CN105316302B - 属于gh12家族的超耐热性内切葡聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种超耐热性内切葡聚糖酶，其具有由下列(A)、(B)或(C)构成的内切葡聚糖酶催化区域：(A)由序列号3或序列号11所示氨基酸序列构成的多肽；(B)由序列号3或序列号11所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在110℃且pH4.0的条件下具有以羧甲基纤维素为底物的水解活性的多肽；(C)由与序列号3或序列号11所示氨基酸序列具有70％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在110℃且pH4.0的条件下具有以羧甲基纤维素为底物的水解活性的多肽。

Description

属于GH12家族的超耐热性内切葡聚糖酶
技术领域
本发明涉及一种超耐热性内切葡聚糖酶、编码上述超耐热性内切葡聚糖酶的多核苷酸、用于表达上述超耐热性内切葡聚糖酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体、以及使用上述超耐热性内切葡聚糖酶的木质纤维素分解产物的制造方法。
本申请要求基于2014年8月4日在日本提交的特愿2014-158651号申请的优先权，并在本文中引用其内容。
背景技术
除了对运输用能源供应的担忧之外，由于全球变暖和大气污染等环境上的问题，近年来，石油替代能源的开发成为非常重要的课题。植物生物质是地球上最丰富的可再生能源，作为石油替代资源而备受期待。作为植物生物质的主要成分的木质纤维素为纤维素或半纤维素(包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖)等多糖类、木质素、以及果胶等。这些多糖类被各种糖苷水解酶水解为葡萄糖或木糖等单糖后，用作生物燃料或化学品原料。
具有复杂结构的木质纤维素是难分解性的，难以用单一的酶分解、糖化(水解)。因此，对于多糖类中的纤维素的水解，通常需要糖苷水解酶中的内切葡聚糖酶(内切-1,4-β-D-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)、外切型内切葡聚糖酶(1,4-β-纤维二糖糖苷酶(cellobiosidase)或内切葡聚糖酶，EC 3.2.1.91)、β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)这三种酶。另一方面，半纤维素包含木聚糖、阿拉伯聚糖和甘露聚糖等，其构成因植物的种类而异。例如，在阔叶树和草本植物中，木聚糖构成了主要成分。对于木聚糖的水解，需要木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶，EC3.2.1.8)、β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)。
在传统的以木质纤维素为资源制造生物乙醇时，以乙醇的高能效转化为目的，尝试了基于高固液比(30～60％的固液比(solid loading))的糖化处理。这种基于高固液比的木质纤维素的酶糖化由于生物质糖化液的粘性高，难以进行木质纤维素的水解反应。于是，通过使用耐热性酶在例如80℃以上的高温下进行木质纤维素的酶解糖化处理，除了加快水解反应速度之外，降低了生物质糖化液的粘性，从而有望缩短糖化反应时间并成功降低酶量。因此，对于各种糖苷水解酶，期望开发耐热性更优异的酶。
大多数耐热性糖苷水解酶可以通过如下方式获得：对生存于高温环境下的嗜热性微生物进行分离鉴定，从这些分离培养的微生物中克隆基因，确定DNA序列后，利用大肠杆菌或丝状真菌等表达耐热性糖苷水解酶。对于可用于高温下的木质纤维素糖化处理的耐热性酶、特别是纤维素的水解所需要的内切葡聚糖酶，出于木质纤维素的分解和纸浆加工等目的，迄今为止，从嗜热性细菌、丝状真菌、古细菌等中分离了大量内切葡聚糖酶(例如参照专利文献1～4、非专利文献1和2)。进一步尝试了制作宿主生物的突变体、或者改变这些酶的氨基酸序列的一部分等，以提高比活性和耐热性(例如参照非专利文献3、4)。然而，这些酶的最适温度几乎全部为60～80℃，期望其耐热性的进一步提高。另一方面，作为超高超耐热性内切葡聚糖酶，报道了最适温度超过90℃的超高超耐热性内切葡聚糖酶(例如参照专利文献5～7、非专利文献1和5)。根据非专利文献5，虽然报道了硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)中的最适温度为95℃的内切葡聚糖酶，但其比活性在90℃为5.5U/mg蛋白质，并不高。上述酶还具有木聚糖酶活性，但木聚糖酶的比活性在90℃也低至4.0U/mg蛋白质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2003/0054539号说明书
专利文献2：美国专利申请公开第2005/0070003号说明书
专利文献3：美国专利申请公开第2003/0129723号说明书
专利文献4：美国专利申请公开第2005/0215450号说明书
专利文献5：特开第2003-210182号公报
专利文献6：特开第2014-27928号公报
专利文献7：美国专利申请公开第2002/0102699号说明书
非专利文献
非专利文献1：Ando等，《Applied and Environmental Microbiology(应用与环境微生物学)》，2002年，第68卷，第430-433页。
非专利文献2：Shi等，《Bioresource Technology(生物资源技术)》，2013年，第142卷，第338-344页。
非专利文献3：Zhang等，《Journal of Biotechnology(生物技术杂志)》，1997年，第57卷，第101-113页。
非专利文献4：Telke等，《PLoS One(科学公共图书馆〃综合杂志)》，2013年，第8卷，第e65727页。
非专利文献5：Maurelli等，《Extremophiles(极端微生物)》，2008年，第12卷，第689-700页。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种至少在110℃且pH4.0的条件下表现出以羧甲基纤维素(下文有时简称为CMC)为底物的水解活性的新的超耐热性内切葡聚糖酶、编码上述超耐热性内切葡聚糖酶的多核苷酸、用于表达上述超耐热性内切葡聚糖酶的表达载体、整合了上述表达载体的转化体、以及使用上述超耐热性内切葡聚糖酶制造木质纤维素分解产物的方法。
解决技术问题的技术手段
本发明的发明人为了解决上述问题，通过从温泉高温土壤中直接提取DNA来进行难培养微生物群的大规模宏基因组测序，成功获取具有新的氨基酸序列的超耐热性内切葡聚糖酶，从而完成本发明。
即，作为本发明的超耐热性内切葡聚糖酶、多核苷酸、表达载体、转化体、超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法、糖苷水解酶混合物、以及木质纤维素分解产物的制造方法，可以列举下列[1]～[10]。
[1]一种超耐热性内切葡聚糖酶，其特征在于具有由下列(A)、(B)或(C)构成的内切葡聚糖酶催化区域：
(A)由序列号3或序列号11所示氨基酸序列构成的多肽；
(B)由序列号3或序列号11所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在110℃且pH4.0的条件下具有以羧甲基纤维素为底物的水解活性的多肽；
(C)由与序列号3或序列号11所示氨基酸序列具有70％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在110℃且pH4.0的条件下具有以羧甲基纤维素为底物的水解活性的多肽。
[2]上述[1]的超耐热性内切葡聚糖酶，其中，上述内切葡聚糖酶催化区域进一步在110℃且pH7.0的条件下具有木聚糖酶活性。
[3]一种多核苷酸，其具有由下列(a)～(e)的碱基序列构成的编码内切葡聚糖酶催化区域的区域：
(a)编码由序列号3或序列号11所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；
(b)由序列号3或序列号11所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且编码至少在110℃且pH4.0的条件下具有以羧甲基纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；
(c)由与序列号3或序列号11所示氨基酸序列具有70％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且编码至少在110℃且pH4.0的条件下具有以羧甲基纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；
(d)与序列号4或序列号12所示氨基酸序列具有70％以上序列一致性、并且编码至少在110℃且pH4.0的条件下具有以羧甲基纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列；
(e)与由序列号4或序列号12所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸的碱基序列、且编码至少在110℃且pH4.0的条件下具有以羧甲基纤维素为底物的水解活性的多肽的碱基序列。
[4]上述[3]的多核苷酸，其中，上述多肽进一步在110℃且pH7.0的条件下具有木聚糖酶活性。
[5]一种表达载体，其整合了上述[3]或[4]的多核苷酸，在宿主细胞中可表达具有内切葡聚糖酶活性的多肽。
[6]一种转化体，其导入有上述[5]的表达载体。
[7]上述[6]的转化体，其为真核微生物。
[8]上述超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法，包括在上述[6]或[7]的转化体中生产超耐热性内切葡聚糖酶。
