CN116904429A - 一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明采用含有胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞进行发酵，生产的胶原蛋白水解酶酶活显著提升，且在宿主菌中的可溶性表达也大幅提升，实现了胶原蛋白水解酶的高效表达，其中，胶原蛋白水解酶突变体是将来自Bacillus cereus VD021的胶原蛋白水解酶经过截短改造得到。将该酶应用于不同来源胶原蛋白的水解催化时可将胶原蛋白全部转化为低分子量胶原蛋白肽，降解效果良好，具有重要的应用前景。

Description

一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

胶原蛋白，简称胶原，是一种结构蛋白，大量存在于人体结缔组织如软骨和皮肤等的细胞外基质中，同时也是哺乳动物中含量最丰富的蛋白，约占人体总蛋白的三分之一。胶原蛋白种类繁多，目前已经发现30种不同的胶原蛋白。胶原蛋白是由原胶原也就是单个胶原分子组成的胶原纤维，而胶原分子通常是由三条左螺旋的氨基酸链以右螺旋的方式组成三螺旋结构，最常见的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原蛋白的三螺旋结构长度约为300nm平均直径为1.5nm，氨基酸的组成却存在共同特点，三条链呈现Gly-X-Y的排列方式，甘氨酸残基占了总氨基酸残基的三分之一，X和Y通常分别为脯氨酸和羟脯氨酸，两者约占总氨基酸组成的四分之一。由于其特殊的三螺旋结构，天然胶原蛋白具有异常的稳定性，很难被一般的蛋白酶所降解。

低分子量的胶原蛋白的制备方法主要分为两类：化学降解法和生物酶解法。化学降解法是目前商业化生产胶原蛋白的主要方式，尽管化学法生产低分子量胶原蛋白的工艺已经十分成熟，但也存在比如破坏氨基酸结构，产品组分单一性差、环境污染等问题。相比于化学降解法，生物酶解法具有反应条件温和、无污染、工艺简单、产品分子量易于控制、不会破坏氨基酸活性基团等优势。

除了用于酶法制备低分子量胶原蛋白，胶原蛋白水解酶酶也被用于治疗清理烧伤创口、愈合伤口、缓解坐骨神经痛、治疗腰椎间盘突出、慢性完全闭塞、掌腱膜挛缩症和纤维性海绵体炎等多种疾病。目前对于胶原蛋白水解酶的研究集中在细菌来源的胶原蛋白水解酶，然而，目前市场上的商业胶原酶利用溶组织梭状芽孢杆菌发酵获得，它也是长期以来市场上唯一的微生物胶原酶，但该菌是致病菌，限制了其在食品行业的应用。且其在大肠杆菌中表达时，胶原蛋白水解酶在包涵体中，不溶现象突出，胶原酶的市场需求很大，但工业化的生产菌株仍然很少，国内市场上销售的胶原酶多为昂贵的进口胶原酶。因此研究胶原酶在微生物表达系统中的高效表达有广阔的前景。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种胶原蛋白水解酶突变体的表达方法及其在水解胶原蛋白中的应用，以来自Bacillus cereus VD021的胶原蛋白水解酶(Protein ID：R8HPH3)为出发序列进行改造，随后优化其在大肠杆菌和毕赤酵母中的重组表达，得到的胶原蛋白水解酶可高效水解胶原蛋白，将其全部降解成胶原蛋白短肽。

本发明的第一个目的是提供一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法，采用含有胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞进行发酵生产，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQ IDNO.1所示氨基酸序列N端的第1-30位氨基酸得到。突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述宿主细胞包括大肠杆菌或毕赤酵母。

进一步地，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.3所示的启动子或lac启动子启动表达。

进一步地，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.4所示的信号肽调控表达。

进一步地，以pET-28a(+)或pRS305为表达载体。

进一步地，所述发酵为分批发酵或补料分批发酵。

进一步地，分批发酵时，包括如下步骤：将种子液接种于发酵培养基中，于28-32℃、230-270rpm培养2-4h，后于23-27℃、580-620rpm下诱导表达，发酵过程中通气量保持在1.5-2.0vvm，流加pH调节剂维持pH在6.8-7.2直至分批发酵结束。

