CN116041440A - 抗衰老短肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及抗衰老短肽及其制备方法。本发明提供了一种短肽，其氨基酸序列包含如SEQ ID No.1所示的序列。本发明还提供了所述肽的编码多核苷酸、包含该多核苷酸的重组表达载体、包含该重组表达载体的重组宿主细胞、所述肽的生产方法以及包含所述肽的具有抗衰老功能的组织工程产品、化妆品或药物以及在制备抗衰老用产品中的用途。本发明所述的抗衰老短肽生产工艺简单，成本低廉，能够让抗衰老皮肤营养产品走近百姓的日常生活，具有广阔的市场应用前景。

Description

抗衰老短肽及其制备方法

优先权和相关申请

本申请要求于2022年6月15日提交中国专利局、申请号为202210681922.8、发明名称为“抗衰老短肽及其制备方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种抗衰老短肽及其制备方法。

背景技术

人和高等动物的皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。表皮没有血管，细胞的能量和营养必须由真皮微循环提供。真皮层是皮肤的生命源泉，是一层致密、坚韧且有弹性的组织，主要由纤维成分(胶原蛋白纤维、弹力纤维和网状纤维)、糖蛋白、氨基葡萄糖和玻尿酸等组成。玻尿酸是一种透明的胶状物质，吸水能力可达500-1000倍，是公认的最佳保湿产品。年轻的皮肤，玻尿酸含量高，皮肤光滑、弹性、水嫩、膨胀饱满；皮肤老化时，真皮层变薄，减少了真皮层与表皮层之间物质交换的界面，细胞的正常代谢和有丝分裂作用受到阻碍，皮肤萎缩产生皱纹，因此抗衰老要从补充真皮层营养物质(如胶原蛋白和玻尿酸等)开始。胶原蛋白可以弥补基底膜功能，帮助表皮层与真皮层的结合，能够将水分、养分保送至真皮层。因此，如果能够补充人体皮肤中的胶原蛋白，将能够有效地对抗皮肤衰老的问题。

棕榈酸五胜肽-3(Pentapeptide-3)别名五环短肽或五胜月肽，它是由法国著名化妆品公司Sederma公司研发出品的一种人工合成的短肽。它能够有效促进透明质酸、胶原蛋白和弹力纤维增生，减少肌肤细纹，提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度，增强肌肤紧致感和光泽度。它是胶原蛋白I(Collagen I)碎片与棕榈酸(Palmitic Acid)结合后得到的对皮肤更具亲和性和亲水、锁水性的物质。研究表明，若将棕榈酸五胜肽-3加入纤维组织母细胞培养皿中，能加强胶原蛋白I、VII(纤维胶原)和纤维黏连蛋白的合成能力，还能促进表皮内的纤维母细胞产生胶原蛋白和玻尿酸等重要成分。可见，棕榈酸五胜肽-3对减轻皮肤老化有重要作用。试管内测试表明，棕榈酸五胜肽-3能迅速激活胶原蛋白IV合成能力达到100％～327％，激活玻尿酸的合成能力达到267％。如今，该短肽已经广泛应用于许多知名品牌的化妆品行列。

目前，已经有很多国家的知名化妆品品牌的许多系列添加了棕榈酸五肽-3作为抗衰老的营养成分。我国上海和深圳的一些生物科技公司也有该产品销售。但是，目前棕榈酸五胜肽-3的制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。因此，为了能使这类短肽类的皮肤营养产品不断走近百姓的日常生活，使得普通人拥有安全、稳定、实用的高品质化妆品，有必要设计研发更加高效的抗衰老短肽，并探索大规模制备抗衰老短肽的技术。

发明内容

发明要解决的问题

为了提高现有抗衰老短肽—棕榈酸五肽-3的生物学活性，同时降低这类美容肽的生产成本，本发明提供一种抗衰老短肽及其制备方法，在达到优良抗衰老效果的同时，降低生产成本，为规模化生产和应用提供便利。

用于解决问题的方案

第一方面，本发明提供了一种短肽，其中，所述短肽的氨基酸序列包含如下(i)-(iv)中的任一项：

(i)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(ii)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其保留如SEQ ID NO.1所示序列的抗衰老效果；

(iii)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID NO.1所示序列的抗衰老效果的氨基酸序列；

(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留如SEQ ID NO.1所示序列的抗衰老效果，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

