CN102317309A - 通过不同的翻译后修饰改变和调节蛋白质活性 - Google Patents

Abstract

本发明的实施方案包括通过使用分离的或部分纯化的糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白、包含糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的细胞提取物和/或在包含一种或多种糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的细胞中改变极端酶的酶活性或溶解性或翻译后修饰目标蛋白质的方法。

Description

通过不同的翻译后修饰改变和调节蛋白质活性

优先权声明

本申请要求2010年1月12日提交的美国专利申请第12/655,993号“ALTERATION AND MODULATION OF PROTEIN ACTIVITY BYVARYING POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION(通过不同的翻译后修饰改变和调节蛋白质活性)”的提交日权益，该申请作为部分继续申请案，根据35U.S.C.§119要求2009年2月26日提交的美国专利申请第12/380,450号和2009年2月26日提交的PCT国际专利申请第PCT/US2009/035307号的优先权。

政府权利

本发明根据美国能源部授予的合同号DE-AC07-99ID13727和DE-AC07-05ID14517在政府支持下产生。政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本发明大体上涉及生物技术领域。更具体地说，本发明的实施方案涉及蛋白质的翻译后修饰。

背景技术

直到最近，人们认为细菌通常并未使其蛋白质糖基化。虽然已报道一些例子，但这些被当作罕见的异常情况而摒弃(Borman 2006)。现在人们逐渐接受细菌以比真核生物可能更多的方式使其蛋白质糖基化，尽管这种看法尚未得到广泛认同(

等，2001)。在最近的评论文章中声明，已显示糖基化有助于蛋白质稳定性、调节物理性质(如溶解性)、保护蛋白质免受水解、改变活性和靶向外化(Upreti等，2003)。1994年，一组人员从酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)中纯化淀粉酶并表示该淀粉酶在活性生长期间与细胞结合(Schwermann等，1994)。随着培养进入稳定期，细胞将活性可溶糖基化形式的淀粉酶释放至培养基中(Schwermann等，1994)。未尝试比较各种形式的淀粉酶的活性。

发明内容

本发明的实施方案包括通过用化学糖基化的方式和/或分离的或部分纯化的糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白、包含糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的细胞提取物，和/或在包含一种或多种糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的细胞中改变极端酶或其它蛋白质的酶活性的方法。本发明的实施方案包括翻译后修饰蛋白质的方法。在一些实施方案中，翻译后修饰可通过使用糖基化(包括化学糖基化)、聚乙二醇化、磷酸化、甲基化或其它形式的翻译后修饰的方式进行，和/或是分离的或部分纯化的糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白，包含糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的细胞提取物，和/或在包含一种或多种糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的细胞中。本发明的实施方案包括翻译后修饰蛋白，所述翻译后修饰蛋白包括但不限于SEQ IDNOS：307(celB)、331(内切葡聚糖酶C)、333(肽聚糖N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶)、335(β-半乳糖苷酶)、337(阿拉伯呋喃糖苷酶)和338(α-木糖苷酶)。因此实施方案包括上述蛋白质的糖基化形式。

本发明的第一方面涉及从极端微生物分离的酶，所述酶在温度高于约80℃和pH低于约2时显示最佳的酶活性。

本发明的另一方面涉及来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)的半纤维素酶。

本发明的再一方面涉及用于降解复合生物分子的酶。

更进一步地，本发明的再一方面涉及可用于同时糖化和发酵过程以将生物质糖转化为终产物的酶。

本发明的再一方面涉及处理生物质的方法，所述方法包括以下步骤：提供具有生物质糖的生物质源，用来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)的水溶性半纤维素酶预处理生物质以产生终产物。

本发明的再一方面涉及制备半纤维素酶的方法，所述方法包括以下步骤：提供酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)源；在有上清液的微生物营养培养基中培养酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)；从营养培养基上清液中分离酸热脂环酸芽孢杆菌的细胞；以及从营养培养基上清液回收并纯化来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)的半纤维素酶。

而且，本发明的再一方面涉及水解多糖的方法，所述方法包括以下步骤：提供来源于微生物的水溶性半纤维素酶；在pH低于约2时用水溶性半纤维素酶进行多糖的水解。

以下将更详细地描述本发明的这些和其它方面。

附图简述

图1分别描述了SEQ ID NO：1(RAAC00164)与ref|YP_001223775.1|、ref|YP_729290.1|、ref|ZP_01084440.1|、ref|ZP_01079150.1|和ref|ZP_01471594.1|(SEQ ID NOS：3-7)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：1指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图2分别描述了SEQ ID NO：18(RAAC00517)与ref|ZP_00589533.1|、ref|ZP_01386435.1|、ref|YP_378533.1|、ref|ZP_00513158.1|和ref|YP_374173.1|(SEQ ID NOS：20-24)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：18指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图3分别描述了SEQ ID NO：35(RAAC00650)与ref|YP_001127183.1|、ref|ZP_02038504.1|、ref|YP_001647987.1|、ref|YP_001377114.1|和ref|NP_835081.1|(SEQ ID NOS：37-41)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：35指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图4分别描述了SEQ ID NO：52(RAAC00991)与ref|ZP_02327412.1|、ref|YP_001487207.1|、ref|ZP_01172765.1|、ref|NP_831314.1|和ref|NP_844008.1|(SEQ ID NOS：54-58)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：52指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图5A和5B分别描述了SEQ ID NO：69(RAAC01110)与ref|YP_001519856.1|、ref|YP_711688.1|、ref|ZP_01331931.1|、ref|YP_001076955.1|和ref|YP_336440.1|(SEQ ID NOS：71-75)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：69指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图6A和6B分别描述了SEQ ID NO：86(RAAC01166)与gb|AAR99615.1|、gb|ABM68334.2|、ref|ZP_01372248.1|、ref|YP_519555.1|和ref|ZP_02234077.1|(SEQ ID NOS：88-92)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：86指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图7分别描述了SEQ ID NO：103(RAAC01167)与ref|ZP_01515212.1|、ref|YP_001277643.1|、ref|ZP_02291400.1|、ref|YP_001633727.1|和ref|YP_001434357.1|(SEQ ID NOS：105-109)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：103指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图8A和8B分别描述了SEQ ID NO：120(RAAC01170)与ref|YP_001324592.1|、ref|YP_342776.1|、ref|NP_780975.1|、ref|YP_001636830.1|和ref|YP_001299026.1|(SEQ ID NOS：122-126)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：120指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图9分别描述了SEQ ID NO：137(RAAC01248)与ref|ZP_02170160.1|、ref|ZP_01171895.1|、ref|YP_076646.1|、ref|YP_590910.1|和ref|ZP_02175410.1|(SEQ ID NOS：139-143)之间的序列比对，所述序列具有对表1中SEQ ID NO：137指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图10A和10B分别描述了SEQ ID NO：154(RAAC01348)与ref|ZP_01665289.1|、ref|ZP_01643350.1|、gb|AAW77167.1|、ref|YP_452722.1|和ref|ZP 02241787.1|(SEQ ID NOS：156-160)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：154指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图11分别描述了SEQ  ID  NO：171(RAAC01377)与ref|YP_147952.1|、ref|YP_520670.1|、ref|YP_001395809.1|、ref|YP_001309701.1|和ref|YP_001643660.1|(SEQ ID NOS：173-177)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：171指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图12分别描述了SEQ ID NO：188(RAAC01611)与ref|YP_146214.1|、ref|YP_001124463.1|、ref|NP_865262.1|、ref|YP_426013.1|和ref|ZP_01885526.1|(SEQ ID NOS：190-194)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：188指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图13A和13B分别描述了SEQ ID NO：205(RAAC01612)与ref|YP_146215.1|、ref|YP_001124464.1|、ref|YP_074948.1|、ref|YP_001039503.1|和ref|NP_621770.1|(SEQ ID NOS：207-211)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：205指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图14A和14B分别描述了SEQ ID NO：222(RAAC01926)与ref|YP_001038202.1|、ref|ZP_01667587.1|、ref|ZP_01575301.1|、ref|YP_001211020.1|和ref|YP_516465.1|(SEQ ID NOS：224-228)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：222指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图15分别描述了SEQ ID NO：239(RAAC01998)与ref|NP_348940.1|、ref|NP_721244.1|、dbj|BAC75700.1|、ref|ZP_00605123.1|和ref|YP_015329.1|(SEQ ID NOS：241-245)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：239指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图16分别描述了SEQ ID NO：256(RAAC02011)与ref|YP_754819.1|、ref|YP_184322.1|、ref|NP_577787.1|、ref|NP_142068.1|和ref|NP_125751.1|(SEQ ID NOS：258-262)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：256指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图17A和17B分别描述了SEQ ID NO：273(RAAC02381)与ref|NP_622177.1|、ref|YP_848858.1|、ref|YP_001374688.1|、ref|NP_470039.1|和ref|ZP_01929325.1|(SEQ ID NOS：275-279)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：273指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图18分别描述了SEQ ID NO：290(RAAC02421)与ref|ZP_01721811.1|、ref|NP_241897.1|、ref|YP_001486101.1|、ref|ZP_01170532.1|和ref|ZP_02327994.1|(SEQ ID NOS：292-296)之间的序列比对，所述序列均具有对表1中SEQ ID NO：290指定的功能。用“*”表示所有序列中的保守氨基酸，并且用“：”表示一般保守氨基酸。

图19为描述温度对如本发明所提供的木聚糖酶活性的影响的图表。

图20为描述在pH4.0时温度对如本发明所提供的纤维素酶活性的影响的图表。

图21为描述在温度为60℃时pH对本发明的纤维素酶活性的影响的图表。

图22为描述在温度为60℃时pH对本发明的木聚糖酶活性的影响的图表。

图23为描述在不同pH和温度下用小麦阿拉伯木聚糖(WAX)测定的SEQ ID NO：307的木聚糖酶活性的图表。从酸热脂环酸芽孢杆菌(黑色柱)分离所述酶或在大肠杆菌(E.coli)(白色柱)中产生所述酶。没有在pH为5.5(60℃和80℃)时从酸热脂环酸芽孢杆菌分离的酶的数据。

图24为描述在不同pH和温度下用羧甲基纤维素(CMC)测定的SEQ ID NO：307的纤维素酶活性的图表。从酸热脂环酸芽孢杆菌(黑色柱)分离所述酶或在大肠杆菌(白色柱)中产生所述酶。没有在pH为5.5(60℃和80℃)时从酸热脂环酸芽孢杆菌分离的酶的数据。

图25为描述在不同pH和温度下如图23和24测定的SEQ IDNO：307的纤维素/木聚糖酶活性比的图表。从酸热脂环酸芽孢杆菌(黑色柱)分离所述酶或在大肠杆菌(白色柱)中产生所述酶。没有在pH为5.5(60℃和80℃)时从酸热脂环酸芽孢杆菌分离的酶的数据。pH为5.5时对于大肠杆菌中产生的酶的柱顶端左侧开口，表明所述比例高于10。

图26为描述在不同pH和温度下用小麦阿拉伯木聚糖(WAX)测定的SEQ ID NO：307的木聚糖酶活性的图表。毕赤酵母(Pichiapastoris)(黑色柱)或大肠杆菌(白色柱)中产生所述酶。

图27为描述在不同pH和温度下用羧甲基纤维素(CMC)测定的SEQ ID NO：307的纤维素酶活性的图表。毕赤酵母(黑色柱)或大肠杆菌(白色柱)中产生所述酶。

图28为描述在不同pH和温度下如图26和27测定的SEQ IDNO：307的纤维素/木聚糖酶活性比的图表。毕赤酵母(黑色柱)或大肠杆菌(白色柱)中产生所述酶。pH为5.5时对于大肠杆菌中产生的酶的柱顶端左侧开口，表明所述比例高于10。

图29为描述在不同pH和温度下用小麦阿拉伯木聚糖(WAX)测定的SEQ ID NO：307的木聚糖酶活性的图表。从酸热脂环酸芽孢杆菌(黑色柱)分离所述酶或在毕赤酵母(白色柱)中产生所述酶。没有在pH为5.5(60℃和80℃)时从酸热脂环酸芽孢杆菌分离的酶的数据。

