CN118047857A - 一种生物合成人体结构性材料的制备方法 - Google Patents

一种生物合成人体结构性材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物合成人体结构性材料的制备方法。本发明提供了一种重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包含n个重复序列，n为大于等于1的整数；其中，所述重复序列为人天然III型胶原蛋白的功能区序列。本发明提供的重组III型胶原蛋白具有更高的细胞黏附效果。同时，本发明提供的重组III型胶原蛋白制备方法简单，在低成本下即可获得较高产量的重组III型胶原蛋白。

Description

一种生物合成人体结构性材料的制备方法
本申请是中国专利申请202310869570.3的分案申请，原申请202310869570.3的申请日为2023年07月14日，其名称为“一种生物合成人体结构性材料的制备方法”。
优先权和相关申请
本发明要求2023年3月24日提交的名称为“一种生物合成人体结构性材料的制备方法”的中国专利申请202310298415.0的优先权，该申请包括附录在内的全部内容作为参考并入本发明。
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种生物合成人体结构性材料的制备方法。
背景技术
人体结构性材料主要是包含胶原蛋白的结构性蛋白，这类蛋白对细胞、组织具有黏附、支撑功能，是主要的细胞外基质组成成分。
胶原蛋白是广泛分布于人体结缔组织的一类蛋白质，也是人体含量最多的蛋白质，可以占到蛋白质总量的25％～35％。它的主要功能体现在维护细胞外环境，维持组织器官的正常生理功能，修复肌体损伤等方面。胶原蛋白是天然的生物资源，具有其它高分子材料所望尘莫及的良好的生物组织相容性，以及优异的对细胞的支撑弹性和可降解性，因此，胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。
天然胶原蛋白分子可形成一种特殊的超螺旋结构，这种超螺旋结构是以3个氨基酸残基为基本重复体的左手螺旋，这三个氨基酸残基通常为Gly-X-Pro。其中，所述Gly代表甘氨酸，X代表任意天然氨基酸，Pro代表脯氨酸。Gly对胶原蛋白中氢键的形成是必须的，它本身没有侧链因此能够使胶原蛋白紧密堆积，并且能维持皮肤张力和弹性。随着人们年龄的增长，真皮内的胶原蛋白发生降解和老化，皮肤变得干燥并出现皱纹。为防止皮肤衰老，有学者研究通过补充胶原蛋白来达到延缓皮肤衰老的进程。
生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织，提取胶原蛋白衍生物。利用传统的生产胶原蛋白的方法制备得到的胶原蛋白不具有对应的生物活性，且存在由物种不同造成的免疫原性和活体动物自身携带的多种病毒污染，具有较大的安全风险。随着现代技术的发展，可通过基因工程技术生产重组胶原蛋白，通过该方法制备得到的重组胶原蛋白具有低免疫原性和较好的生物活性，可被广泛应用于生物医学各领域。但是如何从人胶原蛋白序列中选择出具有功能且能够大量表达用于规模化生产的氨基酸序列是目前我们所面临的困难。所以亟需一种可以克服该缺陷的重组III型胶原蛋白的生物合成方法，使其可作为人体结构性材料得到广泛应用。
发明内容
发明要解决的问题
本发明提供一种重组III型胶原蛋白，并提供其生物合成的制备方法，及其在医药领域的用途，用以解决天然人III型胶原蛋白在体外无法正确表达并大量制备的问题，为人源化胶原蛋白的生产应用提供新的可能。
用于解决问题的方案
本发明在第一方面提供了一种重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包含n个重复序列，n为大于等于1的整数；其中，所述重复序列为人天然III型胶原蛋白的功能区序列；
在一些优选的实施方案中，所述n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的；
在一些更优选的实施方案中，所述为4、8或16；
在一些最优选的实施方案中，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包含如下(i)～(iii)中的任一项：
(i)如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列；
(ii)在如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19或SEQ IDNO.21所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个氨基酸残基并且保留人天然III型胶原蛋白的细胞黏附效果的氨基酸序列；
(iii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.15、SEQ ID NO.17SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.21所示序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留人天然III型胶原蛋白的细胞黏附效果，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
在一些具体的实施方案中，本发明在第一方面中所述的重组III型胶原蛋白的氨基酸序列中包含能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
在一些优选的实施方案中，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列与所述重复序列直接连接；
在一些更优选的实施方案中，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列位于所述重组III型胶原蛋白的N末端。
本发明在第二方面提供了一种编码本发明在第一方面中所述的重组III型胶原蛋白的多核苷酸；
在一些优选的实施方案中，所述多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.22所示的序列。
本发明在第三方面提供了一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如本发明在第二方面中所述的多核苷酸；
在一些优选的实施方案中，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；
在一些更优选的实施方案中，所述重组表达载体为pET-32a。
本发明在第四方面提供了一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含本发明在第三方面中所述的重组表达载体；
在一些优选的实施方案中，所述重组宿主细胞为原核细胞、酵母或真核细胞；
在一些更优选的实施方案中，所述重组宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明在第五方面提供了本发明在第一方面中所述的重组III型胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
