CN116478969A - 胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用 - Google Patents

胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用。本发明优化获得一种胶原酶突变体，与野生型相比，所述突变体的酶解活性更优异。同时，针对胶原酶这一氨基酸序列很长的酶，本领域中尚缺乏使其胞外分泌表达的方案，本发明人在综合考虑各种影响表达的因素后，提供了一种优化的表达方案，成功实现了其分泌表达。本发明的方法大幅度地提高了总蛋白表达及分泌表达的效率。本发明的方法获得的胶原酶具有很高的酶活性，表达方法操作简单、成本低廉。

Description

胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用。
背景技术
胶原蛋白是脊椎动物体内最丰富的蛋白质成分，约占体内总蛋白的三分之一。胶原蛋白(Ⅰ型胶原：300kDa；长300nm，宽15nm)是由三条左旋α链相互缠绕形成的右手三螺旋结构蛋白。其中，每条α链分为螺旋区和非螺旋区，螺旋区由重复的Gly-X-Y三联体序列构成，通常X和Y为脯氨酸和羟脯氨酸。在体内，胶原蛋白由非螺旋区相互作用形成有序、有层次的结构，如纤丝(I型、II型和III型)和网状结构(IV型)。胶原蛋白是构成皮肤，肌腱，韧带等结缔组织的主要成分，为组织提高弹性，支撑和稳定性，同时也参与了细胞的信号传递，迁移，附着和分化。
由于胶原蛋白三螺旋和纤维的独特结构，使其能抵抗大多数蛋白酶的水解。在生理条件下水解胶原的蛋白酶，称为胶原酶。其中，研究最多且详细的是脊椎动物的金属蛋白酶家族，已有大量研究表明这些胶原酶与组织发育，癌细胞扩散有密切的联系。目前也在多种微生物中发现胶原酶，如梭菌属、芽孢杆菌属、弧菌属等。在微生物胶原酶中，溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)胶原酶(EC 3.4.24.3)是被较多研究的胶原酶。与脊椎动物胶原酶相比，溶组织梭菌胶原酶H(ColH)具有广泛的底物特异性，能够在三螺旋区域的Y-Gly水解胶原，将其水解成小分子肽。梭菌胶原酶已广泛用于从各种组织和器官分离细胞和胶原异常相关疾病的临床治疗。然而，本领域仍然有必要进一步提高其酶活性，以期提高其应用价值。
溶组织梭菌是一种严格厌氧的革兰氏阳性菌，是气性坏疽的病原体之一。已知溶组织梭菌至少能产生七种不同的胶原酶和明胶酶以及各种其它蛋白酶，这严重阻碍了从溶组织梭菌培养液中纯化出高纯度的胶原酶单体，这也是市场上现存的梭菌胶原酶大部分是混合物的主要原因。市场上高纯度梭菌胶原酶的稀缺促使人们研究开发其制备方法，有利用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、产气荚膜梭菌等表达系统制备该酶的报道，但是枯草芽孢杆菌存在质粒不稳定和蛋白表达水平低效问题，产气荚膜梭菌存在毒素污染等问题。大肠杆菌是目前应用最多的异源蛋白质表达体系。一般来说，重组蛋白在大肠杆菌中表达具有3种空间定位，即胞质，周质空间以及分泌到培养基中。虽然在大肠杆菌胞质已经成功表达了梭菌胶原酶，但是没有有关分泌表达的报道。
蛋白的表达量受很多因素的制约，有转录阶段的调控，翻译阶段的制约，以及翻译后的蛋白修饰等；同时蛋白的分泌表达也受到很多因素的制备，包括蛋白本身的折叠情况、蛋白的长度(蛋白序列越长时表达难度越大)、宿主细胞与目标蛋白的匹配性/兼容性、宿主的保内外状态(胞质和胞膜情况)等等。因此特定的蛋白，需要找到合适的策略并结合大量的研究试验工作来优化其表达和分泌。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶原酶突变体及其应用。
本发明的目的还在于提供一种促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种胶原酶突变体，其是氨基酸序列对应于SEQ IDNO:1所示的胶原酶，第446位发生突变的胶原酶；较佳地，所述的胶原酶突变体的第446位突变为Asp。
在一个或多个实施方式中，所述胶原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施方式中，所述胶原酶来源于溶组织梭菌(Clostridiumhistolyticum)。
在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，含有该多核苷酸的表达构建体(包括表达载体)或宿主细胞，其中所述多核苷酸编码所述的胶原酶突变体；或所述表达构建体含有所述的多核苷酸；或所述宿主细胞含有所述的表达构建体(包括表达载体)，或基因组中整合有所述的的多核苷酸。
在一个或多个实施方式中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在一个或多个实施方式中，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞等。
在本发明的另一方面，提供一种提高胶原酶的酶活性的方法，所述方法包括对其进行突变改造，对应于SEQ ID NO:1所示的胶原酶，对其第446位进行突变；较佳地，将其第446位突变为Asp。
在本发明的另一方面，提供所述的胶原酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其表达产物(如裂解产物或分泌产物)的用途，用于酶解胶原蛋白；较佳地，其被用于特异性识别和切割胶原蛋白三螺旋区域的Y-Gly，将胶原蛋白水解成小分子肽。
在本发明的另一方面，提供一种酶解蛋白质的方法，所述方法包括：利用所述的胶原酶突变体、所述的表达该突变体的宿主细胞或其表达产物进行酶解反应。
在本发明的另一方面，提供一种用于酶解蛋白质的体系或试剂盒，其中含有：前面任一所述的胶原酶突变体，表达该突变体的宿主细胞或其表达产物(如裂解产物或分泌产物)。
在本发明的另一方面，提供制备所述的胶原酶突变体的方法，该方法包含：(i)培养所述的宿主细胞；(ii)收集含有所述的胶原酶突变体的培养物；(iii)从培养物中分离出所述的胶原酶突变体。
在本发明的另一方面，提供一种促进胶原酶(包括胶原酶突变体)在大肠杆菌中分泌表达的方法，包括：(1)提供表达载体，所述表达载体依次(5’→3’)包含操作性连接的：编码OmpA信号肽的多核苷酸，编码胶原酶的多核苷酸；其中所述OmpA信号肽编码序列的5’端不含有其它元件(较佳地连接启动子，较佳地形成RBS-启动子-OmpA信号肽编码序列-编码胶原酶的多核苷酸)；(2)将(1)的表达载体引入到大肠杆菌中，以IPTG诱导表达，培养液中添加镁离子，诱导2±1小时后添加甘氨酸，从而促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达。
在一种或多种实施方式中，所述的“其它元件”包括：6Histag元件、凝血酶位点、T7tag或类似的功能性元件。
在一种或多种实施方式中，所述的“其它元件”不包括：启动子。
在一个或多个实施方式中，所述的表达载体为原核表达载体，较佳地为pET28a。
在一个或多个实施方式中，所述的IPTG的添加浓度为0.1±0.05mmol/L，较佳地0.1±0.03mmol/L。
在一个或多个实施方式中，在25±2℃以IPTG诱导表达，较佳地在25±1℃以IPTG诱导表达。
在一个或多个实施方式中，在菌液OD600为0.9±0.2时起始诱导表达，较佳地在菌液OD600为0.9±0.1时起始诱导表达。
在一个或多个实施方式中，在诱导后12～26小时，较佳地20±5小时，更佳地20±3小时时结束诱导。
在一个或多个实施方式中，装液量为20±2％，较佳地为20±1％。
在一个或多个实施方式中，所述的甘氨酸在启动诱导后的2.5±1小时，较佳地2.5±0.5小时，更佳地2.5±0.2小时添加。
在一个或多个实施方式中，所述的甘氨酸的添加浓度(在培养基中的终浓度)为2.0±0.3％(w/v)，较佳地为2.0±0.2％，更佳地为2.0±0.1％。
在一个或多个实施方式中，所述的镁离子的添加浓度(在培养基中的终浓度)为8～20mmol/L；较佳地9～15mmol/L；更佳地10～12mmol/L。
在一种或多种实施方式中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
在一种或多种实施方式中，所述的启动子为T7启动子，较佳地其为pET28a自带的启动子。
