JP2016034254A - Ghファミリー12に属する超耐熱性エンドグルカナーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも110℃、pH4.0の条件下でCMCを基質とした加水分解活性を有し、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、特定のアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は特定のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、超耐熱性エンドグルカナーゼ。前記超耐熱性エンドグルカナーゼを含むグリコシド加水分解酵素混合物。
【選択図】なし
Description
[1] (A)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
(C)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、超耐熱性エンドグルカナーゼ。
[2] 前記エンドグルカナーゼ触媒領域が、さらに、110℃、pH7.0の条件下でキシラナーゼ活性を有する、前記[1]の超耐熱性エンドグルカナーゼ。
[3] (a)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(b)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(c)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(d)配列番号4又は配列番号12で表される塩基配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(e)配列番号4又は配列番号12で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
[4] 前記ポリペプチドが、さらに、110℃、pH7.0の条件下でキシラナーゼ活性を有する、前記[3]のポリヌクレオチド。
[5] 前記[3]又は[4]のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
[6] 前記[5]の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
[7] 真核微生物である、前記[6]の形質転換体。
[8] 前記[6]又は[7]の形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産することを含む、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
[9] 前記[1]若しくは[2]の超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記[3]若しくは[4]のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記[8]の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも1種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
[10] セルロースを含む材料を、前記[1]若しくは[2]の超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記[3]若しくは[4]のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、前記[6]しくは前記[7]に記載の形質転換体、前記[8]の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記[9]のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造に好適に用いられる。
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の99%が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の0.1%以下を単離及び培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。
(A)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(すなわち、AR15G−90−3)、
(B)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でCMCを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
(C)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でCMCを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼをコードする。当該超耐熱性エンドグルカナーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
(b)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でCMCを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(c)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でCMCを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(d)配列番号4又は配列番号12で表される塩基配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でCMCを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(e)配列番号4又は配列番号12で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でCMCを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも110℃、pH4.0の条件下でCMCを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するDNA、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するDNAからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた超耐熱性エンドグルカナーゼを生産し得る。
本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に超耐熱性エンドグルカナーゼを発現させる。
前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも1種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物として多糖類の加水分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