图30为描述在不同pH和温度下用羧甲基纤维素(CMC)测定的SEQ ID NO：307的纤维素酶活性的图表。从酸热脂环酸芽孢杆菌(黑色柱)分离所述酶或在毕赤酵母(白色柱)中产生所述酶。没有在pH为5.5(60℃和80℃)时从酸热脂环酸芽孢杆菌分离的酶的数据。

图31为描述在不同pH和温度下如图29和30测定的SEQ IDNO：307的纤维素/木聚糖酶活性比的图表。从酸热脂环酸芽孢杆菌(黑色柱)分离所述酶或在毕赤酵母(白色柱)中产生所述酶。没有在pH为5.5(60℃和80℃)时从酸热脂环酸芽孢杆菌分离的酶的数据。

图32为描述在不同pH和温度下用小麦阿拉伯木聚糖(WAX)测定的缺乏C端203个氨基酸的SEQ ID NO：307的木聚糖酶活性的图表。在毕赤酵母(黑色柱)或大肠杆菌(白色柱)中产生所述酶。

图33为描述在不同pH和温度下用羧甲基纤维素(CMC)测定的缺乏C端203个氨基酸的SEQ ID NO：307的纤维素酶活性的图表。在毕赤酵母(黑色柱)或带N端组氨酸标签的大肠杆菌(白色柱)中产生所述酶。

图34为描述在不同pH和温度下如图32和33测定的缺乏C端203个氨基酸的SEQ ID NO：307的纤维素/木聚糖酶活性比的图表。在毕赤酵母(黑色柱)或大肠杆菌(白色柱)中产生所述酶。

图35为描述大肠杆菌中产生的RAAC00307(SEQ ID NO：337)的阿拉伯呋喃糖苷酶活性比的图表。示出在不同pH下在50℃(菱形)、60℃(正方形)、70℃(三角形)、80℃(“x”)、90℃(“*”)时的活性。在pH为2时，所述酶无活性。

图36为描述大肠杆菌中产生的RAAC00307(SEQ ID NO：337)的β-木糖苷酶活性比的图表。示出在不同pH下在50℃(菱形)、60℃(正方形)、70℃(三角形)、80℃(“x”)、90℃(“*”)时的活性。在pH为2时，所述酶无活性。

图37为描述毕赤酵母中产生的RAAC00307(SEQ ID NO：337)β-木糖苷酶活性比的图表。示出在不同pH下在60℃(菱形)和80℃(正方形)时的活性。

具体实施方式

如下文所述，本发明一方面部分涉及从极端微生物分离的酶，所述酶在温度高于约80℃和最适pH低于约2下显示最佳的酶活性。在本发明的其它方面，所述酶可为来源于酸热脂环酸芽孢杆菌的半纤维素酶和/或木聚糖酶，其中还将所述生物进一步鉴别为ATCC27009。如下文所讨论的酶似乎在pH约为1时显示酶活性。更进一步地，这种酶的分子量为至少约120kDa。在本发明中，所公开的酶可用于同时糖化和发酵过程和/或相继水解和发酵过程以将生物质糖转化为终产物。更进一步地，本文所述酶可用于预处理生物质浆料以降解存在于生物质浆料中的可溶于水的或不溶于水的低聚物和/或多糖，以产生终产物。

如下文所使用的术语“极端微生物”指可在人类认为极端的条件(如沸水、冰、蓄电池酸液或海洋底部)下生存并生长的生物。此类微生物的实例包括但不限于在高达235℉(113℃)的温度下生长的延胡索酸火叶菌(Pyrolobus fumarii)、在-20℃(-4℉)下存活的嗜冷杆菌(Psychrobacter cryopegella)、可在核反应堆中存活的耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)、在海平面大气压300倍的压力下生长的深海发光杆菌(Photobacterium profundum)以及在与蓄电池酸液相同的pH为0的条件下生存的干热嗜酸菌(Picrophilus torridus)。在其中可找到这些微生物的环境包括滚烫温泉、深海热泉、冰川、盐滩以及核反应堆。本发明所用微生物可从天然源和人造源获得或者从培养物贮藏所购买获得。在本发明中，在厌氧、需氧和/或微需氧条件下优选在温度高于40℃，pH低于约5时，更优选在温度高于50℃，pH低于约4时，且最优选在温度高于55℃，pH低于约3.5时进行培养。虽然培养周期随pH、温度和所用营养培养基而不同，但12小时至数天的周期通常将产生良好的结果。如本文所使用，酸热脂环酸芽孢杆菌定义为可从弗吉尼亚马纳萨斯的美国模式培养物保藏所(ATCC)获得并鉴别为酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)的微生物。

如下文所使用的用语“酶活性”指由酶引起所发生的反应。酶为所有生物体产生的蛋白质，其介导、引起和/或促进将一种化学物质变为另一种化学物质的反应而不改变或破坏其本身。在本申请的上下文中，与术语“酶活性”相结合使用的词“最佳”指使酶对于给定的最终结果最好且最快地发挥作用的最有利条件。最佳酶活性可受包括温度、pH和盐浓度在内的条件的影响。

如下文所使用的词“木聚糖酶”指使半纤维素分裂开的酶，方式是断开构成半纤维素分子主链的木糖之间的化学键，或断开半纤维素侧链上的木糖之间的键。

如下文所使用的词“多糖”应指通过化学键连在一起的糖链(可为相同的糖或不同的糖)。多糖可由这些糖的直链组成而有或无侧链。多糖的实例包括淀粉、果胶、纤维素和半纤维素。

本申请上下文中的词“水解”应指其中水与分子反应并将该分子分裂为至少两个部分的化学反应。

如下文所使用的用语“生物质糖”应指来自于生物质组分分解的糖，如纤维素和半纤维素。生物质糖的实例包括但不限于糖类、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖及其组合、低聚物和/或其修饰或取代形式。

用语“同时糖化和发酵过程”在下文应指由可经化学方法预处理或未预处理的生物质制备燃料或化学品(如乙醇)的过程，并且其中纤维素酶和/或半纤维素酶用于将生物质多糖分解为糖(糖化)；且所述糖由微生物源发酵为燃料或化学品产物(发酵)。这两个过程在同一反应器里同时发生(同时的)。

如本申请中使用的用语“终产物”在下文应指通过化学或酶促反应产生的化学品。本发明所涵盖的终产物实例包括简单糖类(如单体、二聚体、三聚体、低聚物等)、醇类、燃料和/或酶促反应的其它产物。

本发明上下文中的词“生物质”应指植物和其它木质纤维材料，如玉米秆、麦秆和木材副产品(如锯屑等)。

术语“生物质浆料的预处理”在本申请的上下文中应指生物质的制备，以用于随后将其转化为燃料，如乙醇。这种预处理包括将生物质磨成粉末或小颗粒和加水(这样形成浆料)的步骤。然后用若干方法处理该浆料，设计该若干方法以将木质素从生物质中部分或全部除去，并将半纤维素和纤维素转化为可更易于用酶(如纤维素酶和半纤维素酶)降解为其组分糖的形式。一些预处理将半纤维素降解为其组分糖，而将纤维素留下作为固体残渣的部分。因为这种处理步骤在酶促降解步骤以及将糖转化为乙醇的发酵步骤之前发生，所以称其为“预处理”。

本发明上下文中的用语“可溶于水的”应指可完全溶于水而不留任何固体残渣的化学品或其它物质。

本发明上下文中的词“半纤维素”指植物的一种组分(另外两种组分为纤维素和木质素)，这种组分由用化学键连接的直链糖(如木糖或甘露糖)构成。这种直链也有由沿着链的糖和其他化学物质组成的分支。

本发明上下文中的词“半纤维素酶”指一类可将半纤维素分裂为其组分糖和其它化学单体的酶。半纤维素酶的实例包括但不限于木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡糖苷酸酶和阿拉伯呋喃糖苷酶。

本发明上下文中的用语“相继水解和发酵过程”应指由生物质制备燃料或化学品(如乙醇)的过程，并且其中物理处理生物质或用反应的化学品或溶剂或其混合物处理生物质以除去木质素，并将生物质中存在的纤维素和半纤维素转化为其组分糖或转化为可更易于用酶(如纤维素酶和半纤维素酶)降解为其组分糖的形式。这些的实例包括研磨、磨碎、酸、碱、有机溶剂等。这些处理可在环境温度至300℃或更高的温度，环境压力至2000psig或更高的压力下进行。然后冷却溶于水中的糖，将pH调至中性，然后接着用各种微生物将糖发酵为燃料或化学品产物(发酵)。这两个过程在单独的反应器中发生，先进行水解步骤，再进行发酵步骤(例如，相继的)。

本发明上下文中的用语“培养酸热脂环酸芽孢杆菌”应指为上述微生物提供食物源(可溶或不溶木质纤维素或其它多糖或糖源)和各种溶于水的维生素和矿物质(这构成营养培养基)，为微生物提供使其生长的适当条件(温度为140℉(60℃)、pH为3.5和氧气)。

本发明上下文中的用语“分离酸热脂环酸芽孢杆菌的细胞”应包括通过如离心从营养培养基中除去细菌细胞的方法。

本发明上下文中的用语“回收并纯化半纤维素酶”应指从营养培养基中分离半纤维素酶。在本发明中，称为阳离子交换的过程用于从营养培养基中分离半纤维素酶。就这一点而言，将营养培养基(含半纤维素酶)通过阳离子交换材料泵送。当使其与阳离子交换材料接触时，半纤维素酶将其自身附于阳离子交换材料上，但营养培养基将通过。然后从阳离子交换材料上除去半纤维素酶并纯化。

本申请上下文中的用语“微生物营养培养基”指微生物(酸热脂环酸芽孢杆菌)的食物源和维生素、矿物质，均溶于水并调至微生物生长所需的pH。更具体而言，微生物营养培养基包含约1g/L的木聚糖；约10mM的NH4Cl；约5.2mM的K₂HPO₄；约0.8mM的MgSO₄-7H₂O；约1.74mM的Na₂SO₄；约25mg/L的MgCl₂；约6.6mg/L的CaCl₂；约2.0mg/L的MnSO₄；约0.5mg/L的ZnSO₄；约0.5mg/L的硼酸；约5mg/L的FeCl₃；约0.15mg/L的CuSO₄；约0.025mg/L的NaMoO₄；约0.05mg/L的CoNO₃；约0.02mg/L的NiCl₂；约0.08mg/L的盐酸吡哆辛，；约0.01mg/L的叶酸；约0.1mg/L的盐酸硫胺素；约0.04mg/L的核黄素；约0.08mg/L的烟酰胺；约0.08mg/L的对氨基苯甲酸酯；约0.01mg/L的生物素；约0.0004mg/L的氰钴胺素；约0.08mg/L的D-泛酸钙；约0.02mg/L的肌醇；约0.05mg/L的溴化胆碱；约0.02mg/L的乳清酸钠；和约0.1mg/L的亚精胺，其中所得到的营养培养基调至pH约为3.5。

本申请上下文中的词“上清液”应指在从中基本上除去细菌细胞后剩余的营养培养基。

发明人已分离并鉴定了温度和酸稳定性内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶，这两种酶在高温和低pH下显示活性，当在这些条件下长时间孵育时表现出稳定性。发明人认为，如下文所述的热和酸稳定性半纤维素酶和纤维素酶在过程中具有特殊价值或作为这些过程的辅助，这些过程一方面可导致降低之前所述预处理过程的严格程度和/或消除不同过程过程中的这些限制因素。就这一点而言，发明人从黄石国家公园和不同培养物保藏所筛选大量生物，以获得具有产生高温和低pH下均稳定的酶的能力的微生物。就这一点而言，从黄石国家公园的诺里斯间歇泉盆地(Norris Geyser Basin)的6处温泉采集水和沉淀物样本。将这些样本接种至pH为3.5并且还含有0.5g/L的燕麦木聚糖或0.5g/L的碎玉米棒的液态矿物盐培养基中。在80℃下接种后来的培养物并每天用肉眼和通过显微镜观察生长情况。更进一步地，美国模式培养物保藏所(ATCC)和德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen(DSMZ))的研究获得4种对于生长的最适温度高于约60℃，最适pH低于约4的合适的异养生物。在由ATCC或DSMZ推荐的培养基(其中用如上所述燕麦木聚糖或碎玉米棒代替碳源)中孵育这几种生物。随后在其最适生长温度和pH为3.5下孵育这些培养物。通过混浊的出现在外观上评估随后微生物的生长情况。