第二方面，本发明提供了一种编码上述短肽的多核苷酸，其中，所述多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO.2所示的序列，优选地，所述多核苷酸的序列为按照宿主细胞表达系统进行了密码子优化的序列。

第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含上述多核苷酸的序列；

优选地，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；

更优选地，所述重组表达载体为pET-32a。

进一步地，所述重组表达载体还包含多核苷酸I，所述多核苷酸I为编码能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列的多核苷酸；

优选地，所述多核苷酸I与上述多核苷酸的5’末端直接连接。

进一步地，所述重组表达载体还包含多核苷酸II，所述多核苷酸II为编码如SEQID NO.3所示的氨基酸序列的多核苷酸；

优选地，所述多核苷酸II与上述多核苷酸的3’末端直接连接。

第四方面，本发明提供了一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含上述重组表达载体；

优选地，所述重组宿主细胞为原核细胞、酵母或真核细胞；

更优选地，所述重组宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

第五方面，本发明提供了上述短肽的生产方法，其包括以下步骤：S1：将根据上述重组表达载体导入宿主细胞；S2：在生产培养基中培养所述宿主细胞并生产短肽；S3：收获并纯化所述短肽，优选用亲和柱层析纯化所述蛋白；S4：任选地对所述蛋白进行酶切，优选用TEV蛋白酶酶切所述短肽。

第六方面，本发明提供了一种组合物，其包含上述短肽，优选地，所述组合物是组织工程产品、化妆品或药物。

第七方面，本发明提供了上述短肽在制备抗衰老用产品中的用途。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，本发明所制备的新型抗衰老短肽为长期筛选优化的序列，比市场上同类产品效果显著提高。本发明所公开的新型抗衰老短肽的生产方法，采用大肠杆菌表达系统，适于大规模放大，生产成本非常低，而且编码所述抗衰老短肽的多核苷酸的序列针对大肠杆菌表达系统进行了密码子优化，进一步提高了产量。同时，本发明所制备的短肽可以有效抑制弹性蛋白酶的活性，具有良好的紧致作用，为抗衰老产品的开发、和生产提供了有效帮助。

附图说明

图1表示根据本发明的抗衰老短肽2T5的纯化过程中各样品的电泳检测结果；第1泳道为菌体离心后的离心上清样品，第2泳道为菌体离心后的沉淀样品，第3泳道为洗杂液样品，第4泳道为洗脱流穿液样品，第5泳道为酶切后流穿液的样品，第6泳道为分子量Marker。

图2表示抗衰老短肽2T5的质谱鉴定结果。抗衰老短肽2T5的理论分子量为1415.57Da，与质谱检测结果完全吻合。

图3表示pET-32a-2T5表达载体的结构示意图。

图4表示根据本发明的抗衰老短肽2T5在不同浓度下对弹性蛋白酶活性的抑制结果。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。

在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。本说明书中，“可选地”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在本发明中，术语“短肽”、“多肽”或“蛋白”可互换地指通过共价键(例如肽键)相互连接的一串至少两个氨基酸残基，可以是重组短肽、天然短肽或合成短肽。短肽可以是线形或分支的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以由非氨基酸隔断。该术语也包括已经被修饰(例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作，如以标记组分缀合)的氨基酸聚合物。在本发明中，术语“短肽”可指含有2～40个氨基酸残基的短肽。

本发明的抗衰老短肽包含以SEQ ID No.1所示的序列、与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列、或以SEQ IDNo.1所示的序列中添加、取代、缺失或修饰一个或多个氨基酸的序列，只要本发明的抗衰老短肽保留SEQ ID No.1的氨基酸序列的抗衰老效果即可。所述“多个”可以是2、3、4、5、6或7。优选地，本发明的抗衰老短肽由12个氨基酸所组成，其氨基酸序列为：GKTTKSENL YFQ(SEQID No.1)。

在本发明中，术语“氨基酸”可以包括天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物以及所有它们的D和L立体异构体。

在本发明中，“同源性”是指两种核酸分子的核苷酸序列之间或两种蛋白质分子的氨基酸序列之间的相似程度。

在本发明中，氨基酸添加可指在氨基酸序列的C端、N端或C端与N端中间的任意位置处添加1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。