本発明に係るリグノセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼによりセルロースやへミセルロースを加水分解して、オリゴ糖を産生することによってリグノセルロース分解物を得る方法である。具体的には、ヘミセルロース若しくはセルロースを含む材料を、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼ、本発明に係る形質転換体、本発明に係る超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、ヘミセルロース若しくはセルロース分解物を生産する。
<1> 温泉土壌からのDNA抽出と全ゲノムシーケンス(Whole Genome Sequence、WGS)
超耐熱性エンドグルカナーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌DNAを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムDNAの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の3ヶ所、5地点(メタゲノムDNAサンプルN2、AR19、AR15、OJ1、及びH1)から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度58〜78℃、pH7.2〜8のレンジにあった。
温泉土壌サンプルAR15について、メタゲノムDNAの配列解読を行い、平均リード長370bp、総リード数5,419,406個、総ゲノム解読量2,007,725,040bpの全ゲノムシーケンス(WGS)データセットを得た。
454シーケンサーで読みとられた塩基配列は、Roche 454の出力(sffファイル)をPyroBayes(Quinlan et al., Nature Methods,2008,vol.5,p.179-81.)にて再ベースコールし、FASTA形式の配列ファイル及びQuality値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、454 Life SciencesのアセンブルソフトウェアNewbler version 2.3を使ってアセンブルした。アセンブルは、「minimum acceptable overlap match (mi)=0.9」、「option:−large(for large or complex genomes,speeds up assembly,but reduces accuracy.)」に設定して行った。
100bp以上にアセンブルされた総コンティグ長は、 合計118,600,846bpであり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数5,419,406リードのうち4,805,640リードが、平均で1,146bp以上のコンティグにアセンブルされ(計103,508コンティグ)、このうち最大コンティグ長は151,585bpであった。
UniProtデータベース(http://www.uniprot.org/)からEC番号が3.2.1.4(セルラーゼ)、3.2.1.21(β−グルコシダーゼ)、3.2.1.37(β−キシロシダーゼ) 、3.2.1.91(セルロース 1,4−β−セロビオシダーゼ)、3.2.1.8(エンド1,4−β−キシラナーゼ)の配列をダウンロードし(アクセス日:2011/12/9)、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアOrphelia(Hoff et al.,Nucleic Acids Research,2009,37(Web Server issue:W101-W105)を使用して、前記<2>で得たコンティグ配列から、遺伝子領域(=オープンリーディングフレーム)を推定した(Orphelia option:default(model=Net700,maxoverlap=60)。推定されたORFからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、BLASTP(blastall ver. 2.2.18)を使い、前記ローカルデータベースに参照した。BLASTPのoption条件は、「Filter query sequence=false」、「Expectation value(E)<1e−20」[以下、デフォルト値:Cost to open a gap=−1、Cost to extended gap=−1、X dropoff value for gapped alignment=0、Threshold for extending hits=0、Word size=default]とし、ヒットしたORF配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。収集された塩基配列は、セルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含んでいた。
前記<3>で収集された塩基配列について、タンパク質の機能領域配列データベースpfam HMMs(Pfam version 23.0 and HMMER v2.3;Finn et al.,Nucleic Acids Research Database,2010,Issue 38,p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムHMMER(Durbin et al.,‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998,Cambridge University Press.;hmmpfam(Ver.2.3.2)、E−value cutoff<1e−5; Database=Pfam_fs(models that can be used to find fragments of the represented domains in a sequence.))を用いて、Pfam領域データベースとの相同性から、前記<3>で収集された各塩基配列についてグリコシド加水分解酵素(GH)ファミリーを決定した。なお、GH触媒ドメインの配列を70%以上カバーしているものを、各ファミリーに属する酵素遺伝子としてカウントした。
オープンリーディングフレームAR15G−90は、283アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、1位のアミノ酸残基がバリン(V)で、3’末端が終始コドンで終わる不完全長配列(配列番号1)である。モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームAR15G−90は、101位のグリシン(G)から271位のロイシン(L)までの171アミノ酸残基がGlycoside hydrolase family 12の触媒ドメインをコードしていると推測された。当該ORFと最も配列同一性が高かった既知アミノ酸配列は、クレンアーキオータ門イグニスファエラ・アグレガンス DSM17230が持つグリコシドハイドロラーゼファミリー12(Genbank:ADM27292.1)であった。ClustalWアルゴリズムにより算出した両者のアミノ酸配列の相同性は、全長で56%、GH12触媒領域については64%であったため、当該ORFは新規な配列であると確認された。