S1：发酵培养根据本发明在第四方面中所述的重组宿主细胞，诱导蛋白表达；
S2：收集所述蛋白；
S3：纯化所述蛋白；在一些优选的实施方案中，包括使用Ni亲和层析柱和/或离子交换层析柱纯化所述蛋白。
在一些具体的实施方案中，在所述S1步骤中，所述发酵培养在转速为200～240rpm、温度为35～38℃的摇床中进行；在一些优选的实施方案中，所述发酵培养在转速为220rpm、温度为37℃的摇床中进行。
在另外一些具体的实施方案中，在所述S1步骤中，所述诱导蛋白表达的具体操作为：在放大培养的菌液中添加IPTG并降温至16℃；在一些优选的实施方案中，所述IPTG的终浓度为0.3～0.7mM；在一些更优选的实施方案中，所述IPTG的终浓度为0.5mM。
在一些具体的实施方案中，在所述S2步骤中，所述收集所述蛋白的具体操作为：将S1步骤所得到的菌体用含有20-30mM Tris、150～250mM氯化钠和15～25mM咪唑的平衡工作液重悬，将菌液温度降温至4～15℃，高压均质后于4℃环境下15000～18000rpm离心20～40min。
本发明在第六方面提供了本发明在第一方面中所述的重组III型人源化胶原蛋白在制备产品中的用途，所述产品包括医疗器械、化妆品、保健品或药物。
发明的效果
本发明提供了多种包含人III型胶原蛋白功能区氨基酸序列的重组III型胶原及其制备方法，并测试了所述重组III型胶原蛋白的蛋白表达量和收率情况。
通过以上技术方案的实施，本发明提供了能够在体外正确表达的重组III型胶原蛋白的氨基酸序列，并且成功在体外进行了生物合成，该蛋白的氨基酸序列源于天然人III型胶原蛋白，用于人体不会产生不良免疫反应。同时，本发明提供的重组III型胶原蛋白的制备方法简单，在低成本下即可获得较高产量的重组III型胶原蛋白。
附图说明
图1为重组III型胶原蛋白的电泳结果图。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。
在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
在本发明中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在本发明中，使用“数值A～数值B”、“在数值A以上”和“在数值A以下”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
在本发明中，任意数值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试装置或方法所致的标准偏差。
在本发明中，术语“多肽”、“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。多肽可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。
在本发明中，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。
在本发明中，氨基酸缺失可指从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。
在本发明中，氨基酸添加可指在氨基酸序列的C端、N端或C端与N端中间的任意位置处添加1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。
在本发明中，氨基酸取代可指在氨基酸序列的某个位置的氨基酸被其他氨基酸替代，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，指与原有氨基酸序列相比，若干个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所取代而形成肽(保守性变异肽)。示例性的，这些保守性变异肽可以根据下列氨基酸取代而产生：Val、Leu或Ile对Ala的取代，Lys、Gln、Asn或His对Arg的取代，Gln、His、Lys或Arg对Asn的取代，Glu或Asn对Asp的取代，Ser或Ala对Cys的取代，Asn或Glu对Gln的取代，Asp或Gln对Glu的取代，Ala对Gly的取代，Asn、Lys、Gln或Arg对His的取代，Leu、Met、Ala、Val或Phe对Ile的取代，Ile、Met、Ala、Val或Phe对Leu的取代，Asn、Gln或Arg对Lys的取代，Ile、Leu或Phe对Met的取代，Leu、Val、Ile、Ala或Tyr对Phe的取代，Ala对Pro的取代，Thr对Ser的取代，Ser或Val对Thr的取代，Phe或Tyr对Trp的取代，Trp、Phe、Thr或Ser对Tyr的取代，及Phe、Ala、Met、Ile或Leu对Val的取代。氨基酸取代也可以是非保守氨基酸取代。
在本发明中，氨基酸修饰可以包括对天然序列的修饰，例如官能团的修饰、分子内共价键合(例如，侧链之间成环)、甲基化、酰基化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化、生物素化等。
在本发明中，“杂交”意指多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下与大体互补的序列结合的能力，而在这些条件下不发生与非互补对象之间的非特异性结合。对此，所述序列优选为90～100％互补的。将能够互相特异性结合的互补序列的特性应用于例如Northern或Southern印迹技术中，或是PCR或RT-PCR的引物结合中。根据本发明，杂交在中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件条件下发生。此类杂交条件描述于描述于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。
在本发明中，合适的载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述蛋白的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。本领域普通技术人员应理解，在本发明中，“载体”包括DNA分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核苷酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ-噬菌体、EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。
在本发明中，宿主细胞可以是真核细胞，例如真菌和酵母，原核细胞，例如肠杆菌科细菌。
在本发明中，“人天然III型胶原蛋白的功能区”是指在人天然III型胶原蛋白中有胶原蛋白氨基酸序列所具有的细胞粘附活性等功能的序列片段。
在一些优选的实施方式中所述人天然III型胶原蛋白的功能区的序列选自由以下所示序列组成的组中的任一种：
(i)GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGAN(SEQ ID NO：24)
(ii)GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER(SEQ ID NO：25)