在此项研究中，如果在木聚糖参存在下出现生长，据推测假定半纤维素酶和/或纤维素酶活性存在。在孵育约3天后收获出现生长的培养物。通过离心从培养物中除去细胞。用具有10000MWCO膜的AMICON

超滤细胞使培养物上清液浓缩约1000-2000倍。然后用小麦阿拉伯木聚糖(从Megazyme购买获得)或羧甲基纤维素(从Sigma-Aldrich获得)进行砷钼酸盐还原糖酸测定化验(先前由Somogyi描述(，1952)，J.Biol.Chem.195：19-23)测试随后的上清液浓缩物中的半纤维素酶和纤维素酶活性。这些分别用作半纤维素酶和纤维素酶活性的底物。测定的标准条件设定为60℃和pH约3.5。参考附图将看出，在温度高达约90℃下测定半纤维素酶和纤维素酶活性，以确定酶活性的最适温度。通过用底物改变上清液浓缩物的孵育温度而修改上文提及的还原糖测定。同样地，在pH为1至约8下测定酶活性以确定酶活性的最适pH。对于这些研究，通过在适当pH缓冲液(pH为1-2，50mM马来酸钠或50mM甘氨酸；pH为2-6，50mM醋酸钠；pH为6-8，50mM磷酸钠；以及pH为8-9，50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris))中制备测定组分而修改还原糖测定。

除上述之外，通过在温度约70℃和pH为2.0下孵育上清液浓缩物而检验根据温度和pH的半纤维素酶和纤维素酶稳定性。在这点上，在浓缩物上置一层矿物油以限制在检验期间蒸发。定时收集样本并在先前所述标准测定条件下测定其半纤维素酶和纤维素酶活性。关于半纤维素酶和纤维素酶反应动力学，用不同量的小麦阿拉伯木聚糖或羧甲基纤维素进行还原糖测定而确定。在60℃和pH为3.5时测定反应动力学。通过用可通过SynexChem获得的ENZYMEKINETICS PRO^TM进行非线性分析计算Michaelis-Menten参数Vmax和Km。在以上提到的过程后，发明人鉴别酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC27009)以进一步检验。

随后，通过浓缩无细胞的培养物材料进行粗酶制备。后来的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-page gel)显示出5条主带和若干次带。后来计算的大量这些条带与报道的其它木聚糖酶和纤维素酶一致。如图19、20、21、22所见，发明人发现从酸热脂环酸芽孢杆菌(本文鉴别为ATCC27009分离的酶的酶活性(木聚糖酶和纤维素酶)最适温度约为80℃。如图19所见，将相对酶活性与从另一种类似微生物嗜热真菌(T.lanuginosus)分离的类似酶所提供的酶活性形成对比。进一步地，人们发现分离的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶在低至1的pH下显示酶活性，最适pH为2，而纤维素酶活性的最适pH约为4，尽管纤维素酶在低至2的pH下确实显示一些活性。图22显示木聚糖酶活性为pH的函数，如上所述。就发明人所知，先前报道的最低最适半纤维素酶pH是关于Collins(2005，FEMS，Micro.Review，29(1)：3-23)。可以想像已分离的该水溶性内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶可能在pH低于1时具有活性，然而目前，还原糖测定试剂在pH低于1时不稳定。另一研究显示当在70℃和pH为2孵育时，新分离的半纤维素酶和纤维素酶显示活性并未降低。上述研究引导发明人推断酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)能够在木聚糖基质上生长，并且还产生细胞外半纤维素酶和纤维素酶活性，二者均溶于水并在pH约为2时表现出显著的半纤维素酶活性，并且分子量至少约为120kDa。再次见图22。

现有技术公开已从白曲霉(Aspergillus kawachii)中纯化并鉴定了酸稳定性木聚糖酶，白曲霉的最适pH为2.0，最适温度在50℃至60℃之间(Purification and Properties of Acid Stable Xylanases fromAspergillus kawachii，K.Ito，H.Ogasawara，T.Sugomoto和T.Ishikawa，Bioscience Biotechnology and Biochemistry 56(4)：547-550，1992年4月)。另外，已报道若干木聚糖酶的最适pH为4至5，并且已报道大量木聚糖酶的最适温度高达100℃。然而，就发明人所知，如下文所述的酶是第一种已知在本文所要求的如此低的pH和如此高的温度下有活性的酶。除上述之外，发明人意识到已从同种生物，即酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)中纯化了木聚糖酶，据报道酸热脂环酸芽孢杆菌具有与之有关的木聚糖酶活性。据报道这种酶的最适pH为4.0，且最适温度约为80℃。就这一点而言，来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)的嗜热嗜酸内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶(celB)显示出与属于糖苷水解酶族51的阿拉伯呋喃糖苷酶的高度序列相似性(K.Eckert和E.Schneider，European Journal of Biochemistry，270(17)：3593-3602，2003年9月)。通过研究如下所示的SEQ ID NO：307可最好地了解如现有技术参考中所述的前述纤维素酶前体。

1   MKRPWSAALA ALIALGTGAS PAWAAAHPSP KVPAGAAGRV

    RAADVVSTPI

51  SMEIQVIHDA LTVPELAAVQ AAAQAASNLS TSQWLQWLYP

    NATPTTSAQS

101 QAAQAVANLF NLATYGAVST RGSNAAQILQ TLQSISPLLS

    PRAVGLFYQS

151 FLTEIGQSSK AILARQASSS IVGNALAQAA  SLSPTISAYL

    RQNGLSPSDL

201 ARTWSSFETQ VDPQGAAQTA LATRICTNAL GFGAPTASAT

    ITVNTAARLR

251 TVPATAFGLN AAVWDSGLNS QTVISEVQAL HPALIRWPGG

    SISDVYNWET

301 NTRNDGGYVN PNDTFDNFMQ FVNAVGASPI ITVNYGTGTP

    QLAADWVKYA

351 DVTHHDNVLY WEIGNEIYGN GYYNGNGWEA DDHAVPNQPQ

    KGNPGLSPQA

401 YAQNALQFIQ AMRAVDPNIK IGAVLTMPYN WPWGATVNGN

    DDWNTVVLKA

451 LGPYIDFVDV HWYPETPGQE TDAGLLADTD QIPAMVAELK

    REINAYAGSN

501 AKNIQIFVTE TNSVSYNPGQ QSTNLPEALF LADDLAGFVQ

    AGAANVDWWD

551 LLNGAEDNYT SPSLYGQNLF GDYGLLSSGQ ATPKGVQEPP

    QYTPLPPYYG

601 FQLVSDFARP GDTLLGSASS QSDIDVHAVR EPNGDIALML

    VNRSPSTIYS

651 ADLNVLGVGP YAITKALVYG EGSSAVSPAL TLPTAHSVKL

    MPYSGVDLVL

701 HPLIPAPHAA ASVTDTLALS SPTVTAGGSE TVTASFSSDR

    PVRDATVELE

751 LYDSTGDLVA NHEMTGVDIA PGQPVSESWT FAAPAANGTY

    TVEAFAFDPA

801 TGATYDADTT GATITVNQPP AAKYGDIVTK NTVITVNGTT

    YTVPAPDASG

851 HYPSGTNISI APGDTVTIQT TFANVSSTDA LQNGLIDMEV

    DGQNGAIFQK

901 YWPSTTLLPG QTETVTATWQ VPSSVSAGTY PLNFQAFDTS

    NWTGNCYFTN

951 GGVVNFVVN

在本发明的某些实施方案中，SEQ ID NO：307可被糖基化。在更多的实施方案中，SEQ ID NO：307可至少在174、193、297、393和404位被糖基化。

关于本发明，从极端微生物分离的新酶具有包括如下所示SEQID NO：326的N端序列：

DVVSTPISMEIQV。

要注意该酶的N端序列与SEQ ID NO：307的第44-56位对齐/对应。

在本发明中，本发明所涵盖的从极端微生物分离的酶包括在以下提供的SEQ ID NO：327中所见的酶：

QASSSIVGNALAQAASLSPTISAYLRQNGLSPSDLARTWSSYYCTQFDDPQGAAQTALATRICNDQALGGGAPTASATITVNTAAR。

应理解该SEQ ID NO：327与SEQ ID NO：307中所见celB序列的第166-248位对齐/对应。应注意，SEQ ID NO：327包括分别在第207、208、212、229和231位上的变化的氨基酸和在第209、213和230位上的添加的氨基酸。

在本发明中，可通过研究以下的SEQ ID NO：328进一步鉴定和最好地了解本发明的所述酶：

GLNAAVWDSGLNSQTVISEVQALHPALIRWPGGSISDMDYNWETNTR

应理解SEQ ID NO：328与SEQ ID NO：307的第258-304位对齐/对应。应注意到SEQ ID NO：328在第295位有变化的氨基酸，且在第296位有附加的氨基酸。

在本发明中，本发明所涵盖的酶进一步包括如下所见的SEQ IDNO：329：

EADDHAVPNQPQKGNPGLSPQAYAQNALQFMQSPVVYYR。

SEQ ID NO：329与SEQ ID NO：307的第379-415位对齐/对应。应理解，相对于之前的SEQ ID NO：307，该SEQ ID NO：329分别在第409、411和413位的氨基酸有变化。更进一步地，附加的氨基酸分别位于第412、414和415位。

在上文提到的对Eckert和Schneider的现有技术参考中，可以看出为了确定具有多糖降解活性的细胞外嗜热嗜酸酶类的存在，已经对酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)进行了研究。作者提到发现生物利用多种多糖(包括木聚糖)作为唯一的碳源和能源。然而，作者未能检测到培养物上清液中的木聚糖酶活性。作者假定细胞相关酶并成功地用Triton

X-100从完整细胞中提取了具有相关木聚糖降解活性的纤维素降解活性。作者观察到即使在培养物到了生长稳定期之后，纤维素降解活性及其相关的木聚糖酶活性仍保持与细胞结合。相反，从本发明的极端微生物分离的，在温度等于或高于80℃和pH低于2时显示最佳酶活性的酶被认为是水溶性的，并且还已经从细胞上清液分离。

本发明还指向一种制备半纤维素酶的方法，所述方法包括以下步骤：提供酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)源；在有上清液的微生物营养培养基中培养酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)；从营养培养基上清液中分离酸热脂环酸芽孢杆菌的细胞；以及从营养培养基上清液回收并纯化来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC 27009)的半纤维素酶。所述方法产生水溶性半纤维素酶，此酶在pH低于约2和温度高于约80℃时显示显著的酶活性。在所述方法中，半纤维素酶包括如SEQ IDNOS：326、327、328和/或329中描述的序列。更进一步地，在所述方法中，所用营养培养基进一步包括约1g/L的木聚糖、约10mM的NH₄Cl、约5.2mM的K₂HPO₄、约0.8mM的MgSO₄-7H₂O、约1.74mM的Na₂SO₄、约25mg/L的MgCl₂、约6.6mg/L的CaCl₂、约2.0mg/L的MnSO₄、约0.5mg/L的ZnSO₄、约0.5mg/L的硼酸、约5mg/L的FeCl₃、约0.15mg/L的CuSO₄、约0.025mg/L的NaMoO₄、约0.05mg/L的CoNO₃、约0.02mg/L的NiCl₂、约0.08mg/L的盐酸吡哆辛、约0.01mg/L的叶酸、约0.1mg/L的盐酸硫胺素、约0.04mg/L的核黄素、约0.08mg/L的烟酰胺、约0.08mg/L的对氨基苯甲酸酯、约0.01mg/L的生物素、约0.0004mg/L的氰钴胺素、约0.08mg/L的D-泛酸钙、约0.02mg/L的肌醇、约0.05mg/L的溴化胆碱、约0.02mg/L的乳清酸钠和约0.1mg/L的亚精胺，其中所得到的营养培养基调至pH约为3.5。如本申请之前所讨论的，该酶可用于各种过程。因此，如上所述方法包括以下步骤：为同时糖化和发酵过程提供回收并纯化的半纤维素酶以便使生物质多糖转化为终产物。使用上文提到的酶的过程包括用回收并纯化的半纤维素酶或粗酶制剂预处理生物质浆料的步骤以降解生物质浆料中存在的低聚物和/或多糖而生成终产物，该粗酶制剂由含有大部分由半纤维素酶组成的蛋白质的生物制得。