进一步地，补料分批发酵时，包括如下步骤：当发酵培养基中初始碳源消耗完毕时，流加甘油，速度为7-9mL·L-1·h-1，直至补料分批发酵结束。

进一步地，流加的甘油浓度为60-80％(w/v)。

本发明的第二个目的是提供一种高效表达胶原蛋白水解酶的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌或毕赤酵母为宿主，异源表达胶原蛋白水解酶突变体，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQ ID NO.1所示氨基酸序列N端的第1-30位氨基酸得到。

进一步地，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.3所示的启动子或lac启动子启动表达。

进一步地，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ ID NO.4所示的信号肽调控表达。

本发明的第三个目的是提供一种胶原蛋白水解酶突变体，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQ ID NO.1所示氨基酸序列N端的第1-30位氨基酸得到。

本发明的第四个目的是提供编码上述胶原蛋白水解酶突变体的基因。

本发明的第五个目的是提供携带上述基因的重组质粒。

本发明的第六个目的是提供表达上述胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。

本发明的第七个目的是提供上述高效表达胶原蛋白水解酶的重组菌、胶原蛋白水解酶突变体、基因、重组质粒或宿主细胞在降解胶原蛋白中的应用，尤其在制备低分子量胶原蛋白(分子量为30-25Da)产品中具有良好表现。

进一步地，所述降解是在45-55℃条件下反应1h～12h。

进一步地，反应体系中，胶原蛋白底物浓度为10g·L^-1～20g·L^-1；胶原蛋白水解酶突变体的添加量为15U-100U。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种在大肠杆菌和毕赤酵母中高效降解胶原蛋白的水解酶突变体，酶活有显著提升，且提高了该酶在重组宿主菌中的可溶性表达。用获得的突变体制备低分子量胶原蛋白，经蛋白肽结构预测发现产物中含有胶原蛋白肽组成的最小单元数三肽，证明其具有良好的降解效果，从而通过控制添加的酶量和反应的时间即可得到不同分子量含量的低分子量胶原蛋白。最后在此基础上，本发明对表达方法进行改进，发现在毕赤酵母中重组表达，并以甘油作为流加碳源进行分批补料发酵时，测定酶活高达38U·mL^-1。

附图说明

图1为纯化后SDS-PAGE电泳图。

图2为BL21-ColVD021和BL21-△30-ColVD021纯化后的蛋白表达量。

图3为BL21-△30-ColVD021重组菌株3-L罐分批发酵结果。

图4为SDS-PAGE分析不同时间点蛋白表达情况。

图5为不同酶活条件下对鸡源II型来源胶原蛋水解的时间过程。

图6为不同酶活条件下对鱼鳞来源胶原蛋水解的时间过程。

图7为不同酶活条件下对牛源I型来源胶原蛋水解的时间过程。

图8为降解20g/L鱼鳞来源胶原蛋白产物序列分析结果。

图9为降解20g/L牛源I型来源胶原蛋白产物序列分析结果。

图10为GS115-△30-ColVD021重组菌株3-L罐补料放大发酵结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例涉及的材料及方法如下：

1、质粒构建试剂及测序验证均在上海生物生工公司购买和完成；各种分析纯试剂购自国药集团。

2、培养基

LB培养基：10g·L^-1NaCl，10g·L^-1胰蛋白胨，5g·L^-1酵母粉。

TB培养基：2.31g·L^-1KH₂PO₄，12.54g·L^-1K₂HPO₄，12g·L^-1胰蛋白胨，24g·L^-1酵母粉，4mL·L^-1甘油。

BSM培养基(g·L^-1)：甘油40.0、K₂SO₄ 18、MgSO₄·7H₂O 14.9、KOH 4.13、CaSO₄0.93、磷酸27mL、PTM1 4.4mL。