在本发明的另一方面，提供一种用于促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达的试剂盒，所述试剂盒中包括：(i)表达载体，所述表达载体依次(5’→3’)包含：编码OmpA信号肽的多核苷酸，编码胶原酶的多核苷酸；其中所述OmpA信号肽编码序列的5’端不含有其它元件；(ii)大肠杆菌；(iii)甘氨酸；和(iv)镁离子溶液。
在本发明的另一方面，提供一种用于促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达的试剂盒，所述试剂盒中包括：(a)重组大肠杆菌，该大肠杆菌中包含表达载体，所述表达载体依次(5’→3’)包含：编码OmpA信号肽的多核苷酸，编码胶原酶的多核苷酸；其中所述OmpA信号肽编码序列的5’端与核糖体结合位点连接、不含有其它元件；(b)甘氨酸；和(c)镁离子溶液。
在一个或多个实施方式中，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂：IPTG；质粒转化试剂；和/或，细胞培养基。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒的应用，用于促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、构建的两种胶原酶分泌质粒结构示意图。
图2、ColH(E446D)两次PCR产物的鉴定。M：marker；1、2：第1次PCR产物；3：第2次PCR产物。
图3、两种胶原酶的Q柱纯化；箭头为胶原酶的洗脱时间。同时，利用SDS-PAGE分别进行表达的蛋白条带的分析。
图4、以明胶和牛跟腱胶原为底物测定两种胶原酶的活性，ColH和ColH(E446D)对明胶和胶原水解活性的比较；A：以明胶为底物；B：以牛跟腱胶原为底物。
图5、三种重组菌株的胶原酶的胞外分泌情况分析；A：10％SDS-PAGE胞外分析；B：水解PZ肽的酶活性分析；1：原始菌，2：菌种A，3：菌种B。
图6、SDS-PAGE电泳分析胶原酶的分泌表达鉴定；A：培养液分析；B：细胞内可溶性成分分析；1-18：分别对应表3中实验1-18。
图7、实验观测指标的趋势图。
图8、甘氨酸添加量对胶原酶表达(B)和分泌(A)的影响。
图9、甘氨酸添加时间对胶原酶表达(B)和分泌(A)的影响。
图10、钙离子对胶原酶表达(B)和分泌(A)的影响。
图11、镁离子对胶原酶表达(B)和分泌(A)的影响。
图12、诱导时间对胶原酶表达和分泌的影响；A：培养基中无甘氨酸和镁离子；B：培养基中添加甘氨酸和镁离子。
具体实施方式
本发明优化获得一种胶原酶突变体，与野生型相比，所述突变体的酶解活性更优异。同时，针对胶原酶这一氨基酸序列很长的酶，本领域中尚缺乏使其胞外分泌表达的方案，本发明人在综合考虑各种影响表达的因素后，提供了一种优化的表达方案，成功实现了其分泌表达。本发明的方法大幅度地提高了总蛋白表达及分泌表达的效率。本发明的方法获得的胶原酶具有很高的酶活性，表达方法操作简单、成本低廉。
术语
如本文所用，除非另外说明，所述的“胶原酶的突变体”、“突变型胶原酶”可互换使用，是指对野生型的胶原酶进行突变后的产物；较佳地，是指对应于野生型胶原酶(如SEQID NO:1)，发生以下位置的突变后所构成的蛋白：第446位；较佳地该位置突变为Asp，简称为“ColH(E446D)”。
如本文所用，若需要表示野生型的胶原酶，其被称为“胶原酶”、“野生型胶原酶”、SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白或WT；较佳地其简称为ColH。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的胶原酶突变体”是指胶原酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化胶原酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
如本文所用，“重组的(Recombinant；R)”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。
如本文所用，“提高酶活性”是指与改造前的野生型胶原酶相比，发生突变的胶原酶的酶活性发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，酶活性提高的突变型胶原酶的酶活性比改造前的酶显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，70％以上，80％以上，100％，150％以上等。
如本文所用，所述的“信号肽”是分泌蛋白新生肽链N端的一段氨基酸残基组成的肽段。信号肽将分泌蛋白引导进入内质网，同时这个肽段被切除。信号肽对分泌性重组蛋白的表达有很大影响，合适的信号肽及其正确排列可以使目的蛋白的表达更为优化。
如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为胶原酶)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
如本文所用，所述的“目的基因/多肽(蛋白)”、“目标基因/多肽(蛋白)”是指感兴趣的、需要利用宿主细胞进行重组表达的基因/蛋白，本发明中所述蛋白为胶原酶。
如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，所述的“操作性相连”，“可操作地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“外源”或“异源”来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是“外源”的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源”的。
突变体、其编码核酸及构建体
本发明的胶原酶突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本发明还包括所述胶原酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然胶原酶突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的胶原酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本发明上面所特别指出的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，包括第446位突变为Asp。
在本发明中，术语“胶原酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括胶原酶突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，包括第446位突变为Asp。
在本发明中，术语“胶原酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的胶原酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，包括第446位突变为Asp。
发明还提供所述胶原酶突变体的类似物。这些类似物与所述胶原酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还提供了编码本发明胶原酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或胶原酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的胶原酶突变体。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码胶原酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，胶原酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含胶原酶突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞，优选地如大肠杆菌；或是低等真核细胞，如霉菌细胞，酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。