可采用使用上文所述酶的其它可能方法。例如，从极端微生物分离的酶可用于水解多糖的方法中，所述方法包括以下步骤：提供来源于极端微生物的水溶性半纤维素酶；和在pH低于约2时用水溶性半纤维素酶对多糖进行水解。正如之前所讨论的，水溶性半纤维素酶在约80℃的温度下有最佳酶活性。

操作

本发明的所述实施方案的操作被认为是显而易见的，就此进行简单概述。

正如所述，通过分别研究SEQ ID NOS：327-329最好了解从极端微生物分离的在温度为约80℃和pH低于约2时显示最佳酶活性的酶。已分离的酶用于处理生物质的方法中，所述方法包括以下步骤：提供具有生物质糖的生物质源；用来源于酸热脂环酸芽孢杆菌(ATCC27009)的水溶性半纤维素酶预处理生物质以产生终产物。在该方法中，生物质糖包含多糖，而半纤维素酶水解多糖。如上文所讨论的，半纤维素酶在pH低于约2和温度高于约80℃时显示酶活性。

如本发明所涵盖的半纤维素酶的分子量约为120kDa。在上文所述的方法中，该方法包括附加步骤：在有或无半纤维素酶存在下预处理生物质；提供相继水解和发酵过程以将生物质糖转化为终产物；以及向相继水解和发酵过程供给半纤维素酶以便使生物质糖转化为终产物。在如上文所讨论的可在有或无半纤维素酶存在下以更低的严格程度进行的预处理生物质的步骤之后，所述方法包括另一步骤：提供同时糖化和发酵过程以将生物质糖转化为终产物；和向同时糖化和发酵过程供给半纤维素酶以便使生物质糖转化为终产物。

因此，可见上文所述酶和方法避免了在此之前采用的现有技术酶和实践带有的许多缺点，进一步提供产生各种所需终产物而同时降低预处理步骤的严格程度的便利方法，该预处理步骤倾向于产生多种有害废物以及因需要高温、高压和大量酸而增加整个过程的成本从而达到高预处理严格程度。

本发明的实施方案包括翻译后修饰蛋白质的方法。在某些实施方案中，可用分离的或部分纯化的糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白、包含糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的细胞提取物和/或在包含一种或多种糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的细胞中进行翻译后修饰。糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白可为(不限于)以下种类：UDP β-葡萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖转移酶和糖基转移酶。在某些实施方案中，糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白可为嗜热嗜酸生物的糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白。嗜热嗜酸菌的实例包括但不限于酸热脂环酸芽孢杆菌和那些属于酸菌属(Acidianus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、除硫叶菌属(Desulfurolobus)、憎叶菌属(Stygiolobus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、硫代谢球菌属(Sulfurisphaera)、硫磺球形菌属(Sulfurococcus)、热原体属(Thermoplasma)、嗜苦菌属(Picrophilus)的生物。糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白的实例包括但不限于SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273和290所提供的糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白，以及可从NCBI购买的登记号为XP_002490630.1、Q54IL5.1、ABN66322.2、XP_002493240.1、XP_002491463.1、XP_002491326.1、CAY71061.1、NP_344219.1、NP_343051.1、ACR41289.1、ACP37471.1、NP_111396.1、NP_111382.1、NP_394039.1、NP_394183.1、YP_023099.1、P_023093.1、AAT43750.1和AAT42890.1的糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白。本发明的实施方案还包括根据本发明的方法糖基化的蛋白质。此类蛋白质的实例包括但不限于糖基化形式的蛋白质SEQ ID NOS：307、331、333、335、337和338。

本发明的实施方案包括改变来自嗜热嗜酸菌的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的物理和/或动力学性质的方法。在某些实施方案中，通过内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的翻译后修饰来改变来自嗜热嗜酸菌的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的纤维素酶活性与木聚糖酶活性比。在一些实施方案中，翻译后修饰可为糖基化。在更多的实施方案中，通过内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的翻译后修饰来改变来自嗜热嗜酸菌的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的溶解性。在一些实施方案中，内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶为酸热脂环酸芽孢杆菌的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶。在更多的实施方案中，内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶为celB(SEQ ID NO：307)。

本发明的实施方案包括通过SEQ ID NO：307的糖基化来改变SEQ ID NO：307的纤维素酶活性与木聚糖酶活性之比。(作为非限制性实例)可通过在能够糖基化SEQ ID NO：307的生物中表达编码SEQID NO：307的序列、使SEQ ID NO：307与有糖基化活性的酶或产生有糖基化活性的酶的细胞接触或现有技术中已知的方法来进行SEQ IDNO：307的糖基化。

在本发明更多的实施方案中，内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的纤维素酶活性与木聚糖酶活性之比可根据翻译后修饰的程度和位置而改变。在一些实施方案中，(作为非限制性实例)可通过利用有糖基化活性的不同酶、能够使蛋白质糖基化的不同细胞、糖基化的不同化学方法，和/或改变糖基化活性的量或与内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶接触的时间来操纵翻译后修饰的程度和位置。在一些实施方案中，内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的翻译后修饰引起在酸性pH下木聚糖酶活性升高。在一些实施方案中，(作为非限制性实例)在pH低于约5，pH约为5、3.5和2时，与未修饰形式的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶相比，修饰形式的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的木聚糖酶活性升高。

在一些实施方案中，内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶的翻译后修饰引起在酸性pH下更高的溶解性。在一些实施方案中，(作为非限制性实例)在pH低于约5，pH约为5、3.5和2时，修饰形式的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶比未修饰形式的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶更易溶。

本发明的实施方案包括与嗜热嗜酸菌酸热脂环酸芽孢杆菌的蛋白质的糖基化和/或翻译后修饰有关的基因和相关蛋白质。由通过对酸热脂环酸芽孢杆菌的基因组测序产生的序列信息确定与这些过程有关的基因的编码序列。这些基因和蛋白质可代表酸热脂环酸芽孢杆菌或其它生物的代谢工程的目标。表1中列出了在酸热脂环酸芽孢杆菌的基因组中发现的核苷酸序列及由其编码的与蛋白质的糖基化和/或翻译后修饰相关的氨基酸的非限制性实例。糖基转移酶和/或翻译后修饰蛋白可为(不限于)以下种类：UDPβ-葡萄糖磷酸转移酶、多萜醇磷酸甘露糖转移酶和糖基转移酶等等。

本发明的实施方案部分涉及包括酸热脂环酸芽孢杆菌的基因和/或蛋白质在内的基因序列和/或蛋白质序列。所包括的基因和蛋白质为在蛋白质的糖基化和/或翻译后修饰中起作用的那些。事实上胞内酶活性可为嗜热的和/或嗜酸的，并且文献中描述了类似基因的一般实例。基因、序列、酶和因子的种类包括但不限于表1所列的那些。

本发明涉及包含酸热脂环酸芽孢杆菌基因组的分离和/或纯化的核苷酸序列的核苷酸序列，所述分离和/或纯化核苷酸序列选自序列SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340或其片段之一。

本发明同样涉及分离的和/或纯化的核苷酸序列，其特征在于包含至少一个以下核苷酸序列：a)序列SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340中的至少一个核苷酸序列；b)与a)中定义的核苷酸序列同源的核苷酸序列；c)与a)或b)中定义的核苷酸序列互补的核苷酸序列，以及其相应RNA的核苷酸序列；d)能在严格条件下与如a)、b)或c)中定义的序列杂交的核苷酸序列；e)包括如a)、b)、c)或d)中所定义的序列的核苷酸序列；和f)经如a)、b)、c)、d)或e)中所定义的核苷酸序列修饰的核苷酸序列。

根据本发明将核苷酸、多核苷酸或核酸序列理解为指呈单体和二聚(称为“串联”)形式的双链或单链核酸和所述核酸的转录产物。

本发明的多个方面涉及可能从分离方法(例如，离子交换层析、通过根据分子大小排斥，或通过亲和力，或可选地，基于在不同溶剂中的溶解性的分级分离技术)开始，或从基因工程方法(如扩增、克隆和亚克隆)开始已分离、纯化或部分纯化的核苷酸序列，对于本发明序列可能由载体携带。

根据本发明所述的分离的和/或纯化的核苷酸序列片段将被理解为指定酸热脂环酸芽孢杆菌基因组的任一核苷酸片段，并且可包括(作为非限制性实例)长度至少为8、12、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000或更长的产生该核苷酸序列的连续核苷酸序列。

根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列的特异性片段将被理解为指定酸热脂环酸芽孢杆菌基因组的任一核苷酸片段，与酸热脂环酸芽孢杆菌基因组序列的相应片段比对和比较之后，该核苷酸片段具有至少一个不同性质的核苷酸或碱基。

在本发明意义上的同源的分离和/或纯化的核苷酸序列被理解为指与根据本发明的核苷酸序列的碱基至少有一定比例同一性的分离和/或纯化的核苷酸序列，所述比例至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％或99.7％，该百分比为纯统计学上的，并且可能在随机的两个核苷酸序列之间和核酸全长上分布不同。

在本发明意义上的特异性同源核苷酸序列被理解为指具有如上所定义的特异性片段的至少一个核苷酸序列的同源核苷酸序列。所述“特异性”同源序列可包括例如与基因组序列相对应的序列或与其表示酸热脂环酸芽孢杆菌的基因组变异体的片段的序列相对应的序列。因此这些特异性同源序列与酸热脂环酸芽孢杆菌株内与突变有关的变化相对应，尤其与截短、取代、缺失和/或添加至少一个核苷酸相对应。所述同源序列可同样对应于和遗传密码简并性有关的变化。

术语“序列同源程度或百分比”指如本申请中所定义的“在最佳比对后两个序列之间序列同一性的程度和百分比”。

当如下所述比对最大一致性时，如果两个序列中的氨基酸或核苷酸残基的序列相同，则两个氨基酸或核苷酸序列被称为“相同”。两个(或多个)肽或多核苷酸之间的序列比较通常通过比较一段或“比较窗”上的两条最佳比对序列的序列进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。可通过Smith和Waterman，Ad.App.Math 2：482(1981)的局部同源算法、Neddleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源比对算法、Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85：2444(1988)的相似性研究方法、通过计算机实现这些算法(Genetics Computer Group(GCG)公司Wisconsin Genetics SoftwarePackage(威斯康星遗传学软件包)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，575 Science Dr.，Madison，Wis.)或通过肉眼观察进行序列比较的最佳比对。

通过在比较窗上比较两个最佳比对序列来确定“序列同一性的百分比”(或同一性程度)，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不含有添加或缺失)相比，比较窗中的肽或多核苷酸序列的部分可包含添加或缺失(即，空隙)。该百分比的计算方式为：确定两序列中出现同一氨基酸残基或核酸碱基的位置数以产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗中的总位数，以及结果乘以100以获得序列同一性的百分比。

上文给出的序列同一性定义是本领域技术人员会使用的定义。该定义本身并不需要借助于任何算法，所述算法仅有助于实现最佳序列比对而对序列同一性计算无用。

从以上给出的定义得出，存在为两比较序列之间的序列同一性而明确定义的唯一值，所述值与为最优或最佳比对而获得的值相对应。

在BLAST N或BLAST P“BLAST 2序列”中，发明人和技术人员通常习惯使用网站ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html上可用的软件比较和确定两序列间的同一性，取决于要比较的序列长度的空隙成本(gapcost)直接由软件选定(即，对于长度＞85的取代矩阵BLOSUM-62为11.2)。

本发明序列的互补核苷酸序列被理解为指其核苷酸与本发明所述序列的核苷酸互补且其方向相反(反义序列)的任何DNA。

在严格条件下与根据本发明的核苷酸序列的杂交被理解为指以使得在两个互补DNA片段之间维持杂交的方式选择的温度和离子强度条件下的杂交。

举例说明，为了定义以上所述核苷酸片段，杂交步骤的更严格条件正好如下。

在SSC缓冲液存在下，在优选温度为65℃下进行杂交，1x SSC相当于0.15M NaCl和0.15M柠檬酸钠。例如，洗涤步骤可如下：2xSSC，在环境温度下用2x SSC洗涤两次后，在65℃下用0.5％的SDS洗涤；2x 0.5x SSC，0.5％的SDS；在65℃下各洗涤10min。