(iii)GetgapglkgenglpgengapgpmgpRgap(SEQ ID NO：26)
(iv)Gqpgppgppgtagfpgspgakgevgpagsp(SEQ ID NO：27)
(v)GqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERget(SEQ ID NO：28)
(vi)gqngepggkGERgapGEKgeggppgvagppggs(SEQ ID NO：29)
(vii)GpRgpvgpsgppgkdgtsghpgpigppgpRgnRGER(SEQ ID NO：30)本发明提供的重组III型胶原蛋白的应用领域包含高端医疗器械制备，如生物敷料、人体仿生材料、整形美容材料、类器官培养、心血管支架、涂层、组织注射填充、眼科材料、妇产科生物材料、神经修复再生、肝脏组织及血管修复再生、3D打印人造器官生物材料等；以及高端化妆品原料、高端保健品和高端药用辅料等。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了不可避免的系统性误差。
实施例1、重组III型胶原蛋白的构建和表达：
1.大肠杆菌基因工程菌的构建
本实施例中构建的重组III型胶原蛋白对应的氨基酸序列及编码上述氨基酸序列的核苷酸序列分别如下所示：
(1)重组III型胶原蛋白T3A4的氨基酸序列：
ENLYFQGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPA GIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAG ANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGAN(SEQ ID NO：1)重组III型胶原蛋白T3A4的核苷酸序列：
GAAAATCTATATTTTCAAGGTGGGAAAGGAGAGATGGGTCCGGCAGGCATCCCGGGCGCACCGGGCCTGATGGGTGCGCGTGGTCCGCCGGGTCCGGCGGGTGCCAATGGTGGCAAGGGCGAAATGGGTCCGGCAGGTATCCCGGGCGCGCCAGGCCTGATGGGTGCTCGTGGCCCACCGGGCCCGGCGGGTGCCAACGGTGGTAAAGGCGAGATGGGTCCGGCAGGCATTCCGGGCGCTCCGGGTCTGATGGGCGCGCGTGGTCCACCGGGTCCGGCCGGTGCGAACGGCGGTAAGGGTGAAATGGGTCCGGCTGGCATTCCGGGTGCGCCGGGCTTGATGGGCGCTCGCGGTCCGCCTGGTCCGGCGGGCGCGAAC(SEQ ID NO：2)
(2)重组III型胶原蛋白T3A8的氨基酸序列：
ENLYFQGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGAN(SEQ ID NO：3)
重组III型胶原蛋白T3A8的核苷酸序列：
GAAAATCTATATTTTCAAGGTGGGAAAGGAGAGATGGGTCCGGCGGGCATCCCGGGCGCTCCGGGCTTGATGGGTGCCCGTGGTCCGCCGGGTCCGGCTGGCGCCAACGGTGGTAAGGGTGAAATGGGCCCGGCTGGTATCCCGGGCGCGCCGGGCCTCATGGGCGCTCGCGGCCCACCGGGCCCCGCGGGCGCGAACGGTGGCAAGGGTGAGATGGGTCCGGCTGGCATTCCGGGCGCGCCGGGCCTGATGGGTGCTCGTGGTCCACCGGGTCCGGCGGGTGCAAATGGTGGTAAGGGCGAAATGGGTCCGGCAGGCATTCCGGGTGCGCCGGGCCTGATGGGTGCGAGAGGTCCGCCGGGCCCAGCGGGTGCGAATGGTGGCAAGGGCGAGATGGGCCCGGCGGGTATTCCGGGCGCACCGGGTTTGATGGGTGCGCGTGGTCCACCGGGCCCAGCTGGCGCGAACGGCGGTAAAGGTGAGATGGGTCCGGCAGGTATTCCGGGGGCGCCTGGCCTGATGGGTGCCCGTGGTCCGCCGGGTCCGGCCGGTGCCAACGGCGGTAAAGGCGAAATGGGTCCGGCGGGCATCCCGGGTGCACCGGGTCTGATGGGCGCACGCGGTCCGCCGGGCCCGGCAGGTGCCAATGGCGGAAAAGGTGAAATGGGCCCGGCGGGCATCCCGGGTGCGCCGGGTCTGATGGGTGCGCGTGGCCCGCCTGGTCCTGCGGGTGCGAAC(SEQ ID NO：4)
(3)重组III型胶原蛋白T3A16的氨基酸序列：
ENLYFQ
GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPG
LMGARGPPGPAGAN
GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPG
LMGARGPPGPAGAN
GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPG
LMGARGPPGPAGAN
GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPG
LMGARGPPGPAGAN
GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPG
LMGARGPPGPAGAN
GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPG
LMGARGPPGPAGAN
GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPG
LMGARGPPGPAGAN
GGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGANGGKGEMGPAGIPGAPGLMGARGPPGPAGAN(SEQ IDNO：5)
重组III型胶原蛋白T3A16的核苷酸序列：
