CN110195074A - 一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法 - Google Patents
一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110195074A CN110195074A CN201910202531.1A CN201910202531A CN110195074A CN 110195074 A CN110195074 A CN 110195074A CN 201910202531 A CN201910202531 A CN 201910202531A CN 110195074 A CN110195074 A CN 110195074A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probnp
- recombinant protein
- sumo
- protein
- label
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010008064 pro-brain natriuretic peptide (1-76) Proteins 0.000 title claims abstract description 86
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 102400001263 NT-proBNP Human genes 0.000 claims abstract description 78
- 101000879203 Caenorhabditis elegans Small ubiquitin-related modifier Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000051619 SUMO-1 Human genes 0.000 claims abstract description 29
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000004217 heart function Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 9
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims abstract description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims abstract description 4
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims abstract description 4
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 238000003450 affinity purification method Methods 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 abstract description 10
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 abstract 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract 1
- 101800000407 Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 description 10
- 102400000667 Brain natriuretic peptide 32 Human genes 0.000 description 9
- 101800002247 Brain natriuretic peptide 45 Proteins 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 108020001621 Natriuretic Peptide Proteins 0.000 description 6
- 102000004571 Natriuretic peptide Human genes 0.000 description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 description 6
- 239000000692 natriuretic peptide Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102100036836 Natriuretic peptides B Human genes 0.000 description 3
- 101710187802 Natriuretic peptides B Proteins 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 3
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000004652 Cardiovascular Abnormalities Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000013875 Heart injury Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229960002478 aldosterone Drugs 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 206010061592 cardiac fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L dipotassium;[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl] phosphate Chemical compound [K+].