泌更多的上述激素，该激素刺激肾脏排钠排水量增加以减少血液潴留。所以，促尿钠排泄肽的浓度能够相对可靠地显示出人体心脏的状况。

BNP是一种在心室当中合成的神经激素，具有利钠、利尿、舒血管、抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统的作用。研究表明，当心室肌细胞压力增高时，前体蛋白(pro-BNP，108个氨基酸)发生裂解，产生含32个氨基酸的BNP及76个氨基酸非活性的N末端脑钠尿肽原(NT-proBNP)。因而BNP和NT-proBNP在评估心脏事件时较其他钠尿肽要好，能够单独地预示左室(LV)舒张末期压力增高的状况，能更好地反映和分析慢性心衰病人的状况。此外，与肌钙蛋白、CK-MB，和肌红蛋白等由于心脏损伤而释放的标志物不同，BNP在损伤发生以前，心脏功能代偿代偿阶段即可发生变化，有利于更早发现心功能的异常。目前BNP与NT-ProBNP的检测已经被广泛应用于急性冠脉综合征、CHF患者危险及稳定性冠状动脉疾病患者心脏事件危险的评价、监控左心室功能不全患者的治疗、探查轻度心功能不全等方面。与NT-ProBNP相比，BNP具有受年龄和肾功能的影响小的特点，对心脏功能的判断更为特异，具有统一的cut-off值。除此之外，BNP检测的主要优势还在于：能够快速、准确、高质量地对心脏衰竭进行诊断。与肌钙蛋白、CK-MB，和肌红蛋白等由于心脏损伤而释放的标志物不同，BNP在损伤发生以前，心脏功能代偿代偿阶段即可发生变化，有利于更早发现心功能的异常。众所周知，心脏衰竭的众多症状中，最常见且促使患者求医的症状就是呼吸困难，而引发此种症状的原因很多。因此面对患者，医生如何以最快速的方法作出正确判断并给予有效的治疗至关重要，BNP的应用能够大大提高心脏衰竭诊断的时效性和准确性，是检测心脏衰竭的最有效指标。另外，BNP是一个治疗有效性的早期监测指标，能够判断治疗是否有效，进而指导治疗。如果没有BNP的监测，治疗效果要等到几周后通过体征的改善才可以知道，而有了BNP监测，可以在2～3天就可以判断治疗效果。再次，除了用于诊断之外，BNP也可以作为心脏衰竭患者预后的指标。在接受治疗之后的患者，若其BNP血中浓度还是居高不下，则其死亡率或是因心脏衰竭恶化的再住院率都相对较高。因此，利用BNP，可以判断心脏衰竭患者恢复的好坏。

美国FDA在2000年11月22日首次批准了Biosite Diagnostics公司用于帮助诊断充血性心力衰竭的BNP试剂盒，Biosite Diagnostics Triage BNP。这是一种床旁检验(POCT)，使用六滴全血或血浆可在15分钟完成此项检测。瑞士罗氏医疗诊断部也开发了类似产品。目前FDA批准其用于充血性心衰(CHF)的辅助诊断，标示急性冠脉综合征和CHF患者危险及评价稳定性冠状动脉疾病患者心脏事件危险。在欧洲，该检测系统的适应证还包括：监控左心室功能不全患者的治疗；探查轻度心功能不全；评价CHF确诊患者心衰严重程度。

根据SFDA相关数据，目前获得国内批文的BNP检测产品共有14种，其中6种为BNP质控或标准品，这6种产品全为进口，分别由Biosite Incorporated、Abbott GmbH & Co.KG、Bayer HealthCare LLC、Siemens Medical SolutionsDiagnostics四家公司把持。如前所述，如同心肌肌钙蛋白为心梗诊断的金标准标志物一样，B型钠尿肽(BNP)作为心衰诊断的金标准标志物，已得到全球心血管界和检验医学界的公认，在不远的将来一定会在我国得到普遍使用，然而由于目前的相关检测试剂严重依赖进口，导致患者使用成本相对较高，280元人民币/次检测。