本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。本发明建立的重组细胞(宿主细胞)可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在表达时，本发明的胶原酶突变体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高速离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的优化的胶原酶突变体有多方面的与胶原酶特性相关的用途，包括用于酶解胶原蛋白；较佳地，其被用于特异性识别和切割胶原蛋白三螺旋区域的Y-Gly，将胶原蛋白水解成小分子肽。应理解，表达该突变体的宿主细胞或其表达产物(如裂解产物或分泌产物)也具有该用途。
分泌表达
基于本发明人的新发现，提供了一种促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达的方法，包括：(1)提供表达载体，所述表达载体依次(5’→3’)包含操作性连接的：编码菌外膜蛋白A(OmpA)信号肽的多核苷酸，编码胶原酶的多核苷酸；其中所述OmpA信号肽编码序列的5’端不含有其它元件；(2)将(1)的表达载体引入到大肠杆菌中，以IPTG诱导表达，培养液中添加镁离子，诱导2±1小时后添加甘氨酸，从而促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达。
本发明中，所述的胶原酶包括全长的胶原酶或其生物活性片段(或称为活性片段)。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的胶原酶的氨基酸序列也包括在本发明中。胶原酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。
所述胶原酶的生物活性片段也可以应用到本发明中。在这里，胶原酶的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的胶原酶的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持70％的全长胶原酶的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长胶原酶的80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
在本发明中，胶原酶指SEQ ID NO:1序列的蛋白。该术语还包括具有与SEQ ID NO:1序列的蛋白相同功能的、SEQ ID NO:1序列的蛋白的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个；如5个，3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
编码所述胶原酶或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。编码成熟胶原酶的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的序列基本上相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
术语“编码胶原酶的多核苷酸”或“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。所述的编码序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。
包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或胶原酶的编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。优化构建了含所述胶原酶编码序列和合适的转录/翻译控制信号(编码OmpA信号肽的多核苷酸、启动子)的表达载体。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成以及蛋白的表达/分泌。
在生物技术领域中，异源蛋白的重组表达/分泌是一个重要研究课题。为了提高重组蛋白的表达/分泌，需深入的实验研究工作。有很多因素可以影响重组蛋白的表达/分泌，其中信号肽就是一个影响因素。此外，其它不少因素也决定着重组蛋白的分泌表达，包括蛋白的长度(通常蛋白序列越长时表达难度越大)、蛋白翻译后的折叠情况、宿主细胞与目标蛋白的匹配性/兼容性、宿主的保内外状态(胞质和胞膜情况)等等。
本发明人对胶原酶的大肠杆菌表达进行研究的初期，发现以OmpA作为信号肽的分泌表达并不理想。为此，本发明人进行了深入分析，发现在信号肽在N端的位置影响分泌能力，N端不应含有不适当的元件/氨基酸残基，否则显著降低信号肽引导的胶原酶的分泌功能。因此，作为本发明的优选方式，所述OmpA信号肽编码序列的5’端不含有其它元件，这种策略使得胶原酶的表达/分泌的效率大幅度地提高。
作为本发明的优选方式，本发明的胶原酶的表达盒中，从5’至3’依次包括：RBS序列，启动子序列，信号肽核苷酸编码序列，胶原酶成熟肽编码序列，翻译终止子序列，这些序列是操作性相连的。在信号肽核苷酸编码序列之前，不含有His tag序列，Thrombin位点序列，T7 tag序列等。
包含本发明的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明的方法适用于在原核宿主细胞、尤其是大肠杆菌中重组表达目的蛋白(胶原酶)。本发明还提供了含有所述表达载体的宿主细胞。
排除了信号肽N端的位置影响分泌效果这一因素后、通过优化应用OmpA信号肽实现胶原酶在大肠杆菌中的分泌表达后，本发明人对诱导表达的优化进行了深入研究，筛选到适用于促进胶原酶原核表达和分泌的表达条件以及化学试剂，从而进一步提高了胶原酶的分泌水平。
本发明中披露，甘氨酸、金属离子对胶原酶分泌具有显著影响。同时也发现，从添加时机而言，甘氨酸应在诱导表达起始后的适当时间添加，这显著优于培养时或启动诱导时同时添加。
本发明中也披露，尽管培养基中添加钙镁离子都能促进大肠杆菌的生长，但只有镁离子能促进ColH的胞外分泌。
作为本发明的最优选的实施方案，在诱导温度为25℃、诱导菌浓OD600＝0.9、IPTG浓度为0.1mmol/L、装液量为20％，镁离子浓度为10mmol/L，诱导2.5h后添加2％甘氨酸条件下，诱导20h，这可极高水平地提高胶原酶的分泌表达量。
在培养重组细胞分泌表达出胶原酶后，还可包括步骤：从培养产物(培养基或发酵液)中分离胶原酶。从培养产物中分离或纯化胶原酶可采用本领域技术人员熟知的技术。例如可采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、凝胶过滤法纯化、分子筛、或采用亲和层析法纯化。
本发明的主要优点在于表达量高、分泌量高，表达的酶具有很高的活性。本发明另外一个优点是操作、培养简单：采用本发明的构建的表达系统和方法，利用低成本的培养基以及低成本的添加物质，即可实现高效的表达和分泌，操作简单、易于控制。
分泌表达还有如下优点：提高蛋白质的稳定性，利于蛋白质正确地折叠，避免被胞内蛋白酶的水解，简化下游地纯化工艺。
经由本发明的优化，重组细胞的胞外胶原酶活性可达到680U/L，是优化前的38.1倍。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1、菌株与质粒
使用的克隆菌株：大肠杆菌DH5α。
使用的表达菌株：大肠杆菌BL21(DE3)。
使用的质粒：pET28a。
colH基因：委托基因公司合成。
2、主要试剂
Primer STAR DNA聚合酶、QuickCut限制酶、T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司。
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。
Seamless Cloning Master Mix、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素、明胶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