分别在2x SSC缓冲液存在下采用(例如)42℃的温度的中等严格条件和在2x SSC缓冲液存在下采用37℃的温度的低严格条件对于两序列之间的杂交需要普遍较不明显的互补性。

根据1989年Sambrook等的教义，本领域技术人员使以上所述对于具有约350个碱基大小的多核苷酸的严格杂交条件适用于更大或更小的寡核苷酸。

在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列中是可在获得根据本发明所述的同源序列的方法中用作引物或探针的核苷酸序列。这些方法，如聚合酶链式反应(PCR)、核酸克隆和测序为本领域技术人员所熟知。

在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列中，又是首选的可在诊断SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340，其片段之一或如下所定义的其变异体之一的存在的方法中用作引物或探针的核苷酸序列。

，例如可通过特异性扩增(如PCR)或在用根据本发明的核苷酸序列的适当限制酶消化后获得根据本发明所述的核苷酸序列片段，1989年Sambrook等人的文章中详细地描述了这些方法。同样可根据本领域普通技术人员所熟知的方法通过化学合成获得这种代表性片段。

经修饰的核苷酸序列应被理解为指根据本领域技术人员所熟知的技术通过诱变获得的任何核苷酸序列，并且相对于根据本发明的正常序列含有修饰，例如在多肽表达的调控序列和/或启动子序列中的突变，尤其导致所述多肽的表达速度发生变化或复制周期发生调整。

同样，经修饰的核苷酸序列被理解为指编码如下所定义的经修饰的多肽的任何核苷酸序列。

本发明涉及核苷酸序列，其包括分离的和/或纯化的酸热脂环酸芽孢杆菌核苷酸序列，其特征在于选自SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340或其片段之一。

本发明的实施方案同样涉及分离的和/或纯化的核苷酸序列，其特征在于包括选自以下的核苷酸序列：a)核苷酸序列SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339、340或其片段之一中的至少一种；b)如a)中定义的序列的特异性片段的核苷酸序列；c)与a)或b)中定义的序列至少有80％同一性的同源核苷酸序列；d)与a)、b)或c)中定义的序列对应的的互补核苷酸序列或RNA序列；以及e)经a)、b)、c)或d)中定义的序列修饰的核苷酸序列。

在根据本发明的分离的和/或纯化的核苷酸序列中是核苷酸序列SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340或其片段和与序列SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340或其片段的至少一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％或99.7％同一性的同源性的任何分离的和/或纯化核苷酸序列。所述同源序列可包括(例如)与酸热脂环酸芽孢杆菌基因组序列对应的序列。同样地，这些特异性同源序列可与酸热脂环酸芽孢杆菌株内与突变有关的变化相对应，尤其与至少一个核苷酸的截短、取代、缺失和/或添加相对应。对于本领域普通技术人员显而易见的是，用标准技术和公用计算机程序(如BLAST)易于产生和鉴定此类同系物。同样地，以上提及的各同系物应视为如本文前面所述并且应全面描述。

本发明的实施方案包括根据本发明的核苷酸序列或其片段编码的分离的和/或纯化的多肽，其序列用片段表示。与分离的和/或纯化的多肽相对应的氨基酸序列可由序列SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340中的至少一个的的3个可能阅读框之一编码。

本发明的实施方案同样涉及分离的和/或纯化的多肽，其特征在于包括选自至少一个氨基酸序列SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337、338或其片段之一的多肽。

在根据本发明的实施方案的分离的和/或纯化的多肽中为氨基酸序列SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338或其片段的分离的和/或纯化的多肽，或与序列SEQ IDNOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338或其片段的至少一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％或99.7％同一性的同源性的任何其它分离的和/或纯化的多肽。对于本领域普通技术人员显而易见的是，用标准技术和公用计算机程序(如BLAST)易于产生和鉴定此类同系物。同样地，以上提及的各同系物应视为如本文前面所述并且应全面描述。

本发明的实施方案也涉及多肽，其特征在于包括选自以下的多肽：a)根据本发明的氨基酸序列的多肽的至少5个氨基酸的特异性片段；b)与a)中定义的多肽同源的多肽；c)如a)或b)中定义的多肽的特异性生物活性片段；以及d)经如a)、b)或c)中定义的多肽修饰的多肽。

在目前的描述中，术语多肽、肽和蛋白质可互换。

在本发明的一些实施方案中，可使根据本发明的分离的和/或纯化的多肽糖基化、聚乙二醇化和/或进行另外的翻译后修饰。在更多的实施方案中，糖基化、聚乙二醇化和/或另外的翻译后修饰可在体内或体外发生和/或可用化学技术进行。在另外的实施方案中，任何糖基化、聚乙二醇化和/或另外的翻译后修饰可为N-连接或O-连接。

在本发明的的一些实施方案中，根据本发明的分离的和/或纯化的多肽的任何一种可在温度等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90和/或95℃时有酶活性或功能活性，和/或在pH等于、低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0时有酶活性或功能活性。在本发明更多的实施方案中，根据本发明的分离的和/或纯化的多肽可能需要糖基化、聚乙二醇化和/或另外的翻译后修饰以在pH等于或低于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0时，或在温度等于或高于约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90和/或95℃时有酶活性或功能活性。

本发明的方方面面涉及通过纯化从天然源分离或获得的多肽，或者通过基因重组获得的多肽，或者通过化学合成获得的多肽，因此这些多肽可能含有以下将描述的非天然氨基酸。

根据本发明的实施方案的“多肽片段”被理解为指定含有至少5个连续氨基酸，优选10个连续氨基酸或15个连续氨基酸的多肽。

在本发明中，“特异性多肽片段”被理解为指定由根据本发明的核苷酸序列的特异性片段编码的连续多肽片段。

“同源多肽”将被理解为指定相对于天然多肽具有某些修饰的多肽，这些修饰例如尤其是至少一个氨基酸的缺失、添加或取代、截短、延长、嵌合融合和/或突变。在同源多肽中，优选的多肽的氨基酸序列与根据本发明的多肽的氨基酸序列具有至少80％或90％同源性。

“特异性同源多肽”将被理解为指定如上文定义的同源多肽并且具有根据本发明的多肽的特异性片段。

在取代的情况下，一个或多个连续或非连续氨基酸被“当量”氨基酸取代。措辞“当量”氨基酸此处针对指定能够被具有基本结构的氨基酸中的一个取代但基本上不改变相应肽的生物活性的任一氨基酸，并且以致“当量”氨基酸将按以下定义。对于本领域普通技术人员显而易见的是，用标准分子生物技术和公用计算机程序(如BLAST)易于产生和鉴定这种取代。同样地，以上提及的各个取代应视为如本文前面所述并且应全面描述。可根据当量氨基酸与其取代的氨基酸的结构同源性或能够实现的不同多肽之间生物活性对比试验的结果来确定这些当量氨基酸。

作为非限制性实例，将提到能够实现而不会导致相应修饰多肽的生物活性大量改变的取代的可能性，例如由缬氨酸或异亮氨酸替换亮氨酸、由谷氨酸替换天门冬氨酸、由天冬酰胺替换谷氨酰胺、由赖氨酸替换精氨酸等，在相同条件下可设想反向取代。

在另一实施方案中，取代限制为具有经鉴定的类似酶活性的其它蛋白质中的非保守氨基酸的取代。例如，本领域的普通技术人员可比对类似生物中具有相同功能的蛋白质，并确定在具有该功能的蛋白质中通常保守的氨基酸。在网上worldwideweb.charite.de/bioinf/strap/结合由NCBI提供的数据库获得可用于产生这种比对的程序的一个实例。

因此，根据本发明的一个实施方案，可在具有该功能的蛋白质中通常保守的位置进行取代或突变。在另一实施方案中，可突变或取代核酸序列以致其编码的氨基酸不变(简并取代和/或突变)和/或突变或取代以致在具有该功能的蛋白质中通常保守的位置进行任何所得到的氨基酸的取代或突变。

特异性同源多肽同样与如以上定义的特异性同源核苷酸序列编码的多肽对应，因此在目前的定义中特异性同源多肽包括突变的或与变异体对应的多肽，该变异体可存在于酸热脂环酸芽孢杆菌中，并且尤其与至少一个氨基酸残基的截短、取代、缺失和/或添加相对应。

根据本发明实施方案的“多肽的特异性生物活性片段”尤其将被理解为指定如以上定义、具有根据本发明的多肽的至少一个特征的特异性多肽。在某些实施方案中，所述肽能够起表1所列至少一种类型的蛋白质的作用。

根据本发明实施方案的多肽片段可对应酸热脂环酸芽孢杆菌中天然存在的分离或纯化片段或对应可通过用蛋白水解酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶或胶原酶)或化学试剂(如溴化氰(CNBr))裂解所述多肽获得的片段。正如化学合成，同样也可从由根据本发明的表达载体转化的宿主容易地制备这种多肽片段，所述表达载体含有使所述片段表达的核酸且在适当调节和/或表达元件控制下放置。

根据本发明的实施方案的多肽的“经修饰多肽”被理解为指定如以下将描述的通过基因重组或化学合成获得的，相对于正常序列至少有一处修饰的多肽。这些修饰对根据本发明的多肽的特异性和/或活性起源或结构构造、定位的起源和膜插入能力的起源的氨基酸可能有影响或可能没有影响。因此可能产生当量的、活性增加或降低的和当量的、特异性更窄或更广的多肽。在经修饰多肽之中，有必要提到其中多达5个或更多氨基酸可被修饰，在N或C端截短或者甚至缺失或添加的多肽。

本领域的普通技术人员熟知使对真核细胞或原核细胞的调节进行证明的方法。同样很好理解例如通过根据本发明和以下所述的载体可能将编码所述经修饰多肽的核苷酸序列用于所述调节。

可通过用组合化学获得上述经修饰的多肽，其中在模型、细胞培养物或微生物上测试所述多肽之前，可能系统地改变部分多肽，(例如)以选择最具活性或具有所寻性质的化合物。

化学合成同样具有能使用非天然氨基酸或非肽键的优点。

因此，为了延长根据本发明的多肽的寿命，可能有兴趣使用非天然氨基酸(如D形式)或其它氨基酸类似物(例如特别是含硫形式)。

最后，可能将根据本发明的多肽的结构，其特异性或经修饰的同源形式整合到多肽类型或其它类型的化学结构中。因此，可能有兴趣在N端和C端提供蛋白酶不能识别的分子。

编码根据本发明的多肽的核苷酸序列同样是本发明的一部分。

本发明同样涉及可用作引物或探针的核苷酸序列，其特征在于所述序列选自根据本发明的核苷酸序列。

众所周知，在各实施方案中，本发明同样涉及由核苷酸序列编码的酸热脂环酸芽孢杆菌的特异性多肽，该特异性多肽能够从天然多肽中通过纯化获得，通过基因重组获得或经由本领域技术人员熟知的程序通过化学合成获得，并且如以下所具体描述。同样地，本发明还包括标记或未标记的单克隆抗体或多克隆抗体，其针对所述核苷酸序列编码的所述特异性多肽。

另外，本发明的实施方案涉及将根据本发明的核苷酸序列作为引物或探针用于检测和/或扩增核酸序列。

因此，根据本发明实施方案的核苷酸序列可尤其通过PCR技术(聚合酶链式反应)用于扩增核苷酸序列(Erlich，1989；Innis等，1990；Rolfs等，1991；以及White等，1997)。

有利地，这些寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸引物长度至少为8个核苷酸，优选为至少12个核苷酸，并且甚至更优选为至少20个核苷酸。

靶核酸的其它扩增技术可有利地用作PCR的备选方案。

本发明的核苷酸序列，尤其根据本发明的引物同样可用在扩增靶核酸的其它方法中，如：1989年Kwoh等描述的TAS技术(Transcription-based Amplification system(转录依赖的扩增系统))；1990年Guatelli等描述的3SR技术(Self-Sustained SequenceReplication(自主序列复制))；1991年Kievitis等描述的NASBA技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification(依赖核酸序列的扩增技术))；SDA技术(Strand Displacement Amplification(链置换扩增))(Walker等，1992)；以及TMA技术(Transcription MediatedAmplification(转录介导扩增))。