定量检测人BNP常用的是免疫学方法，建立免疫学定量检测方法除了需要特异性良好的抗体之外，还需要相应的检测标准品与之配套。由于BNP的分子量仅由3.5KD，在体内降解速度较快，在血液中半衰期约20分钟。人体内BNP极低，正常外周血浓度为100pg/ml左右；因而无法从血浆(血清)中纯化使得天然NT-ProBNP多肽制备十分困难。而直接多肽合成成本过高，且多肽存在不稳定、保存困难等问题。用基因工程制备低分子量多肽，一般采用融合蛋白表达，能克服单独表达低分子量多肽时出现的翻译效率低表达产物易受蛋白水解酶降解的缺陷，但较大的标签蛋白对小分子蛋白的免疫原性有一定的影响。所以通常使用一些蛋白酶切除标签蛋白，切除标签后的蛋白需要进一步纯化和去除加入的蛋白酶，操作比较麻烦并且蛋白酶十分昂贵。对检测标准品要求主要为：与天然存在的人BNP有相同或相近的结构，具有相同的免疫原性及高度的稳定性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种BNP重组蛋白，以代替天然BNP多肽，用作BNP免疫诊断试剂标准品。

BNP重组蛋白具有选自于下列a)或b)的氨基酸序列：

a)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后仍具有所述BNP重组蛋白活性的氨基酸序列。

本发明还提供一种编码上述BNP重组蛋白的核苷酸序列，其具有选自下列c)、d)或e)的核苷酸序列：

c)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

d)不同于SEQ ID NO：2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

e)按照碱基互补配对原则所有碱基能与上述c)或d)中的序列杂交，并且编码具有所述BNP重组蛋白活性的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种上述BNP重组蛋白的制备方法的制备方法，以代替天然BNP多肽，用作BNP免疫诊断试剂标准品。所述BNP重组蛋白的制备方法主要包含以下步骤：

1)根据GENEBANK中提供的BNP编码序列，获得BNP的编码序列SEQID NO：3，将编码序列SEQ ID NO：3同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列SEQ ID NO：4，利用2段由5个甘氨酸组成的Linker将3段经改造的序列进行连接获得重组BNP的编码序列SEQ ID NO：2，以全基因合成的方式获得重组BNP基因；

2)重组BNP基因与载体连接，构建BNP重组质粒，获得BNP重组质粒；

3)BNP重组质粒转化大肠杆菌，进行BNP重组蛋白的表达，获得BNP重组蛋白；

4)BNP重组蛋白的可溶性鉴定；

5)BNP重组蛋白的纯化；

6)BNP重组蛋白的浓度、纯度鉴定；

7)BNP重组蛋白的活性鉴定。

上述制备方法中，步骤1)包括：将编码序列SEQ ID NO：3中第2、3、13、14、30、31位氨基酸同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子，根据改造后的基因序列进行串联拼接；其中上述的大肠杆菌优选为BL21。

上述制备方法中，步骤2)中使用的载体为pET42a。

上述制备方法中，步骤5)包括采用GST亲和层析纯化，其中采用的亲和层析纯化介质优选为快流速GST标签(GSTrap Fast Flow)。

上述制备方法中，步骤5)还包括采用His亲和层析纯化，其中采用的亲和层析纯化介质优选为快流速组氨酸标签(Histrap Fast Flow)。

上述制备方法中，步骤5)还包括脱盐柱(Desalting)处理。

上述的步骤5)具体包括以下步骤：

①将含目的BNP重组蛋白的破菌上清用快流速GST凝胶初纯化，采用洗脱液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L还原型谷胱苷肽，pH8.0)连续洗脱并收集目的BNP重组蛋白蛋白峰；

②初纯化的BNP重组蛋白用快流速组氨酸标签亲和层析柱再次纯化，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱收集后者；

③用脱盐柱脱盐和去除咪唑，流动相缓冲为50mM Tris-HCl，pH 8.0；

④脱盐后BNP重组蛋白内加入带有His标签的重组EK酶，重组EK酶与BNP重组蛋白量比为1∶1000，置于4℃低速摇床24-48小时；

⑤再次用快流速组氨酸标签亲和层析柱纯化及去除重组EK酶，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱，40mM洗下蛋白即为所需BNP重组蛋白。