[K+].OC[C@H]1O[C@H](OP([O-])([O-])=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O KCIDZIIHRGYJAE-YGFYJFDDSA-L 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002600 fibrillogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 210000002837 heart atrium Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000013094 purity test Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种提高心功能标记物N端脑钠肽NT‑proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法，所述的NT‑proBNP重组蛋白与SUMO标签蛋白融合表达，并通过SUMO酶酶切去除，纯化获得无标签的NT‑proBNP重组蛋白，具有如SEQ.No.1所示的氨基酸序列，本发明所述的提高NT‑proBNP重组蛋白稳定性的缓冲体系为含有5%‑10%海藻糖，5%‑20%甘油，5%‑15%环糊精，3%‑8%山梨醇，pH为6.5~7.4的PBS缓冲液，可以使NT‑proBNP重组蛋白具有天然的NT‑proBNP蛋白的生物活性，可作为心衰诊断试剂标准品和抗体制备的优质可靠的原料，而且纯度高，成本低，稳定性高，具有较高商业化价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法。
背景技术
利钠肽(NP)家族现在越来越受到重视，大多数人类利钠肽家族是由心脏分泌的，并起到控制水盐平衡、维持压力调节稳态等作用。心血管利钠肽内分泌组分包括ANP、BNP、CNP、DNP和VNP。尽管分型各不相同，但是大多数种类的利钠肽在相同种属间的进化是相当保守的。在种属内存在差异的哺乳动物只有BNP及其氨基末端前体BNP (NT-proBNP)。
B型利钠肽除了具有利钠肽共有的那些功能外，还可能具有抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、抗心肌纤维化、强松弛性等作用。BNP主要在心脏表达，尤以心房表达更加丰富。另外，BNP的释放受到压力和容量两种因素调节，进而能预示出心室容积扩大、左室舒张末期压增大，心室超负荷以及心脏损伤程度等一系列心血管异常情况。
NT-proBNP是在BNP前体(proBNP)形成BNP过程中产生的一种无生物活性的蛋白，在代谢过程中，产生的BNP与NT-proBNP含量相同，所以NT-proBNP与BNP同样可以作为一种心脏标志物。但是NT-proBNP缺乏主动清除机制，NT-proBNP在体液中的半衰期要长，浓度更大，更容易检测，并且检测样本更容易获得，因此其已经成为一种主要的心脏检测指标。
2002年，FDA批准了罗氏公司研究发现的NT-proBNP上市。随后BNP作为心衰的诊断指标，分别于2005年、2007年写入ESC/AHA心衰防治指南与中国心衰诊疗指南。 NT-proBNP检测在本世纪初先后进入我国，十几年来已经为各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。尤其在当下我国老龄化趋势愈加严重、心衰危险因素流行增加造成心力衰竭发病率持续升高的背景下，NT-proBNP 用于心衰高风险人群的筛查对于心衰的及时预防、早期发现及有效管理，从而降低心衰的发病率及死亡率具有重要意义。
由于NT-proBNP目前已经作为生化检验中重要的一种检测指标，因此NT-proBNP标准品目前在临床应用广泛，NT-proBNP标准品的用量非常大，目前常用的表达系统主要有大肠杆菌表达系统、毕氏酵母表达系统、真核细胞表达系统等。然而，真核表达系统投资巨大，表达周期长，生产条件要求高。并且NT-proBNP氨基酸结构简单，并没有复杂的翻译后加工过程，所以选择大肠杆菌表达系统是经济实用，表达产率高，纯化工艺简单的一种生产策略。目前，市面上的NT-proBNP标准品大多是采用大肠杆菌表达系统表达后再纯化的产品。因其需求量大，因此需要能高产量重组表达NT-proBNP的方法。
NT-proBNP标准品的瓶颈在于其稳定性，要做到一级标准品要求NT-proBNP要稳定两年以上，而天然的NT-proBNP具有73个氨基酸，分子量小，易降解，半衰期仅为24小时。随着生物技术在诊断领域的发展，引进了许多新的多肽获得方法。本发明则利用了基因工程的方法表达NT-proBNP，并在前期基因设计综合考虑NT-proBNP的结构特性，得到了重组的NT-proBNP多肽。重组NT-proBNP与天然的NT-proBNP具有相同的氨基酸，并且具有相同的免疫原性。
发明内容
基于以上现有技术，本发明的目的在于提供一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法，在不改变天然NT-proBNP氨基酸结构和免疫活性的前提下制备NT-proBNP重组蛋白，同时提供提供一种能稳定保存NT-proBNP重组蛋白的缓冲体系。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，制备步骤如下：
步骤一、设计融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；
步骤二、培养大肠杆菌；
步骤三、诱导表达，使步骤一设计的融合蛋白在大肠杆菌中表达，得到融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；
步骤四、分离纯化步骤三中表达的融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；
步骤五、用SUMO酶对步骤四得到的融合蛋白进行酶切，得到NT-proBNP重组蛋白和SUMO标签蛋白混合蛋白；
步骤六、步骤五得到的混合蛋白进行分离纯化，得到高纯度的NT-proBNP重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ.No.1。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤二中大肠杆菌培养时培养基组成成分质量体积比为甘油1～1.5％、葡萄糖4.5～5％、酵母粉1.8～2.4％、蛋白胨1.2～1.8％、磷酸氢二钾 1.8～2.4％和磷酸二氢钾0.20～0.30％。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤三中大肠杆菌表达时，在诱导表达过程中加入乙醇0.1％-3％和IPTG 0.1-1mM，诱导温度为15℃-25℃，诱导时间为4-20h。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤四表达的融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白，融合后的氨基酸序列为SEQ.No.2。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤四分离纯化时采用亲和纯化方法Ni-IDABeads 6FF，用咪唑进行纯化和洗脱，孵育纯化时使用的咪唑浓度含量为20～25mM，洗脱时分别用浓度为45～50mM和450～550mM的咪唑进行，每次2～4h，得到高纯度融合SUMO标签的NT-proBNP蛋白。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤五SUMO酶酶切时SUMO酶与融合SUMO 标签蛋白的NT-proBNP蛋白的质量比为1:200，酶切缓冲液为含有质量比为1-10mMDTT， 5％-20％甘油的PBS缓冲液，pH为pH6.5-7.4，酶切温度20-30℃，反应时间2～4h。