4-苯基偶氮苄氧基羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(PZ肽)、牛跟腱胶原蛋白购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。
3、胶原酶活性的测定
参照Wunsch和Heidrich描述(Wunsch和Heidrich，Z.Physiol.Chem.，333，149-151)，用4-苯基偶氮苄氧基羰基-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(Pz肽)测胶原酶的活性，酶活性单位U定义为每分钟增加0.1A320的酶量。根据供应商提供的说明书，使用明胶或牛跟腱胶原作为底物，检测胶原酶活性，酶活性单位U定义为在25℃(pH 7.5)条件下每分钟从胶原蛋白中释放出的1μmol甘氨酸的酶量。
4、胶原酶的表达以及纯化
将携带pET28a-ColH或pET28a-ColH(E446D)质粒等的菌株接种在含50μg/mL的LB培养基中，在37℃、200r/min下培养至OD600为0.6时加入IPTG后，转移至30℃下继续培养4h。然后在10 000r/min，4℃，离心5min，收集细胞沉淀。用20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0；含5mmol/L Ca2+)悬浮收集的细胞，超声破碎(超声时间5s，间歇时间5s，超声功率280W；循环次数99次)。在4℃，10 000r/min离心5min收集上清液，然后将上清液加载到用含10mmol/L咪唑的缓冲液A(20mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,0.5mol/L NaCl)预平衡的Ni柱。用含10mmol/L咪唑5个柱体积的缓冲液A洗柱，然后用含250mmol/L咪唑3个柱体积的缓冲液A洗脱。将收集的组分，用50mM Tris HCl(pH 8.0)透析。将透析液加载到用50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)预平衡的MonoQ柱。用20个柱体积的缓冲液(0～0.5mol/L NaCl)线性梯度洗脱，纯化的胶原酶于-20℃备用。
5、序列信息
(1)胶原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1；溶组织梭菌Clostridium histolyticum)
VQNESKRYTVSYLKTLNYYDLVDLLVKTEIENLPDLFQYSSDAKEFYGNKTRMSFIMDEIGRRAPQYTEIDHKGIPTLVEVVRAGFYLGFHNKELNEINKRSFKERVIPSILAIQKNPNFKLGTEVQDKIVSATGLLAGNETAPPEVVNNFTPILQDCIKNIDRYALDDLKSKALFNVLAAPTYDITEYLRATKEKPENTPWYGKIDGFINELKKLALYGKINDNNSWIIDNGIYHIAPLGKLHSNNKIGIETLTEVMKVYPYLSMQHLQSADQIKRHYDSKDAEGNKIPLDKFKKEGKEKYCPKTYTFDDGKVIIKAGARVEEEKVKRLYWASKEVNSQFFRVYGIDKPLEEGNPDDILTMVIYNSPEEYKLNSVLYGYDTNNGGMYIEPEGTFFTYEREAQESTYTLEELFRHEYTHYLQGRYAVPGQWGRTKLYDNDRLTWYEEGGAELFAGSTRTSGILPRKSIVSNIHNTTRNNRYKLSDTVHSKYGASFEFYNYACMFMDYMYNKDMGILNKLNDLAKNNDVDGYDNYIRDLSSNYALNDKYQDHMQERIDNYENLTVPFVADDYLVRHAYKNPNEIYSEISEVAKLKDAKSEVKKSQYFSTFTLRGSYTGGASKGKLEDQKAMNKFIDDSLKKLDTYSWSGYKTLTAYFTNYKVDSSNRVTYDVVFHGYLPNEGDSKNSLPYGKINGTYKGTEKEKIKFSSEGSFDPDGKIVSYEWDFGDGNKSNEENPEHSYDKVGTYTVKLKVTDDKGESSVSTTTAEIKDLSENKLPVIYMHVPKSGALNQKVVFYGKGTYDPDGSIAGYQWDFGDGSDFSSEQNPSHVYTKKGEYTVTLRVMDSSGQMSEKTMKIKITDPVYPIGTEKEPNNSKETASGPIVPGIPVSGTIENTSDQDYFYFDVITPGEVKIDINKLGYGGATWVVYDENNNAVSYATDDGQNLSGKFKADKPGRYYIHLYMFNGSYMPYRINIEGSVGR
(2)胶原酶的基因序列(SEQ ID NO:2)
gtccagaacgaaagcaaacgctacaccgtcagctacctgaaaaccctgaactactacgacctggtcgatctgctggtcaaaaccgaaatcgagaacctgccggacctgtttcagtatagcagcgacgcgaaagagttctacggcaacaaaacccgcatgtccttcatcatggacgaaattggtcgtcgcgcaccgcagtataccgaaatcgaccacaaaggcatcccgaccctggttgaagttgttcgcgcaggtttctacctgggcttccacaacaaagagctgaacgagatcaacaaacgcagcttcaaagagcgcgttattccgagtattctggcgattcagaaaaacccgaacttcaaactgggcaccgaggtccaggataaaattgttagcgcgaccggtctgctggcaggtaacgaaaccgcaccgccggaagtcgttaacaacttcaccccgatcctgcaggactgcatcaaaaacatcgaccgctacgcactggacgatctgaaaagcaaagcactgtttaacgttctggcagcaccgacctacgatattaccgaatacctgcgcgcgaccaaagaaaaaccggaaaacaccccgtggtacggtaaaatcgacggcttcatcaacgagctgaaaaaactggcgctgtacggcaaaatcaacgacaacaacagctggatcatcgacaacggcatctaccatattgcgccgctgggtaaactgcatagcaacaacaaaatcggcatcgagaccctgaccgaagtcatgaaagtctacccgtacctgagcatgcagcatctgcaaagcgcagatcagatcaaacgccactacgacagcaaagacgcagaaggcaacaaaatcccgctggacaaattcaaaaaagagggcaaagagaaatactgcccgaaaacctacacctttgacgacggcaaagtcatcattaaagcaggcgcacgcgtcgaagaagaaaaagtcaaacgcctgtactgggcgagcaaagaagtcaacagccagttcttccgcgtttacggcatcgataaaccgctggaagaaggtaacccggacgatattctgaccatggtcatctacaacagcccggaagagtacaaactgaacagcgttctgtacggttacgataccaacaacggcggtatgtatatcgaaccggaaggcaccttctttacctacgaacgcgaagcacaggaaagcacctataccctggaagaactgttccgtcacgagtatacccattatctgcagggccgttacgctgttccgggtcagtggggtcgtaccaaactgtacgacaacgatcgtctgacctggtacgaagaaggcggcgcagaactgtttgcaggtagtacccgtacctctggtattctgccgcgtaaaagcatcgtcagcaacatccacaacaccacccgtaacaaccgctacaaactgagcgataccgttcatagcaaatacggcgcgagctttgagttctacaactacgcctgcatgttcatggactacatgtacaacaaagacatgggcatcctgaacaaactgaacgacctggcgaaaaacaacgacgttgacggctacgacaactacatccgtgatctgagcagcaattacgcactgaacgacaaataccaggaccacatgcaggaacgcatcgataactacgagaacctgaccgttccgtttgttgcggacgattatctggtccgtcacgcgtacaaaaacccgaacgagatctacagcgagatcagcgaagtcgcgaaactgaaagacgcgaaaagcgaggtcaaaaaatcccagtactttagcacctttaccctgcgcggtagctataccggcggcgcaagtaaaggtaaactggaagaccagaaagccatgaacaaattcatcgacgacagcctgaaaaaactggacacctacagctggtctggttataaaaccctgaccgcgtacttcaccaactacaaagtcgacagcagcaaccgcgttacctacgacgttgtttttcacggttacctgccgaacgaaggcgatagcaaaaacagcctgccgtacggtaaaattaacggcacctacaaaggcaccgagaaagagaaaatcaaatttagcagcgaaggtagctttgatccggacggcaaaatcgtctcttacgagtgggatttcggcgacggtaacaaaagcaacgaagaaaacccggaacatagctacgataaagtcggtacctacaccgtcaaactgaaagtcaccgacgacaaaggcgaaagtagcgttagtaccaccaccgcggaaatcaaagacctgagcgagaacaaactgccggtcatctatatgcacgttccgaaaagcggcgcactgaaccagaaagtcgtgttttatggcaaaggtacctacgatccggacggtagcattgctggttatcagtgggatttcggcgacggtagcgattttagcagcgaacagaacccgagtcacgtctacaccaaaaaaggcgaatacaccgttaccctgcgcgttatggattcttctggccagatgtccgagaaaaccatgaaaatcaaaatcaccgacccggtctatccgattggtaccgagaaagagccgaacaacagcaaagaaaccgcatctggtccgattgttccgggtattccggttagcggtaccatcgaaaacaccagcgaccaggactacttctacttcgacgttattaccccgggcgaagtcaaaatcgacatcaacaaactgggttacggcggcgctacctgggttgtgtacgacgaaaacaacaacgccgtgagttatgcaaccgacgacggtcaaaacctgagcggcaaattcaaagcggataaaccgggtcgctactacatccacctgtacatgttcaacggcagctatatgccgtatcgcatcaacatcgaaggcagcgttggtcgt
(3)突变体ColH(E446D)
将ColH的446位谷氨酸(Glu，E)突变为天冬氨酸(Asp，D)得到ColH(E446D)突变体，通过IMAC和MonoQ柱的高效液相色谱纯化出电泳纯的ColH和ColH(E446D)。
对于基因序列，针对相应位点也进行突变，从而可编码ColH(E446D)。
(4)信号肽序列
MKKTAIAIAVALAGFATVAQA(SEQ ID NO:3)
实施例1、表达质粒的构建与转化
本发明人经过大量研究、序列比较以及实验分析工作，确定将ColH中锌离子结合第二基序的第一个(446位)谷氨酸突变为天冬氨酸。本发明人发现，在例如以明胶或胶原为底物时测定ColH与ColH(E446D)的活性，显示突变体活性分别提高了16.4％和25.4％。
pET28a-ColH模板质粒的建立：将ColH的编码序列插入到pET28a的多克隆位点中，获得pET28a-ColH模板质粒。
pET28a-ColH(E446D)质粒构建：第一轮PCR分别以F1和R1，F2和R2为引物对，以pET28a-ColH(E446D)为模板，扩增出ColH(E446D)的5’片段和3’片段。第二轮PCR以F1和R2为引物对，第一轮PCR扩增出的两种片段为模板，扩增出ColH(E446D)。将第二轮PCR扩增的产物用BamHI和XhoI进行双酶切，再用T4连接酶将酶切产物连接到用相同限制酶进行双酶切的pET28a质粒中，得到ColH(E446D)的表达质粒pET28a-ColH(E446D)。pET28a-ColH(E446D)质粒转化大肠杆菌DH5α，测序验证，再转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得分泌表达的菌株，定义为原始菌株。
为实现在大肠杆菌中分泌表达ColH(E446D)，根据pET28a-ColH(E446D)模板质粒序列，本发明人合成了带有大肠杆菌OmpA信号肽的引物F3和R3(表1)。
以pET28a-ColH(E446D)为模板，以F3和R3进行PCR扩增出OmpA-ColH(E446D)。将扩增产物用BamHI和XhoI进行双酶切，再用T4连接酶将酶切产物连接到用相同限制酶进行双酶切的pET28a质粒中，得到插入有信号肽编码序列的表达质粒，pET28a-noterompA-ColH(E446D)，如图1所示。该质粒转化大肠杆菌DH5α，测序验证，再转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得分泌表达的菌株，定义为菌株A。
以F4和R4为引物，pET28a-noterompA-ColH(E446D)为模板，PCR扩增出OmpA-ColH(E446D)。将扩增产物与用NcoI和XhoI双酶切的PET28a质粒混合，加入Seamless CloningMaster Mix得到pET28a-terompA-ColH(E446D)，如图1所示。同上，该质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)，定义为菌株B。
表1、引物
实施例2、胶原酶的表达纯化与活性测定
本发明人通过重叠延伸PCR成功构建了ColH(E446D)，电泳结果如图2所示。
本发明人通过IMAC和MonoQ柱的高效液相色谱纯化出电泳纯的ColH和ColH(E446D)，两种胶原酶都在0.08mol/L NaCl处被洗脱，两种胶原酶的Q柱纯化结果如图3所示。从图3可以看出，ColH与ColH(E446D)在SDS-PAGE中都呈现为单一条带，达到了电泳纯。
以明胶和牛跟腱胶原为底物测定两种胶原酶的活性，结果如图4A-B所示。从图4可以看出，将ColH中446位谷氨酸突变为天冬氨酸，非常显著地提高了其对大分子的水解活性(活性提高约20％～30％)。
实施例3、信号肽的位置对胶原酶分泌的影响
分别用酶切连接与无缝克隆成功构建pET28a-noterompA-ColH(E446D)和pET28a-terompA-ColH(E446D)两种质粒，如图1所示。
本发明人将菌株A、菌株B和原始菌(含pET28a-ColH质粒的表达菌株)接种在含50μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，在37℃、200r/min条件培养至OD600＝0.6，加入0.5mmol/L的IPTG诱导胶原酶的表达。诱导20h后，通过SDS-PAGE电泳分析三种菌株胶原酶的分泌情况，并测定胞外活性，结果如图5A-B所示。
从图5中可以看出，信号肽的插入促进胶原酶的分泌，并且信号肽N端多余的氨基酸片段会影响胶原酶的分泌效果。本发明人意外地发现，菌株B胞外活性是菌株A的3倍。
因此，后续实施例中以菌种B(N端多余的氨基酸片段被去除的菌种)作为表达菌株。
实施例4、胶原酶在大肠杆菌中的分泌表达以及样品的制备