上述制备方法中，步骤6)中采用Lowry法(Folin酚法)测定BNP重组蛋白浓度；采用高效液相色谱法(HPLC)测定BNP重组蛋白纯度。

本发明还有一个目的是提供上述的BNP重组蛋白在免疫诊断中的应用，其可代替天然BNP多肽用作BNP免疫诊断试剂标准品，或BNP重组蛋白用于制备BNP检测试剂盒。

本发明获得的BNP重组蛋白为含106个氨基酸的多肽，与天然BNP的32个氨基酸相比，为三段编码天然BNP的氨基酸多肽经2段linker(5个甘氨酸)连接而成。经密码子改造的基因构建的原核表达质粒在大肠杆菌中实现了高效可溶性表达，大肠杆菌表达蛋白制备工艺简单，价格低廉，能大规模生产。发明获得的BNP重组蛋白为含106个氨基酸的多肽在纯化过程中发现，它在与融合蛋白切开后能非特异性的结合到HisTrap HP柱，经(20mmol/L sodiumphosphate，0.5M NaCl，20-50mmol/L咪唑pH7.4)可以将其洗脱，而未切开的蛋白及切下的标签蛋白与加入的EK酶(带His标签)不能洗脱，达到纯化分离和去除加入的蛋白酶的效果，制备的串联重组BNP纯度很高，方法简单，所用的纯化材料也是很常见的纯化填料。并且研究发现：在相同的保存条件和测定条件下，串联重组BNP在4℃保存15天活性下降了9.3％，而BNP(合成含32个氨基酸的多肽)下降了53.6％，串联重组BNP的稳定性明显优于天然BNP。由于串联重组BNP切除了标签蛋白，与天然存在的人BNP相比具有相同或相近的结构，能被现在的BNP的检测试剂检测，其具有与天然BNP相同的免疫原性，而且纯度高，有更好的稳定性；而且上述的纯化工艺简单，成产成本低。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为串联重组BNP结构示意图；

图2为BNP基因密码子偏性分析图，其中柱高值在50以下的部分为在大肠杆菌使用频率较低的密码子；

图3为pET42a-BNP重组质粒酶切鉴定电泳图，其中：M为Marker；泳道1为pET42a空未酶切；泳道2为pET42a空双酶切；泳道3为pET42a-BNP质粒未酶切；泳道4为pET42a-BNP质粒双酶切；

图4pET42a-BNP重组质粒诱导表达的SDS-PAGE电泳图，其中：M为Marker；泳道1为pET42a空诱导；泳道2为pET42a-BNP诱导；泳道3为pET42a-BNP经GSTrap F.F.初纯化流穿蛋白；泳道4为pET42a-BNP经GSTrap F.F.初纯化洗脱蛋白；

图5为pET42a-BNP经GSTrap F.F.初纯化产物进行EK酶切割后电泳鉴定结果，其中：M为Marker；泳道1为上样流穿峰蛋白；泳道2为切割流穿峰蛋白；泳道3为洗脱峰蛋白。

具体实施方式

材料和来源

菌种、质粒、所用菌株E.coli BL21(DE3)、DH5α为本实验室保存；

pGEM-T购自promega公司；

pET32a(+)及pET42a(+)购自Novagen公司。

主要试剂：

Sal I、BamH I购自ToYoBo公司；

pfu DNA聚合酶、T₄DNA连接酶购自promega公司；

DL2000 DNA Marker，DNA胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自Tiangen生物科技有限公司；

BNP检测试剂盒购自Roche公司；

蛋白质BCA法定量检测试剂购自PIERCE公司；

蛋白质Marker为中科院生物制品研究所产品；

纯化所用层析柱及填料购自Amersham公司；

肠激酶(EK酶)为本室自制(带HIS-Tag)，以质量比1∶1000(EK酶：目的融合蛋白)，将二者混合于含1mM CaCl₂的50mM pH 9.0的Tris-HCl。