为了更好的实现本发明，进一步的，步骤六纯化时采用亲和纯化方法Ni-IDABeads6FF， SUMO标签蛋白和SUMO酶均分别与Ni-IDABeads 6FF结合，而NT-proBNP蛋白与Ni-IDABeads 6FF不结合，用咪唑进行纯化和洗脱，孵育纯化时的咪唑浓度含量为20～25mM，洗脱时分别用浓度为45～50mM和450～550mM的咪唑进行，每次2～4h，得到高纯度无标签的 NT-proBNP的蛋白。
为了更好的实现本发明，进一步的，高纯度NT-proBNP蛋白存储缓冲体系为含有质量比为5％-10％海藻糖，5％-20％甘油，5％-15％环糊精，3％-8％山梨醇的PBS缓冲液，其pH 为6.5～7.4。
有益效果
本发明的有益效果如下：
1、本发明则利用了基因工程的方法表达NT-proBNP，并在前期基因设计综合考虑NT-proBNP的结构特性，得到了NT-proBNP重组蛋白。重组NT-proBNP与天然的 NT-proBNP具有相同的氨基酸，并且具有相同的免疫原性。
2、NT-proBNP标准品的瓶颈在于其稳定性，要做到一级标准品要求NT-proBNP要稳定两年以上，而天然的NT-proBNP具有73个氨基酸，分子量小，易降解，在4℃时半衰期仅为24小时。本发明提供的缓冲体系，可以有效的提高NT-proBNP标准品稳定性，在 -20℃和-80℃中能保持160天，依然维持原有水平延长保存周期。
附图说明
图1为NT-proBNP蛋白浓度采用BCA蛋白浓度测定试剂盒的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
将优化好的如上述的编码的NT-proBNP蛋白核苷酸序列由南京德泰生物科技(南京) 有限公司合成，在合成得到核苷酸序列后将序列克隆到pET-SUMO载体中。
1、转化到BL21(DE3)表达宿主菌：
从-80℃冰箱中取出感受态细胞BL21(DE3)，并将其迅速置于冰水中，在冰上融化2-5 min。将约100ng的表达载体质粒DNA直接加入感受态细胞中，轻微摇动混和随后置于冰水浴上30min，取出后放入42℃水浴锅中热激90s，热激完迅速放回冰水浴中3min，拿出后取200ul的LB液体培养基加入到已转化的感受态细胞中，放入摇床中在37℃，195rpm 条件下生长1h，吸取80ul悬液均匀涂布含有50μg/mL的硫酸卡那霉素LB平板中，将平板放于工作台上数分钟以使涂布的液体被吸收，倒置37℃培养过夜。
2、NT-proBNP蛋白放大培养
①从转化平板中接种单克隆，加入1支10mL含50μg/mL的硫酸卡那霉素LB培养基中，37℃×200rpm培养至OD600约为0.5～0.8；
②接种到含50μg/mL的硫酸卡那霉素的1L TB培养基中，放入摇床(37℃×200rpm)中生长至OD600＝0.6～0.8时，将摇床温度降至15-25℃，约1h后加入终浓度0.1％-3％的乙醇和0.1-1mM的IPTG，诱导时间为4-20h。
③8000rpm×15min×4℃离心收集湿菌，并用磷酸缓冲盐(PBS)重悬一次以清洗一遍菌体，总计收集30g菌体；
④加入50μl的磷酸缓冲盐(PBS)混合以重悬沉淀；
⑤加入50μl的2×SDS上样缓冲液迅速在100℃加热样品15min使蛋白变性，然后12000rpm×5min×4离心取上清电泳。电泳前10min，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰，SEQ.No.2。
3、NT-proBNP蛋白纯化和酶切
①上清中亲和层析纯化NT-proBNP蛋白用细胞裂解缓液:1XPBS(pH6.5-7.4)，20mMImidazole；含1mM DTT，1％Triton X-100，1μg/mL Pepstatin A，1μg/mL Leupeptin重悬30g菌泥；
②超声裂解用750W功率，在冰浴中进行超声，每超声3s，间歇6s，总计15min，结束后在显微镜下观察破碎结果；
③12500rpm×15min×4℃离心保留上清和沉淀，上清用0.45μm滤膜过滤；
④用1XPBS(pH6.5-7.4)平衡3mL-5mL的Ni-IDABeads 6FF柱，平衡约5-10CV直至紫外示数达到基线；
⑤将步骤3过滤后的上清同平衡后的Ni-IDA柱混合后置于旋转混合仪上于4℃孵育60 min；
⑥用一空的层析柱截留含有NT-proBNP蛋白的Ni-IDA柱，并1XPBS(pH6.5-7.4)冲洗10-20CV，流速控制在1.0mL/min，直至紫外示数达到基线；
⑦用分别含有50mM、100mM以及500mM Imidazole的1XPBS(pH6.5-7.4)洗脱目标蛋白，流速控制在1.5mL/min，并收集每个Imidazole浓度梯度的洗脱液组分；
⑧取每个组分20μl加入20μl的2×SDS上样缓冲液迅速在100℃加热样品10min 使蛋白变性，然后12000rpm×5min×4℃离心取上清电泳。电泳前10min，100V稳压电泳，之后溴酚蓝指示剂进入分离胶200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部1cm，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中脱色至背景清晰。结果见SEQ.No.3；
⑨收集洗脱的NT-proBNP蛋白，透析至SUMO酶切缓冲液为PBS(pH6.5-7.4)， 1-10mMDTT，5％-20％甘油中，酶切时酶与蛋白以质量比1:200的比例，温度20-30℃，时间2-3h；
⑩SUMO酶切结束后再次通过亲和纯化方法(Ni-IDABeads 6FF)纯化回收NT-proBNP 蛋白，利用SUMO标签蛋白和SUMO酶都与Ni-IDA Beads 6FF结合，而NT-proBNP蛋白与Ni-IDA Beads 6FF不结合，孵育纯化时的咪唑浓度含量为20mM咪唑，洗脱时分别利用50mM咪唑和500mM咪唑，以获得高纯度无标签的NT-proBNP的蛋白，并将其透析至蛋白存储缓冲体系含有5％-10％海藻糖，5％-20％甘油，5％-15％环糊精，3％-8％山梨醇的PBS(pH6.5-7.4)中。
4、NT-proBNP重组蛋白的浓度和纯度鉴定
测定NT-proBNP蛋白浓度采用BCA蛋白浓度测定试剂盒。其标准曲线如说明书附图中图1所示。
稀释十倍测得其OD＝0.100，最终换算浓度为2.13mg/mL，由此得到最终酶切后无签 NT-proBNP蛋白的得率为70-80mg/L。
NT-proBNP蛋白经高效液相色谱(HPLC)纯度测定为95％纯度。