本发明的多核苷酸还可用在用作探针的核酸的扩增技术或修饰技术中，如：1988年Landegren等描述且于1991年Barany等改进的采用热稳定的连接酶的LCR技术(Ligase Chain Reaction(连接酶链式反应))；1992年Segev描述的RCR技术(Repair Chain Reaction(修复链式反应))；1990年Duck等描述的CPR技术(Cycling ProbeReaction(循环探针反应))；1983年Miele等描述，并且尤其是1986年由Chu等改进术，1988年由Lizardi等改进，然后由Burg等改进，以及1996年由Stone等改进的使用Q-β复制酶的扩增技术。

在待检测靶多核苷酸可能为RNA(如mRNA)的情况中，在采用借助于根据本发明的至少一个引物进行扩增反应之前，或在采用借助于本发明的至少一个探针进行检测过程之前，将可能使用逆转录酶类型的酶以便从生物样本中所含的RNA获得cDNA。因此，获得的cDNA将作为根据本发明的扩增或检测过程中采用的引物或探针的靶标。

可按照检测探针与靶序列或由靶序列产生的扩增子杂交的方式选择检测探针。作为序列，有利的是这样的探针具有至少12个核苷酸的序列，尤其具有至少20个核苷酸的序列，以及优选具有至少100个核苷酸的序列。

本发明的实施方案还包括可用作根据本发明的探针或引物的核苷酸序列，其特征在于用放射性化合物或非放射性化合物进行标记。

虽然通常用放射性同位素(32P、35S、3H、125I)或非放射性分子(生物素、乙酰氨基芴、地高辛、5-溴脱氧尿苷、荧光素)标记序列以获得可大量应用的探针，但未标记的核苷酸序列也可直接用作探针或引物。

例如，法国专利第7810975号或1988年Urdea等或Sanchez-Pescador等描述了核苷酸序列的非放射性标记的实例。

在后一种情况下，还可能用法国专利申请公布No.FR-2422956和No.FR-2518755中描述的标记方法中的一种。

可以多种方式实施杂交技术(Matthews等，1988)。最普通的方法在于将细胞的核酸提取物固定在支持物上(如硝化纤维、尼龙、聚苯乙烯)并在明确条件下孵育带探针的固定靶核酸。杂交后，除去过量探针并用适当的方法检测形成的杂交分子(测量与探针有关的放射性、荧光或酶活性)。

在各实施方案中，本发明同样包括根据本发明的核苷酸序列，特征在于该核苷酸序列共价或非共价地固定在支持物上。

根据采用根据本发明的核苷酸序列的另一有利模式，后者可固定在支持物上，因此可用来通过特异性杂交捕获从待测生物样本获得的靶核酸。必要时，将支持物和样本分开，然后借助于第二探针(用易检测元素标记的通常所说的检测探针)检测所述捕获探针和靶核酸之间形成的杂交复合物。

本发明的另一方面是用于序列的克隆和/或表达的载体，其特征在于含有根据本发明的核苷酸序列。

根据本发明的载体同样是本发明的一部分，所述载体其特征在于含有使所述核苷酸序列在确定的宿主细胞中整合、表达和/或分泌的元件。

那么，所述载体可包含启动子、翻译起始和终止信号以及适当的转录调控区域。所述载体可能能够在宿主细胞中保持稳定，并可任选地具有表示所翻译蛋白质的分泌的特殊信号。可根据所用宿主细胞选择这些不同的元件。为此，可将根据本发明的核苷酸序列插入所选宿主中的自主复制载体或所选宿主的整合载体中。

根据本领域技术人员当前使用的方法制备此类载体，并且可能通过标准方法(如脂质转染、电穿孔和热冲击)将由此产生的克隆引入适当宿主中。

根据本发明的载体为例如源自质粒或病毒的载体。用于表达本发明的多肽的载体的实例为杆状病毒。

这些载体用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的核苷酸序列。

本发明同样包括用根据本发明的载体转化的宿主细胞。

可获得这些细胞，方式是将插入如以上定义的载体的核苷酸序列引入宿主细胞，然后在使该转染的核苷酸序列复制和/或表达的条件下培养所述细胞。

宿主细胞可选自原核细胞或真核体系，如细菌细胞(Olins和Lee，1993)，但同样地，酵母细胞(Buckholz，1993)以及植物细胞(如拟南芥)和动物细胞，尤其是哺乳动物细胞的培养物(Edwards和Aruffo，1993)(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，但同样地，其中可能使用采用杆状病毒的方法的昆虫细胞，如Sf9昆虫细胞(Luckow，1993)。

本发明的实施方案同样涉及包含根据本发明的转化细胞之一的生物。

根据本发明的表达一个或多个酸热脂环酸芽孢杆菌基因或部分基因的转基因生物可根据本领域技术人员熟知的方法(如病毒转染或非病毒转染)在例如大鼠、小鼠或兔中获得。可能在本质上普遍存在的或对一种组织有选择性的强启动子的控制下通过转染所述基因的多个拷贝获得表达一个或多个所述基因的转基因生物。同样可能通过在胚细胞株中同源重组，将这些细胞株转至胚胎，在生殖系水平选择受影响的嵌合体，并且使所述嵌合体生长而获得转基因生物。

根据本发明所述的转化细胞以及转基因生物可用于制备重组多肽的方法中。

现今，可能用由根据本发明的表达载体转化的细胞或用根据本发明的转基因生物通过基因工程相对大量地产生重组多肽。

制备本发明重组形式的多肽的方法其本身包括在本发明内，其特征在于采用载体和/或由根据本发明的载体转化的细胞和/或包含一个根据本发明的所述转化细胞的转基因生物。

如本文所使用的“转化”和“经转化”涉及将核酸引入细胞，不管是原核细胞或真核细胞。而且，本文所使用的“转化”和“经转化”无需涉及生长控制或生长反调节。

在所述制备本发明重组形式的多肽的方法中，制备方法采用载体和/或经所述载体转化的细胞和/或包含一个所述转化细胞的转基因生物，均含有编码酸热脂环酸芽孢杆菌多肽的根据本发明的核苷酸序列。

根据本发明实施方案的变异体可由产生与“载体”蛋白(嵌合蛋白)融合的重组多肽组成。该体系的优点在于可稳定和/或减少重组产物的蛋白质水解、在体外复性过程中提高溶解性和/或当融合伴侣对特异性配体有亲和力时简化纯化。

更具体地，本发明的实施方案涉及制备本发明的多肽的方法，包括以下步骤：a)在使根据本发明的核苷酸序列的重组多肽表达的条件下培养转化细胞；b)若需要，回收所述重组多肽。

当制备本发明多肽的方法采用根据本发明的转基因生物时，那么从所述生物提取重组多肽。

本发明的实施方案还涉及能够通过如先前描述的本发明的方法获得的多肽。

在另一个实施方案中，本发明还包括制备合成多肽的方法，特征在于其使用根据本发明的多肽的氨基酸序列。

本发明的另一个实施方案同样涉及通过根据本发明的方法获得的合成多肽。

根据本发明实施方案的多肽同样可通过多肽合成领域的常规技术制备。可在均匀溶液或固相内进行这种合成。

例如，可借助于1974年Houben-Weyl描述的在均匀溶液中合成的技术。

这种合成方法包括按所需顺序依次两个两个地缩合连续氨基酸，或按适当顺序缩合氨基酸和先前形成的已包含若干氨基酸的片段，或按这种方式缩合先前制备的若干片段，应了解必须预先保护这些氨基酸或片段携带的所有反应功能，除其它的酮基和羧基的胺功能之外或反之亦然，根据肽合成中熟知的方法，特别是在激活羧基功能后，这些功能通常必须参与肽键的形成。

也可借助于Merrifield描述的技术。

为了根据Merrifield方法制成肽链，借助于极多孔的聚合树脂，其中链的第一个C端氨基酸固定在该聚合树脂上。该氨基酸通过其羧基固定在树脂上并且其胺功能受到保护。因此将要形成肽链的氨基酸相继地固定在已形成的肽链部分的氨基上，该氨基每次预先去保护，且将该氨基酸附着于树脂上。当整条期望的肽链已形成，除去形成肽链的不同氨基酸的保护基并借助于酸将肽和树脂分离。

另外，本发明涉及具有至少一个根据本发明的多肽和能够诱导人或动物免疫反应的多肽序列的杂交多肽。

有利地，抗原决定簇为能够诱导体液和/或细胞反应。

对于这种决定簇而言，可能包括根据本发明的糖基化、聚乙二醇化和/或其它翻译后修饰形式的多肽，使用这些形式的多肽是为了获得能够诱导合成针对多个表位的抗体的免疫原性组合物。

这些杂交分子可部分由根据本发明的多肽载体分子或其片段结合可能产生免疫性的部分形成，该可能产生免疫性的部分尤其是白喉毒素、破伤风毒素的表位，乙型肝炎病毒的表面抗原(法国专利7921811)、脊髓灰质炎病毒的VP1抗原或任何其它病毒或细菌毒素或抗原。

杂交分子的合成方法包括基因工程中用于构造编码所寻多肽序列的杂交核苷酸序列的方法。例如，可能便于参考获得编码1984年Minton描述的融合蛋白的基因的技术。

所述编码杂交多肽的杂交核苷酸序列以及根据本发明的杂交多肽特征在于它们是通过表达所述杂交核苷酸序列而获得的重组多肽，其同样是本发明的一部分。

本发明同样包括特征在于含有一个所述杂交核苷酸序列的载体。用所述载体转化的宿主细胞、包括一个所述转化细胞的转基因生物以及用所述载体、所述转化细胞和/或所述转基因生物制备重组多肽的方法当然同样是本发明的一部分。

根据本发明的多肽、以下描述的根据本发明的抗体和根据本发明的核苷酸序列可方便地用于在能含有酸热脂环酸芽孢杆菌的样本中检测和/或鉴定酸热脂环酸芽孢杆菌的方法中。这些根据本发明的将使用的多肽、抗体和核苷酸序列的特异性的方法将尤其能够检测和/或鉴定酸热脂环酸芽孢杆菌。

根据本发明的多肽可方便地用于在能含有酸热脂环酸芽孢杆菌的样本中检测和/或鉴定酸热脂环酸芽孢杆菌的方法中，特征在于包括以下步骤：a)使该样本与根据本发明的多肽或其一个片段接触(在使所述多肽和生物样本中可能存在的抗体之间发生免疫反应的条件下)；b)证明可能形成的抗原-抗体复合物。

任何常规方法可用于执行所述可能形成的抗原-抗体复合体的检测。

作为实例，根据ELISA技术，根据各实施方案的方法通过免疫荧光法或放射免疫测定法(RIA)或其等效方法发挥免疫酶法(immunoenzymatic process)的作用。

因此，本发明同样涉及根据本发明的借助适当标记标签(如酶、荧光或放射性类型)标记的多肽。

此类方法包括例如以下操作：在微量滴定板的孔内沉淀定量的根据本发明的多肽组合物；将逐渐加倍稀释的血清或生物样本(除先前定义的必须分析的生物样本外)引入所述孔内；孵育微量滴定板；将针对猪免疫球蛋白的标记抗体引入微量滴定板的孔内，这些抗体的标记已借助酶进行，该酶选自能够通过至少在确定波长(如550nm)下改变底物的辐射吸收而水解底物的那些酶；通过与对照试验比较，检测水解底物的量。

根据本发明实施方案的多肽使得能够制备特征在于特异性识别根据本发明的多肽的单克隆或多克隆抗体。有利地，可能根据1975年Kohler和Milstein描述的技术由杂交瘤制备单克隆抗体。例如，可能通过用根据本发明的多肽或DNA，连同免疫反应的佐剂使动物(尤其是小鼠)免疫，然后纯化亲和层析柱上免疫动物血清中所含的特异性抗体制备单克隆抗体，其中用作抗原的多肽已预先固定在亲和层析柱上。也可通过在亲和层析柱上纯化受酸热脂环酸芽孢杆菌免疫激发的动物的血清中所含的抗体或根据本发明的多肽或片段来制备根据本发明的多克隆抗体，其中根据本发明的多肽已预先固定在亲和层析柱上。