全基因合成由Invitrogen公司完成；

其它试剂均为中国产化学分析纯。

实施例一重组BNP基因的克隆

根据GENEBANK提供的BNP基因序列(NM_002521.2)得到BNP编码序列为BNP基因中编码第77-108个氨基酸的共99个碱基(SEQ ID NO：3)。将此序列递交于Graphical codon usage analyzer(http://guca.schoedl.del)分析发现该基因中第2、3、13、14、30、31位氨基酸编码的密码子在E.coli BL21中使用的频率偏低(参照图2的BNP基因密码子偏性分析图，其中柱高值为50以下的部分为在大肠杆菌使用频率偏低的密码子)，对其进行同义改造后获得编码序列SEQID NO：4，利用2段由5个甘氨酸组成的Linker将3段经改造的序列进行连接获得重组BNP的编码序列SEQ ID NO：2，将该编码序列带上Sal I、BamH I酶切位点，其中BamH I酶切位点后加入GATGATGATGATAAG序列，其编码Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列为EK酶的识别位点后委托上海英骏生物工程有限公司进行合成。

实施例二pET42a-BNP重组质粒的构建

将pET42a载体和合成全基因经BamH I/Sal I双酶切消化4小时后用T₄DNA连接酶4℃过夜连接，取一无菌离心管，加入已制备好的感受态DH5α菌200μl，冰浴，吸取1μl连接产物加入管中，转化DH5α菌，轻拍管壁混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，取出离心管再冰浴2分钟，加入800μl室温的2×YT培养液混匀，37℃摇床220rpm振荡培养1小时，分别将50μl、200μl及剩下的全部转化菌液涂于3个含卡那霉素抗性的2×YT培养板上，37℃恒温培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养，用碱裂解法提取质粒，取质粒用BamHI Sal I双酶切4小时，酶切反应体系为：pET42a-BNP质粒DNA 10μl，BamH I 1μl，Sal I 1μl，10×缓冲液K 2μl，ddH₂O 6μl，并取酶切产物10μl行1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定可见与设计值318bp一致的片断(图3)。

实施例三BNP重组蛋白的诱导表达及鉴定

1转化BL21菌

取重组pET42a-BNP质粒转化BL21(DE3)菌，涂布于含卡那霉素抗性的LB固体培养基，37℃培养箱过夜培养，次日挑取白色菌落接种于LB培养基扩大培养。

2BNP重组蛋白的诱导表达

将转化pET42a-BNP的细菌扩大培养，测细菌OD值达0.6-0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导，按时间点2、4、6、8、10、12小时收集诱导的细菌。结果表明，IPTG诱导的细菌出现分子量约为40kD的特异性蛋白条带，与预期pET42a/BNP的分子量值相符，约占细菌总蛋白的30％。再将IPTG诱导6小时的BL21重组菌用裂菌液破菌，离心后分别取上清和沉淀电泳，未诱导的菌液和诱导6小时的菌液分别做阴性和阳性对照，结果在上清中与阳性对照重组蛋白条带相对应的位置发现特异蛋白条带，而沉淀无此蛋白条带，证实重组融合蛋白为可溶性表达(图4)。

实施例四BNP重组蛋白的纯化

转化pET42a-BNP重组质粒的菌经1.0mmol/L的IPTG诱导表达后使用GSTrapF.F.初纯化，使用GSTrap F.F.的结合缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，0.15MNaCl，pH7.3)重悬后冰上超声破菌，4℃高速离心留上清经过滤后用Amersham的AKTAprime上柱，平衡后用洗脱液(50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L还原型谷胱苷肽，pH8.0)洗脱，收集洗脱蛋白(图4)。将含目的蛋白的洗脱峰用His-结合缓冲液(20mmol/L sodium phosphate，0.5M NaCl，pH7.4)按1∶9的体积比稀释后上HisTrap HP再次纯化，His-结合缓冲液平衡后用His-洗脱缓冲液(20mmol/Lsodium phosphate，0.5M NaCl，0.5M咪唑PH7.4)先10％B洗脱去除非特异性结合的杂蛋白，平衡后用100％B将目的蛋白洗下。将获得的纯化重组蛋白用HiTrapDesalting置换缓冲体系为EK切割缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，按EK酶与蛋白1∶1000的质量比加入EK酶，4℃低速摇床(60r/分钟)切割12小时左右。切割后用His-结合缓冲液稀释后HisTrap HP纯化，分别收集穿透、10％B和100％B的蛋白，17.5％SDS-PAGE电泳进行鉴定。