甘油补料培养基：使用去离子水配置70％(w/v)甘油溶液，灭菌后加入过滤除菌的12mL·L^-1PTM1溶液。

3、引物序列

表1引物序列信息

4、胶原蛋白水解酶酶活测定方法

本发明采用茚三酮显色法测定胶原酶的活性。

标准曲线的绘制：

取11个5mL离心管，依次加入浓度为0mmol·L^-1、0.06mmol·L^-1、0.12mmol·L^-1、0.18mmol·L^-1、0.24mmol·L^-1、0.30mmol·L^-1、0.36mmol·L^-1、0.42mmol·L^-1、0.48mmol·L^-1、0.54mmol·L^-1、0.60mmol·L^-1的甘氨酸标准溶液0.3mL。先后加入等体积的乙酸缓冲液和茚三酮显色液，混匀后放入沸水中，反应15min，随后用冷水冷却5min，加入等体积的60％乙醇，充分混合后吸取200μL到96孔板中，使用酶标仪测定样品在570nm下的吸光值，以甘氨酸浓度为横坐标，以减去空白对照后的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

以来源于鱼鳞皮肤的胶原蛋白为底物，反应体系为：1.3mL胶原蛋白溶液，0.2mL粗酶液，在37℃水浴锅反应0.5h，加入1.5mL 10％三氯乙酸溶液终止反应。随后混匀并取样0.3mL至新的5mL离心管中，加入0.3mL乙酸缓冲液，混匀再加入0.3mL茚三酮显色液，混匀。具体操作同标准曲线的绘制，不同之处在于最终的反应液需要用60％乙醇适当稀释。

酶活力单位定义：

在37℃，pH 7.5(钙离子存在)条件下反应0.5h，每分钟水解胶原蛋白产生1μmol甘氨酸所需的酶量为1个酶活力单位U。

5、胶原蛋白分子量测定

使用凝胶排阻色谱检测胶原蛋白的降解以及测定胶原蛋白肽的分子量。测定分子量时，使用50mM Tris-Hcl，5mM CaCl₂，pH 7.5缓冲液溶解胶原蛋白，底物浓度为20mg·mL^-1，加入不同终酶活的胶原蛋白，50℃反应，反应过程中定时取样，煮沸样品使蛋白灭活，12000rpm离心10min，上清液使用0.22μm水系滤膜去除杂质后测定样品分子量。高效液相色谱条件：色谱柱为TSK-G2000SWxl(7.8×300mm，5μm)，柱温为25℃；以浓度0.1M的NaNO₃溶液为流动相，设定流速0.8mL·min^-1；进样量为20μL；使用示差检测器检测。以不同分子量的胶原蛋白肽作为标准样品，制作不同标样洗脱时间与分子量之间的标准曲线。

实施例1：胶原蛋白水解酶大肠杆菌表达质粒pET-28a-ColVD021、pET-28a-△30-ColVD021的构建

胶原蛋白水解酶ColVD021(氨基酸序列见SEQ ID NO.1)的基因由天霖生物科技有限公司进行密码子优化后合成，其C端添加了6×His标签，并与载体pET-28a(+)相连，使用引物pET-28a-S-F。质粒转化Escherichia coli BL21(DE3)，得到质粒pET-28a-ColVD021。

以含有野生型胶原蛋白水解酶基因的重组质粒pET-28a-ColVD021为模板，对氨基酸序列N端的第1位至第30位氨基酸进行截短得到

pET-28a-△30-ColVD021，使用引物C-HIS-F、C-HIS-F-T、C-HIS-R。

引物序列见表1。使用限制性内切酶DpnI消化模板质粒后柱纯化回收，将纯化的片段使用平末端磷酸化连接酶试剂盒(Blunting Kination Ligation Kit)进行连接，接着转化Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布含有卡那霉素的LB平板，单克隆子提质粒测序验证。具体操作为：在含有终浓度50μg·mL^-1硫酸卡那霉素LB平板上划线，放37℃培养箱过夜培养，挑取单菌落到添加终浓度50μg·mL^-1硫酸卡那霉素的5mL液体LB培养基里，放置弹簧摇床过夜培养10h左右，离心收集菌体，按照质粒提取试剂盒上的步骤进行，后使用太极连接转化，菌落PCR验证，挑取验证正确的单菌，命名为BL21-△30-ColVD021。