[9]一种糖苷水解酶混合物，其包含上述[1]或[2]的超耐热性内切葡聚糖酶、上述[3]或[4]的多核苷酸编码的超耐热性内切葡聚糖酶、或者利用上述[8]的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制得的超耐热性内切葡聚糖酶及至少一种其他糖苷水解酶。
[10]一种木质纤维素分解产物的制造方法，包括使包含纤维素的木质纤维素所构成的材料与上述[1]或[2]的超耐热性内切葡聚糖酶、上述[3]或[4]的多核苷酸编码的超耐热性内切葡聚糖酶、上述[6]或上述[7]中记载的转化体、利用上述[8]的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制得的超耐热性内切葡聚糖酶、或者上述[9]的糖苷水解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。
发明效果
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性。因此，上述超耐热性内切葡聚糖酶适合于高温条件下的、包含纤维素的木质纤维素所构成的材料的糖化处理(水解处理)。
此外，本发明的多核苷酸、整合了上述多核苷酸的表达载体、导入有上述表达载体的转化体适合用于制造本发明的超耐热性内切葡聚糖酶。
附图说明
图1为开放阅读框AR15G-90编码的多肽(下文有时称为AR15G-90)的氨基酸序列(序列号1)与Ignisphaera aggregans DSM17230的糖苷水解酶第12家族(序列号8)的氨基酸序列的比对图。
图2为表示实施例1中的AR15G-90-3基因在大肠杆菌中表达得到的AR15G-90-3蛋白的SDS-PAGE分析结果的图。
图3为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR15G-90-3蛋白对各底物的水解活性的测定结果的图。
图4为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR15G-90-3蛋白不存在钙离子(图中的“AR15G-90-3”)和存在钙离子的情况下(图中的“AR15G-90-3+0.5mM Ca2+”)的在各温度下的CMC水解活性(pH4.0)、以及TrEG(里氏木霉EG2)和TmEG(海栖热袍菌EG)的CMC水解活性(pH4.0)的测算结果的图。
图5为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR15G-90-3蛋白在各pH的CMC水解活性(70℃)的测算结果的图。
图6为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR15G-90-3蛋白在各温度的木聚糖酶活性(pH7.0)的测算结果的图。
图7为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR15G-90-3蛋白在各pH的木聚糖酶活性(70℃)的测算结果的图。
图8为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR15G-90-3蛋白的CMC水解活性(以非处理区(未预温育)的活性为100％的相对值(相对活性，％))的测算结果的图。
图9为表示实施例1中的大肠杆菌所表达的AR15G-90-3蛋白的木聚糖酶活性(以非处理区(未预温育)的活性为100％的相对值(％))的测算结果的图。
图10为开放阅读框AR15G-90编码的多肽(AR15G-90)的氨基酸序列(序列号1)、开放阅读框AR15G-90B编码的多肽(下文有时称为AR15G-90B)的氨基酸序列(序列号9)、以及Ignisphaera aggregans DSM17230的糖苷水解酶第12家族(序列号8)的氨基酸序列的比对图。
图11为表示实施例2中的大肠杆菌所表达的AR15G-90B-15蛋白在各温度下的CMC水解活性(以90℃的活性为100％的相对值(％))的测算结果的图。
具体实施方式
[超耐热性内切葡聚糖酶]
众所周知包含丝状真菌、细菌和古细菌的大多微生物是具有难培养性的，在土壤等微生物环境中生存的菌约99％为未知的菌。特别公认在高温环境中生存的微生物的培养是极其困难的，目前的微生物培养技术仅分离培养出土壤中生存的微生物的0.1％以下。此高温土壤微生物的难培养性是耐热性酶的开发没有进展的一个原因。
近年来，通过开发可大量序列解码千兆碱基对的新一代千兆测序仪(giga-sequencer)，可完整解码土壤等中所含有的微生物群的基因组。提出了利用该分析技术的宏基因组分析法，从而使难培养性微生物的基因组解码得到了飞速发展，上述宏基因组分析法即制备来自于土壤等环境样本的微生物菌落的基因组DNA，对基因组结构不均匀且多杂的菌群直接进行基因组的全面解码，通过并行计算机进行解码数据的拼接，再度构成微生物群基因组序列。
本发明的发明人如下述实施例1所示，从所采集的高温温泉土壤(例如可列举58～78℃的含有土壤、泥、生物垫、生物膜等的温泉水)提取微生物菌落的基因组DNA(宏基因组DNA)，进行宏基因组DNA的鸟枪法测序和注释，获得编码与已知内切葡聚糖酶类似的氨基酸序列(例如具有20％以上序列一致性、且期望值(E-Value)不足1e-20的氨基酸序列)的开放阅读框(ORF)。在这些ORF中，对于内切葡聚糖酶催化区域可确认的106个ORF，根据ORF的碱基序列信息设计引物，通过PCR法，从高温温泉土壤宏基因组DNA克隆得到候选基因。将PCR克隆得到的DNA整合到大肠杆菌中，表达上述碱基序列编码的蛋白质，通过CMC分解活性检测来进行功能筛选。最终，从这些ORF中得到具有内切葡聚糖酶活性的超耐热性内切葡聚糖酶(下文有时称为“AR15G-90-3”)。分别将AR15G-90-3的氨基酸序列示于序列号3，将编码AR15G-90-3的氨基酸序列的碱基序列示于序列号4。
另外，AR15G-90-3为N末端缺失的部分蛋白质，如下述实施例2所示，AR15G-90B-15为AR15G-90-3的全长蛋白质。分别将AR15G-90B-15的氨基酸序列示于序列号11，将编码AR15G-90B-15的氨基酸序列的碱基序列示于序列号12。
如下述实施例1<9>所示，AR15G-90-3对地衣多糖(Lichenan)表现出特别高的水解活性，对于CMC、非结晶纤维素磷酸溶胀Avicel(Phosphoric acid swollen Avicel，下文有时简称为PSA)、以及木聚糖(xylan)表现出高水解活性，对于微晶纤维素Avicel、海带多糖(Laminarin)、以及对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(下文有时简称为PNPC)也表现出水解活性。另一方面，对于对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(下文有时简称为PNPG)和对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(下文有时简称为PNPX)几乎没有表现出分解活性。
即，AR15G-90-3的一个方面为对于具有β-1,4键的化合物(例如CMC、PSA、Avicel、PNPC等)和具有β-1,3键与β-1,4键的化合物(例如地衣多糖等)的底物特异性高，且具有木聚糖酶活性的超耐热性内切葡聚糖酶。
在公知的氨基酸序列数据库中对AR15G-90-3的氨基酸序列进行检索时，序列一致性最高的氨基酸序列为泉古菌门Ignisphaera aggregans DSM17230的糖苷水解酶第12家族(Genbank：ADM27292.1)(序列号8)，对于其序列一致性(相似性)，全长为56％，GH12催化区域为64％。由底物特异性和与已知的蛋白质的氨基酸序列的序列一致性得知，AR15G-90-3为属于GH12家族的新内切葡聚糖酶。
AR15G-90-3至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性。实际上，如下述实施例1<10>、<11>所示，AR15G-90-3在60～160℃的宽温度范围内、且pH3～8的宽pH范围内表现出内切葡聚糖酶活性，在80～120℃的温度范围内、且pH3～8的范围内表现出强内切葡聚糖酶活性，在90～110℃的温度范围内、且pH4～6的范围内表现出非常强的内切葡聚糖酶活性。
更具体而言，AR15G-90-3的以CMC为底物的pH4.0的CMC水解活性在60～90℃的范围内随着温度的升高而升高，在90～120℃的范围内稳定且高，在120℃以上有缓慢下降的倾向。
除了内切葡聚糖酶活性之外，AR15G-90-3进一步在110℃且pH7.0的条件下具有木聚糖酶活性。实际上，如下述实施例1<12>、<13>所示，AR15G-90-3在40～140℃的宽温度范围内、且pH5～10的宽pH范围内表现出木聚糖酶活性，在80～120℃的温度范围内、且pH6～9.5的范围内表现出强木聚糖酶活性，在90～115℃的温度范围内、且pH6.5～9的范围内表现出非常强的木聚糖酶活性。
更具体而言，AR15G-90-3的以木聚糖为底物的pH7.0的木聚糖酶活性在40～110℃的范围内随着温度的升高而升高，超过110℃时有急剧下降的倾向。
另外，在本说明书中，“具有活性”或“表现出活性”是指至少对1种底物起作用，与阴性对照(Negative control)相比，被水解的底物的还原性末端的数量或者在显色反应中存在显著差异。
因此，“具有内切葡聚糖酶活性”是指对选自由具有β-1,4键的化合物(例如CMC、PSA、Avicel、PNPC等)和具有β-1,3键与β-1,4键的化合物(例如地衣多糖等)构成的组的至少1种底物起作用，与阴性对照(Negative control)相比，被水解的底物的还原性末端的数量或者在显色反应中存在显著差异。
“具有木聚糖酶活性”是指至少对木聚糖起作用，与阴性对照(Negative control)相比，被水解的木聚糖的还原性末端的数量或者在显色反应中存在显著差异。