在本发明中，氨基酸取代可指在氨基酸序列的某个位置的氨基酸被其他氨基酸替代，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。氨基酸取代可以是保守氨基酸取代，指与原有氨基酸序列相比，若干个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所取代而形成肽(保守性变异肽)。示例性的，这些保守性变异肽可以根据下列氨基酸取代而产生：Val、Leu或Ile对Ala的取代，Lys、Gln、Asn或His对Arg的取代，Gln、His、Lys或Arg对Asn的取代，Glu或Asn对Asp的取代，Ser或Ala对Cys的取代，Asn或Glu对Gln的取代，Asp或Gln对Glu的取代，Ala对Gly的取代，Asn、Lys、Gln或Arg对His的取代，Leu、Met、Ala、Val或Phe对Ile的取代，Ile、Met、Ala、Val或Phe对Leu的取代，Asn、Gln或Arg对Lys的取代，Ile、Leu或Phe对Met的取代，Leu、Val、Ile、Ala或Tyr对Phe的取代，Ala对Pro的取代，Thr对Ser的取代，Ser或Val对Thr的取代，Phe或Tyr对Trp的取代，Trp、Phe、Thr或Ser对Tyr的取代，及Phe、Ala、Met、Ile或Leu对Val的取代。氨基酸取代也可以是非保守氨基酸取代。

在本发明中，氨基酸缺失可指从氨基酸序列中删除1、2或3个以上氨基酸，只要改变后的序列完全或部分保留原有氨基酸序列的活性。

在本发明中，氨基酸修饰可以包括对天然序列的修饰，例如官能团的修饰、分子内共价键合(例如，侧链之间成环)、甲基化、酰基化、泛素化、磷酸化、氨基己烷化、生物素化等。

在本发明中，“杂交”意指多核苷酸或寡核苷酸在严格条件下与大体互补的序列结合的能力，而在这些条件下不发生与非互补对象之间的非特异性结合。对此，所述序列优选为90～100％互补的。将能够互相特异性结合的互补序列的特性应用于例如Northern或Southern印迹技术中，或是PCR或RT-PC R的引物结合中。根据本发明，杂交在中等严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件条件下发生。此类杂交条件描述于描述于Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。例如，具体的杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件在6×氯化钠/柠檬酸钠(S SC)中，在约45℃，然后在至少50℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤2次(对于低严格性条件，可以将洗涤温度升高到55℃)；(2)中等严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在60℃，在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤1次或多次；(3)高严格性杂交条件在6×SSC，在约45℃，然后在65℃，在0.2×SS C，0.1％SDS中洗涤1次或多次且优选；(4)非常高的严格性杂交条件是0.5M磷酸钠，7％SDS，在65℃，然后在65℃，在0.2×SSC，1％SDS中洗涤1次或多次。

本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子包括编码本发明的短肽的核酸序列。核酸可以是DNA或cDNA。核酸分子可以主要由编码本发明所述短肽的核酸序列组成，或可以仅由编码本发明所述短肽的核酸序列组成。此类核酸分子可以用本领域已知的方法合成。由于遗传密码的简并性，本领域技术人员应理解，不同核酸序列的核酸分子可以编码相同的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，根据2T5的氨基酸序列(包含以SEQ ID No.1所示的序列)，按照大肠杆菌偏好的密码子进行优化。优选地，本发明的多核苷酸的序列为：GGCAAAACCACCAAAAGCGAAAATCTGTATTTTCAG(SEQ ID NO.2)。

在本发明中，合适的载体是载体构建领域已知的，包括启动子的选择和其他调控元件，例如增强子元件。本发明所述的载体包括适合引入细胞的序列。例如，载体可以是表达载体，在该载体中，所述蛋白的编码序列受到它自身顺式作用调控元件的控制，载体的设计便于宿主细胞的基因整合或基因替换等。本领域普通技术人员应理解，在本发明中，“载体”包括DNA分子，例如，质粒、噬菌体、病毒或其他载体，它含有一个或多个异源的或重组的核苷酸序列。合适的噬菌体和病毒载体包括，但不限于：λ-噬菌体、EMBL噬菌体、猿猴病毒、牛疣病毒、Epstein-Barr病毒、腺病毒、疱疹病毒、小鼠肉瘤病毒、鼠类乳癌病毒、慢病毒等。在一个优选的实施方案中，本发明的重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体。更优选地，所述重组表达载体为pET-32a。