pET42a-BNP表达的融合蛋白是以GST-BNP形式存在，经EK酶切后得到106个氨基酸的目的蛋白，其BNP氨基酸序列与天然完全相同。GST-BNP经HPLC检测纯度为92.1％，每升诱导菌获得32.4mg融合蛋白，经切割后可以获得5.6mg左右的重组串联BNP(图5)。

实施例五BNP重组蛋白的浓度、纯度鉴定

1Lowry法(Folin酚法)测定BNP-83蛋白质含量

表1：制备标准曲线：

单位：(ml)

在650nm波长下，以空白管为对照调零，分别测定各管的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，只作标准曲线。

将待测蛋白稀释后，紫外分光光度计测定A₂₆₀值和，A₂₈₀值。根据公式，蛋白浓度C＝(1.45×A₂₈₀-0.75×A₂₆₀)×稀释倍数，计算出待测蛋白的粗略浓度，然后将蛋白样品用蒸馏水稀释至25-250μg范围，按照上表的操作程序反应，测定出650nm吸光度值，然后在标准曲线上查出相应的浓度，在乘以稀释倍数计为待测蛋白的浓度，多管计算平均值，测得浓度为1.362g/L。

2纯化产物用高效液相色谱法(HPLC)进行纯度测定。

重组串联BNP经HPLC检测纯度为98.6％，每升诱导菌获得32.4mg该融合蛋白，经切割后可以获得5.6mg左右的重组串联BNP。

实施例六重组串联BNP特异免疫反应性鉴定

采用Roche公司BNP检测试剂盒测定其特异免疫反应性：稀释成合适的浓度后，将1000倍稀释后的蛋白1μl加入到299μl的人血清中，分别测定人血清和加了重组蛋白的人血清中BNP含量。

经Roche电化学发光免疫测定试剂测定其特异免疫反应性，结果如下(表2)。制备的BNP重组蛋白具有较强的特异免疫反应活性，

表2：电化学发光免疫测定试剂测定重组BNP特异免疫反应性

(浓度单位：pg/ml)

测定样品	测定浓度	增加浓度	理论增加浓度	增加浓度/理论增加浓(*100％)
					人血清+PBS	4298	0	0	0
人血清+重组BNP	18821	14532	14100	103％

增加浓度＝测定浓度-人血清测定浓度；

理论增加浓度＝(融合蛋白分子量/BNP分子量)*蛋白纯度*蛋白浓度；

实施例七BNP重组蛋白稳定性试验

将纯化的BNP重组蛋白用保存液(含BSA、抑肽酶aprotinin、EDTA和庆大霉素)稀释后等份分装，各种蛋白初始浓度相近。置于4℃保存，分别于1、3、7、9、11、15d后后用BNP电化学发光免疫测定试剂测定，计算免疫活性比率。测定结果如下(表3)。

表3：BNP重组蛋白稳定性试验

(浓度单位：pg/ml)

结果表明：在相同的保存条件和测定条件下，重组串联BNP在4℃保存15天活性下降了9.3％，而合成32肽BNP下降了53.6％，重组串联BNP的稳定性明显优于合成32肽BNP。由于重组串联BNP切除了标签蛋白，与天然存在的人BNP相比仅多了2段免疫原性较低的linker，具有3段重复的天然BNP序列，能被现在的BNP的检测试剂检测，故可以代替天然BNP多肽用于BNP免疫诊断试剂标准品。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>重庆紫禾医药技术开发有限公司