将实施例1中构建的分泌表达菌株(菌株B)接种在含50μg/mL的LB培养基中，在37℃、200r/min下培养到一定菌浓后，加入一定量的IPTG在一定温度下诱导表达。诱导一定时间取4.5mL的菌液，10 000r/min，4℃，离心5min，分别收集培养液和细胞沉淀。用9mL50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0；含5mmol/L Ca2+)悬浮收集的细胞，超声破碎(超声时间5s，间歇时间5s，超声功率180W；循环次数33次)。之后，10 000r/min，4℃，离心5min，收集上清和不溶性组分。SDS-PAGE电泳鉴定其表达情况，并测定胞外培养基中与胞内可溶性组分中胶原酶活性(以下简称胞内活性)。
优化胶原酶分泌的培养条件。经过多方面的实验观测和分析后，本发明人确定了4个条件作为优化培养的方向：诱导温度，诱导剂IPTG浓度，诱导时菌体浓度，装液量，对它们进行优化研究。部分分析条件如表2和表3中所列举。实验以胞外酶活和总酶活作为结果的双指标。
表2
表3
SDS-PAGE电泳分析胶原酶ColH(E446D)的分泌表达鉴定实验结果如图6A、图6B、图7所示。由图7得出，最优的IPTG浓度以及诱导时菌体浓度相同，诱导温度、装液量的最优水平不同，需要综合考虑。
进一步的分析中，本发明人发现，对于胶原酶这一不易于表达和分泌的蛋白而言，30℃诱导，虽然利于胶原酶的分泌，但胶原酶总表达量却显著降低；20℃诱导，虽然利于胶原酶的表达，但是胶原酶的分泌却显著降低，只有当诱导温度取25℃时，总表达量高，分泌效率也较理想。装液量为30％时，总活性最高，但是此时胶原酶的分泌效率最低；装液量为20％时，虽然总胶原酶活性会降低但是胶原酶的分泌量会显著增加。
综上所述，诱导条件对于胶原酶的表达和分泌有很大的影响。当诱导温度为25℃，IPTG浓度为0.1mmol/L，诱导时OD600为0.9，装液量为20％时，最利于胶原酶的表达和分泌。
实施例5、培养基中添加剂对胶原酶分泌的影响
在上述实验优化的培养条件下，本发明人研究了多种多样的实验策略来进一步提高大肠杆菌胶原酶(ColH(E446D))的分泌量。
本发明人发现，胶原酶在大肠杆菌中的分泌表达不仅受到信号肽，诱导表达条件(培养基成分，诱导温度，诱导剂浓度等)的影响，也受到细胞膜通透性(尤其是细胞外膜)的影响。增加细胞膜的通透性，包括选择具有细胞膜或细胞壁缺陷性的菌株；共表达策略(如共表达大肠菌素E1溶解蛋白和细菌素释放蛋白)；向培养基中添加一些化学物质(如离子、TritonX-100、Tween-80等)。然而，对于胶原酶而言，很多化学物质的添加大大影响其活性或表达，会起到不利的作用。
在反复实验的基础上，本发明人发现，甘氨酸、金属离子对胶原酶分泌具有显著影响。同时也发现，从添加时机而言，甘氨酸应在诱导表达起始后的适当时间添加，这显著优于培养时或启动诱导时同时添加。
(1)甘氨酸的添加量对胶原酶分泌的影响
以菌种B为作为表达菌株，以实施例2中确定的诱导表达的条件进行表达，在诱导5h后向培养基中添加0％，0.5％，1.0％，1.5％，2.0％的甘氨酸。在诱导12h和24h分别取样测定胞外活性和总活性，结果如图8所示。从图8A可以看出，随着培养基中甘氨酸量的增加，胞外活性也逐渐增加。从图8B中可以看出，在12h的诱导时间随着培养基中甘氨酸量的增加，总活性逐渐降低；但是在24h的诱导时间随着培养基中甘氨酸的增加，总活性反而呈现增加的趋势。可能是分泌到培养基中酶的稳定性高于胞内的稳定性。随着培养基添加甘氨酸量的增加，胞外活性逐渐增加，但是培养基中甘氨酸的量太高会极大的抑制大肠杆菌的生长。所以，后续实施例中，甘氨酸的添加量为2.0％。
(2)甘氨酸的添加时间对胶原酶分泌的影响
在固定培养基中甘氨酸浓度下，研究了甘氨酸的添加时间对胶原酶分泌的影响，如图9A-B所示。从图中可以得出，在诱导2.5h时添加甘氨酸，胞外活性与总活性都为最大值。
甘氨酸添加时间过早过晚都会显著影响胶原酶的表达和分泌。甘氨酸添加过早，菌体还未来得及表达胶原酶但其生长已经受到抑制；甘氨酸添加过晚，此时的菌体老化产胶原酶的能力受到很大的限制，而且诱导后期菌体的生长速率的降低会造成菌体含有甘氨酸的比率降低，严重影响胶原酶的分泌。
因此，较为优选地，在诱导2-3h时添加甘氨酸，使得胶原酶的胞外活性与总活性都相对较为理想。
(3)一些离子的添加对胶原酶分泌的影响
本发明人发现，甘氨酸虽然促进了蛋白分泌表达，但同时菌体变得十分脆弱，从菌体OD600值的降低和CFU/OD(单位OD600的菌落形成数)的下降可以看出(结果未显示)。
进一步的实验研究中发现，向培养基中进一步添加不同浓度的金属离子，可以改变菌体变得脆弱这一情况。
本发明人发现，钙镁离子的添加都减少了菌体变得脆弱这一情况，表现在OD600值的升高(数据未显示)，但是钙离子抑制了胶原酶的分泌，也未能促进胶原酶表达；相反添加镁离子促进胶原酶的分泌，也促进胶原酶表达，培养基中添加10mmol/L氯化镁对胶原酶的表达和分泌效果最好。如图10A-B和图11A-B所示。
添加10mmol/L钙离子或镁离子，诱导24h胶原酶的分泌率(前者为57.8％，后者为80.7％)的差异可以证明这一猜测。
实施例6、诱导时间对胶原酶分泌的影响
以菌种B为作为表达菌株，以实施例2中确定的诱导表达的条件进行表达，进行两组实验(实验组在培养基中添加甘氨酸和镁离子，对照组不加)考察诱导时间对大肠杆菌胶原酶分泌的影响，如图12A-B所示。在培养基中添加甘氨酸和镁离子，虽然在诱导开始阶段抑制胶原酶的合成，但是诱导后期会促进胶原酶的表达，可能是胶原酶分泌到培养基会降低对菌体的负荷促进胶原酶的继续合成。在诱导20h时，实验组的胞外活性和总活性都到达最大值，为680和850U/L，其中胞外活性是优化前的38.1倍。
结论
(1)将ColH的446位谷氨酸突变为天冬氨酸，非常显著地提高了其水解明胶和胶原的活性。
(2)利用OmpA信号肽实现了在大肠杆菌中分泌表达高分子量的ColH。
(3)信号肽在N端的位置影响分泌能力，N端不应含有不适当的元件/氨基酸，否则显著降低信号肽引导的胶原酶的分泌功能。
(4)通过优化诱导表达条件，使胞外胶原酶活性达到680U/L，是优化前的38.1倍。
(5)培养基中添加钙镁离子都能促进大肠杆菌的生长，但只有镁离子能促进ColH的分泌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
序列表
<110> 上海雅心生物技术有限公司
<120> 胶原酶突变体、促进重组胶原酶分泌表达的方法及其应用
<130> 218224
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 981
<212> PRT
<213> Clostridium histolyticum
<400> 1
Val Gln Asn Glu Ser Lys Arg Tyr Thr Val Ser Tyr Leu Lys Thr Leu
1 5 10 15
Asn Tyr Tyr Asp Leu Val Asp Leu Leu Val Lys Thr Glu Ile Glu Asn
20 25 30
Leu Pro Asp Leu Phe Gln Tyr Ser Ser Asp Ala Lys Glu Phe Tyr Gly
35 40 45
Asn Lys Thr Arg Met Ser Phe Ile Met Asp Glu Ile Gly Arg Arg Ala
50 55 60
Pro Gln Tyr Thr Glu Ile Asp His Lys Gly Ile Pro Thr Leu Val Glu
65 70 75 80
Val Val Arg Ala Gly Phe Tyr Leu Gly Phe His Asn Lys Glu Leu Asn
85 90 95
Glu Ile Asn Lys Arg Ser Phe Lys Glu Arg Val Ile Pro Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Ile Gln Lys Asn Pro Asn Phe Lys Leu Gly Thr Glu Val Gln Asp
115 120 125
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130 135 140
Pro Glu Val Val Asn Asn Phe Thr Pro Ile Leu Gln Asp Cys Ile Lys
145 150 155 160
Asn Ile Asp Arg Tyr Ala Leu Asp Asp Leu Lys Ser Lys Ala Leu Phe