NT-proBNP蛋白的稳定性测试(单位：pg/ml)
| 天数 | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| -80℃ | 8920 | 8919 | 8915 | 8917 | 8890 | 8895 |
| -20℃ | 8920 | 8918 | 8910 | 8895 | 8890 | 8885 |
| 4℃ | 8920 | 8810 | 8911 | 8880 | 8870 | 8000 |
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，制备步骤如下：
步骤一、设计融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；
步骤二、培养大肠杆菌；
步骤三、诱导表达，使步骤一设计的融合蛋白在大肠杆菌中表达，得到融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；
步骤四、分离纯化步骤三中表达的融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白；
步骤五、用SUMO酶对步骤四得到的融合蛋白进行酶切，得到NT-proBNP重组蛋白和SUMO标签蛋白混合蛋白；
步骤六、步骤五得到的混合蛋白进行分离纯化，得到高纯度的NT-proBNP重组蛋白，其氨基酸序列为SEQ.No.1。
2.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤二中大肠杆菌培养时培养基组成成分质量体积比为甘油1~1.5%、葡萄糖4.5~5%、酵母粉1.8~2.4%、蛋白胨1.2~1.8%、磷酸氢二钾1.8~2.4%和磷酸二氢钾0.20~0.30%。
3.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤三中大肠杆菌表达时，在诱导表达过程中加入乙醇0.1%-3%和IPTG 0.1-1mM，诱导温度为15℃-25℃，诱导时间为4-20h。
4.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤四表达的融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP重组蛋白，融合后的氨基酸序列为SEQ.No.2。
5.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤四分离纯化时采用亲和纯化方法Ni-IDA Beads 6FF，用咪唑进行纯化和洗脱，孵育纯化时使用的咪唑浓度含量为20~25mM，洗脱时分别用浓度为45~50mM和450~550mM的咪唑进行，每次2~4h，得到高纯度融合SUMO标签的NT-proBNP蛋白。
6.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤五SUMO酶酶切时SUMO酶与融合SUMO标签蛋白的NT-proBNP蛋白的质量比为1:200，酶切缓冲液为含有质量比为1-10mMDTT，5%-20%甘油的PBS缓冲液，pH为pH6.5-7.4，酶切温度20-30℃，反应时间2~4h。
7.根据权利要求1所述的心功能标记物NT-proBNP重组蛋白，其特征在于，步骤六纯化时采用亲和纯化方法Ni-IDA Beads 6FF，SUMO标签蛋白和SUMO酶均分别与Ni-IDA Beads6FF结合，而NT-proBNP蛋白与Ni-IDA Beads 6FF不结合，用咪唑进行纯化和洗脱，孵育纯化时的咪唑浓度含量为20~25mM，洗脱时分别用浓度为45~50mM和450~550mM的咪唑进行，每次2~4h，得到高纯度无标签的NT-proBNP的蛋白。
8.一种提高心功能标记物NT-proBNP稳定性的缓冲体系，其特征在于，高纯度NT-proBNP蛋白存储缓冲体系为含有质量比为5%-10%海藻糖，5%-20%甘油，5%-15%环糊精，3%-8%山梨醇的PBS缓冲液，其pH为6.5~7.4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910202531.1A CN110195074A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910202531.1A CN110195074A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110195074A true CN110195074A (zh) | 2019-09-03 |
Family
ID=67751734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910202531.1A Pending CN110195074A (zh) | 2019-03-18 | 2019-03-18 | 一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110195074A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111848775A (zh) * | 2020-08-05 | 2020-10-30 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种NT-proBNP重组蛋白的保存液及其制备方法 |
| CN112876553A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-06-01 | 宁波海壹生物科技有限公司 | 一种稳定的b型钠尿肽校准品及其制备方法 |
| CN116120448A (zh) * | 2021-08-26 | 2023-05-16 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗NT-proBNP的结合蛋白 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050136542A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-23 | Beckman Coulter, Inc. | Stabilized liquid reference solutions |
| CN102040660A (zh) * | 2009-10-16 | 2011-05-04 | 重庆紫禾医药技术开发有限公司 | 用作bnp免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用 |
| CN102277371A (zh) * | 2011-08-15 | 2011-12-14 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心 | 脑钠肽的制备方法 |