实施例2：对胶原蛋白水解酶截短后的突变体△30-ColVD021和野生型ColVD021进行摇瓶发酵

采用实施例1制备的重组菌株BL21-△30-ColVD021在摇菌管培养种子液，在50mL摇菌管中分装5mL的LB培养基，添加50μg·mL^-1硫酸卡那霉素，用一次性接种环挑取单菌落，接种到培养基中，再将摇菌管置于弹簧摇床，在37℃，220r·min^-1条件下过夜培养用作种子液，后转接入摇瓶培养：在250mL三角瓶中分装50mL的TB培养基，添加50μg·mL^-1硫酸卡那霉素，接种1mL摇菌管中培养好的菌液，置于摇床中，先37℃，220r·min^-1培养约2h至OD₆₀₀约为0.7左右，添加0.5mmoL·L^-1的IPTG，25℃，220r·min^-1培养8h。

重组菌培养结束后，发酵得到的菌体用50mL离心管收集，4℃，8000rpm，离心10min，弃去上清，加10mL的pH 7.5 100mM Tris-HCl缓冲液悬浮沉淀，将3管溶液合为1管，得到30mL菌液，使用超声破碎仪破碎15min左右，4℃，8000rpm，离心10min，弃去沉淀，上清液使用0.45μm的微孔滤膜过滤，得到粗酶液。使用AKTA蛋白纯化仪进行蛋白纯化，首先使用缓冲液A平衡预装纯化柱HisTrap HP column(GE healthcare)，接着上样过膜后的样品，使用缓冲液A冲洗柱子，然后按照缓冲液B浓度10％，20％，40％，60％进行梯度洗脱洗去杂质，目的蛋白在40％的缓冲液B浓度洗脱。如图1所示。

粗酶液的酶活测定结果：BL21-ColVD021和BL21-△30-ColVD021的粗酶液的酶活分别为0.277U·mL^-1和0.475U·mL^-1。突变体的酶活提高至原始酶的170％。

纯化后的蛋白表达量及酶活测定结果：与菌株BL21-ColVD021相比，BL21-△30-ColVD021总的蛋白表达量明显增加，可溶性蛋白的表达量也明显提高(见图2，条带6为BL21-ColVD02，8为BL21-△30-ColVD021)。纯化后酶活提高至4U·mL^-1。

实施例3：对胶原蛋白水解酶截短后的突变体△30-ColVD021进行3-L罐放大培养

为了评估胶原蛋白水解酶工业化应用的潜力，以甘油作为碳源，在3-L发酵罐进行发酵培养。3-L罐分批培养：从冷冻甘油管中吸取100μL菌液，接种于100mL含有50μg·mL-1卡那霉素的新鲜LB液体培养基，37℃、220rpm培养至对数中期(8-10h)，按10％(v/v)的接种量将种子液转接到含有900mL新鲜TB液体培养基的3-L发酵罐中，30℃、250rpm培养3h，加入终浓度为0.5mM IPTG，25℃、600rpm继续培养，间隔取样。整个过程通气量为1.5vvm，自动添加2M NaOH维持发酵液的pH为7.0。

结果见图3-4。胶原蛋白水解酶目的条带随着发酵时间延长而逐渐增粗，并在12h达到最大值，与酶活结果相一致。

实施例4：制备特定分子量分布的胶原蛋白

为了考察上述制备的胶原蛋白水解酶突变体水解制备胶原蛋白的效率，向20g·L^-1的不同来源胶原蛋白溶液中加入不同酶活的胶原蛋白水解酶突变体，并在降解过程中定时取样分析反应体系中胶原蛋白分子量分布的变化情况。

结果见图5-7。在反应的初期，胶原蛋白水解的底物的分子量迅速降低，之后逐渐趋于不变。在3h时，分别添加酶活为70U、100U和100U的胶原蛋白水解酶突变体，大分子(分子量>5kDa)分布比例分别从0.36％、3.65％、2.53％降至0.05％、0.27％、0.21％，小分子(分子量<1kDa)比例分别从84.38％、58.10％、57.67％升高至94.40％、90.06％、87.30％。