配列番号7で表される塩基配列からなるフォワードプライマー(5’−CACCATGGTGACCATCACGCCGAGTACA−3’:配列番号5で表される塩基配列の5’末端側に4塩基(CACC)と開始コドン(ATG)を付加したもの。5’側に付加したCACCは、ベクターに挿入するための配列である。)と配列番号6で表される塩基配列からなるリバースプライマー(5’−CTACCTCAGTGTTTTACCTGGC−3’)を用い、ゲノムDNA増幅キット(GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit、GEヘルスケア社製)で増幅した温泉土壌DNAをテンプレートにして、PCRを行った。配列番号5で表される塩基配列は、配列番号2で表される塩基配列の1〜21位の塩基からなる部分配列と相同的な(同一の)塩基配列である。また、配列番号6で表される塩基配列は、配列番号2で表される塩基配列の831〜852位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したPCR産物は、Champion pET Directional TOPO(登録商標) Expression Kits(ライフテクノロジーズ社製)のpET101/D−TOPOベクターに挿入し、One Shot TOP10株に形質転換した。コロニーPCRによりポジティブクローンを選抜し、100mg/Lアンピシリンを含むLB液体培地を用いて37℃、200rpmで17〜20時間培養した後、ミニプレップキット(Wizard(登録商標) plus SV Minipreps DNA Purification System、Promega社製)を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の3730 DNA Analyzerシーケンサーを用いて配列確認を行った。
酵素タンパク質の精製には、C末端側にヒスチジンタグを付加させたタンパク質を用いた。上記pET101/D−TOPOベクターにエンドグルカナーゼ候補遺伝子AR15G−90−3のストップコドンを外したものを挿入することによって、ヒスチジンタグ付加配列を作製した。タグ配列が付加された目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Rosetta−gamiB(DE3)pLysS株(Merck社製)を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を100mg/Lアンピシリンを含むLB培地に植菌し、OD600=0.2〜0.8程度まで培養した後、IPTG(Isopropyl−β−D(−)−thiogalactopyranoside)を添加し、さらに5〜20時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の1/10容量の50mM Tris−HCl Buffer(pH8.0)を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置astrason3000(MISONIX社製)を用いて、5分間破砕−5分間休止工程を7〜8回繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター(孔径φ=0.45μm、ミリポア社製)で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
まず、CMC(カルボキシメチルセルロース、Sigma社製)を基質とし、AR15G−90−3遺伝子がコードする酵素タンパク質(AR15G−90−3)のCMC加水分解活性を調べた。
前記<7>で得られた遺伝子組換え大腸菌破砕上清、又は精製途中の酵素試料のCMC加水分解活性測定は、100μLの1質量%CMC水溶液、 50μLの200mM 酢酸バッファー(pH4.0)、50μLの遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製途中の酵素試料からなる混合液を、40〜99℃で10〜15分間反応させることにより行った。全ての計測において、遺伝子組換え大腸菌破砕上清又は精製酵素試料の代わりに50mMのTris−HClバッファー(pH8.0)を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素は、反応温度で5分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応終了後は、等量の3,5−dinitrosalicylic acid reagent(DNS溶液)を加えて100℃で5分間加熱処理し、5分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて540nmによって吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。1分間に1μmolの還元糖を生成する酵素活性を1Uとし、タンパク質量で除した値を比活性(U/mg)とした。
AR15G−90−3遺伝子がコードする酵素タンパク質(AR15G−90−3)に対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記<7>で得られた精製酵素溶液(0.2mg/mL)を用いた。また、基質として、PSA、アビセル粉末(微結晶性セルロース粉末、Merck社製)、CMC(Sigma社製)、キシラン(ブナ材由来、Sigma社製)、リケナン(MP Biomedicals社製)、ラミナリン(Laminaria digitata由来、Sigma社製)、PNPC(Sigma社製)、PNPX(Sigma社製)、及びPNPG(Sigma社製)を用いた。
PSAはリン酸溶液でアビセル粉末(微結晶性セルロース粉末、Merck社製)を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、pHが5以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたPSAは全て当該方法により調製した。
PNPG、PNPX、又はPNPCを基質とした反応においては、反応終了後は、等量の200mM 炭酸ナトリウム水溶液を加えて5分間遠心し、上清を得た。上清中のp−ニトロフェノール量を、分光光度計を用いて420nmによって吸光度を計測し、p−ニトロフェノールで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したp−ニトロフェノール量を求めた。1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを生成する酵素活性を1Uとし、タンパク質量で除した値を比活性(U/mg)とした。
酵素タンパク質(AR15G−90−3)のCMC加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記<7>で得られた精製酵素を50mMのTris−HClバッファー(pH8.0)で0.13mg/mLに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、CMC(カルボキシメチルセルロース、Sigma社製)を用いた。
酵素タンパク質(AR15G−90−3)のCMC加水分解活性のpH依存性を調べた。計測には、前記<7>で得られた精製酵素を50mMのTris−HClバッファー(pH8.0)で0.13mg/mLに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、CMC(カルボキシメチルセルロース、Sigma社製)を用いた。
AR15G−90−3は、pH3〜8の範囲において、CMC加水分解活性を示した。至適pHは、70℃でpH4.4(基質、バッファーと酵素の混合液の実測値)であった。
AR15G−90−3はキシラン分解活性(キシラナーゼ活性)も示したため、キシラナーゼ活性の温度依存性を調べた。計測には、前記<7>で得られた精製酵素を50mMのTris−HClバッファー(pH8.0)で0.13mg/mLに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、キシラン(ブナ材由来、Sigma社製)を用いた。
AR15G−90−3のキシラナーゼ活性のpH依存性を調べた。計測には、前記<7>で得られた精製酵素を50mMのTris−HClバッファー(pH8.0)で0.1mg/mLに希釈した精製酵素溶液を用いた。また、基質としては、キシラン(ブナ材由来、Sigma社製)を用いた。
タンパク質の熱安定性に関わる指標として、熱変性温度又は熱崩壊温度Tm(melting temperature)がしばしば使われる。一定時間の予備加温(プリインキュベーション)により酵素活性が無処理区の50%に減少するプリインキュベーション温度T50はタンパク質の熱崩壊温度Tmにほぼ等しく、酵素活性を計測することにより求めることができる。この方法により、AR15G−90−3の熱崩壊温度Tmを求めた。
温泉土壌サンプルAR15の全ゲノムシーケンスデータセットを元に、バージョンアップしたアセンブルソフトウェアで再度アセンブルを行い、AR15G−90の全長配列の取得を試みた。
実施例1の<1>において454シーケンサーで読みとられた塩基配列に対して、454 Life SciencesのアセンブルソフトウェアNewbler version 2.7を使ってアセンブルを行った。設定は実施例1の<2>と同様にして行った。
アノテーションソフトウェアとしてMetagene(Noguchi et al., DNA Research,2008,15(6))を使用した以外は、実施例1の<3>と同様にして、前記<2>で得たコンティグ配列からORF予測を行った。
実施例1の<4>と同様にして、遺伝子のグリコシド加水分解酵素(GH)ファミリー分類を行い、BLASTPによる相同性検索及びHMMERにより、AR15G−90のN末側アミノ酸が55アミノ酸残基長いORF(オープンリーディングフレームAR15G−90B)が得られた。オープンリーディングフレームAR15G−90Bは、338アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、1位のアミノ酸残基がメチオニン(M)で、3’末端が終始コドンで終わる完全長配列(配列番号9)であった。56位のアミノ酸残基であるバリン(V)以降はAR15G−90と同一配列であった。シグナル配列予測ソフトウェアSignalP 4.1を使った解析によれば、シグナルペプチドは予想されなかった。当該ORFと最も配列同一性が高かった既知アミノ酸配列は、クレンアーキオータ門イグニスファエラ・アグレガンス DSM17230が持つグリコシドハイドロラーゼファミリー12(Genbank:ADM27292.1)であり、ClustalWアルゴリズムにより算出した両者のアミノ酸配列の相同性は、全長で55%であったため、当該ORFは新規な配列であると確認された。
配列番号14で表される塩基配列からなるフォワードプライマー(5’−CACCATGAGTAGAAAGACAGCTGTTTACATAGCTATAGC−3’:配列番号13で表される塩基配列の5’末端側に4塩基(CACC)を付加したもの。5’側に付加したCACCは、ベクターに挿入するための配列である。)を用いた以外は、実施例1の<6>と同様にして、遺伝子クローニングを行った。
実施例1の<7>及び<8>と同様にして、大腸菌を用いて遺伝子を発現させ、AR15G−90B−15遺伝子がコードする酵素タンパク質(AR15G−90B−15)のエンドグルカナーゼ活性を調べた。CMC加水分解活性測定は、遺伝子組換え大腸菌破砕上清を用い、50、70、90℃で1時間反応させることにより行った。計測は、3回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。各温度における、AR15G−90B−15タンパク質によるCMC加水分解(pH4.0)によって生じた還元糖量を、最も高い還元糖量の値を100%とした相対値(%)とし、これをCMC加水分解活性の相対値としてプロットした(図11)。AR15G−90B−15は、各温度においてCMC加水分解活性を示し、計測した3点では90℃が最も高い活性を示した温度であった。
Claims (10)
- (A)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(B)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
(C)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域を有することを特徴とする、超耐熱性エンドグルカナーゼ。 - 前記エンドグルカナーゼ触媒領域が、さらに、110℃、pH7.0の条件下でキシラナーゼ活性を有する、請求項1に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ。
- (a)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
(b)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列のうちの1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(c)配列番号3又は配列番号11で表されるアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(d)配列番号4又は配列番号12で表される塩基配列と70%以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
(e)配列番号4又は配列番号12で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも110℃、pH4.0の条件下でカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドが、さらに、110℃、pH7.0の条件下でキシラナーゼ活性を有する、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項3又は4に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。 - 請求項5に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
- 真核微生物である、請求項6に記載の形質転換体。
- 請求項6又は7に記載の形質転換体内で、超耐熱性エンドグルカナーゼを生産することを含む、超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法。
- 請求項1若しくは2に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項3若しくは4に記載のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は請求項8に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼと、少なくとも1種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
- セルロースを含む材料を、請求項1若しくは2に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項3若しくは4に記載のポリヌクレオチドがコードする超耐熱性エンドグルカナーゼ、請求項6若しくは7に記載の形質転換体、請求項8に記載の超耐熱性エンドグルカナーゼの製造方法によって製造された超耐熱性エンドグルカナーゼ、又は請求項9に記載のグリコシド加水分解酵素混合物に接触させることにより、リグノセルロース分解物を生産することを含む、リグノセルロース分解物の製造方法。
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