GAAAATCTATATTTTCAAGGTGGGAAAGGAGAGATGGGTCCAGCTGGCATTCCGGGCGCGCCGGGTCTCATGGGTGCGAGAGGCCCACCGGGCCCGGCTGGCGCCAACGGCGGTAAGGGCGAAATGGGTCCGGCGGGCATCCCGGGCGCTCCGGGCCTGATGGGTGCTCGCGGTCCGCCTGGCCCAGCGGGAGCAAATGGCGGTAAAGGTGAAATGGGTCCGGCCGGTATCCCGGGCGCACCGGGACTGATGGGCGCGCGTGGCCCGCCTGGTCCGGCCGGCGCCAATGGTGGCAAGGGTGAGATGGGGCCGGCTGGTATCCCGGGCGCGCCAGGCTTGATGGGCGCGCGTGGTCCGCCGGGCCCCGCCGGTGCGAACGGCGGCAAGGGCGAGATGGGTCCGGCGGGTATTCCGGGTGCGCCGGGTCTGATGGGTGCCCGTGGTCCGCCGGGTCCAGCGGGCGCGAATGGTGGTAAAGGTGAGATGGGTCCGGCAGGTATCCCGGGTGCGCCAGGCCTGATGGGTGCGCGCGGTCCTCCGGGCCCGGCGGGCGCCAATGGCGGAAAGGGTGAAATGGGCCCGGCGGGCATCCCGGGTGCGCCGGGTCTGATGGGAGCCCGTGGTCCGCCGGGACCGGCTGGCGCGAACGGCGGAAAAGGTGAAATGGGTCCGGCAGGCATTCCGGGCGCACCGGGGCTGATGGGTGCGCGTGGCCCGCCGGGTCCGGCGGGTGCAAATGGCGGTAAGGGCGAAATGGGTCCGGCTGGGATTCCGGGTGCCCCGGGCCTTATGGGTGCGCGTGGTCCGCCGGGTCCGGCGGGTGCCAACGGTGGCAAAGGTGAGATGGGTCCGGCGGGCATTCCGGGTGCACCGGGTTTGATGGGTGCTCGCGGTCCGCCCGGCCCGGCAGGCGCCAACGGTGGTAAAGGTGAAATGGGTCCGGCAGGCATCCCGGGTGCGCCAGGGCTGATGGGCGCTCGTGGTCCACCGGGTCCGGCTGGTGCGAACGGCGGAAAAGGCGAAATGGGTCCGGCAGGCATTCCGGGGGCTCCGGGTCTGATGGGTGCGCGCGGTCCGCCGGGGCCGGCGGGAGCGAACGGCGGTAAGGGTGAGATGGGCCCAGCGGGCATCCCGGGAGCGCCAGGTTTAATGGGCGCGCGTGGTCCTCCGGGTCCGGCGGGGGCGAACGGCGGCAAGGGTGAGATGGGTCCTGCCGGCATTCCGGGAGCACCGGGTCTGATGGGTGCACGTGGCCCTCCGGGCCCGGCGGGTGCGAACGGTGGCAAGGGCGAGATGGGTCCTGCGGGTATCCCGGGTGCA
CCGGGACTGATGGGTGCACGCGGTCCGCCTGGCCCAGCCGGCGC
CAACGGCGGTAAAGGTGAAATGGGTCCGGCTGGTATCCCGGGCGCACCGGGCTTGATGGGCGCGCGTGGTCCTCCGGGTCCGGCTGGCGCTAAT(SEQ ID NO：6)
(4)重组III型胶原蛋白T3B4的氨基酸序列：
ENLYFQ
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER(SEQ ID NO：7)重组III型胶原蛋白T3B4的核苷酸序列：
GAGAATCTATATTTTCAAGGAGAAAGGGGGGAAACCGGTCCGCCGGGCCCAGCGGGTTTCCCGGGTGCCCCGGGCCAGAATGGCGAGCCGGGTGGCAAGGGTGAGAGAGGCGAACGTGGTGAAACGGGTCCTCCGGGCCCGGCGGGTTTTCCGGGCGCTCCGGGCCAGAACGGCGAGCCGGGCGGTAAAGGCGAGCGTGGCGAGCGCGGTGAAACCGGTCCGCCGGGCCCAGCGGGTTTTCCGGGTGCGCCAGGCCAAAACGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAGCGTGGTGAGCGCGGTGAAACCGGTCCGCCGGGTCCGGCTGGCTTCCCGGGCGCACCGGGGCAAAACGGCGAGCCGGGCGGTAAGGGCGAACGT(SEQ ID NO：8)
(5)重组III型胶原蛋白T3B8的氨基酸序列：
ENLYFQ
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER(SEQ ID NO：9)重组III型胶原蛋白T3B8的核苷酸序列：
GAGAATCTATATTTTCAAGGAGAAAGGGGGGAGACGGGTCCGCCTGGCCCAGCGGGCTTTCCGGGTGCGCCGGGCCAGAACGGTGAGCCGGGCGGTAAGGGTGAACGTGGTGAGCGTGGCGAAACCGGTCCTCCGGGCCCGGCTGGCTTCCCGGGTGCCCCAGGTCAAAACGGTGAGCCGGGCGGTAAAGGTGAGCGTGGTGAGCGTGGTGAAACGGGCCCGCCGGGACCAGCGGGTTTCCCGGGTGCTCCGGGCCAAAACGGCGAACCGGGTGGCAAGGGTGAGCGCGGTGAACGCGGCGAAACCGGTCCGCCAGGTCCGGCAGGGTTCCCGGGTGCACCGGGTCAGAACGGCGAACCGGGCGGCAAAGGTGAGCGTGGCGAGCGTGGTGAAACCGGTCCGCCGGGTCCGGCGGGCTTTCCGGGTGCGCCAGGGCAAAATGGTGAGCCGGGCGGTAAAGGTGAGCGTGGTGAACGCGGAGAAACTGGCCCACCGGGCCCGGCGGGCTTTCCGGGCGCTCCGGGCCAGAATGGCGAGCCGGGAGGTAAGGGCGAGCGCGGGGAGCGTGGTGAAACCGGTCCGCCGGGCCCGGCGGGTTTTCCGGGCGCGCCGGGTCAGAATGGCGAACCGGGTGGCAAAGGCGAGCGCGGTGAAAGAGGCGAAACCGGCCCTCCGGGTCCGGCAGGCTTCCCGGGCGCCCCGGGTCAGAACGGTGAACCGGGTGGTAAGGGTGAGCGT(SEQ ID NO：10)
(6)重组III型胶原蛋白T3B16的氨基酸序列：
ENLYFQ
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGERGETGPPGPAGFPGA
PGQNGEPGGKGER
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GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGER(SEQ IDNO：11)
重组III型胶原蛋白T3B16的核苷酸序列：
GAGAATCTATATTTTCAAGGAGAAAGGGGGGAAACTGGTCCACCGGGCCCGGCTGGCTTCCCGGGAGCGCCTGGTCAGAATGGTGAACCGGGTGGCAAAGGCGAGCGTGGTGAGCGCGGTGAGACGGGCCCACCGGGTCCGGCTGGCTTTCCGGGTGCGCCGGGTCAGAATGGCGAACCGGGCGGGAAAGGTGAGCGCGGTGAACGTGGTGAAACCGGTCCGCCGGGCCCGGCGGGTTTTCCGGGTGCCCCGGGACAAAACGGCGAACCGGGCGGTAAAGGTGAACGCGGCGAGCGTGGTGAAACCGGTCCGCCAGGCCCGGCGGGT
TTCCCGGGTGCACCGGGTCAGAACGGCGAACCGGGTGGCAAGGGCGA
ACGTGGTGAGCGCGGTGAAACCGGTCCGCCGGGCCCAGCCGGTTTTC
CGGGCGCGCCAGGTCAGAATGGCGAACCGGGAGGCAAAGGCGAACG