通常，任何具有生理活性的蛋白质都能在不损害其生理活性的前提下，可以进行1个或2个以上氨基酸的缺失、取代或添加。即，对于AR15G-90-3，也可以在不丧失糖苷水解活性的前提下，进行1个或2个以上氨基酸的缺失、取代或添加。
即，本发明的超耐热性内切葡聚糖酶为具有由下列(A)～(C)中任一多肽构成的内切葡聚糖酶催化区域的超耐热性糖苷水解酶。
(A)由序列号3或序列号11所示氨基酸序列构成的多肽(即AR15G-90-3)；
(B)由序列号3或序列号11所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性的多肽；或者
(C)由与序列号3或序列号11所示氨基酸序列具有70％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性的多肽。
在本说明书中，“多肽中的氨基酸的缺失”是指失去(即去除)构成多肽的一部分氨基酸。
在本说明书中，“多肽中的氨基酸的取代”是指将构成多肽的氨基酸替换为其他氨基酸。
在本说明书中，“多肽中的氨基酸的添加”是指在多肽中插入新的氨基酸。
在上述(B)的多肽中，对于序列号3或序列号11所示氨基酸序列，缺失、取代或添加氨基酸的个数优选为1～20个，更加优选为1～10个，进一步优选为1～5个。
在上述(C)的多肽中，与序列号3或序列号11所示氨基酸序列的序列一致性只要是70％以上且不足100％即可，没有特别的限制，但优选为75％以上且不足100％，更加优选为80％以上且不足100％，进一步优选为85％以上且不足100％，更进一步优选为90％以上且不足100％，特别优选为95％以上且不足100％。
另外，氨基酸序列之间的序列一致性(相似性)是以使对应氨基酸有最多一致的方式，在相当于插入及缺失的部分加入空位的同时，使两个氨基酸序列并列得到比对，再以一致的氨基酸相对于除去所得比对中的空位的氨基酸序列整体的比例求得。氨基酸序列之间的序列一致性可以使用上述技术领域中公知的各种相似性检索软件来求得。本发明的氨基酸序列的序列一致性的值是以利用公知的相似性检索软件BLASTP得到的比对为基础算得的。
作为上述(B)和(C)的多肽，可以是人工设计的，也可以是AR15G-90-3等的同源物或其部分蛋白质。
上述(A)～(C)的多肽分别可以根据氨基酸序列进行化学合成，也可以使用下述本发明的多核苷酸，利用蛋白质表达系统来生产。此外，上述(B)和(C)的多肽也可以分别根据由序列号3或序列号11所示氨基酸序列构成的多肽，利用导入氨基酸突变的基因重组技术来进行人工合成。
上述(A)～(C)的多肽至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性。因此，通过具有上述(A)～(C)中任一多肽作为内切葡聚糖酶催化区域，能够得到超耐热性内切葡聚糖酶。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶以选自由具有β-1,3键与β-1,4键的化合物、具有β-1,4键的化合物、以及木聚糖所构成的组中的至少一种为底物。
作为具有β-1,3键与β-1,4键的化合物，可列举地衣多糖、β-葡聚糖等。作为具有β-1,4键的化合物，可列举Avicel、微晶性细菌纤维素(Bacterial microcrystallinecellulose，BMCC)、滤纸等结晶纤维素、CMC、PSA、纤维二糖等。
作为本发明的超耐热性内切葡聚糖酶，优选除了CMC和木聚糖之外，进一步以选自由地衣多糖、β-葡聚糖、PSA、Avicel、PNPC和木葡聚糖所构成的组中的至少一种为底物，更加优选除了CMC和木聚糖之外，进一步以选自由地衣多糖、PSA和木葡聚糖所构成的组中的至少一种为底物，进一步优选以CMC、木聚糖和地衣多糖为底物。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶还可以进一步以上述底物之外的其他葡聚糖等为底物。作为可充当本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的底物的物质，例如可列举：PNPX、对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-L-吡喃阿拉伯糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃甘露糖苷、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷、对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷；海带多糖等由β-1,3键和β-1,6键形成的葡聚糖；由β-1,3键形成的葡聚糖、由β-1,6键形成的葡聚糖、龙胆二糖等由β-1,6键形成的低聚糖。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶优选至少在pH4.0的条件下、且在90～110℃的温度范围内表现出CMC水解活性，更加优选在80～120℃的温度范围内表现出CMC水解活性，进一步优选在60～160℃的温度范围内表现出CMC水解活性。本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的CMC水解活性的最适温度在pH4.0的条件下优选在90～120℃的范围内。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶所具有的内切葡聚糖酶活性的最适pH虽然依赖于反应温度和底物而发生变化，但是在pH4.0～5.0的范围内。例如，底物为CMC时，在70℃下的最适pH为4.4。作为本发明的超耐热性内切葡聚糖酶，优选至少在pH4～6的范围内表现出内切葡聚糖酶活性，更加优选在pH3～8的范围内表现出内切葡聚糖酶活性。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶进一步优选至少在pH7.0的条件下、且在90～115℃的温度范围内表现出木聚糖酶活性，更加优选在80～120℃的温度范围内表现出木聚糖酶活性，优选在40～140℃的宽温度范围内表现出木聚糖酶活性。本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的木聚糖酶活性的最适温度在pH7.0的条件下优选在90～120℃的范围内，更加优选在100～115℃的范围内。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶所具有的木聚糖酶活性的最适pH虽然依赖于反应温度等而发生变化，但是在pH6.5～9.0的范围内，优选在pH7.5～8.5的范围内。作为本发明的超耐热性内切葡聚糖酶，优选至少在pH6.5～9.0的范围内表现出木聚糖酶活性，更加优选在pH5～10的范围内表现出木聚糖酶活性。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶还可以进一步具有内切葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性之外的糖苷水解活性。作为其他糖苷水解活性，可列举β-木糖苷酶活性、β-葡糖苷酶活性或纤维二糖水解酶活性等。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶可以是仅由上述(A)～(C)的多肽中的任一多肽构成的内切葡聚糖酶催化区域所构成的酶，也可以进一步含有其他区域。作为其他区域，可列举公知的糖苷水解酶所具有的酶催化区域之外的区域。例如，在本发明的超耐热性内切葡聚糖酶中，相对于公知的糖苷水解酶，还包含通过酶催化区域被上述(A)～(C)的多肽取代而得到的酶。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶含有内切葡聚糖酶催化区域之外的区域时，还优选含有纤维素结合模块。纤维素结合模块可以位于内切葡聚糖酶催化区域的上游(N末端一侧)，也可以位于其下游(C末端一侧)。此外，纤维素结合模块和内切葡聚糖酶催化区域可以直接结合，也可以通过适当长度的连接区域进行结合。作为本发明的超耐热性内切葡聚糖酶，优选在内切葡聚糖酶催化区域的上游或下游通过连接区域存在纤维素结合模块，更加优选在内切葡聚糖酶催化区域的下游通过连接区域存在纤维素结合模块。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶所含有的纤维素结合模块只要是具有与纤维素结合能力的区域即可，例如与PSA或结晶Avicel的结合能力，其氨基酸序列没有特别的限制。作为该纤维素结合模块，例如可使用已知的蛋白质所具有的纤维素结合模块、或者对其进行适当改变的纤维素结合模块。此外，在本发明的超耐热性内切葡聚糖酶具有内切葡聚糖酶催化区域和纤维素结合模块的情况下，优选它们通过连接序列进行结合。上述连接序列的氨基酸序列及其长度等没有特别的限制。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶另外还可以在N末端或C末端具有可转移并定位于细胞内特定区域的信号肽、或者向细胞外分泌的信号肽。作为这种信号肽，例如可列举质外体转移信号肽、内质网驻留信号肽、核转运信号肽、或者分泌信号肽等。作为内质网驻留信号肽，例如可列举由HDEL的氨基酸序列构成的信号肽等。本发明的超耐热性内切葡聚糖酶在其N末端或C末端具有信号肽时，可使在转化体中表达的超耐热性内切葡聚糖酶分泌到细胞外，或定位于细胞中的内质网等中。
此外，本发明的超耐热性内切葡聚糖酶，除此之外，由于在利用表达系统生产时可简单纯化，例如也可以在上述超耐热性内切葡聚糖酶的N末端或C末端添加各种标记。作为上述标记，例如可使用His标记、HA(血凝素)标记、Myc标记及Flag标记等在重组蛋白的表达纯化中广泛使用的标记。
[编码超耐热性内切葡聚糖酶的多核苷酸]