| CN102879589A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-16 | 中国人民解放军总医院 | 一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法 |
| CN108774634A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-11-09 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 重组sumo蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法 |
-
2019
- 2019-03-18 CN CN201910202531.1A patent/CN110195074A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050136542A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-06-23 | Beckman Coulter, Inc. | Stabilized liquid reference solutions |
| CN102040660A (zh) * | 2009-10-16 | 2011-05-04 | 重庆紫禾医药技术开发有限公司 | 用作bnp免疫诊断试剂标准品的重组蛋白及制备方法与应用 |
| CN102277371A (zh) * | 2011-08-15 | 2011-12-14 | 中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心 | 脑钠肽的制备方法 |
| CN102879589A (zh) * | 2012-09-26 | 2013-01-16 | 中国人民解放军总医院 | 一种能稳定保存的人NT-proBNP制剂及其制备方法 |
| CN108774634A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-11-09 | 通用生物系统（安徽）有限公司 | 重组sumo蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111848775A (zh) * | 2020-08-05 | 2020-10-30 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种NT-proBNP重组蛋白的保存液及其制备方法 |
| CN112876553A (zh) * | 2021-01-18 | 2021-06-01 | 宁波海壹生物科技有限公司 | 一种稳定的b型钠尿肽校准品及其制备方法 |
| CN112876553B (zh) * | 2021-01-18 | 2021-10-29 | 宁波海壹生物科技有限公司 | 一种稳定的b型钠尿肽校准品及其制备方法 |
| CN116120448A (zh) * | 2021-08-26 | 2023-05-16 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗NT-proBNP的结合蛋白 |
| CN116120448B (zh) * | 2021-08-26 | 2024-03-12 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种抗NT-proBNP的结合蛋白 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110195074A (zh) | 一种提高N端脑钠肽NT-proBNP稳定性的缓冲体系及制备方法 | |
| WO2021083072A1 (zh) | 人胶原蛋白17型多肽、其生产方法和用途 | |
| CN111454350B (zh) | 一种重组纤连蛋白突变体及其应用 | |
| CN111004319A (zh) | 重组人源胶原蛋白及其应用 | |
| CN112724242B (zh) | 利用毕赤酵母生产重组类人胶原蛋白和宿主细胞蛋白的方法 | |
| CN110498849A (zh) | 一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法 | |
| WO2023231489A1 (zh) | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 | |
| CN110590939A (zh) | 一种利用基因工程获得重组人纤连蛋白的方法 | |
| CN116082493B (zh) | 高稳定性重组胶原蛋白、构建方法及其应用 | |
| CN108410839A (zh) | 一种热稳定性提高的β-葡萄糖醛酸苷酶突变体 | |
| CN118047857A (zh) | 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 | |
| CN106608915A (zh) | Glp-1(7-37)多肽类似物 | |
| CN108220369A (zh) | 一种生产重组水蛭素的方法 | |
| CN112625117A (zh) | 一种可溶性重组特立帕肽的非变性纯化方法及应用 | |
| CN116333094B (zh) | 一种重组人源化I型胶原蛋白α1及表达载体和应用 | |
| CN114181917B (zh) | 一种改造尿酸酶、基因序列、制备方法及应用 | |
| CN112225781B (zh) | 一种表达新型冠状病毒n蛋白的方法 | |
| CN102277371A (zh) | 脑钠肽的制备方法 | |
| CN111808836B (zh) | 耐热的i型普鲁兰酶的突变体酶及其制备方法与应用 | |
| CN108220372A (zh) | 一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法 | |
| WO2022242033A1 (zh) | 一种生产猪肌红蛋白的基因工程菌及其发酵与纯化 | |
| CN112358537A (zh) | 一种重组hEGF在毕赤酵母中的生产方法 | |
| CN109055465B (zh) | 一种生产重组人脑利钠肽的培养基及生产方法 | |
| CN112142848A (zh) | 一种重组人胰岛素及其纯化制备方法 | |
| CN112680454B (zh) | 一种人干扰素-κ的生产方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190903 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |