CN1958797B

CN1958797B - 南极假丝酵母脂肪酶的制备方法

Info

Publication number: CN1958797B
Application number: CN2006101186728A
Authority: CN
Inventors: 唐克轩; 姚红艳
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2006-11-23
Filing date: 2006-11-23
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2026-11-23
Also published as: CN1958797A

Abstract

本发明提供了一种南极假丝酵母脂肪酶的制备方法，属于分子生物学领域。按照毕赤酵母偏爱密码子结构，通过化学方法人工合成了CALB基因，人工合成的DNA分子，编码具有与野生型CALB蛋白在氨基酸水平上具有相同功能的核苷酸序列，所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交。本发明所说基因在毕赤酵母细胞中高效表达，所表达的脂肪酶量达到21.6mg/L，从而提供了一种按毕赤酵母偏爱密码子设计合成在毕赤酵母中表达的南极假丝酵母脂肪酶基因，为解决酶成本高、满足工业大规模生产需要具有重要意义。

Description

南极假丝酵母脂肪酶的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种分子生物技术领域核的制备方法，特别是一种南极假丝酵母脂肪酶的制备方法。

背景技术

脂肪酶(EC.3.1.1.3)是在生物催化反应中非常重要的一类酶，目前已被广泛应用于油化学、清洁剂、食品工业和精细化工产品制备等很多领域。在众多脂肪酶中，CALB(Candida antarctica lipase B，南极假丝酵母脂肪酶B)的用途最为广泛，它对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。近几年的研究成果表明CALB以及Novozym 435(吸附固定于大孔丙烯酸树脂的CALB)在酯化、水解、转酯以及其它类型的反应中都显示了较其它脂肪酶更为出色的催化性能。CALB良好的催化性能已引起了全世界的关注，目前诺维信公司生产的Novozym435价格在300元/克左右，所以降低成本已是实现工业化生产的关键。目前从理论上降低CALB成本可以具有以下几种途径：1)降低酶的发酵生产成本。由于大规模发酵存在单位酶产量降低和酶稳定性降低的问题，所以在大规模发酵中很难降低成本。2)降低固定化成本。目前固定化采用吸附固定，机械搅拌或磁力搅拌都容易使Novozym435在反应过程中出现酶脱落，甚至固定化颗粒破碎，这也是固定化酶面临的普遍问题。3)利用异源重组表达来提高脂肪酶的产量。

在1994年，CALB的核苷酸序列被克隆和研究(Structure.1994，2：293-308)，研究提供了CALB完整编码区的核苷酸序列及其信号肽序列，并且与其它脂肪酶的核苷酸序列同源性的比较表明CALB与其它脂肪酶没有明显的同源性。尽管在1995年CALB在米曲霉中进行了异源表达(Journal of Botany.1995，73：869)，在一定程度上克服了野生型南极假丝酵母发酵培养成本高以及对脂肪酶B表达量低的问题，但是尚未发现与本发明主题有密切联系文献的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种南极假丝酵母脂肪酶的制备方法，并利用基因工程的办法，将该基因在毕赤酵母中实现高效表达，以提高表达脂肪酶的含量，从而能够实现降低发酵的成本。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明按照毕赤酵母偏爱密码子结构，通过化学方法人工合成了CALB基因，人工合成的DNA分子，编码具有与野生型CALB蛋白在氨基酸水平上具有相同功能的核苷酸序列，所述的编码具有CALB脂肪酶活性的多肽的核苷酸序列，具有SEQID NO.1中从核苷酸第l-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交。

所述的“中度严谨条件下”指核苷酸序列之间能在2×SSC(0.3M柠檬酸钠，3M氯化钠，pH 7.0)和0.1％SDS的条件下。

所述的“化学方法”指亚磷酸三酯法，用于核苷酸序列的固相合成。

所述的“人工合成”指在体外进行的、使用核酸自动合成仪合成核苷酸序列的方法。

所述的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。

本发明的南极假丝酵母脂肪酶基因按如下毕赤酵母偏爱密码子对照表的优先结构设计：

氨基酸	代码	毕赤酵母	氨基酸	代码	毕赤酵母
						Gly	G	GGT	Cys	C	TGT
Glu	E	GAA	Tyr	Y	ACT
						Asp	D	GAT	Leu	L	TTG
Val	V	GTT	Pro	P	CCA
						Ala	A	GCT	Phe	F	TTT
Arg	R	AGA	His	H	CAT
						Ser	S	TCT	Gln	Q	CAA
Lys	K	AAG	Ile	I	ATT
						Asn	N	AAC/AAT	Thr	T	ACT
Met	M	ATG	Trp	W	TGG
						End		TAA