<120>用作BNP免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>106

<212>PRT

<213>BNP重组蛋白氨基酸序列

SPK MVQ GSG CFG RKM DRI SSS SGL GCK VLR RHG 33

GGG GSP KMV QGS GCF GRK MDR ISS SSG LGC KVL 66

RRH GGG GGS PKM VQG SGC FGR KMD RIS SSS GLG 99

CKV LRR H 106

<210>2

<211>318

<212>DNA

<213>编码BNP重组蛋白的核苷酸序列

<400>2

agcccgaaaa tggtgcaagg gtctggctgc tttgggcgca aaatggaccg catcagctcc 60

tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgcgc cgccatggtg gtggtggtgg tagcccgaaa 120

atggtgcaag ggtctggctg ctttgggcgc aaaatggacc gcatcagctc ctccagtggc 180

ctgggctgca aagtgctgcg ccgccatggt ggtggtggtg gtagcccgaa aatggtgcaa 240

gggtctggct gctttgggcg caaaatggac cgcatcagct cctccagtgg cctgggctgc 300

aaagtgctgc gccgccat 318

<210>3

<211>99

<212>DNA

<213>GENE BANK中获得的BNP编码序列

<400>3

agccccaaga tggtgcaagg gtctggctgc tttgggagga agatggaccg gatcagctcc 60

tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgagg cggcattaa 99

<210>4

<211>99

<212>DNA

<213>同义置换后的BNP编码序列

<400>4

agcccgaaaa tggtgcaagg gtctggctgc tttgggcgca aaatggaccg catcagctcc 60

tccagtggcc tgggctgcaa agtgctgcgc cgccattaa 99

Claims

1.一种Ｂ型钠尿肽（BNP）重组蛋白，其特征在于：该Ｂ型钠尿肽重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

2.一种权利要求1的BNP重组蛋白的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

1）根据GENEBANK中提供的BNP编码序列，获得BNP的编码序列SEQ ID NO:3，将编码序列SEQ ID NO:3同义置换为大肠杆菌偏爱的密码子获得编码序列SEQ ID NO:4，利用2段由编码5个甘氨酸的核苷酸序列组成的Linker，将3段经改造的序列进行连接获得重组BNP的编码序列SEQ ID NO:2，以全基因合成的方式获得重组BNP基因；

2）BNP基因与载体连接，构建BNP重组质粒，获得BNP重组质粒，所述载体为pET42a；

3）BNP重组质粒转化大肠杆菌，进行BNP重组蛋白的表达，获得BNP重组蛋白；

4）BNP重组蛋白的可溶性鉴定；

5）BNP重组蛋白采用亲和层析纯化和脱盐柱处理；

6）BNP重组蛋白的浓度、纯度鉴定；

7）BNP重组蛋白的活性鉴定。

3.根据权利要求2所述的BNP重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤1）包括：将编码序列SEQ ID NO:3中第2、3、13、14、30、31位氨基酸的密码子使用频率低，柱高值为50以下，改造为大肠杆菌偏爱的密码子，根据改造后的基因序列进行全基因合成。

4.根据权利要求2所述的BNP重组蛋白的制备方法，其特征在于采用的亲和层析纯化介质为快流速GST标签亲和层析柱。

5.根据权利要求2所述的BNP重组蛋白的制备方法，其特征在于采用的亲和层析纯化介质为快流速GST组氨酸标签亲和层析柱。

6.根据权利要求2或4或5所述的BNP重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤5）包括以下步骤：

将含目的BNP重组蛋白的破菌上清用快流速GST标签亲和层析柱初纯化，采用连续洗脱并收集目的BNP重组蛋白蛋白峰；

初纯化的BNP重组蛋白用快流速组氨酸标签亲和层析柱再次纯化，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱收集后者；

用脱盐柱脱盐和去除咪唑，流动相缓冲为50mM Tris-HCl，pH 8.0；

脱盐后BNP重组蛋白内加入带有His标签的重组EK酶，重组EK酶与BNP重组蛋白质量比为1：1000，置于4℃，转速为60r/分钟摇床切割12小时；

再次用快流速组氨酸标签亲和层析柱纯化及去除重组EK酶，洗脱采用40mM和500mM咪唑阶段洗脱，40mM洗下蛋白即为所需BNP重组蛋白。

7.根据权利要求2所述的BNP重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤6）中采用Lowry法测定BNP重组蛋白浓度或高效液相色谱法测定BNP重组蛋白纯度。