本发明的多核苷酸编码本发明的超耐热性内切葡聚糖酶。上述超耐热性内切葡聚糖酶可以通过将整合了上述多核苷酸的表达载体导入宿主中，利用上述宿主的表达系统来生产。
具体而言，本发明的多核苷酸为具有由下列(a)～(e)中任一碱基序列构成的编码内切葡聚糖酶催化区域的区域的多核苷酸。
(a)编码由序列号3或序列号11所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列；
(b)由序列号3或序列号11所示氨基酸序列中的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而形成的氨基酸序列所构成的、并且编码至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性的多肽的碱基序列；
(c)由与序列号3或序列号11所示氨基酸序列具有70％以上序列一致性的氨基酸序列构成的、并且编码至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性的多肽的碱基序列；
(d)与序列号4或序列号12所示氨基酸序列具有70％以上序列一致性、并且编码至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性的多肽的碱基序列；
(e)与由序列号4或序列号12所示碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下进行杂交的多核苷酸的碱基序列、且编码至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性的多肽的碱基序列。
另外，在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的缺失”是指失去(即去除)构成多核苷酸的一部分核苷酸。
在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的取代”是指将构成多核苷酸的碱基替换为其他碱基。
在本说明书中，“多核苷酸中的碱基的添加”是指在多核苷酸中插入新的碱基。
本说明书中，“严格条件”例如可列举《分子克隆-实验室手册第三版》(Sambrook等，冷泉港实验室出版社)中记载的方法。例如可列举，通过在由6×SSC(20×SSC的组成：3M氯化钠、0.3M柠檬酸溶液，pH7.0)、5×邓哈特溶液(Denhardt's solution)(100×邓哈特溶液的组成：2质量％的牛血清白蛋白、2质量％的Ficoll、2质量％的聚乙烯吡咯烷酮)、0.5质量％的SDS、0.1mg/mL的鲑鱼精子DNA及50％的甲酰胺组成的杂交缓冲液中，在42～70℃进行数小时到一晚的温育而使杂交进行的条件。另外，作为用于温育后的清洗时的清洗缓冲液，优选为含有0.1质量％SDS的1×SSC溶液，更加优选为含有0.1质量％SDS的0.1×SSC溶液。
在上述(a)～(e)的碱基序列中，简并密码子优选宿主中使用频率高的密码子。例如，作为上述(a)的碱基序列，可以是序列号4或序列号12所示碱基序列，也可以是在不改变所编码的氨基酸序列的前提下，将序列号4或序列号12所示碱基序列变更为宿主中使用频率高的密码子的碱基序列。密码子的变更可以通过公知的基因序列突变技术或人工基因合成来进行。
由序列号4或序列号12所示碱基序列构成的多核苷酸可以根据碱基序列信息进行化学合成，也可以是利用基因重组技术从自然界取得的编码AR15G-90-3的基因(有时被称为“AR15G-90-3基因”或“基因克隆AR15G-90-3”)或编码AR15G-90B-15的基因(有时被称为“AR15G-90B-15基因”或“基因克隆AR15G-90B-15”)的全长或含有内切葡聚糖酶催化区域的部分区域(在AR15G-90-3的情况下为编码由序列号3中的第101位的甘氨酸(G)至第271位的亮氨酸(L)的171个氨基酸残基所构成的部分区域的区域)。AR15G-90-3基因或AR15G-90B-15基因的全长或其部分区域可以通过例如从自然界获取含有微生物的样本，以从上述样本回收的基因组DNA为模板，使用基于序列号4或序列号12所示碱基序列用常规方法设计的正向引物和反向引物进行PCR而获得。也可以将以从上述样本回收的mRNA为模板通过反转录反应合成的cDNA作为模板。另外，回收充当模板的核酸的样本优选为在温泉土壤等高温环境下采集的样本。
在上述(d)的碱基序列中，与序列号4或序列号12所示碱基序列的序列一致性只要是70％以上且不足100％即可，没有特别的限制，但优选为75％以上且不足100％，更加优选为80％以上且不足100％，进一步优选为85％以上且不足100％，更进一步优选为90％以上且不足100％，特别优选为95％以上且不足100％。
另外，碱基序列之间的序列一致性(相似性)是以使对应碱基最多一致的方式，在相当于插入和缺失的部分加入空位的同时，使两个碱基序列并列得到比对，再以一致的碱基相对于除去所得比对中的空位的碱基序列整体的比例求得。氨基酸序列之间的序列一致性可以使用上述技术领域中公知的各种相似性检索软件来进行求得。本发明的碱基序列的序列一致性的值是以利用公知的相似性检索软件BLASTN得到的比对为基础算得的。
例如，上述(b)、(c)或(d)的碱基序列所构成的多核苷酸分别可以通过对序列号4或序列号12所示碱基序列构成的多核苷酸进行1个或2个以上碱基的缺失、取代或添加来人工合成。此外，作为上述(b)、(c)或(d)的碱基序列，可以是AR15G-90-3基因(或AR15G-90B-15基因)的同源基因的全长序列或其部分序列。AR15G-90-3基因(或AR15G-90B-15基因)的同源基因可以通过在获取碱基序列已知的基因的同源基因时所使用的基因重组技术来获得。
本发明的多核苷酸，可以仅为具有编码内切葡聚糖酶催化区域的区域的多核苷酸，也可以除上述区域之外，还具有编码纤维素结合模块、连接序列、各种信号肽、各种标记等的区域。
[表达载体]
本发明的表达载体为整合了上述本发明的多核苷酸、可在宿主细胞中表达至少在110℃且pH4.0的条件下具有以CMC为底物的水解活性的多肽的表达载体。即，以可表达上述本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的状态整合上述本发明的多核苷酸的表达载体。具体而言，需要在表达载体中整合由从上游开始的具有启动子序列的DNA、上述本发明的多核苷酸、以及具有终止子序列的DNA所构成的表达盒。另外，可以利用众所周知的基因重组技术来进行多核苷酸向表达载体中的整合。多核苷酸向表达载体中的整合也可以使用市售的表达载体制作试剂盒。
在本说明书中，“表达载体”是指从上游开始包含具有启动子序列的DNA、具有用于整合外源DNA的序列的DNA、以及具有终止子序列的DNA的载体。
作为上述表达载体，可以是导入大肠杆菌等原核细胞的表达载体，也可以是导入酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞、或植物细胞等真核细胞的表达载体。作为这些表达载体，可以分别对应宿主使用通常所使用的任意表达载体。
本发明的表达载体优选为不仅整合了上述本发明的多核苷酸，还整合了耐药基因等的表达载体。这是由于可以利用表达载体容易地进行转化宿主细胞和非转化宿主细胞的筛选。
作为上述耐药基因，例如可列举卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和双丙氨磷抗性基因等。
[转化体]
本发明的转化体导入有本发明的表达载体。在上述转化体中，可表达本发明的超耐热性内切葡聚糖酶。作为导入表达载体的宿主，可以是大肠杆菌等原核细胞，也可以是酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞、或植物细胞等真菌细胞。即，本发明的转化体为导入有本发明的表达载体的大肠杆菌、酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、哺乳动物培养细胞、植物细胞等。
通过培养大肠杆菌的转化体，可以简便且大量的生产本发明的超耐热性内切葡聚糖酶。另一方面，由于在真核细胞内，蛋白质被实施了糖链修饰，通过使用真核细胞的转化体，能够比使用原核细胞的转化体时生产耐热性更加优异的超耐热性内切葡聚糖酶。
使用表达载体制作转化体的方法没有特别的限制，可以利用在制作转化体时通常使用的方法来进行。作为上述方法，例如有热休克法、农杆菌介导法、粒子枪法、电穿孔法及PEG(聚乙二醇)法等。其中，宿主为植物细胞的情况下，优选以粒子枪法或农杆菌介导法来进行。
在将原核细胞、酵母、丝状真菌、昆虫培养细胞、或哺乳培养细胞等用作宿主的情况下，所得到的转化体通常可以与转化前的宿主一样利用常规方法进行培养。
[超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法]
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法，是在上述本发明的转化体中生产超耐热性内切葡聚糖酶的方法。若使用将上述本发明的多核苷酸整合到不具有控制表达时期等的能力的启动子下游的表达载体制备转化体，并对该转化体进行培养，则在上述转化体内稳定表达本发明的超耐热性内切葡聚糖酶。另一方面，对于使用通过特定化合物或温度条件等诱导表达的所有表达诱导型启动子制备的转化体，通过对上述转化体进行培养，进行适应于各种表达诱导条件的诱导处理，在上述转化体中表达超耐热性内切葡聚糖酶。
由转化体生产的超耐热性内切葡聚糖酶能够以留存于上述转化体中的状态使用，也可以从上述转化体中提取纯化。
从转化体中提取纯化本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的方法只要是不损害上述超耐热性内切葡聚糖酶的糖苷水解活性的方法即可，没有特别的限制，可以利用从细胞或活体组织中提取多肽时通常使用的方法来进行提取。作为上述方法，例如可列举将转化体浸入适当的提取缓冲液中，提取超耐热性内切葡聚糖酶后，将提取液与固体残渣分离的方法。作为上述提取缓冲液，优选为含有表面活性剂等增溶剂的提取缓冲液。转化体为植物的情况下，在浸入提取缓冲液前，可以预先将上述转化体切碎或粉碎。此外，作为分离提取液和固体残渣的方法，例如可使用过滤法、压缩过滤法、或离心分离处理法等公知的固液分离处理，也可以对浸入提取缓冲液状态的转化体进行挤压。提取液中的超耐热性内切葡聚糖酶可以利用盐析法、超滤法或层析法等公知的纯化方法进行纯化。