实施例5：对降解产物进行蛋白序列预测

为了考察胶原蛋白水解酶突变体水解制备胶原蛋白产物组成，对其产物进行结构预测。在完全降解20g·L^-1鱼鳞来源胶原蛋白和20g·L^-1牛源I型胶原蛋白的降解产物中发现含有大量胶原蛋白组成的基本单元三肽，并对其结构进行预测。

结果见图8-9，降解鱼鳞来源胶原蛋白添加酶活为100U时，对降解后的产物进行肽序测定，发现含有三肽，其序列可能是CCF PQQ QPQ。降解牛源I型来源胶原蛋白添加酶活为70U，对降解后的产物进行肽序测定，发现含有三肽，其序列可能是GPR PGR。以上结果证明本发明的胶原蛋白水解酶突变体能将胶原蛋白降解到胶原蛋白最小的结构单位-三肽，降解效果好。

实施例6：胶原蛋白水解酶毕赤酵母表达质粒pGAP(m)-sp23-△30-ColVD021的构建

以之前构建的质粒pGAP(m)-sp23-HAase(专利申请号：201811172714.5)为模板，设计引物对GAP(m)-sp23-F/R，进行PCR扩增，得到载体骨架片段。利用重组克隆试剂盒，一步法无缝连接载体骨架片段及胶原蛋白水解酶突变体基因片段，获得pGAP(m)-sp23-△30-ColVD021。

实施例7：对胶原蛋白水解酶GAP(m)-sp23-△30-ColVD021进行3-L罐放大培养

将实施例6中的重组质粒pGAP(m)-sp23-△30-ColVD021用限制性内切酶SalI单酶切线性化，电转化表达宿主Pichia pastoris GS115，转化后涂布于G418抗生素筛选平板，挑选阳性克隆，提取基因组进行PCR验证，验证正确的菌株命名为GS115-△30-ColVD021。

为了评估重组菌工业化应用的潜力，以甘油作为流加碳源，在3-L发酵罐进行分批补料发酵培养。BSM发酵培养基中甘油在20h左右耗尽，此时流加甘油，速度为8mL·L-1·h-1，直至发酵结束。如图10所示，菌体干重随着发酵时间延长而逐渐增加，在108h达到最高值，达到148g·L^-1。胶原蛋白水解酶酶活在36h之前增长较为缓慢，之后开始显著增加，同样在108h达到最大值，表明毕赤酵母组成型表达重组蛋白与菌体生长相偶联。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种高效表达胶原蛋白水解酶的方法，其特征在于，采用含有胶原蛋白水解酶突变体的宿主细胞进行发酵生产，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQ ID NO.1所示氨基酸序列N端的第1-30位氨基酸得到。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌或毕赤酵母。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ IDNO.3所示的启动子或lac启动子启动表达。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶原蛋白水解酶突变体由SEQ IDNO.4所示的信号肽调控表达。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵为分批发酵或补料分批发酵。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

分批发酵时，包括如下步骤：将种子液接种于发酵培养基中，于28-32℃、230-270rpm培养2-4h，后于23-27℃、580-620rpm下诱导表达，发酵过程中通气量保持在1.5-2.0vvm，流加pH调节剂维持pH在6.8-7.2直至分批发酵结束；

补料分批发酵时，包括如下步骤：当发酵培养基中初始碳源消耗完毕时，以7-9mL·L-1·h-1的速度流加甘油，直至补料分批发酵结束。

7.一种高效表达胶原蛋白水解酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌或毕赤酵母为宿主，异源表达胶原蛋白水解酶突变体，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQID NO.1所示氨基酸序列N端的第1-30位氨基酸得到。

8.一种胶原蛋白水解酶突变体，其特征在于，所述胶原蛋白水解酶突变体通过截去SEQID NO.1所示氨基酸序列N端的第1-30位氨基酸得到。

9.编码权利要求8所述胶原蛋白水解酶突变体的基因或携带所述基因的重组质粒。

10.权利要求7所述的重组菌、权利要求8所述的胶原蛋白水解酶突变体、权利要求9所述的基因或重组质粒在降解胶原蛋白中的应用。