用人工合成的方法获得CALB基因核苷酸编码序列后，就可以用重组法来大批量获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

用在毕赤酵母中产生和表达的方法能够获得所述的CALB基因，其方法步骤如下：

(1)将按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成的编码CALB蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成南极假丝酵母脂肪酶基因表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列有至少85％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交。

本发明可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在生产本发明的脂肪酶多肽时，可以将脂肪酶编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成脂肪酶蛋白表达载体。

本发明所说“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

(2)将步骤(1)中的表达载体电击转入毕赤酵母，在28-30℃条件下，在抗生素平板上培养2-4天，获得含有CALB蛋白基因的重组细胞。

(3)再生重组细胞，获得表达CALB蛋白基因的重组酵母菌株。

所述的CALB基因，是指编码具有与南极假丝酵母脂肪酶催化活性相同的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-957位核苷酸序列。该术语还指能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-957位的核苷酸序列的同源性至少85％，较佳地至少90％，更佳地至少95％，最佳地至少98％的核苷酸序列。

本发明所说的“CALB”指具有脂肪酶催化活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。

本发明按照毕赤酵母偏爱密码子的优先结构，人工合成了南极假丝酵母的脂肪酶基因，并利用基因工程的办法，使之在毕赤酵母中高度表达，提高了脂肪酶的表达量，从而降低了工业发酵的成本，在工业上具有广阔的产业化前景。

具体实施方式

为更好地理解本发明的技术方案，以下通过具体的实施例来进一步详细说明。下列实施例中按照常规条件，如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

CALB蛋白基因的序列信息与同源性分析

本发明根据南极假丝酵母脂肪酶CALB蛋白质氨基酸序列，按毕赤酵母偏爱密码子对照表设计合成了南极假丝酵母脂肪酶CALB基因，全长为957bp，即为开放阅读框，详细序列见SEQ ID NO.1。据此推导出，除了一个终止密码子外，共编码318个氨基酸残基，分子量为33.3KD，等电点(pI)为5.26，详细序列见SEQ ID NO.2。

按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成的CALB基因序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与野生型南极假丝酵母CALB具有一定的同源性。在核苷酸水平上，它与野生型南极假丝酵母脂肪酶CALB的核苷酸序列(GenBankAccession No.Z30645)的全编码序列具有一定的同源性，其中同源性较高的部分见同源比较(GAP)图表1；在氨基酸水平上，它与野生型南极假丝酵母CALB(GenPept Accession No.P41365)氨基酸残基的同源性达到100％，见氨基酸序列同源比较(FASTA)图表2。由此可见，设计合成的CALB与野生型南极假丝酵母脂肪酶CALB在蛋白水平上一致同源，可以认为两者在功能上也相同。

表1

78％ identity in 281nt overlap

Query 133 ggtccacaatctttcgactctaactggattccattgtctactcaattgggttacactcca 192

|||||||| || |||||||| |||||||| || | || || || ||||||||||| ||

Sbjct 205 ggtccacagtcgttcgactcgaactggatccccctctcaacgcagttgggttacacaccc 264

Query 193 tgttggatttctccaccacctttcatgttgaacgacactcaagttaacactgaatacatg 252

|| ||||| || || || || |||||| | |||||||| || || ||||| || ||||||

Sbjct 265 tgctggatctcacccccgccgttcatgctcaacgacacccaggtcaacacggagtacatg 324

Query 253 gttaacgctattactgctttgtacgctggttctggtaacaacaagttgccagttttgact 312

|| ||||| || || || | ||||||||||| || ||||||||| | || || | ||

Sbjct 325 gtcaacgccatcaccgcgctctacgctggttcgggcaacaacaagcttcccgtgcttacc 384

Query 313 tggtctcaaggtggtttggttgctcaatggggtttgactttcttcccatctattagatct 372

||||| || |||||| ||||||| || |||||| |||| |||||||| ||| || ||

Sbjct 385 tggtcccagggtggtctggttgcacagtggggtctgaccttcttccccagtatcaggtcc 444

Query 373 aaggttgatagattgatggcttttgctccagactacaaggg 413

||||| ||| || | ||||| ||||| || |||||||| ||

Sbjct 445 aaggtcgatcgacttatggcctttgcgcccgactacaaggg 485

Query：按毕赤酵母密码子偏爱设计人工合成的CALB基因的核酸序列

Sbjct：南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的核酸序列(Z30645)

表2按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成的CALB与南极假丝酵母CALB核苷酸序列的同源比较(GAP)。其中，相同的核苷酸在两个序列之间用竖线符标出。

表2

100％ identity in 317 aa overlap

Query 2 LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG 61

LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG

Sbjct 26 LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLG 85

Query 62 YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS 121

YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS

Sbjct 86 YTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPS 145

Query 122 IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT 181

IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT

Sbjct 146 IRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTT 205

Query 182 NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA 241

NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA

Sbjct 206 NLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSA 265

Query 242 LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPY 301

LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPY

Sbjct 266 LRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPY 325

Query 302 ARPFAVGKRTCSGIVTP 318

ARPFAVGKRTCSGIVTP

Sbjct 326 ARPFAVGKRTCSGIVTP 342

Query：按毕赤酵母密码子偏爱设计人工合成的CALB的氨基酸序列

Sbjct：南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的氨基酸序列(P41365)

表2按毕赤酵母偏爱密码子设计的CALB与南极假丝酵母CALB的氨基酸序列同源比较(FASTA)。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

实施例2

将实施例1合成的CALB基因在毕赤酵母中的产生

毕赤酵母表达载体的构建

在保证阅读框正确的前提下，将含有合成基因CALB的pPICZαA质粒载体的大肠杆菌，接种到含Zeocin抗生素的LB培养基中，在37℃的恒温摇床上培养过夜，过夜的细菌按照分子克隆所提供的方法抽提质粒。

再采用电击法(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)将其转入毕赤酵母(如GS115，或KM71)。

实施例3

CALB基因在毕赤酵母细胞中的诱导表达及表达产物的鉴定

CALB基因在毕赤酵母细胞中的诱导表达

1.将实施例2所获得的含有CALB基因的重组酵母细胞用无菌牙签挑取，接种于25ml BMGY培养基中，28℃，250rpm振荡培养至光密度值OD₆₀₀＝2-6(一般需要16-18小时)，使细胞处于对数生长期。

2.培养细胞在室温下1500-3000g离心5min，弃上清。

3.菌体用BMMY培养基悬浮，使菌液的OD₆₀₀＝1.0，菌液在28℃，250rpm继续振荡培养，每隔24小时加入纯甲醇至终浓度是0.5％，以补充挥发的甲醇来保证正常诱导。

4.按照时间点(0，6，12，24，48，72，96小时)分别取出1ml培养液，测定OD₆₀₀。

CALB诱导表达产物的鉴定

各时间点取样在室温下12000rpm离心2-3分钟，测定上清水解对硝基苯酚葵酸酯的活力：取4μl表达上清加至对硝基苯酚酯测定脂肪酶活反应体系含192μl 1M TrisCl，pH8.0，4μl 25mM对硝基苯酚葵酸酯(用DMSO配制)，混匀室温反应10min，加100μl无水乙醇终止反应，反应生成的对硝基苯酚是黄色物质，从而确定上清中表达脂肪酶。同时终止反应后，测光吸收A_405nm，根据对硝基苯酚标准浓度的光吸收A_405nm曲线计算反应体系生成的对硝基苯酚，再计算样品每分钟分解硝基苯酚葵酸酯产生对硝基苯酚的μg数，即酶活力单位(U)。根据OD₆₀₀和水解酶活力(U)绘制重组脂肪酶酵母菌的生长曲线。结果表明重组脂肪酶酵母菌在诱导表达48小时后，酶活力达到最高1.5×10³U/ml，光密度值OD₆₀₀是10.8。