本发明的超耐热性内切葡聚糖酶在转化体中以具有分泌信号肽的状态表达时，在对上述转化体进行培养后，回收从所得到的培养物除去转化体的培养液上清，由此能够简便的获得含有超耐热性内切葡聚糖酶的溶液。此外，本发明的超耐热性内切葡聚糖酶具有His标记等标记时，通过利用上述标记的亲和层析法，能够简便的纯化提取液或培养液上清中的超耐热性内切葡聚糖酶。
即，本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法包括在对上述本发明的转化体进行培养，在上述本发明的转化体中生产超耐热性内切葡聚糖酶，以及根据需要从上述转化体中提取纯化上述超耐热性内切葡聚糖酶。
[糖苷水解酶混合物]
本发明的糖苷水解酶混合物也可以以含有上述本发明的超耐热性内切葡聚糖酶、或者由上述本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制造的超耐热性内切葡聚糖酶与至少一种其他糖苷水解酶的糖苷水解酶混合物的形式使用。由上述本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制造的超耐热性内切葡聚糖酶可以是包含在转化体中的状态的超耐热性内切葡聚糖酶，也可以是从转化体中提取纯化的超耐热性内切葡聚糖酶。通过将本发明的超耐热性内切葡聚糖酶以与其他糖苷水解酶的混合物的形式用于多糖的水解反应，能够更高效地分解难分解的木质纤维素。
作为上述糖苷水解酶混合物中含有的上述超耐热性内切葡聚糖酶之外的其他糖苷水解酶，只要是具有木质纤维素水解活性的酶即可，没有特别的限制。作为上述糖苷水解酶混合物中含有的上述内切葡聚糖酶之外的其他糖苷水解酶，例如可列举木聚糖酶、β-木糖苷酶等半纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、或内切葡聚糖酶等。作为本发明的糖苷水解酶混合物，除了上述超耐热性内切葡聚糖酶之外，优选为还含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶中的至少一种糖苷水解酶的混合物，更加优选为还含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶这两种糖苷水解酶的混合物。其中，优选为除了上述超耐热性内切葡聚糖酶之外，还含有选自由木聚糖酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶及β-葡糖苷酶所构成的组中的至少1种糖苷水解酶的混合物，更加优选为除了上述超耐热性内切葡聚糖酶之外，还含有木聚糖酶、β-木糖苷酶、纤维二糖水解酶及β-葡糖苷酶所全部这些糖苷水解酶的混合物。
上述糖苷水解酶混合物中含有的其他糖苷水解酶优选为至少在85℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶，更加优选为在70～90℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶。通过使上述糖苷水解酶混合物含有的全部酶为耐热性的(例如酶活性的最适温度或酶蛋白的热变性温度为70℃以上)，能够在高温条件下高效进行基于上述糖苷水解酶混合物的木质纤维素分解反应。即，上述糖苷水解酶混合物仅含有耐热性糖苷水解酶时，通过将上述糖苷水解酶混合物用于木质纤维素糖化处理，使得可以在糖化温度为70～90℃的高温环境下进行木质纤维素水解反应(高温糖化：高温水解)。通过此高温糖化，可以显著减少酶量和糖化时间，大幅降低糖化成本(水解成本)。
[木质纤维素分解产物的制造方法]
本发明的木质纤维素分解产物的制造方法为通过本发明的超耐热性内切葡聚糖酶对由包含纤维素的木质纤维素所构成的材料进行水解以生成低聚糖，从而得到木质纤维素分解产物的方法。具体而言，使包含半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料与本发明的超耐热性内切葡聚糖酶、本发明的转化体、利用本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制得的超耐热性内切葡聚糖酶、或者本发明的糖苷水解酶混合物接触，由此生产上述包含半纤维素或纤维素的分解产物的木质纤维素分解产物。
另外，此处所述“半纤维素或纤维素的分解产物”具体是指通过切断半纤维素或纤维素的糖苷键而生成的产物。
本发明的木质纤维素分解产物的制造方法的另一方面为，使包含半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料与本发明的超耐热性内切葡聚糖酶、本发明的转化体、或者利用本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制得的超耐热性内切葡聚糖酶接触，主要通过切断纤维素的糖苷键部位而生产所生成的产物的方法。
本发明的木质纤维素分解产物的制造方法的又一方面为，使包含半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料与本发明的糖苷水解酶混合物接触，通过切断半纤维素或纤维素的糖苷键而生产所生成的产物的方法。
作为上述包含半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料，只要包含半纤维素或纤维素即可，没有特别的限制。作为上述材料，例如可列举杂草或农业废弃物等纤维素类生物质、或者废纸等。优选使上述包含半纤维素或纤维素的材料与本发明的超耐热性内切葡聚糖酶接触前，先进行破碎或切碎等物理处理、利用酸或碱等的化学处理、或者浸渍或溶解于适当的缓冲液中的处理等。
利用本发明的超耐热性内切葡聚糖酶进行包含半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料的水解反应的反应条件只要是使上述超耐热性内切葡聚糖酶表现出内切葡聚糖酶活性的条件即可，优选为表现出内切葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性的条件。例如优选在60～160℃且pH3～8的条件下进行反应，更加优选在80～120℃且pH5.0～8.0的条件下进行反应，进一步优选在90～110℃且pH4.0～7.0的条件下进行反应。上述水解反应的反应时间可考虑供水解的包含半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料的种类、预处理方法、或者用量等进行适当的调整。例如可以10分钟～100小时的反应时间进行上述水解反应，在分解纤维素类生物质的情况下，能够以1～100小时的反应时间进行上述水解反应。
在包含半纤维素或纤维素的木质纤维素所构成的材料的水解反应中，除了本发明的超耐热性内切葡聚糖酶之外，优选还使用至少一种其他糖苷水解酶。作为其他糖苷水解酶，可以使用与上述糖苷水解酶混合物中含有的糖苷水解酶一样的糖苷水解酶，优选的是，至少在85℃、优选至少在70～90℃具有糖苷水解酶活性的耐热性糖苷水解酶。此外，上述木质纤维素分解产物的制造方法的一个方面为，使用本发明的超耐热性内切葡聚糖酶、本发明的转化体、或者利用本发明的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制得的超耐热性内切葡聚糖酶，另一方面为使用上述糖苷水解酶混合物。
实施例
下面示出实施例对本发明进行进一步的详细说明，但本发明并不局限于以下实施例。
[实施例1]来自于温泉土壤的新超耐热性内切葡聚糖酶的克隆
<1>来自于温泉土壤的DNA提取与全基因组序列(Whole Genome Sequence,WGS)
以超耐热性内切葡聚糖酶的基因探索为目的，从中性～弱碱性温泉采集土壤DNA，进行构成这些土壤的微生物群的基因组DNA的碱基序列解码。
作为中性～弱碱性温泉土壤样本，从在野外有喷出高温温泉的日本国内的3处的5个地点(宏基因组DNA样本N2、AR19、AR15、OJ1和H1)采集含有土壤、泥、生物垫的温泉水。这些温泉土壤样本在采集温度58～78℃、pH7.2～8的范围内。
使用DNA提取试剂盒(ISOIL Large for Beads ver.2,NIPPON GENE社制)，从所采集的温泉土壤样本各10g中提取DNA。对于所提取的DNA中的5μg，使用罗氏诊断(RocheDiagnostics)社制GS FLX Titanium 454进行宏基因组DNA的鸟枪法测序。残余DNA用于内切葡聚糖酶基因的PCR克隆。
对温泉土壤样本AR15进行宏基因组DNA的序列解码，得到平均解码长度(readlength)为370bp、总解码数(total read number)为5,419,406个、总基因组解码量为2,007,725,040bp的全基因组序列(WGS)数据集。
<2>温泉宏基因组数据的拼接与统计量
对于454测序仪解码的碱基序列，将Roche 454的输出(sff文件)通过PyroBayes(Quinlan等，《Nature Methods(自然方法)》，2008年，第5卷，第179-181页)再次进行碱基识别(base-calling)，得到FASTA形式的序列文件和质量值文件。切掉所得序列解码的端部，提高其品质，使用454生命技术公司的拼接软件Newbler 2.3版进行拼接。拼接是设定为“最低的可接受重叠匹配(mi)＝0.9”、“选项：-大(对于大型或复杂的基因组，加快拼接，但降低精度。)”来进行的。
拼接为100bp以上的总解码长度共计为118,600,846bp，此数据集用于纤维素酶基因分析。解码总数为5,419,406个解码中的4,805,640个解码拼接为平均1,146bp以上的重叠群(共计103,508个重叠群)，其中最大重叠群的长度为151,585bp。