165 170 175
Asn Val Leu Ala Ala Pro Thr Tyr Asp Ile Thr Glu Tyr Leu Arg Ala
180 185 190
Thr Lys Glu Lys Pro Glu Asn Thr Pro Trp Tyr Gly Lys Ile Asp Gly
195 200 205
Phe Ile Asn Glu Leu Lys Lys Leu Ala Leu Tyr Gly Lys Ile Asn Asp
210 215 220
Asn Asn Ser Trp Ile Ile Asp Asn Gly Ile Tyr His Ile Ala Pro Leu
225 230 235 240
Gly Lys Leu His Ser Asn Asn Lys Ile Gly Ile Glu Thr Leu Thr Glu
245 250 255
Val Met Lys Val Tyr Pro Tyr Leu Ser Met Gln His Leu Gln Ser Ala
260 265 270
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275 280 285
Ile Pro Leu Asp Lys Phe Lys Lys Glu Gly Lys Glu Lys Tyr Cys Pro
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Arg Val Glu Glu Glu Lys Val Lys Arg Leu Tyr Trp Ala Ser Lys Glu
325 330 335
Val Asn Ser Gln Phe Phe Arg Val Tyr Gly Ile Asp Lys Pro Leu Glu
340 345 350
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Asn Leu Thr Val Pro Phe Val Ala Asp Asp Tyr Leu Val Arg His Ala
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Leu Asp Thr Tyr Ser Trp Ser Gly Tyr Lys Thr Leu Thr Ala Tyr Phe
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Tyr Glu Trp Asp Phe Gly Asp Gly Asn Lys Ser Asn Glu Glu Asn Pro
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Glu His Ser Tyr Asp Lys Val Gly Thr Tyr Thr Val Lys Leu Lys Val
740 745 750
Thr Asp Asp Lys Gly Glu Ser Ser Val Ser Thr Thr Thr Ala Glu Ile
755 760 765
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Pro Ile Val Pro Gly Ile Pro Val Ser Gly Thr Ile Glu Asn Thr Ser
885 890 895
Asp Gln Asp Tyr Phe Tyr Phe Asp Val Ile Thr Pro Gly Glu Val Lys
900 905 910
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Asp Glu Asn Asn Asn Ala Val Ser Tyr Ala Thr Asp Asp Gly Gln Asn
930 935 940
Leu Ser Gly Lys Phe Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Ile His
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Leu Tyr Met Phe Asn Gly Ser Tyr Met Pro Tyr Arg Ile Asn Ile Glu
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Gly Ser Val Gly Arg
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<211> 2943
<212> DNA
<213> Clostridium histolyticum
<400> 2
gtccagaacg aaagcaaacg ctacaccgtc agctacctga aaaccctgaa ctactacgac 60
ctggtcgatc tgctggtcaa aaccgaaatc gagaacctgc cggacctgtt tcagtatagc 120
agcgacgcga aagagttcta cggcaacaaa acccgcatgt ccttcatcat ggacgaaatt 180
ggtcgtcgcg caccgcagta taccgaaatc gaccacaaag gcatcccgac cctggttgaa 240
gttgttcgcg caggtttcta cctgggcttc cacaacaaag agctgaacga gatcaacaaa 300
cgcagcttca aagagcgcgt tattccgagt attctggcga ttcagaaaaa cccgaacttc 360
aaactgggca ccgaggtcca ggataaaatt gttagcgcga ccggtctgct ggcaggtaac 420
gaaaccgcac cgccggaagt cgttaacaac ttcaccccga tcctgcagga ctgcatcaaa 480
aacatcgacc gctacgcact ggacgatctg aaaagcaaag cactgtttaa cgttctggca 540
gcaccgacct acgatattac cgaatacctg cgcgcgacca aagaaaaacc ggaaaacacc 600
ccgtggtacg gtaaaatcga cggcttcatc aacgagctga aaaaactggc gctgtacggc 660
aaaatcaacg acaacaacag ctggatcatc gacaacggca tctaccatat tgcgccgctg 720
ggtaaactgc atagcaacaa caaaatcggc atcgagaccc tgaccgaagt catgaaagtc 780
tacccgtacc tgagcatgca gcatctgcaa agcgcagatc agatcaaacg ccactacgac 840
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accatggtca tctacaacag cccggaagag tacaaactga acagcgttct gtacggttac 1140
gataccaaca acggcggtat gtatatcgaa ccggaaggca ccttctttac ctacgaacgc 1200
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cgtctgacct ggtacgaaga aggcggcgca gaactgtttg caggtagtac ccgtacctct 1380
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tacaaactga gcgataccgt tcatagcaaa tacggcgcga gctttgagtt ctacaactac 1500
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gacctggcga aaaacaacga cgttgacggc tacgacaact acatccgtga tctgagcagc 1620