本发明还提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含上述多核苷酸的序列。

在一个优选的实施方案中，本发明的重组表达载体还包含多核苷酸I，所述多核苷酸I为编码能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸I与上述多核苷酸的5’末端直接连接。

在另一优选的实施方案中，本发明的重组表达载体还包含多核苷酸II，所述多核苷酸II为编码如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多核苷酸；优选地，所述多核苷酸II与上述多核苷酸的3’末端直接连接。

在一个优选的实施方案中，本发明的短肽序列在表达时可以在其N端增加ENLYFQ(SEQ ID No.4)序列，其可以通过TEV蛋白酶切除而直接获得SEQ ID No.1的序列。优选地，ENLYFQ(SEQ ID No.4)序列与本发明的短肽的N端直接连接。

在另一优选的实施方案中，本发明的短肽序列在表达时可以包含C端序列GKTTKS(SEQ ID No.3)，从而增加表达多肽的稳定性。优选地，GKTTKS(SEQ ID No.3)序列与本发明的短肽的C端直接连接。

在本发明中，宿主细胞可以是真核细胞，例如真菌和酵母，原核细胞，例如肠杆菌科细菌。在一个具体的实施方案中，宿主细胞为大肠杆菌BL21(D E3)。

本发明提供上述的抗衰老短肽的生产方法，包括如下步骤：

S1：将本发明的重组表达载体导入宿主细胞；S2：在生产培养基中培养所述宿主细胞并生产短肽；S3：收获并纯化所述短肽；S4：任选地对所述蛋白进行酶切。

在优选的实施方案中，本发明的抗衰老短肽可以通过以下方法进行制备。例如，可以通过如下步骤生产：(1)大肠杆菌基因工程菌的构建；(2)大肠杆菌基因工程菌的发酵培养；(3)蛋白的诱导和表达；(4)蛋白的纯化和任选的酶切。

在上述步骤(1)中，大肠杆菌基因工程菌的构建可以通过如下步骤进行：

a.设计抗衰老短肽2T5的氨基酸序列；b.合成上述对应的氨基酸序列的核苷酸序列；c.将抗衰老短肽2T5的核苷酸序列克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；

在上述步骤(2)与(3)中，大肠杆菌基因工程菌的发酵培养和蛋白的诱导和表达可以通过如下步骤进行：

a.挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于LB培养基中35～38℃培养过夜；b.将菌液接种放大培养，35～38℃培养2.5～3小时，加入IPTG进行诱导，15～18℃继续培养18～22小时，离心收集菌体；

在上述步骤(4)中，蛋白的纯化和酶切可以通过如下步骤进行：

a.用Tris缓冲液重悬细菌，超声破碎，离心收集上清液；

b.利用亲和层析柱从上清液中纯化得到抗衰老短肽。

在本发明中，“组织工程产品”是指用于组织工程的产品。组织工程是一门以细胞生物学和材料科学相结合，进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。

实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了不可避免的系统性误差。

实施例1：大肠杆菌基因工程菌的构建

a.为了获得抗衰老短肽2T5，特别设计氨基酸序列为：GKTTKSENLYFQ(SEQ IDNO.1)。

b.合成上述对应的氨基酸序列的核苷酸序列为：GGCAAAACCACCAAAAGCGAAAATCTGTATTTTCAG(SEQ ID NO.2)。

c.将抗衰老短肽2T5的核苷酸序列克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；具体为：

根据2T5的氨基酸序列，按照大肠杆菌偏好的密码子进行优化，即SEQ ID NO.2。

委托北京六合华大基因科技有限公司将2T5基因片段(SEQ ID NO.2)前端(即2T5基因片段的5’端)连接上编码TEV蛋白酶酶切位点(ENLYFQ(SEQ ID NO.4))的基因序列，末尾(即2T5基因片段的3’端)连接氨基酸序列GKTTKS(SEQ ID NO.3)对应的编码基因序列，得到CCGAAAACCTGTATTTCCAGGGCAAAACCACCAAAAGCGAAAATCTGT ATTTTCAGGGTAAAACCACCAAGAGC(如SEQ ID NO.5所示)之后通过Kpn I(NEB公司货号：R0136L)和Xho I(NEB公司，货号：R0146L)的酶切位点插入pET-32a表达载体(北京六合华大基因科技有限公司，该表达载体中包含编码Trx的基因序列)，构建得到pET-32a-2T5表达载体(重组表达质粒的载体图谱参见图3)，将表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选得到阳性大肠杆菌基因工程菌。