<3>内切葡聚糖酶的开放阅读框(ORF)预测
从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)下载EC号为3.2.1.4(纤维素酶)、3.2.1.21(β-葡糖苷酶)、3.2.1.37(β-木糖苷酶)、3.2.1.91(纤维素酶1,4-β-纤维二糖糖苷酶)、3.2.1.8(内切-1,4-β-木聚糖酶)的序列(访问日期：2011/12/9)，构建这些糖苷水解酶基因的蛋白质组本地数据库。使用注释软件Orphelia(Hoff等，《Nucleic Acids Research(核酸研究)》，2009年，第37卷，Web服务器问题：W101-W105)，由上述<2>所得重叠群序列推断基因区域(＝开放阅读框)(Orphelia选项：默认(模型＝Net700，最大重叠(maxoverlap)＝60))。为了从推断的ORF提取糖苷水解酶基因，使用了BLASTP(blastall ver.2.2.18)，参照了上述本地数据库。BLASTP的选项条件设为“过滤查询序列＝假”，“期望值(E)<1e-20”[以下为默认值：空位开放罚分＝-1，空位扩展罚分＝-1，空位比对的X下降值＝0，阈值拓展命中＝0，字段长度＝默认(Cost to open a gap＝-1，Cost to extended gap＝-1，Xdropoff value for gapped alignment＝0，Threshold for extending hits＝0，Wordsize＝default)]，以命中ORF序列为糖苷水解酶基因进行收集。收集的碱基序列包含纤维素酶、内切半纤维素酶、脱支酶等糖苷水解酶基因。
<4>基因的糖苷水解酶(GH)家族分类
对于在上述<3>中收集的碱基序列，以蛋白质功能区域序列数据库pfam HMMs(Pfam 23.0版和HMMER v2.3；Finn等，《Nucleic Acids Research Database(核酸研究数据库)》，2010年，第38卷，第D211-222页)为标准进行功能分类。具体而言，使用了蛋白质基序检索程序HMMER(Durbin等，“The theory behind profile HMMs.Biological sequenceanalysis:probabilistic models of proteins and nucleic acids(概形HMM理论。生物序列分析理论：蛋白质和核酸的概率模型)”，1998年，剑桥大学出版社；hmmpfam(2.3.2版)中，E值截止值<1e-5；数据库＝Pfam_fs(可用于查找所表示的结构域在序列中的片段的模型。))，由与Pfam结构域数据库的相似性确定糖苷水解酶(GH)家族。另外，将覆盖GH催化结构域的70％以上的碱基序列计入属于各家族的酶基因。
通过使用了宏基因组AR15的序列数据的BLASTP进行相似性检索，预测106个作为内切葡聚糖酶序列的ORF为内切葡聚糖酶基因。这106个ORF的GH家族分类示于表1中。如表1所示，从宏基因组AR15得到13个属于GH5家族的内切葡聚糖酶基因的全长ORF，4个属于GH9家族的内切葡聚糖酶基因的全长ORF，4个属于GH12家族的内切葡聚糖酶基因的全长ORF。对于推断为内切葡聚糖酶基因的全部全长ORF，设计引物，通过PCR从温泉土壤宏基因组DNA克隆基因。结果从属于GH12家族的、具有内切葡聚糖酶基因序列的ORF的AR15G-90分离出内切葡聚糖酶基因。
[表1]
<5>开放阅读框AR15G-90
开放阅读框AR15G-90编码由283个氨基酸残基构成的多肽，上述多肽为第1位氨基酸残基为缬氨酸(V)、编码上述多肽的碱基序列的3’末端以终止密码子终止的非全长序列(序列号1)。从基序的序列相似性推测，在开放阅读框AR15G-90所编码的多肽中，第101位的甘氨酸(G)至第271位的亮氨酸(L)的171个氨基酸残基为糖苷水解酶第12家族的催化结构域。与上述ORF编码的氨基酸序列的序列一致性最高的已知氨基酸序列为泉古菌门Ignisphaera aggregans DSM17230所具有的糖苷水解酶第12家族(Genbank：ADM27292.1)。对于利用ClustalW算法算得的两者的氨基酸序列的相似性，全长为56％，在GH12催化区域为64％，从而确认了上述ORF为新的序列。
图1示出了开放阅读框AR15G-90编码的多肽的氨基酸序列与Ignisphaeraaggregans DSM17230的糖苷水解酶第12家族的氨基酸序列(序列号8)的比对图。在图1中，黑白对比的氨基酸表示这些全部氨基酸序列中的相同氨基酸残基(一致序列)，“-”表示缺失(空位)。
<6>来自于开放阅读框AR15G-90的基因克隆
使用由序列号7所示碱基序列构成的正向引物(5’-CACCATGGTGACCATCACGCCGAGTACA-3’：在序列号5所示碱基序列的5’末端添加4个碱基(CACC)和起始密码子(ATG)而成。5’一侧所添加的CACC为用于插入载体的序列。)与由序列号6所示碱基序列构成的反向引物(5’-CTACCTCAGTGTTTTACCTGGC-3’)，以通过基因组DNA扩增试剂盒(GenomiPhi V2 DNA扩增试剂盒，GE医疗社制)扩增的温泉土壤DNA为模板，进行PCR。序列号5所示碱基序列与由序列号2所示碱基序列的第1～21位碱基所构成的部分序列为相同的(同一)碱基序列。此外，序列号6所示碱基序列与由序列号2所示碱基序列的第831～852位碱基构成的部分序列为互补的碱基序列。将所扩增的PCR产物插入Champion pETDirectional TOPO(注册商标)表达试剂盒(生命技术(Life Technologies)社制)的pET101/D-TOPO载体中，转化为One Shot TOP10菌株。通过菌落PCR选择阳性克隆，使用含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，以37℃、200rpm培养17～20小时后，使用小提试剂盒(Miniprep Kit，Wizard(注册商标)plus SV Minipreps DNA Purification System，Promega社制)进行质粒的制备。所制备的质粒用生命技术(Life Technologies)社的3730DNA分析测序仪进行序列确认。
通过PCR克隆，从开放阅读框AR15G-90得到5个基因克隆AR15G-90-2、AR15G-90-3、AR15G-90-9、AR15G-90-12和AR15G-90-13。作为内切葡聚糖酶候选基因的基因克隆AR15G-90-3的碱基序列(序列号4)与开放阅读框AR15G-90(序列号2)一样包含852bp，与ORF有4个碱基不同。即，第93位的碱基在开放阅读框AR15G-90中为T(胸腺嘧啶)，而在所克隆的AR15G-90-3基因中为C(胞嘧啶)；第335位的碱基在开放阅读框AR15G-90中为G(鸟嘌呤)，而在所克隆的AR15G-90-3基因中为A(腺嘌呤)；第652位的碱基在开放阅读框AR15G-90中为G，而在所克隆的AR15G-90-3基因中为A；第699位的碱基在开放阅读框AR15G-90中为G，而在所克隆的AR15G-90-3基因中为A。其中2处的碱基不同使氨基酸也不同，开放阅读框AR15G-90的氨基酸序列(序列号1)与内切葡聚糖酶候选基因AR15G-90-3的氨基酸序列(序列号3)有2个氨基酸残基不同。即，第112位的氨基酸残基在开放阅读框AR15G-90中为精氨酸(R)，而在所克隆的AR15G-90-3基因中为赖氨酸(K)；第218位的氨基酸残基在开放阅读框AR15G-90中为缬氨酸(V)，而在所克隆的AR15G-90-3基因中为异亮氨酸(I)。
<7>AR15G-90-3基因的基因表达及酶蛋白的纯化
酶蛋白的纯化使用了在C末端一侧添加有组氨酸标记的蛋白质。通过在上述pET101/D-TOPO载体中插入去除了终止密码子的内切葡聚糖酶候选基因AR15G-90-3，制成组氨酸标记添加序列。具有添加了标记序列的目标基因的质粒通过热休克法导入蛋白质表达用大肠杆菌。转化用感受态细胞使用了Rosetta-gamiB(DE3)pLysS菌株(Merck社制)。将具有目标基因的大肠杆菌接种到含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，培养至OD600＝0.2～0.8左右之后，添加IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代半乳糖苷)，进一步培养5～20小时，由此进行目标蛋白质的诱导表达。培养后，进行离心分离回收大肠杆菌，添加培养液的1/10体积的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行悬浊。然后，使用超声波破碎装置astrason3000(MISONIX社制)，重复7～8次破碎5分钟-暂停5分钟的步骤，得到含有目标蛋白质的基因重组大肠杆菌的粗提物。上述基因重组大肠杆菌粗提物用过滤器(孔径Millipore社制)过滤，将所得滤液作为基因重组大肠杆菌破碎上清液。
以终浓度为500mM的方式向上述基因重组大肠杆菌破碎上清液中添加NaCl，填充到用含有500mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的离子交换柱HiTrap FF(GE医疗社制)中，用中压液相色谱系统AKTA design(GE医疗社制)，在含有500mM NaCl和500mM咪唑的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中以0～100％的浓度梯度对蛋白质进行分级。