TGGTGAACGTGGTGAGACCGGTCCGCCGGGTCCGGCGGGCTTCCCGG
GTGCTCCGGGCCAGAATGGCGAGCCGGGCGGAAAAGGTGAACGTGGT
GAACGCGGTGAGACCGGACCGCCTGGTCCGGCGGGTTTTCCGGGTGC
CCCAGGCCAAAACGGCGAGCCGGGTGGCAAGGGTGAACGTGGTGAG
CGTGGAGAAACTGGACCGCCGGGACCGGCGGGTTTTCCGGGGGCACC
GGGTCAAAACGGTGAGCCGGGCGGTAAAGGTGAGCGTGGTGAGCGTG
GTGAAACCGGTCCGCCGGGTCCTGCGGGTTTCCCGGGTGCGCCGGGC
CAAAATGGTGAGCCGGGTGGCAAGGGCGAGCGTGGCGAACGCGGCG
AGACGGGCCCGCCGGGCCCGGCTGGCTTCCCGGGCGCACCGGGCCAG
AACGGTGAACCGGGAGGCAAGGGTGAACGCGGCGAGCGTGGTGAAA
CCGGTCCGCCGGGTCCGGCTGGCTTCCCGGGTGCCCCTGGACAAAATG
GTGAACCGGGTGGTAAGGGTGAGAGAGGCGAGCGTGGTGAAACCGGT
CCGCCTGGCCCGGCGGGTTTCCCGGGCGCGCCGGGCCAGAACGGCGA
GCCGGGTGGTAAAGGCGAGCGTGGGGAGCGCGGCGAAACGGGTCCG
CCCGGCCCAGCGGGATTCCCGGGCGCCCCCGGCCAGAACGGTGAACC
GGGCGGCAAGGGTGAGCGCGGTGAGCGTGGTGAAACCGGTCCGCCGG
GCCCAGCAGGCTTCCCGGGTGCGCCAGGCCAGAACGGCGAGCCGGGA
GGTAAGGGCGAACGTGGTGAGAGAGGCGAGACCGGTCCGCCTGGTCC
GGCGGGTTTTCCGGGCGCACCGGGTCAAAACGGTGAGCCAGGCGGTA
AAGGCGAACGTGGCGAGCGTGGTGAAACCGGTCCACCGGGACCGGCA
GGCTTTCCGGGCGCTCCGGGTCAAAACGGTGAACCGGGTGGTAAGGGCGAGCGA(SEQ ID NO：12)
(7)重组III型胶原蛋白T3C8的氨基酸序列：
ENLYFQ
GetgapglkgenglpgengapgpmgpRgapgetgapglkgenglpgengapgpmgpRgap
getgapglkgenglpgengapgpmgpRgapgetgapglkgenglpgengapgpmgpRgap
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getgapglkgenglpgengapgpmgpRgapgetgapglkgenglpgengapgpmgpRgap(SEQ IDNO：13)
重组III型胶原蛋白T3C8的核苷酸序列：
GAAAATCTATATTTTCAAGGAGAGACAGGGGCTCCGGGCCTGAAGGGTGAAAATGGCTTACCGGGCGAGAATGGTGCCCCCGGCCCTATGGGTCCGCGTGGCGCGCCAGGTGAAACGGGTGCGCCGGGTCTGAAAGGCGAGAACGGCCTGCCGGGTGAGAACGGCGCGCCGGGTCCGATGGGTCCGCGTGGTGCGCCAGGCGAAACCGGTGCACCGGGTCTCAAAGGTGAGAACGGCCTGCCCGGCGAAAACGGCGCACCGGGTCCGATGGGTCCGCGTGGCGCGCCGGGTGAAACCGGTGCTCCGGGCTTGAAAGGTGAGAATGGCCTGCCGGGCGAGAATGGCGCGCCGGGACCGATGGGTCCGCGCGGTGCTCCGGGCGAGACTGGTGCACCGGGCCTGAAAGGCGAGAATGGCCTGCCGGGTGAAAACGGCGCGCCGGGTCCGATGGGCCCGCGTGGTGCGCCAGGTGAAACCGGCGCCCCGGGCTTGAAGGGCGAGAACGGTCTGCCGGGTGAGAACGGTGCCCCGGGTCCGATGGGTCCGCGTGGTGCGCCGGGTGAAACCGGTGCTCCGGGTTTGAAGGGCGAAAATGGCTTGCCGGGCGAGAACGGCGCTCCGGGTCCGATGGGTCCGAGAGGCGCACCAGGTGAAACCGGTGCCCCGGGGCTTAAGGGTGAAAACGGCCTGCCGGGTGAGAACGGCGCGCCAGGTCCGATGGGCCCTCGCGGTGCGCCG(SEQ ID NO：14)
(8)重组III型胶原蛋白T3D8的氨基酸序列：(SEQ ID NO：15)
ENLYFQ
Gqpgppgppgtagfpgspgakgevgpagspgqpgppgppgtagfpgspgakgevgpagsp
gqpgppgppgtagfpgspgakgevgpagspgqpgppgppgtagfpgspgakgevgpagsp
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重组III型胶原蛋白T3D8的核苷酸序列：(SEQ ID NO:16)
GAAAATCTATATTTTCAGGGACAACCCGGGCCTCCGGGTCCACCGGGAACCGCAGGCTTTCCGGGTAGCCCGGGTGCTAAAGGTGAAGTCGGTCCGGCGGGCAGCCCGGGACAGCCGGGGCCGCCGGGCCCGCCGGGCACGGCGGGGTTTCCGGGCTCTCCGGGTGCTAAGGGTGAGGTTGGCCCGGCGGGTTCACCGGGCCAACCGGGCCCCCCGGGACCGCCCGGCACCGCTGGCTTCCCGGGTTCCCCGGGTGCGAAAGGGGAGGTAGGTCCGGCGGGCAGCCCGGGTCAACCGGGTCCGCCAGGTCCGCCAGGCACCGCGGGTTTTCCGGGCTCCCCGGGTGCCAAAGGCGAGGTGGGTCCGGCGGGTAGCCCGGGCCAACCGGGCCCACCGGGCCCGCCGGGCACGGCAGGCTTTCCGGGTAGCCCGGGTGCAAAGGGTGAAGTGGGCCCAGCCGGTAGCCCGGGCCAGCCGGGTCCACCTGGCCCGCCGGGCACCGCCGGCTTCCCGGGTTCCCCGGGTGCCAAAGGCGAAGTTGGTCCGGCTGGTTCTCCGGGTCAGCCGGGTCCGCCGGGTCCTCCGGGTACTGCGGGTTTCCCGGGTAGCCCGGGTGCGAAGGGCGAAGTTGGTCCGGCGGGTAGTCCTGGTCAGCCGGGGCCGCCTGGCCCACCAGGCACCGCGGGTTTCCCGGGCAGCCCGGGCGCTAAGGGTGAGGTGGGCCCGGCAGGCTCGCCG
(9)重组III型胶原蛋白T3E8的氨基酸序列：
ENLYFQ
GqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERgetgqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERget
gqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERgetgqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERget
gqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERgetgqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERget
gqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERgetgqpgdkgeggapglpgiagpRgspGERget(SEQ IDNO：17)
重组III型胶原蛋白T3E8的核苷酸序列：
GAAAATCTATATTTTCAGGGACAACCCGGGGACAAAGGCGAGGGTGGTGCGCCAGGGTTGCCGGGCATTGCGGGTCCGCGTGGTAGCCCGGGAGAACGTGGTGAAACGGGCCAACCGGGCGACAAAGGTGAAGGCGGAGCACCGGGCCTGCCGGGCATTGCTGGCCCACGTGGTTCGCCGGGCGAACGCGGCGAAACCGGTCAACCGGGAGATAAGGGTGAGGGTGGCGCACCGGGTCTGCCTGGGATCGCGGGCCCACGTGGTAGCCCGGGCGAGCGCGGTGAGACCGGTCAGCCGGGCGATAAAGGCGAGGGCGGTGCGCCGGGCCTGCCGGGTATCGCCGGTCCGCGTGGTAGCCCGGGCGAGCGCGGAGAAACCGGCCAGCCGGGCGACAAGGGTGAAGGTGGTGCTCCGGGTCTGCCTGGCATTGCGGGTCCGAGAGGCTCTCCGGGCGAGCGTGGCGAAACCGGCCAGCCGGGTGATAAAGGCGAAGGTGGTGCACCGGGTTTACCGGGTATTGCGGGTCCGCGTGGCTCCCCGGGTGAGCGCGGTGAGACGGGTCAACCGGGTGACAAGGGTGAGGGCGGCGCTCCGGGTCTGCCGGGCATCGCCGGTCCGCGTGGTAGCCCTGGCGAGCGCGGTGAAACCGGTCAGCCGGGCGATAAGGGTGAGGGTGGTGCGCCGGGGTTGCCAGGCATCGCGGGCCCACGTGGTTCCCCGGGGGAGCGTGGTGAAACT(SEQ ID NO：18)
(10)重组III型胶原蛋白T3F8的氨基酸序列：
ENLYFQ
gqngepggkGERgapGEKgeggppgvagppggsgqngepggkGERgapGEKgeggppg
vagppggs
gqngepggkGERgapGEKgeggppgvagppggsgqngepggkGERgapGEKgeggppg
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gqngepggkGERgapGEKgeggppgvagppggsgqngepggkGERgapGEKgeggppg
vagppggs
gqngepggkGERgapGEKgeggppgvagppggsgqngepggkGERgapGEKgeggppgvagppggs(SEQ ID NO：19)
重组III型胶原蛋白T3F8的核苷酸序列：
GAAAATCTATATTTTCAGGGACAAAACGGGGAGCCGGGCGGGAAAGGTGAACGTGGTGCGCCGGGCGAAAAAGGTGAAGGCGGTCCGCCTGGTGTTGCCGGTCCGCCGGGCGGTAGCGGTCAAAACGGCGAACCGGGCGGTAAGGGTGAACGTGGTGCTCCGGGCGAAAAAGGCGAGGGTGGCCCGCCGGGCGTGGCAGGCCCGCCGGGTGGTTCGGGCCAGAATGGCGAACCTGGCGGTAAAGGTGAGCGCGGTGCTCCGGGTGAGAAGGGCGAGGGCGGACCGCCGGGCGTGGCGGGTCCGCCGGGTGGCTCCGGCCAAAACGGCGAACCGGGTGGTAAAGGCGAGCGTGGTGCGCCGGGTGAAAAAGGCGAGGGTGGCCCACCGGGTGTAGCGGGTCCGCCGGGTGGAAGCGGTCAGAACGGTGAACCGGGTGGTAAGGGTGAGAGAGGCGCACCGGGTGAAAAGGGCGAAGGCGGCCCACCGGGTGTTGCGGGTCCGCCTGGTGGTAGCGGTCAGAACGGCGAACCGGGTGGCAAGGGTGAGCGTGGTGCTCCGGGTGAGAAGGGTGAGGGCGGCCCGCCGGGGGTGGCCGGTCCCCCGGGGGGTAGCGGTCAGAATGGCGAGCCGGGTGGGAAAGGCGAGCGTGGTGCGCCAGGTGAAAAAGGCGAGGGCGGCCCACCGGGCGTCGCAGGCCCGCCGGGTGGCTCTGGTCAAAACGGTGAACCGGGCGGCAAGGGTGAGCGCGGTGCGCCAGGCGAGAAGGGCGAAGGTGGTCCGCCGGGTGTTGCGGGTCCGCCGGGCGGCTCC(SEQ ID NO：20)
(11)重组III型胶原蛋白T3G8的氨基酸序列：
ENLYFQ
GpRgpvgpsgppgkdgtsghpgpigppgpRgnRGERgpRgpvgpsgppgkdgtsghpgpig
ppgpRgnRGER
gpRgpvgpsgppgkdgtsghpgpigppgpRgnRGERgpRgpvgpsgppgkdgtsghpgpig
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ppgpRgnRGER
gpRgpvgpsgppgkdgtsghpgpigppgpRgnRGERgpRgpvgpsgppgkdgtsghpgpigppgpRgnRGER(SEQ ID NO：21)
重组III型胶原蛋白T3G8的核苷酸序列：