本发明利用PCR方法分析确认了毕赤酵母细胞内含有目的基因CALB，利用SDS-PAGE电泳和水解对硝基苯酚葵酸酯的颜色反应鉴定了CALB的表达，利用仿生亲和分离方法对CALB进行的纯化，利用Lowry法测定蛋白含量(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)。结果表达的脂肪酶蛋白量达到21.6mg/L。而野生型南极假丝酵母的脂肪酶表达量非常低，酶蛋白表达量的增加对解决酶成本高、满足工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。

本发明涉及的序列和记号分列如下：

SEQ ID NO.1的信息

<110>上海交通大学

<120>南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列

<140>

<141>2006-03-25

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>957

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

1 atgttgcctt ctggttctga ccctgctttt tctcaaccaa agtctgtttt ggatgctggt

61 ttgacttgtc aaggtgcttc tccatcttct gtttctaaac caattttgtt ggttccaggt

121 actggtacta ctggtccaca atctttcgac tctaactgga ttccattgtc tactcaattg

181 ggttacactc catgttggat ttctccacca cctttcatgt tgaacgacac tcaagttaac

241 actgaataca tggttaacgc tattactgct ttgtacgctg gttctggtaa caacaagttg

301 ccagttttga cttggtctca aggtggtttg gttgctcaat ggggtttgac tttcttccca

361 tctattagat ctaaggttga tagattgatg gcttttgctc cagactacaa gggtactgtt

421 ttggctggtc ctttggatgc tttggctgtt tctgctccat ctgtttggca acaaactact

481 ggttctgctt tgactactgc tttgagaaac gctggtggtt tgactcaaat tgttccaact

541 actaacttgt actctgctac tgacgaaatt gttcaacctc aagtttctaa ctctccattg

601 gactcttctt acttgttcaa cggtaagaac attcaagctc aagctgtttg tggtccattg

661 ttcgttattg accatgctgg ttctttgact tctcaattct cttacgttgt tggtagatct

721 gctttgagat ctactactgg tcaagctaga tctgctgact atggtattac tgactgtaac

781 cctttgccag ctaatgattt gactccagaa caaaaggttg ctgctgctgc tttgttggct

841 ccagaagctg ctgctattgt tgctggtcca aagcaatact gtgaaccaga cttgatgcca

901 tacgctagac catttgctgt tggtagaaga acttgttctg gtattgttac tccataa

SEQ ID N0.2的信息

<210>2

<211>318

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

1 MLPSGSDPAF SQPKSVLDAG LTCQGASPSS VSKPILLVPG TGTTGPQSFD SNWIPLSTQL

61 GYTPCWISPP PFMLNDTQVN TEYMVNAITA LYAGSGNNKL PVLTWSQGGL VAQWGLTFFP

121 SIRSKVDRLM AFAPDYKGTV LAGPLDALAV SAPSVWQQTT GSALTTALRN AGGLTQIVPT

181 TNLYSATDEI VQPQVSNSPL DSSYLFNGKN VQAQAVCGPL FVIDHAGSLT SQFSYVVGRS

241 ALRSTTGQAR SADYGITDCN PLPANDLTPE QKVAAAALLA PAAAAIVAGP KQNCEPDLMP

301 YARPFAVGKR TCSG IVTP

Claims

1.一种南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征在于，按照毕赤酵母偏爱密码子结构，通过化学方法人工合成了南极假丝酵母脂肪酶B基因，该基因如SEQ ID NO.1所示，编码具有与野生型南极假丝酵母脂肪酶B蛋白在氨基酸水平上具有相同功能的核苷酸序列；

所述的化学方法，指亚磷酸三酯法，用于核苷酸序列的固相合成；

所述的人工合成，指在体外进行的、使用核酸自动合成仪合成核苷酸序列的方法。

2.根据权利要求1所述的南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征是，所述的通过化学方法人工合成了南极假丝酵母脂肪酶B基因，具体采用如下方法获得：

(1)将按毕赤酵母偏爱密码子设计人工合成的编码南极假丝酵母脂肪酶B蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成南极假丝酵母脂肪酶基因表达载体，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将步骤(1)中的表达载体电击转入毕赤酵母，在28-30℃条件下，在抗生素平板上培养2-4天，获得含有南极假丝酵母脂肪酶B蛋白基因的重组细胞；

(3)再生重组细胞，获得表达南极假丝酵母脂肪酶B蛋白基因的重组酵母菌株。