将具有CMC水解活性的分级收集混合后，通过离心式超滤膜VIVASPIN20(Sartorius stedim社制)与含有750mM硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行溶液交换。将溶液交换后的CMC水解活性分级填充(load)到以相同溶液平衡的疏水相互作用分离柱HiTrap Phennyl HP(GE医疗社制)中，通过50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)以0～100％的浓度梯度对蛋白质进行分级。将具有CMC水解活性的分级收集混合后，用VIVASPIN20浓缩到液量为8mL左右。将所浓缩的样本添加到由含有150mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的凝胶过滤柱Hiload26/60superdex200pg(GE医疗社制)中，通过以2～3mL/分钟的流速流过柱体积的1～1.5倍体积的相同缓冲液来进行分级。将具有CMC水解活性的分级收集混合后，进行与50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的溶液交换和浓缩，得到终浓度约1mg/mL的纯化酶。
通过SDS-PAGE分析对基因重组大肠杆菌破碎上清液和纯化酶进行了确认。对于5μg上述上清液和0.5μg纯化酶，分别以使含有2-巯基乙醇的试剂缓冲液的4倍浓缩液(和光纯药社制)成为1倍的方式混合，然后在95℃处理4分钟之后，用10％的标准TGX免染预制胶(伯乐(Bio-Rad)社制)进行电泳。电泳结束后，通过成像系统ChemiDoc(伯乐社制)使蛋白质的条带可视化。
图2中示出了由导入有AR15G-90-3基因的转化大肠杆菌制备的基因重组大肠杆菌破碎上清液和由上述基因重组大肠杆菌破碎上清液纯化而成的纯化酶的SDS-PAGE分析结果。泳道1为蛋白质量标准，泳道2为基因重组大肠杆菌破碎上清液，泳道3为纯化酶的电泳图案。结果，在上述基因重组大肠杆菌破碎上清液(泳道2)中，确认到在由氨基酸序列(序列号3)和pET101/D-TOPO载体的组氨酸标记预测的质量35.6kDa附近的条带。在纯化酶(泳道3)中，虽然与对应于上述条带的强条带一同检测到2条弱条带，但确认了主要含有的蛋白质为上述酶蛋白(图中的箭头)。
<8>AR15G-90-3的CMC水解活性测定
首先，以CMC(羧甲基纤维素，Sigma社制)为底物，对AR15G-90-3基因编码的酶蛋白(AR15G-90-3)的CMC水解活性进行了研究。
上述<7>中得到的基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化途中的酶试样的CMC水解活性测定时通过将100μL 1质量％的CMC水溶液、50μL 200mM醋酸缓冲液(pH4.0)、50μL基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化途中的酶试样所构成的混合液在40～99℃反应10～15分钟来进行的。
在整个测算过程中，将添加50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)替代基因重组大肠杆菌破碎上清液或纯化酶试样以相同条件反应的混合液作为对照区。另外，底物溶液和酶在反应温度下分别各自保温5分钟后进行混合，开始反应。反应结束后，添加等量的3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS溶液)，在100℃进行5分钟加热处理，冷却5分钟后进行离心，得到上清液。上清液中的还原糖含量是用分光光度计测量540nm的吸光度，使用由葡萄糖制作的校准曲线进行计算，由与对照区的差求得通过酶水解生成的还原糖含量。以1分钟生成1μmol还原糖的酶活性为1U，除以蛋白质量得到的值为比活性(U/mg)。
<9>AR15G-90-3的底物特异性
对于AR15G-90-3基因编码的酶蛋白(AR15G-90-3)，研究其相对于各种纤维素底物及半纤维素底物的水解活性。测算使用了在上述<7>中得到的纯化酶溶液(0.2mg/mL)。此外，作为底物，使用了PSA、Avicel粉末(微晶纤维素粉末，Merck社制)、CMC(Sigma社制)、木聚糖(来源于榉木，Sigma社制)、地衣多糖(MP Biomedicals社制)、海带多糖(来源于掌状海带，Sigma社制)、PNPC(Sigma社制)、PNPX(Sigma社制)、以及PNPG(Sigma社制)。
PSA是通过Avicel粉末(微晶纤维素粉末，Merck社制)一溶解到磷酸溶液后即添加灭菌蒸馏水(purified water)而析出，然后对其进行清洗直至pH达到5以上而制备的。另外，以下实验中使用的PSA全都是通过上述方法制备的。
具体而言，首先，作为反应液，将由50μL 200mM的醋酸缓冲液(pH4.0)(木聚糖的情况下为McIlvaine缓冲液(pH7.0))、5μL纯化酶溶液(0.2mg/mL)和45μL纯化水构成的混合液在70℃预温育5分钟后，进一步添加以同样方式保温的100μL各底物溶液(PSA、Avicel粉末、CMC、木聚糖、地衣多糖和海带多糖为1质量％水溶液，PNPG、PNPX和PNPC为3.4mM水溶液)，所得混合液在70℃温育20分钟，由此进行酶促反应。反应中，为了防止不溶性底物的沉淀，利用恒温混匀器(ThermoMixer，Eppendorf社制)对混合液进行1400rpm的振荡来进行搅拌。在整个测算过程中，将添加50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)替代纯化酶溶液以相同条件反应的混合液作为对照区。
反应结束后，在以PSA、Avicel粉末、CMC、木聚糖、地衣多糖或海带多糖为底物的反应中，以与上述<8>的研究AR15G-90-3的CMC水解活性时相同的方式，计算通过水解生成的还原糖含量，求得比活性(U/mg)。然而，在木聚糖的情况下，使用了用木糖制作的校准曲线。
在以PNPG、PNPX或PNPC为底物的反应中，反应结束后，添加等量的200mM碳酸钠水溶液，离心5分钟，得到上清液。上清液中的对硝基苯酚含量是用分光光度计测算420nm的吸光度，使用由对硝基苯酚制作的校准曲线进行计算，由与对照区的差求得通过酶的水解生成的对硝基苯酚含量。以1分钟生成1μmol对硝基苯酚的酶活性为1U，除以蛋白质量得到的值为比活性(U/mg)。
各个测算通过3次独立的试验进行，求取平均值和标准误差。测定结果示于图3中。结果，AR15G-90-3对CMC、木聚糖、PSA和地衣多糖表现出水解活性，但对Avicel、海带多糖和PNPC的水解活性非常小，对PNPG和PNPX几乎没有表现出水解活性。
<10>CMC水解活性的温度依赖性
对酶蛋白(AR15G-90-3)的CMC水解活性的温度依赖性进行了研究。测算中使用了在上述<7>中得到的纯化酶被50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释为0.13mg/mL的纯化酶溶液。此外，作为底物，使用了CMC(羧甲基纤维素，Sigma社制)。
具体而言，通过使由50μL 200mM醋酸缓冲液(pH4.0)、40μL50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、10μL纯化酶溶液(0.13mg/mL)和100μL 1质量％CMC水溶液构成的混合液在60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160℃下反应15分钟来进行。在进行100℃以上的活性测定时，使用了玻璃瓶、橡胶塞和铝盖(日电理化硝子社制)。反应结束后，以与上述<8>相同的方式求得因酶的水解生成的还原糖含量，算出CMC水解活性(比活性)(U/mg)。此外，添加0.5mM钙离子，以同样的方式测定CMC水解活性。
此外，作为已知的内切葡聚糖酶，使用了TrEG(里氏木霉EG2，Megazyme社制)和TmEG(海栖热袍菌EG，Megazyme社制)，以同样的方式测定CMC分解活性。作为缓冲液，对于TrEG使用了200mM McIlvaine缓冲液(pH4.0)取代醋酸缓冲液，对于TmEG使用了200mMMcIlvaine缓冲液(pH5.0)取代醋酸缓冲液，在30、40、50、60、70、80、90、100℃下进行了反应。
各个测算通过3次独立的试验进行，求取平均值和标准误差(standard errors)。测算结果示于图4中。AR15G-90-3在60～160℃的温度范围内表现出CMC水解活性。表现出最高活性的最适温度(Topt)是在pH4.0时为100℃。此外，若将0.5mM钙离子添加到酶-底物反应液中，则Topt升高至110℃，各温度的比活性也增加。于此相对的是，对于已知的内切葡聚糖酶的Topt，TrEG为60℃，TmEG为80℃。即，AR15G-90-3与作为超嗜热菌海栖热袍菌的EG相比，最适温度还高20℃以上。
此外，在整个温度区间都确认到，通过钙离子的添加，AR15G-90-3的CMC水解活性增加。特别明显的是，在钙离子的存在下，120℃以上的CMC分解活性的降低趋势变缓，与不存在钙离子时在140℃下的活性为最适温度下的活性的40％左右相对的是，在钙离子的存在下，在160℃下的活性保持在最适温度下的活性的60％。这被认为是由于钙离子的存在而获得的使酶蛋白稳定的效果。
<11>CMC水解活性的pH依赖性
对酶蛋白(AR15G-90-3)的CMC水解活性的pH依赖性进行了研究。测算中使用了在上述<7>中得到的纯化酶被50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释为0.13mg/mL的纯化酶溶液。此外，作为底物，使用了CMC(羧甲基纤维素，Sigma社制)。
具体而言，通过使由50μL McIlvaine缓冲液(pH3～8)、30μL纯化水、20μL纯化酶溶液(0.13mg/mL)和100μL 1质量％CMC水溶液构成的混合液在70℃下反应15分钟来进行。反应结束后，以与上述<8>相同的方式求得因酶的水解生成的还原糖含量，算出CMC水解活性(比活性)(U/mg)。
各个测算通过3次独立的试验进行，求取平均值和标准误差。测算结果示于图5中。pH标绘底物、缓冲液和酶的混合液的测量值。