GAAAATCTATATTTTCAAGGACCCAGGGGGCCCGTGGGTCCGAGCGGTCCGCCGGGCAAGGACGGCACCTCTGGTCACCCGGGCCCCATCGGTCCACCGGGTCCGCGTGGTAATCGCGGTGAACGCGGTCCGAGAGGCCCGGTTGGTCCTTCCGGACCTCCGGGTAAGGATGGTACTTCAGGCCATCCGGGTCCTATTGGCCCACCGGGTCCGCGTGGTAATCGTGGTGAACGTGGCCCTCGCGGTCCGGTAGGTCCGAGCGGTCCGCCAGGCAAAGATGGCACCAGCGGTCACCCGGGGCCCATCGGCCCACCGGGCCCGCGTGGCAACCGCGGCGAGCGTGGTCCGCGTGGTCCTGTTGGCCCAAGCGGTCCTCCGGGCAAAGATGGTACGTCTGGCCACCCGGGTCCGATCGGCCCACCGGGCCCGAGAGGCAATCGTGGTGAGCGCGGCCCCCGTGGTCCGGTCGGTCCGAGCGGTCCGCCGGGTAAGGACGGCACCAGCGGCCACCCTGGACCGATTGGTCCGCCGGGTCCGCGCGGAAACCGCGGTGAGCGCGGTCCGCGTGGCCCGGTGGGTCCGAGTGGCCCACCGGGCAAAGACGGCACCTCGGGTCACCCGGGTCCGATTGGTCCGCCGGGTCCGCGTGGAAACCGTGGTGAACGTGGCCCGCGTGGCCCCGTGGGTCCGAGCGGCCCACCGGGCAAAGATGGTACGTCCGGTCATCCGGGCCCGATTGGCCCGCCGGGCCCGCGTGGAAACCGTGGCGAACGCGGTCCGCGTGGTCCGGTTGGTCCGAGCGGTCCGCCGGGCAAGGACGGCACCTCCGGCCATCCGGGTCCCATCGGTCCGCCGGGTCCGAGAGGCAACCGTGGTGAGCGT(SEQ ID NO：22)
本发明的重组III型胶原蛋白在表达时，在其N末端添加了能够被TEV蛋白酶切除的氨基酸序列ENLYFQ(SEQ ID NO：23)；优选的，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列与所述人天然III型胶原蛋白的功能区序列直接连接。
将上述重组III型胶原蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22分别克隆进入表达载体的多克隆位点中，得到相应的重组表达载体，然后将所述重组表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌。具体操作为：
i)根据重组III型胶原蛋白的氨基酸序列(具体分别为SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21)，优化选择其大肠杆菌偏好的密码子基因，得到对应的核苷酸序列即SEQID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22。
委托北京盛元科盟生物科技有限公司将重组III型胶原蛋白T3A4、T3A8、T3A16、T3B4、T3B8、T3B16、T3C8、T3D8、T3E8、T3F8和T3G8的基因片段通过Kpn I(NEB公司货号：R0136L)和Xho I(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点分别插入pET-32a表达载体(北京盛元科盟生物科技有限公司)，构建得到pET-32a-T3A4、pET-32a-T3A8、pET-32a-T3A16、pET-32a-T3B4、pET-32a-T3B8、pET-32a-T3B16、pET-32a-T3C8、pET-32a-T3D8、pET-32a-T3E8、pET-32a-T3F8和pET-32a-T3G8重组表达载体，将上述重组表达载体分别导入大肠杆菌BL21(DE3)中(Merck公司)，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。具体过程为：
1：取1μl的该质粒于100μl的大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，冰上静置30min。
2：将该混合物于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速置于冰上静置2min。
3：向该混合物中加入600μl无抗性的LB培养基，37℃，220rpm条件下培养1h。
4：取200μl该菌液均匀的涂布在含有氨苄青霉素抗性的LB平板上(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，100μg/ml氨苄抗生素)。
5：将平板倒置培养于37℃温箱中，培养约20h待长出清晰可见的菌落。
2.大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和诱导表达
a.从LB平板中挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于5ml的LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)中，220rpm，37℃摇床培养过夜。
b.将菌液按照1：100的比例接种到LB培养基中放大培养，220rmp，37℃摇床培养7小时，待菌液的OD600约为0.6时，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，降温至16℃，继续过夜诱导培养；此时表达出的蛋白分别命名为T3A4、T3A8、T3A16、T3B4、T3B8、T3B16、T3C8、T3D8、T3E8、T3F8、T3G8，离心收集菌体。
c.将收集的菌体用平衡工作液(25mM Tris、200mM氯化钠和20mM咪唑)重悬，将菌液降温至≤15℃，进行均质，高压均质两次，完成后收集菌液。将均质后的菌液分装至离心瓶中，于17000rpm、4℃离心30min，收集上清液，取上清液和沉淀进行电泳检测。
3.重组III型胶原蛋白的纯化
a.水洗柱材，5个CV。b.平衡液(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)平衡柱材，5个CV。c.上样：将离心后的上清液加入柱材中，直至液体流完后。d.清洗杂蛋白：添加洗杂液25mL(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)至液体流完。e.收集目的蛋白：添加25mL洗脱液(200mM氯化钠，25mM Tris，250mM咪唑)，并收集流穿液得到目的多肽Trx-T3A4、Trx-T3A8、Trx-T3A16、Trx-T3B4、Trx-T3B8、Trx-T3B16、Trx-T3C8、Trx-T3D8、Trx-T3E8、Trx-T3F8和Trx-T3G8。对上述洗脱的目的多肽进行电泳检测。
4.电泳检测
对上文“3.重组III型胶原蛋白的纯化”部分所制备得到的目的多肽Trx-T3A4、Trx-T3A8、Trx-T3A16、Trx-T3B4、Trx-T3B8、Trx-T3B16、Trx-T3C8、Trx-T3D8、Trx-T3E8、Trx-T3F8和Trx-T3G8利用SDS-PAGE检测分子量和纯度。具体过程为：取纯化后的多肽液40μl，加入10μl 5×的蛋白上样缓冲液(250mM的Tris-HCl(pH:6.8)，10％SDS,0.5％溴酚蓝，50％甘油，5％β-巯基乙醇)，置于100℃沸水中煮10min，然后每孔10μl加入SDS-PAGE蛋白胶中，电压80V跑2h后，用考马斯亮蓝染色液(0.1％考马斯亮蓝R-250，25％异丙醇，10％冰醋酸)进行蛋白染色20min，再利用蛋白脱色液(10％醋酸，5％乙醇)进行脱色。
检测结果如图1所示，多肽Trx-T3A4、Trx-T3A8、Trx-T3A16、Trx-T3B4、Trx-T3B8、Trx-T3B16、Trx-T3C8、Trx-T3D8、Trx-T3E8、Trx-T3F8和Trx-T3G8得到正确的表达。
5、蛋白浓度和收率的检测