实施例2：大肠杆菌基因工程菌的发酵培养

a.挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，置于5mL的LB培养基中37℃培养过夜。

b.将菌液按照1：100接种放大培养，37℃培养3小时，加入0.5mM IPTG进行诱导，16℃继续培养20小时；此时表达出的蛋白为2T5，离心收集菌体。

实施例3：重组抗衰老短肽2T5的纯化和任选的酶切

粗纯：a.水洗柱材。b.平衡液(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)平衡柱材。c.上样：破碎收集得到的菌体，离心(离心上清样品名称记作“菌液上清”，离心沉淀样品名称记作“沉淀”)，将离心后的上清液加入柱材中，直至液体流完。d.清洗杂蛋白：添加洗杂液25mL(200mM氯化钠，25mM Tris，20mM咪唑)至液体流完(流出的洗杂液样品名称记作“柱材”)。e.收集目的蛋白：添加25mL洗脱液(200mM氯化钠，25mM Tris，250mM咪唑)，并收集流穿液得到目的短肽Trx-2T5(洗脱流穿液样品名称记作“洗脱”)。为了切除Trx标签的目的短肽，并得到氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的短肽2T5，加入适量具有His标签的TEV蛋白酶，于4℃孵育16h后，收集流穿液(酶切后流穿液样品名称记作“切后”)，即为去除载体蛋白Trx的短肽2T5。

对上述抗衰老短肽2T5纯化过程中的各个样品进行SDS-PAGE检测，检测结果如图1所示，因短肽2T5理论分子量为1415.57Da，无法通过常规的SDS-PAGE进行检测并显示，需要利用质谱方法进行鉴定。因而对纯化后的抗衰老短肽2T5进行质谱检测，检测样品经ziptipC18脱盐，然后与基质(CHCA)混合并点板，使用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪MALDI-TOF/TOF Ultraflextreme^TM，Brucker，Germany在反射模式下进行分析。质谱检测结果如图2所示，短肽2T5的理论分子量为1415.57Da，与质谱检测结果完全吻合。

实施例4：重组抗衰老短肽2T5的生物学功能

1.细胞分泌胶原蛋白的过程中，TGF-β会大量表达。因此，TGF-β表达量的增高指示着细胞合成胶原蛋白的增强。以大鼠腱细胞为模型，加入不同浓度的短肽2T5(0.2μg/ml,2μg/ml，20μg/ml，200μg/ml)，24小时之后收集大鼠腱细胞上清，直接转移到TGF-β的检测试剂盒中进行检测。

2.利用标准的MTT法检测抗衰老短肽2T5的细胞毒性。参考标准mtt法的操作方法，加入不同浓度的短肽(0.2μg/ml，2μg/ml，20μg/ml，200μg/ml)，24小时之后检测细胞活性。

3.免疫组化方法检测抗衰老短肽2T5刺激细胞合成胶原蛋白的效果。以大鼠腱细胞为模型，加入短肽(浓度为20μg/ml)24小时之后，4％多聚甲醛固定，3％BSA封闭，然后用兔抗鼠胶原蛋白的抗体(Novotec，Saint Martin La Garenne，France)进行标记1小时。用荧光显色，然后镜下观察即可。

实施例5：抗衰老短肽2T5的紧致功效评估(弹性蛋白酶活性抑制试验)试剂的配制：

称取0.4g氯化钙溶解于10ml纯化水中，配制成40g/L氯化钙溶液。取0.1ml该溶液，与10ml 10×TES溶液(购自上海碧云天生物技术有限公司，产品编号：ST453-500ml)混合后，定容至100ml，从而制备TESCA缓冲液。

称取适量弹性蛋白酶(购自上海源叶生物科技有限公司，货号：S10165)，使用TESCA缓冲液溶解，配制成200U/ml工作液，作为弹性蛋白酶溶液。

称取5mg弹性蛋白溶液(购自Sigma公司)，加入5ml纯化水配制成1mg/ml的蛋白溶液。

称取12mg表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)(购自上海源叶生物科技有限公司，货号：B20106)，加入10ml TESCA缓冲液，从而制备EGCG溶液。