AR15G-90-3在pH3～8的范围内表现出CMC水解活性。
最适pH在70℃下为pH4.4(底物、缓冲液和酶的混合液的测量值)。
<12>木聚糖酶活性的温度依赖性
由于AR15G-90-3也表现出木聚糖酶分解活性(木聚糖酶活性)，对木聚糖酶活性的温度依赖性进行了研究。测算中使用了在上述<7>中得到的纯化酶被50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释为0.13mg/mL的纯化酶溶液。此外，作为底物，使用了木聚糖酶(来源于榉木，Sigma社制)。
具体而言，通过使由50μL McIlvaine缓冲液(pH7.0)、20μL 50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、30μL纯化酶溶液(0.13mg/mL)和100μL1质量％木聚糖水溶液构成的混合液在40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或140℃下反应15分钟来进行。在进行100℃以上的活性测定时，使用了玻璃瓶、橡胶塞和铝盖(日电理化硝子社制)。反应结束后，使用由木糖制作的校准曲线，以与上述<8>相同的方式求得因酶的水解生成的还原糖含量，算出木聚糖酶活性(比活性)(U/mg)。
各个测算通过3次独立的试验进行，求取平均值和标准误差。测算结果示于图6中。AR15G-90-3在40～140℃的温度范围内表现出木聚糖酶活性。表现出最高活性的最适温度(Topt)是在pH7.0时为110℃。
<13>木聚糖酶活性的pH依赖性
对AR15G-90-3的木聚糖酶活性的pH依赖性进行了研究。测算中使用了在上述<7>中得到的纯化酶被50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释为0.1mg/mL的纯化酶溶液。此外，作为底物，使用了木聚糖酶(来源于榉木，Sigma社制)。
具体而言，通过使由25μL布里顿-罗宾逊(Britton-Robinson)缓冲液(pH5～10)、15μL纯化水、10μL纯化酶溶液(0.1mg/mL)和50μL1质量％木聚糖水溶液构成的混合液在70℃下反应15分钟来进行。反应结束后，以与上述<12>相同的方式求得因酶的水解生成的还原糖含量，算出木聚糖酶活性(比活性)(U/mg)。
各个测算通过3次独立的试验进行，求取平均值和标准误差。测算结果示于图7中。pH标绘底物、缓冲液和酶的混合液的测量值。AR15G-90-3在pH5～10的范围内表现出木聚糖酶活性。最适pH在70℃下为pH8.6(底物、缓冲液和酶的混合液的测量值)。
<11>以CMC和木聚糖为底物的AR15G-90-3的热稳定性
作为关于蛋白质的热稳定性的指标，使用了热变性温度或热解温度Tm(熔融温度)。通过一定时间的预加热(预温育)使酶活性降低至未处理区的50％的预温育温度T50几乎与蛋白质的热解温度Tm相同，能够通过测算酶活性来求得。通过此方法，求得AR15G-90-3的热解温度Tm。
具体而言，在不添加底物的条件下，在50～130℃下预加温(预温育)30分钟后进行酶促反应。使酶促反应的反应液的组成在CMC底物的情况下与上述<10>相同，在木聚糖底物的情况下与上述<12>相同，在70℃下反应15分钟。以CMC水解活性或木聚糖酶水解活性为降低至未处理区的50％的预温育温度T50指标，研究AR15G-90-3的热稳定性。各数据进行逻辑函数的逼近，将近似曲线成为相对活性值50％的温度设为T50(即Tm)。
分别将CMC水解活性测定结果示于图8，木聚糖水解活性的测定结果示于图9。酶活性表示为以非处理区(未预温育)的活性为100％的相对值(相对活性，％)。AR15G-90-3的CMC水解活性为T50＝108.6℃，木聚糖降解活性为T50＝107.6℃。
[实施例2]
尝试以温泉土壤样本AR15的全基因组序列数据集为基础，用新版拼接软件进行再拼接，获得AR15G-90的全长序列。
<1>温泉宏基因组数据的再拼接
对于实施例1的<1>中的用454测序仪解码的碱基序列，使用454生命科学的拼接软件Newbler2.7版进行拼接。以设定与实施例1的<2>相同的方式进行。
<2>内切葡聚糖酶的ORF预测
除了使用使用注释软件Metagene(Noguchi等，《DNA Research(DNA研究)》，2008，15(6))之外，以与实施例1的<3>同样的方式，由上述<2>得到的重叠群序列预测ORF。
<3>开放阅读框AR15G-90B
以与实施例1的<4>相同的方式进行基因的糖苷水解酶(GH)家族分类，通过BLASTP的相似性检索和HMMER，得到AR15G-90的N末端一侧的氨基酸为55个氨基酸残基长的ORF(开放阅读框AR15G-90B)。开放阅读框AR15G-90B编码由338个氨基酸残基构成的多肽，上述多肽为第1位氨基酸残基为蛋氨酸(M)、编码上述多肽的碱基序列的3’末端以终止密码子终止的全长序列(序列号9)。在上述多肽中，作为第56位氨基酸残基的缬氨酸(V)之后与AR15G-90为相同序列。根据使用信号序列预测软件Signal4.1进行的分析，估计不是信号肽。与上述ORF编码的多肽的氨基酸序列的序列一致性最高的已知氨基酸序列为泉古菌门Ignisphaera aggregans DSM17230所具有的糖苷水解酶第12家族(Genbank：ADM27292.1)。对于利用ClustalW算法算得的两者的氨基酸序列的相似性，全长为55％，从而确认了上述ORF为新的序列。
图10示出了开放阅读框AR15G-90B编码的多肽(AR15G-90B)的氨基酸序列(序列号9)、开放阅读框AR15G-90编码的多肽(AR15G-90)的氨基酸序列(序列号1)与Ignisphaeraaggregans DSM17230的糖苷水解酶第12家族的氨基酸序列(序列号8)的比对图。在图10中，黑白对比的氨基酸表示这些全部氨基酸序列中的相同氨基酸残基(一致序列)，“-”表示缺失(空位)。
<5>来自于开放阅读框AR15G-90B的基因克隆
除了使用由序列号14所示碱基序列构成的正向引物(5’-CACCATGAGTAGAAAGACAGCTGTTTACATAGCTATAGC-3’：在序列号13所示碱基序列的5’末端添加4个碱基(CACC)而成。5’一侧所添加的CACC为用于插入载体的序列。)之外，以与实施例1的<6>相同的方式进行基因克隆。
通过PCR克隆，从开放阅读框AR15G-90B得到基因克隆AR15G-90B-15。作为内切葡聚糖酶候选基因的基因克隆AR15G-90B-15的碱基序列(序列号12)与开放阅读框AR15G-90B(序列号10)一样包含1,017bp，与ORF有13个碱基不同(表2)。其中3处的碱基不同使氨基酸也不同，开放阅读框AR15G-90B的氨基酸序列(序列号9)与内切葡聚糖酶候选基因AR15G-90B-15的氨基酸序列(序列号11)有3个氨基酸残基不同。即，第122位的氨基酸残基在开放阅读框AR15G-90B中为丝氨酸(S)，而在所克隆的AR15G-90B-15基因中为天冬酰胺(N)；第273位的氨基酸残基在开放阅读框AR15G-90B中为缬氨酸(V)，而在所克隆的AR15G-90B-15基因中为异亮氨酸(I)，第314位的氨基酸残基在开放阅读框AR15G-90B中为蛋氨酸(M)，而在所克隆的AR15G-90B-15基因中为苏氨酸(T)。
[表2]
<5>AR15G-90B-15的基因表达和CMC水解活性测定
以与实施例1的<7>和<8>相同的方式，利用大肠杆菌表达基因，对AR15G-90B-15基因编码的酶蛋白(AR15G-90B-15)的内切葡聚糖酶活性进行研究。CMC水解活性测定通过利用基因重组大肠杆菌破碎上清液在50、70、90℃下反应1小时来进行。测算通过3次独立的试验进行，求取平均值和标准误差。在各温度下，由AR15G-90B-15蛋白的CMC水解(pH4.0)生成的还原糖含量为以最高还原糖含量的值的100％的相对值(％)，将其作为CMC水解活性的相对值进行标绘(图11)。AR15G-90B-15示出了各温度下的CMC水解活性，在测算过的3个点，90℃为表现出最高活性的温度。

Claims (10)

1.一种超耐热性内切葡聚糖酶，其特征在于具有由序列号3或序列号11所示氨基酸序列构成的多肽。
2.根据权利要求1所述的超耐热性内切葡聚糖酶，其中，所述多肽进一步在110℃且pH7.0的条件下具有木聚糖酶活性。
3.一种多核苷酸，其具有编码由序列号3或序列号11所示氨基酸序列构成的多肽的碱基序列。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其中，所述多肽进一步在110℃且pH7.0的条件下具有木聚糖酶活性。
5.一种表达载体，其整合了权利要求3或4所述的多核苷酸，在宿主细胞中可表达具有内切葡聚糖酶活性的多肽。
6.一种转化体，其导入有权利要求5所述的表达载体。
7.根据权利要求6所述的转化体，其为真核微生物。
8.一种超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法，其包括在根据权利要求6或7所述的转化体中生产超耐热性内切葡聚糖酶。
9.一种糖苷水解酶混合物，其包含权利要求1或2所述的超耐热性内切葡聚糖酶、权利要求3或4所述的多核苷酸编码的超耐热性内切葡聚糖酶、或者利用权利要求8所述的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制得的超耐热性内切葡聚糖酶及至少一种其他糖苷水解酶。
10.一种木质纤维素分解产物的制造方法，其包括使包含纤维素的木质纤维素所构成的材料与权利要求1或2所述的超耐热性内切葡聚糖酶、权利要求3或4所述的多核苷酸编码的超耐热性内切葡聚糖酶、权利要求6或7所述的转化体、利用权利要求8所述的超耐热性内切葡聚糖酶的制造方法制得的超耐热性内切葡聚糖酶、或者权利要求9所述的糖苷水解酶混合物接触，由此生产木质纤维素分解产物。
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