(1)精确量取适量上文“3.重组III型胶原蛋白的纯化”部分所制备得到的目的多肽Trx-T3A4、Trx-T3A8、Trx-T3A16、Trx-T3B4、Trx-T3B8、Trx-T3B16、Trx-T3C8、Trx-T3D8、Trx-T3E8、Trx-T3F8和Trx-T3G8样品，用洗脱液(200mM氯化钠，25mM Tris，250mM咪唑)稀释10-50倍，用玻璃棒充分搅拌均匀。使用紫外可见分光光度计在280nm处测定吸光度，根据公式C(mg/ml)＝A280×吸光系数×稀释倍数，计算蛋白浓度(注：吸光度值需在0.1～1)。
不同重组III型胶原蛋白的吸光系数、稀释倍数和A280值如下表1所示：
表1不同重组III型胶原蛋白的吸光系数、稀释倍数和A280值
(2)按照如下方法进行重组III型胶原蛋白收率的检测：
蛋白收率＝蛋白表达量(g)÷菌体重量(g)×100％
[试验结果]蛋白浓度和收率的结果如下表2所示：
表2不同重组III型胶原蛋白的菌体重量、浓度、蛋白表达量和收率
实验结论：
1、根据表2所示结果可以看出，不同重组III型胶原蛋白表达量大小依次为：T3G8＞T3C8＞T3F8＞T3B16＞T3B8＞T3D8＞T3B4＞T3A16＞T3E8＞T3A4＞T3A8；
2、根据图1所示的结果可以看出：(i)重组III型胶原T3A4和T3A8洗脱液中均无明显的目的蛋白，无明显目的蛋白表达。
(ii)T3B4(粗纯理论分子量为28.4kDa)蛋白表达量少，洗脱液中含目的蛋白；T3B8(粗纯理论分子量为39.6kDa)蛋白表达量少，洗脱液中含明显的目的蛋白；T3D8(粗纯理论分子量为37.7kDa)蛋白表达量少，洗脱液中含目的蛋白；T3F8(粗纯理论分子量为40.2kDa)洗脱液中有明显的目的蛋白；T3C8(粗纯理论分子量为39.0kDa)蛋白表达量较多，洗脱目的蛋白量较大；T3E8(粗纯理论分子量为39.1kDa)蛋白表达量少，洗脱液中目的蛋白相对较少；T3A16(粗纯理论分子量为58.5kDa)蛋白表达量少，洗脱液中含目的蛋白；T3B16(粗纯理论分子量为62.0kDa)蛋白表达量少，洗脱液中含目的蛋白，降解带较多；T3G8(粗纯理论分子量为44.3kDa)蛋白表达量少，洗脱液中含目的蛋白，杂带较多。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (10)

1.一种重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包含n个重复序列，n为大于等于1的整数；其中，所述重复序列为人天然III型胶原蛋白的功能区序列；
优选的，所述n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，其中，当n为大于等于2的整数时，各重复序列之间是直接连接的；
更优选的，所述为4、8或16；
最优选的，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列包含如下(i)～(iii)中的任一项：
(i)如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列；
(ii)在如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQID NO.11、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个氨基酸残基并且保留人天然III型胶原蛋白的氨基酸序列；
(iii)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO.1、SEQID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17SEQ ID NO.19或SEQ ID NO.21所示序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列全部选自人天然III型胶原蛋白，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。
2.根据权利要求1所述的重组III型胶原蛋白，其特征在于，所述重组III型胶原蛋白的氨基酸序列中包含能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；
优选的，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列与所述重复序列直接连接；
更优选的，所述能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列位于所述重组III型胶原蛋白的N末端。
3.一种编码权利要求2所述的重组III型胶原蛋白的多核苷酸；
优选的，所述多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20或SEQ IDNO.22所示的序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的多核苷酸；
优选的，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；
更优选的，所述重组表达载体为pET-32a。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含权利要求4所述的重组表达载体；
优选的，所述重组宿主细胞为原核细胞、酵母或真核细胞；
更优选的，所述重组宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.权利要求1或2所述的重组III型胶原蛋白的制备方法，其包括以下步骤：
S1：发酵培养根据权利要求5所述的重组宿主细胞，诱导蛋白表达；
S2：收集所述蛋白；
S3：纯化所述蛋白；优选的，包括使用Ni亲和层析柱和/或离子交换层析柱纯化所述蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在所述S1步骤中，所述发酵培养在转速为200～240rpm、温度为35～38℃的摇床中进行；优选的，所述发酵培养在转速为220rpm、温度为37℃的摇床中进行。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，在所述S1步骤中，所述诱导蛋白表达的具体操作为：在放大培养的菌液中添加IPTG并降温至16℃；优选的，所述IPTG的终浓度为0.3～0.7mM；更优选的，所述IPTG的终浓度为0.5mM。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的制备方法，在所述S2步骤中，所述收集所述蛋白的具体操作为：将S1步骤所得到的菌体用含有20-30mM Tris、150～250mM氯化钠和15～25mM咪唑的平衡工作液重悬，将菌液温度降温至4～15℃，高压均质后于4℃环境下15000～18000rpm离心20～40min。
10.权利要求1或2所述的重组III型胶原蛋白在制备产品中的用途，所述产品包括医疗器械、化妆品、保健品或药物。
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