aattacgcac tgaacgacaa ataccaggac cacatgcagg aacgcatcga taactacgag 1680
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aacgagatct acagcgagat cagcgaagtc gcgaaactga aagacgcgaa aagcgaggtc 1800
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aaaggtaaac tggaagacca gaaagccatg aacaaattca tcgacgacag cctgaaaaaa 1920
ctggacacct acagctggtc tggttataaa accctgaccg cgtacttcac caactacaaa 1980
gtcgacagca gcaaccgcgt tacctacgac gttgtttttc acggttacct gccgaacgaa 2040
ggcgatagca aaaacagcct gccgtacggt aaaattaacg gcacctacaa aggcaccgag 2100
aaagagaaaa tcaaatttag cagcgaaggt agctttgatc cggacggcaa aatcgtctct 2160
tacgagtggg atttcggcga cggtaacaaa agcaacgaag aaaacccgga acatagctac 2220
gataaagtcg gtacctacac cgtcaaactg aaagtcaccg acgacaaagg cgaaagtagc 2280
gttagtacca ccaccgcgga aatcaaagac ctgagcgaga acaaactgcc ggtcatctat 2340
atgcacgttc cgaaaagcgg cgcactgaac cagaaagtcg tgttttatgg caaaggtacc 2400
tacgatccgg acggtagcat tgctggttat cagtgggatt tcggcgacgg tagcgatttt 2460
agcagcgaac agaacccgag tcacgtctac accaaaaaag gcgaatacac cgttaccctg 2520
cgcgttatgg attcttctgg ccagatgtcc gagaaaacca tgaaaatcaa aatcaccgac 2580
ccggtctatc cgattggtac cgagaaagag ccgaacaaca gcaaagaaac cgcatctggt 2640
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cgt 2943
<210> 3
<211> 21
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<213> Artificial Sequence
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Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
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Thr Val Ala Gln Ala
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
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gcgccgcctt cgtcgtacca ggt 23
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ggtggtggtg ctcgagacga c 21

Claims (10)

1.一种胶原酶突变体，其特征在于，其是氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示的胶原酶，第446位发生突变的胶原酶；较佳地，所述的胶原酶突变体的第446位突变为Asp。
2.分离的多核苷酸,含有该多核苷酸的表达构建体或宿主细胞，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的胶原酶突变体；或
所述表达构建体含有所述的多核苷酸；或
所述宿主细胞含有所述的表达构建体，或基因组中整合有所述的的多核苷酸。
3.一种提高胶原酶的酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括对其进行突变改造，对应于SEQ ID NO:1所示的胶原酶，对其第446位进行突变；较佳地，将其第446位突变为Asp。
4.权利要求1所述的胶原酶突变体、表达该突变体的宿主细胞或其表达产物的用途，用于酶解胶原蛋白；较佳地，其被用于特异性识别和切割胶原蛋白三螺旋区域的Y-Gly，将胶原蛋白水解成小分子肽。
5.一种酶解蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1所述的胶原酶突变体，权利要求2所述的表达该突变体的宿主细胞或其表达产物进行酶解反应。
6.制备权利要求1所述的胶原酶突变体的方法，该方法包含：
(i)培养权利要求3所述的宿主细胞；
(ii)收集含有所述的胶原酶突变体的培养物；
(iii)从培养物中分离出所述的胶原酶突变体。
7.一种促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达的方法，其特征在于，包括：
(1)提供表达载体，所述表达载体依次包含操作性连接的：编码OmpA信号肽的多核苷酸，编码胶原酶的多核苷酸；其中所述OmpA信号肽编码序列的5’端不含有其它元件；
(2)将(1)的表达载体引入到大肠杆菌中，以IPTG诱导表达，培养液中添加镁离子，诱导2±1小时后添加甘氨酸，从而促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表达载体为原核表达载体，较佳地为pET28a；或
所述的IPTG的添加浓度为0.1±0.05mmol/L，较佳地0.1±0.03mmol/L；或
在25±2℃以IPTG诱导表达，较佳地在25±1℃以IPTG诱导表达；或
在菌液OD600为0.9±0.2时起始诱导表达，较佳地在菌液OD600为0.9±0.1时起始诱导表达；或
在诱导后12～26小时，较佳地20±5小时，更佳地20±3小时时结束诱导；或
装液量为20±2％，较佳地为20±1％。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的甘氨酸在启动诱导后的2.5±1小时，较佳地2.5±0.5小时，更佳地2.5±0.2小时添加；或
所述的甘氨酸的添加浓度为2.0±0.3％(w/v)，较佳地为2.0±0.2％，更佳地为2.0±0.1％；或
所述的镁离子的添加浓度为8～20mmol/L；较佳地9～15mmol/L；更佳地10～12mmol/L。
10.一种用于促进胶原酶在大肠杆菌中分泌表达的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒中包括：(i)表达载体，所述表达载体依次包含：编码OmpA信号肽的多核苷酸，编码胶原酶的多核苷酸；其中所述OmpA信号肽编码序列的5’端不含有其它元件；(ii)大肠杆菌；(iii)甘氨酸；和(iv)镁离子溶液；或
所述试剂盒中包括：(a)重组大肠杆菌，该大肠杆菌中包含表达载体，所述表达载体依次包含：编码OmpA信号肽的多核苷酸，编码胶原酶的多核苷酸；其中所述OmpA信号肽编码序列的5’端与核糖体结合位点连接、不含有其它元件；(b)甘氨酸；和(c)镁离子溶液；
较佳地，所述试剂盒中还包括选自下组的试剂：
IPTG；
质粒转化试剂；和/或
细胞培养基。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116904429A (zh) * 2023-08-30 2023-10-20 江南大学 一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用

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