在各实施方案中，本发明同样涉及单克隆抗体或多克隆抗体或其片段或嵌合抗体，其特征在于能够特异性识别根据本发明的多肽。

本发明实施方案的抗体同样可能按先前为本发明的核酸探针描述的相同方式标记，如酶、荧光或放射性类型的标记。

另外，本发明的实施方案针对检测和/或鉴定样本中酸热脂环酸芽孢杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：a)使样本与根据本发明的单克隆抗体或多克隆抗体接触(在使所述抗体和生物样本中可能存在的酸热脂环酸芽孢杆菌的多肽之间发生免疫反应的条件下)；b)证明可能形成的抗原-抗体复合物。

本发明同样涉及检测和/或鉴定样本中酸热脂环酸芽孢杆菌的方法，其特征在于采用根据本发明的核苷酸序列。

更具体地，本发明涉及检测和/或鉴定样本中酸热脂环酸芽孢杆菌的方法，其特征在于包括以下步骤：a)如果必要的话，从待分析样本分离DNA；b)借助于至少一个或一对根据本发明的引物特异性扩增样本的DNA；c)证明扩增产物。

例如，这些可通过利用根据本发明的核酸探针的分子杂交技术检测。这种探针便于用非放射性(低温探针)或放射性同位素标记。

对于本发明的目的，“生物样本的DNA”或“生物样本中所含的DNA”将被理解为指所考虑的生物样本中存在的DNA，或所述生物样本中存在的RNA在逆转录酶类作用之后可能获得的cDNA。

本发明的另一个实施方案包括一种方法，其特征在于包括以下步骤：a)使根据本发明的核苷酸探针与生物样本接触，如果必要的话，在使探针和样本的DNA杂交的条件下预先使生物样本中所含的DNA易于进行杂交；b)证明核苷酸探针和生物样本的DNA之间形成的杂种。

本发明还涉及根据本发明实施方案的方法，其特征在于包括以下步骤：a)使固定在根据本发明的支持物上的核苷酸探针与生物样本接触，如果必要的话，在使探针和样本的DNA杂交的条件下预先使生物样本的DNA易于进行杂交；b)，如果必要的话，在除去未与探针杂交的生物样本DNA之后，使固定在支持物上的核苷酸探针和生物样本中所含的DNA之间形成的杂种与根据本发明标记的核苷酸探针；c)证明步骤b)中形成的新型杂种。

根据先前定义的检测和/或鉴定方法的有利实施方案，其特征在于在步骤a)之前，先借助于至少一个根据本发明的引物扩增生物样本的DNA。

方法的实施方案包括用第二多肽糖基化或翻译后修饰第一多肽，该第二多肽选自与SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338至少有90％序列同一性的多肽。

方法更多的实施方案包括调节蛋白质稳定性、溶解性、降解性、活性和/或第一个多肽的外化的方法，所述方法包括通过第二多肽糖基化或翻译后修饰第一多肽，该第二多肽选自与SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338至少有90％序列同一性的多肽。

方法更多的实施方案包括将生成或编码纯化的和/或分离的重组核苷酸序列和/或纯化的和/或分离的重组多肽的细胞置于温度等于或高于约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃和/或95℃和/或pH等于、低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0的环境下，所述纯化的和/或分离的重组核苷酸序列包括核苷酸序列，其选自与序列SEQ IDNOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340中的至少一个有至少90％序列同一性的核苷酸序列，纯化的和/或分离的重组多肽选自与序列SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338的至少一个有至少90％序列同一性的多肽。

本发明提供经基因改造而具有改变的产生所表达蛋白质的能力的细胞。具体地，本发明涉及革兰氏阳性微生物，如目标蛋白表达增强的杆菌属(Bacillus)，其中一个或多个染色体基因已失活，和/或其中一个或多个染色体基因从杆菌染色组缺失。在一些另外的实施方案中，一个或多个固有染色体区域从相应野生型杆菌宿主染色体中缺失。在更多实施方案中，杆菌为脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus sp.)或酸热脂环酸芽孢杆菌。

在另外的实施方案中，在温度等于或高于约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃和/或95℃和/或pH等于、低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0时通过纯化的和/或分离的重组核苷酸序列和/或纯化的和/或分离的重组多肽糖基化和/或翻译后修饰多肽的方法，所述纯化的和/或分离的重组核苷酸序列包括核苷酸序列，其选自与序列SEQ IDNOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340的至少一个有至少90％序列同一性的核苷酸序列，纯化的和/或分离的重组多肽选自与序列SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338的至少一个有至少90％序列同一性的多肽。

在本发明的一些实施方案中，任一根据本发明的分离的和/或纯化的多肽可在温度等于或高于约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃和/或95℃时有酶活性或功能活性，和/或在pH等于、低于和/或高于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0时有酶活性或功能活性。在本发明更多的实施方案中，根据本发明的分离的和/或纯化的多肽可能需要糖基化、聚乙二醇化和/或其它翻译后修饰以在pH等于或低于8、7、6、5、4、3、2、1和/或0或在温度等于或高于约25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃和/或95℃时有酶活性或功能活性。

以下说明性实施例中更详细地描述了本发明。尽管实施例可能仅代表本发明的所选实施方案，但应了解以下实施例是说明性的而并非限制性的。

实施例

实施例1：用来自酸热脂环酸芽孢杆菌的核苷酸和氨基酸序列糖基化

在SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340中提供从酸热脂环酸芽孢杆菌分离的分别编码多肽SEQ IDNOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338的核苷酸序列。用本领域的标准技术将核苷酸序列SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340置于表达载体中。然后将载体置于细胞中，如细菌细胞或真核细胞(如Sf9细胞或CHO细胞)。连同细胞中存在的正常机构，包含SEQ ID NOS：2、19、36、53、70、87、104、121、138、155、172、189、206、223、240、257、274、291、332、334、336、339和340的载体产生多肽SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338。然后分离和/或纯化多肽SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338。然后各自证明分离的和/或纯化的多肽SEQ IDNOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290、307、331、333、335、337和338具有表1所提供的一种或多种活性或一些其它活性。

证明分离的和/或纯化的多肽SEQ ID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290具有连同其它蛋白质或细胞组分使其它蛋白质糖基化的活性。

实施例2：用来自酸热脂环酸芽孢杆菌的核苷酸和氨基酸序列调节蛋白质稳定性、溶解性、降解性、活性和/或第一多肽的外化

实施例1的多肽和核苷酸序列用于通过糖基化或其它翻译后修饰而翻译后修饰一种或多种其它蛋白质。证明，与相同或相似氨基酸序列的未修饰蛋白质相比，经修饰蛋白质具有改变的的蛋白质稳定性、溶解性、降解性、活性和/或外化。

实施例3：酸热脂环酸芽孢杆菌的糖基化蛋白

通过以下方案获得多肽RAAC02676(SEQ ID NO：307)。在小麦阿拉伯木聚糖上培养酸热脂环酸芽孢杆菌并在3天后收获。离心培养物以除去细胞，并用0.22μm过滤器过滤所得到的上清液以除去任何残余碎片。用超滤通过分子量为10,000Da的截留膜将过滤后的上清液浓缩至约1mL。另外，再次纯化所得到经浓缩过滤的上清液，方式是捕捉阳离子交换柱上的蛋白质，用盐梯度洗提蛋白质，将其再装至另一阳离子交换柱上，并且用另一盐梯度洗提。将样本集中并在12％SDS-PAGE凝胶上进行电泳。从凝胶上剪下单独条带，进行凝胶胰蛋白酶消化。然后洗提肽片段，并在C-18柱上分离，其通过电喷射注入离子阱质谱仪。通过MASCOT运行质谱，MASCOT比较所观测的谱和由已知蛋白质序列产生的理论谱。MASCOT允许使用者指定蛋白质中可能存在的修饰并寻找与这些修饰相符的谱。MASCOT鉴定大量如以下表2提供的从RAAC02676消化的可能被糖基化的多肽。

如表2中可见，查询94、96、221、332、333、337和400返回期望的RAAC02676上的N-连接糖基化。表2中的所有片段均为SEQID NO：307(RAAC02676)的片段。O-连接糖基化也是所期望的。

表2

实施例4：来自酸热脂环酸芽孢杆菌的蛋白质的糖蛋白染色

在小麦阿拉伯木聚糖上培养酸热脂环酸芽孢杆菌并在3天后收获。离心培养物以除去细胞，并用0.22μm过滤器过滤所得到的上清液以除去任何残余碎片。用超滤通过分子量为10,000Da的截留膜将过滤后的上清液浓缩至约1mL。用标准方案将若干道该浓缩材料与阳性对照和阴性对照一起在12％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，该阳性对照和阴性对照为已知糖基化或非糖基化蛋白。垂直地将凝胶切为两半，一半用SIMPLY BLUE^TM SAFE STAIN染色，另一半用来自Sigma的糖蛋白检测试剂盒染色。阳性对照和阴性对照均用SIMPLYBLUE^TM SAFE STAIN染色，且仅阳性对照用指示染色方案正确操作的糖蛋白染色剂染色。SIMPLY BLUE^TM染色的凝胶上，酸热脂环酸芽孢杆菌蛋白质道显示约120kDa的条带，这是酸热脂环酸芽孢杆菌细胞外蛋白质的预期重量。在糖蛋白染色凝胶的相同位置显示粉红色条带，指示糖基化蛋白的阳性结果。

实施例5：SEQ ID NO：307的化学糖基化引起更高的木聚糖酶活性

在大肠杆菌中表达SEQ ID NO：307并用Co-树脂体系进行纯化。改变编码SEQ ID NO：307的核酸用于大肠杆菌中的最佳密码子用途。用单(乳糖氨基)单(琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(mono(lactosylamido)mono(succinimidyl)suberate)对纯化的SEQ ID NO：307进行化学糖基化。这种化学物质与蛋白质上的胺基进行化学反应以在蛋白质上形成末端带有乳糖的N-连接修饰。用糖基化染色剂检验纯化的SEQ IDNO：307的糖基化。在pH为2、3.5和5时测试纯化的糖基化和非糖基化SEQ ID NO：307的木聚糖酶活性。在pH为2和3.5时，糖基化SEQ ID NO：307比非糖基化形式的SEQ ID NO：307的活性水平高。非糖基化SEQ ID NO：307在pH为2和3.5时显示溶解性降低。

实施例6：SEQ ID NO：307在毕赤酵母中的表达

将编码SEQ ID NO：307的核酸插入毕赤酵母中，并且若干克隆在pH为3.5时具有显著的木聚糖酶和纤维素活性，而在pH为2时不具活性。改变编码SEQ ID NO：307的核酸用于毕赤酵母中的最佳密码子用途。

实施例7：比较酸热脂环酸芽孢杆菌和大肠杆菌中表达的SEQ IDNO：307的木聚糖酶和纤维素酶活性

将编码SEQ ID NO：307的核酸插入带N-端组氨酸标签的大肠杆菌中，且纯化合成的蛋白质。改变编码SEQ ID NO：307的核酸用于大肠杆菌中的最佳密码子选择。所得到的纯化蛋白质未糖基化。也从酸热脂环酸芽孢杆菌中纯化蛋白质SEQ ID NO：307。对于由酸热脂环酸芽孢杆菌生成的蛋白质，按惯例使从这种生物纯化的蛋白质糖基化。用小麦阿拉伯木聚糖(WAX)测试纯化蛋白质的木聚糖酶活性。比较结果呈现于图23。没有在pH为5.5时从酸热脂环酸芽孢杆菌纯化的酶的数据。如图23中可见，在pH为2且温度为80℃时酸热脂环酸芽孢杆菌纯化酶(黑色柱)的木聚糖酶活性显著高于大肠杆菌纯化酶(白色柱)。

也用羧甲基纤维素(CMC)测试纯化蛋白质的纤维素酶活性。比较结果呈现于图24。没有在pH为5.5时从酸热脂环酸芽孢杆菌纯化的酶的数据。如图24中可见，在pH为3.5时酸热脂环酸芽孢杆菌纯化酶(黑色柱)的纤维素酶活性显著低于大肠杆菌纯化酶(白色柱)。