弹性蛋白酶活性抑制评价：

通过以下方法评价弹性蛋白酶活性。按照下表1中列出的组成分别将50μL的样品或对照品、纯水、蛋白酶溶液和/或TESCA缓冲液加入96孔板中。37℃孵育10min后，添加蛋白溶液100μL。然后在37℃下进行酶解40min，并使用酶标仪测定405nm处的吸光值(OD值)。每组三个平行，取平均值。其中，样品组中使用的样品为浓度分别为0.10％、0.05％和0.025％的实施例3中制备的去除了标签Trx的短肽2T5；阳性对照组中使用的对照品为EGCG溶液。

表1

根据下述公式计算样品组的弹性蛋白酶活性抑制率。

式中：

A-(蛋白酶溶液+样品)实验溶液的OD值；

B-(样品+TESCA缓冲液)实验空白的OD值；

C-(蛋白酶溶液+纯水)对照溶液的OD值；

D-(纯水+TESCA缓冲液)对照空白的OD值。

对于阳性对照组，除了将上式A和B中的样品替换为表1所示E和F组中的对照品EGCG以外，以与上式相同的方式测定OD值，并计算对照品EGCG的弹性蛋白酶活性抑制率。

样品组和阳性对照组的测定结果总结于下表2。

表2

组别	弹性蛋白酶抑制率(％)
		阳性对照组	41.91
样品组(0.10％)	64.10
		样品组(0.05％)	53.55
样品组(0.025％)	47.96

如上表2所示，相比于阳性对照品EGCG，根据本发明制备的短肽2T5在不同浓度下都具有明显升高的弹性蛋白酶抑制率，表明本发明的短肽2T5具有一定的紧致功效。

产业上的可利用性

根据本发明的方法制备的抗衰老短肽2T5由12个氨基酸所组成，其氨基酸序列为GKTTKSENLYFQ(SEQ ID NO.1)。本发明利用大肠杆菌发酵的工艺，重组表达制备短肽2T5，生产工艺简单，成本低廉，易于推广。所得短肽2T5可以作为有用成分用于抗衰老产品。

Claims (9)

1.一种短肽，其特征在于，所述短肽的氨基酸序列包含如下(i)-(iv)中的任一项：

(i)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(ii)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，其保留如SEQ ID NO.1所示序列的抗衰老效果；

(iii)在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中添加、取代、缺失或修饰1个或多个氨基酸残基并且保留如SEQ ID NO.1所示序列的抗衰老效果的氨基酸序列；

(iv)由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码如SEQ IDNO.1所示序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交，并且所述氨基酸序列保留如SEQ ID NO.1所示序列的抗衰老效果，所述严格条件是中等严格条件，中-高严格条件，高严格条件或非常高严格条件。

2.一种编码如权利要求1所述的短肽的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列包含如SEQ ID NO.2所示的序列，优选地，所述多核苷酸的序列为按照宿主细胞表达系统进行了密码子优化的序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2所述的多核苷酸的序列；

优选地，所述重组表达载体包括pET系列载体、穿梭载体、噬菌体或病毒载体；

更优选地，所述重组表达载体为pET-32a。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含多核苷酸I，所述多核苷酸I为编码能够通过TEV蛋白酶切除的氨基酸序列的多核苷酸；

优选地，所述多核苷酸I与如权利要求2所述的多核苷酸的5’末端直接连接。

5.根据权利要求3或4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体还包含多核苷酸II，所述多核苷酸II为编码如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多核苷酸；

优选地，所述多核苷酸II与如权利要求2所述的多核苷酸的3’末端直接连接。

6.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞包含如权利要求3～5任一项所述的重组表达载体；

优选地，所述重组宿主细胞为原核细胞、酵母或真核细胞；

更优选地，所述重组宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

7.根据权利要求1所述的短肽的生产方法，其包括以下步骤：

S1：将根据权利要求3～5任一项所述的重组表达载体导入宿主细胞；

S2：在生产培养基中培养所述宿主细胞并生产短肽；

S3：收获并纯化所述短肽，优选用亲和柱层析纯化所述蛋白；

S4：任选地对所述蛋白进行酶切，优选用TEV蛋白酶酶切所述短肽。

8.一种组合物，其特征在于，包含根据权利要求1所述的短肽，优选地，所述组合物是组织工程产品、化妆品或药物。

9.根据权利要求1所述的短肽在制备抗衰老用产品中的用途。

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