图25呈现图23和24中呈现的数据的纤维素/木聚糖酶活性比。如本文所见，在pH为2且温度为80℃时，从酸热脂环酸芽孢杆菌纯化的酶主要具有木聚糖酶活性，而在其它所有测试条件(黑色柱)下主要具有纤维素活性。在所有测试条件(白色柱)下，从大肠杆菌纯化的酶主要具有纤维素活性。该数据证实SEQ ID NO：307的糖基化状态改变SEQ ID NO：307的相对木聚糖酶活性和纤维素活性。

实施例8：大肠杆菌和毕赤酵母中表达的SEQ ID NO：307的木聚糖酶和纤维素酶活性的比较

将编码SEQ ID NO：307的核酸插入毕赤酵母中并纯化所得的蛋白质。改变编码SEQ ID NO：307的核酸用于毕赤酵母中的最佳密码子用途。对于由毕赤酵母生成的蛋白质，按惯例使从这种生物纯化的蛋白质糖基化。将编码SEQ ID NO：307的核酸插入带N-端组氨酸标签的大肠杆菌中，并纯化所得的蛋白质。改变编码SEQ ID NO：307的核酸用于大肠杆菌中的最佳密码子用途。所得到的纯化蛋白质未糖基化。用小麦阿拉伯木聚糖测试纯化蛋白质的木聚糖酶活性。比较结果呈现于图26中。如图26中可见，在所有条件下(除了在pH为3.5且温度为80℃时)毕赤酵母纯化酶(黑色柱)的木聚糖酶活性显著高于大肠杆菌纯化酶(白色柱)。

也用羧甲基纤维素测试纯化蛋白质的纤维素酶活性。比较结果呈现于图27中。如图27中可见，在60℃下毕赤酵母纯化酶(黑色柱)具有明显较高的纤维素酶活性，而在80℃下大肠杆纯化酶(白色柱)显示明显较高的纤维素酶活性。

图28呈现图26和27中呈现的数据的纤维素/木聚糖酶活性比。如本文所见，在所有条件下(除了在pH为2且温度为80℃时)，从毕赤酵母纯化的酶主要具有纤维素酶活性。在所有测试条件下，从大肠杆菌纯化的酶主要具有纤维素活性。该数据证实SEQ ID NO：307的糖基化状态改变SEQ ID NO：307的相对木聚糖酶活性和纤维素活性。

实施例9：比较酸热脂环酸芽孢杆菌和毕赤酵母中表达的SEQ IDNO：307的木聚糖酶和纤维素酶活性

将编码SEQ ID NO：307的核酸插入毕赤酵母中并纯化合成的蛋白质。改变编码SEQ ID NO：307的核酸用于毕赤酵母中的最佳密码子用途。对于由毕赤酵母产生的蛋白质，按惯例使从这种生物纯化的蛋白质糖基化。还从酸热脂环酸芽孢杆菌中纯化蛋白质SEQ IDNO：307。对于由酸热脂环酸芽孢杆菌产生的蛋白质，按惯例使从这种生物纯化的蛋白质糖基化。用小麦阿拉伯木聚糖测试纯化蛋白质的木聚糖酶活性。比较结果呈现于图29中。没有在pH为5.5时从酸热脂环酸芽孢杆菌纯化的酶的数据。如图29中可见，在pH为2和3.5且温度为80℃时酸热脂环酸芽孢杆菌纯化酶(黑色柱)的木聚糖酶活性显著高于毕赤酵母纯化酶(白色柱)。

也用羧甲基纤维素测试纯化蛋白质的纤维素酶活性。比较结果呈现于图30中。没有在pH为5.5时从酸热脂环酸芽孢杆菌纯化的酶的数据。如图30中可见，在所有条件下(除了在pH为3.5且温度为80℃时)，酸热脂环酸芽孢杆菌纯化酶(黑色柱)的纤维素酶活性显著低于毕赤酵纯化酶(白色柱)。

图31呈现图29和30中呈现的数据的纤维素/木聚糖酶活性比。如本文所见，在pH为2且温度为80℃时，从酸热脂环酸芽孢杆菌纯化的酶主要具有木聚糖酶活性，而在所有其它测试条件下主要具有纤维素活性(黑色柱)。在pH为2且温度为80℃时，从毕赤酵母纯化的酶也主要具有木聚糖酶活性，而在所有其它测试条件下主要具有纤维素酶活性(白色柱)。该数据证实SEQ ID NO：307的糖基化状态改变SEQ ID NO：307的相对木聚糖酶活性和纤维素活性。

实施例10：比较大肠杆菌和毕赤酵母中表达的截短SEQ ID NO：307的木聚糖酶和纤维素酶活性

将编码无203个C端氨基酸的截短SEQ ID NO：307的核酸插入带C端组氨酸标签的毕赤酵母中，并纯化合成的蛋白质。改变编码SEQ ID NO：307的核酸用于毕赤酵母中的最佳密码子用途。对于由毕赤酵母产生的蛋白质，按惯例使从这种生物纯化的蛋白质糖基化。将编码无203个C端氨基酸和N端33个前导序列氨基酸的截短SEQ IDNO：307的核酸插入大肠杆菌中，并纯化合成的蛋白质。改变编码SEQID NO：307的核酸用于大肠杆菌中的最佳密码子用途。所得到的纯化蛋白质未糖基化。用小麦阿拉伯木聚糖测试纯化蛋白质的木聚糖酶活性。比较结果呈现于图32中。如图32中可见，在60℃的所有条件下毕赤酵母纯化酶(黑色柱)具有显著较高的木聚糖酶活性，而在80℃的所有条件下大肠杆菌纯化酶(白色柱)具有较高的木聚糖酶。

也用羧甲基纤维素测试纯化蛋白质的纤维素酶活性。比较结果呈现于图33中。如图33中可见，在温度为60℃且pH为3.5和5.5时毕赤酵母纯化酶(黑色柱)具有显著较高的纤维素酶活性，而在所有其它条件下大肠杆菌纯化酶(白色柱)显示较高的纤维素酶活性。

图34呈现图32和33中呈现的数据的纤维素/木聚糖酶活性比。如本文所见，在所有条件下两种纯化酶均主要具有纤维素酶活性。

实施例11：大肠杆菌和毕赤酵母中表达的SEQ ID NO：338的活性

在大肠杆菌和毕赤酵母中均表达RAAC00568(SEQ ID NO：338)。对于具体的生物，优化在编码DNA中的密码子用途。在大肠杆菌中，所表达的酶主要为内含体。少量酶是可溶的并且能够通过固定金属亲和层析(IMAC)经由组氨酸标签纯化。在pH为6.0且温度为60℃时测试该纯化酶的α-葡糖苷酶和α-木糖苷酶活性，并且发现无活性。还做了若干尝试使内含体溶解，并未产生活性蛋白质。在毕赤酵母中，表达可溶性酶并通过IMAC纯化。这种酶在pH为5.5且温度为60℃时有α-葡糖苷酶和α-木糖苷酶活性。这些结果证明RAAC00568的表达体系和糖基化状态可改变酶的溶解性和活性。实施例12：大肠杆菌和毕赤酵母中表达的SEQ ID NO：337的活性

在大肠杆菌和毕赤酵母中均表达RAAC00307(SEQ ID NO：337)。对于具体的生物，优化在编码DNA中的密码子用途。通过固定金属亲和层析(IMAC)经由组氨酸标签纯化大肠杆菌产生的酶。测试这种酶的α-阿拉伯呋喃糖苷酶(AFS)活性以及β-木糖苷酶(BXYL)活性。测试结果呈现于图35-37中。在毕赤酵母中，表达可溶性酶并通过IMAC纯化。

大肠杆菌表达的AFS的最适条件为pH为6.0，温度为70℃，而BXYL的最适条件为pH为5.0，温度在70℃和80℃之间(图35和36)。在pH为2.0时，酶没有AFS或BXYL活性(图35和36)。在pH为2、3.5和5.5且温度为60℃和80℃时，筛选毕赤酵母表达的酶。结果呈现于图37。表达期间毕赤酵母所进行的糖基化修饰似乎将活性改变至更低pH。在pH为3.0且温度为60℃时，毕赤酵母表达的酶中的BXYL为10.8U/mg，而对于大肠杆菌表达的酶而言仅有1.1U/mg。在pH为2.0时，毕赤酵母表达的酶也有一些活性，而对于大肠杆菌表达的酶而言没有活性。这些结果证明RAAC00307的表达体系和糖基化状态可能改变其活性。

虽然已在某些实施方案的上下文中描述了本发明，但可在本发明精神和范围内进一步修改本发明。因此，本申请旨在涵盖使用其一般原理的本发明的任何变化、使用或改编。进一步地，本申请旨在涵盖如本发明所属领域已知或惯例中的相对于本公开内容的背离，其受所附权利要求及其法律等效物的限制。

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Claims (25)

1.一种分离的和/或纯化的糖基化蛋白，其中所述糖基化蛋白包括SEQ ID NO：307。

2.一种改变极端酶的酶活性的方法，所述方法包括：

使所述极端酶与能够使所述极端酶糖基化的分离的和/或纯化的酶或化学体系进行流体接触；以及

使所述极端酶糖基化。

3.根据权利要求2所述的方法，其中从生物中分离和/或纯化能够使所述极端酶糖基化的所述分离的和/或纯化的酶。

4.根据权利要求3、9、10、13、18和22任一项所述的方法，其中所述生物选自酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。

5.根据权利要求2、9和10任一项所述的方法，其中所述极端酶为嗜热嗜酸菌的极端酶。

6.根据权利要求2、9和10任一项所述的方法，其中所述极端酶选自SEQ ID NOS：307、337和338。

7.根据权利要求2、9和10任一项所述的方法，其中与非糖基化形式的极端酶相比，所述极端酶具有改变的纤维素酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶活性。

8.根据权利要求2、9和10任一项所述的方法，其中在选自低于约5、约3.5和约2的pH下，或在选自低于约90℃、约80℃、约70℃、约60℃和约50℃的温度下，与非糖基化形式的极端酶相比，所述糖基化极端酶具有改变的纤维素酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶活性。

9.一种改变极端酶的酶活性的方法，所述方法包括：

使所述极端酶与能够使所述极端酶糖基化的生物细胞提取物进行流体接触；以及

使所述极端酶糖基化。

10.一种改变极端酶的酶活性的方法，所述方法包括：

为能够表达所述极端酶并使所述极端酶糖基化的生物提供编码所述极端酶的核酸；以及

由所述生物产生糖基化形式的极端酶。

11.根据权利要求10和22任一项所述的方法，其中所述编码蛋白质的核酸进一步包含分泌信号。

12.一种通过根据权利要求2、9和10任一项所述的方法产生的分离的和/或纯化的极端酶。

13.一种翻译后修饰目标蛋白质的方法，所述方法包括：

使目标蛋白质与从能够使所述目标蛋白质糖基化的生物分离的糖基转移酶进行流体接触。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述糖基转移酶选自SEQID NOS：1、18、35、52、69、86、103、120、137、154、171、188、205、222、239、256、273、290的糖基转移酶。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述目标蛋白质为极端酶。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述极端酶选自SEQ IDNOS：307、331、333、335、337和338。

17.根据权利要求13、18和22任一项所述的方法，其中所述翻译后修饰包括糖基化。

18.一种翻译后修饰目标蛋白质的方法，所述方法包括：使目标蛋白质与嗜热嗜酸生物的细胞提取物进行流体接触。

19.根据权利要求18和22任一项所述的方法，其中所述嗜热嗜酸生物为酸热脂环酸芽孢杆菌。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述目标蛋白质为嗜热嗜酸菌的酶。

21.根据权利要求18和22任一项所述的方法，其中所述目标蛋白质选自SEQ ID NOS：307、331、333、335、337和338。

22.一种使目标蛋白质糖基化的方法，所述方法包括：

为嗜热嗜酸生物提供编码所述目标蛋白质的核酸；以及

在所述嗜热嗜酸生物中产生所述目标蛋白质。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述目标蛋白质为嗜热嗜酸菌的内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶。

24.一种通过根据权利要求13、18和22所述的方法的任意一种产生的分离的和/或纯化的蛋白质。

25.一种分离的和/或纯化的糖基化蛋白，其中所述蛋白选自SEQID NOS：307、331、333、335、337和338。

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