JP6586659B2 - 耐熱性グリコシド加水分解酵素 - Google Patents
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Description
本発明は、セロビオハイドロラーゼとエンドグルカナーゼが連結した耐熱性グリコシド加水分解酵素、当該耐熱性グリコシド加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性グリコシド加水分解酵素を発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性グリコシド加水分解酵素を用いたセルロース分解物の製造方法に関する。
植物バイオマス、若しくはリグノセルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。植物バイオマス乾燥重量の主要構成要素は、セルロースやヘミセルロース等の多糖類とリグニンから成るリグノセルロースである。例えば、多糖類は、グリコシド加水分解酵素であるセルラーゼやヘミセルラーゼによってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品の原料として利用される。
リグノセルロースは複雑な構造を持ち、難分解性であり、単一のグリコシド加水分解酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、エンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１、ＥＣ ３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされ、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ ３．２．１．８）やβ−キシロシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３７）などの他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。
従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％ ｓｏｌｉｄ ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば７５℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。
セロビオハイドロラーゼは、リグノセルロース加水分解プロセスにおいて最も重要な役割を果たしているが、その多くは糸状菌由来のものであり、その耐熱性は一般的にあまり高くない。至適温度が６５℃を超える耐熱性のセロビオハイドロラーゼは、これまでに数個報告されているにすぎない（例えば、特許文献１参照）。耐熱性エンドグルカナーゼについては、リグノセルロースの分解やセルロース繊維の処理剤、紙パルプの処理を目的として、これまでに好熱性細菌、糸状菌、アーキア等から多く分離されている（例えば、特許文献２参照）。触媒ドメインが連結した耐熱性のセルラーゼ複合酵素については、好熱性細菌カルジセルロシルプトル・ベスシ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｓｃｉｉ）のＣｅｌＡが報告されており、ＧＨファミリー（Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ）９とＧＨファミリー４８の触媒ドメインは、それぞれを単独で用いた場合よりも連結させて用いた方がセルロースの分解活性が向上することが報告されている（非特許文献１参照。）。
しかしながら、耐熱性セロビオハイドロラーゼと耐熱性エンドグルカナーゼが連結した天然由来の酵素については、今までに報告された例がない。糸状菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオハイドロラーゼと好熱性細菌アシドサーマス・セルリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）のエンドグルカナーゼを人為的に連結させた酵素が報告されているが、連結した酵素タンパク質だけではなく、切断されたエンドグルカナーゼも生産されており、効率的ではない（特許文献３、非特許文献２参照。）。
Yi et al., Plosone, 2013, vol.8, e84172
Zou et al., Microbial Cell Factories, 2012, vol.11, p.21.
本発明は、少なくとも６５℃で、さらにはカルシウムイオン存在下においては７０℃で、セロビオハイドロラーゼ活性とエンドグルカナーゼ活性を示す、ＧＨファミリー６に属する耐熱性セロビオハイドロラーゼ触媒領域とＧＨファミリー５に属する耐熱性エンドグルカナーゼ触媒領域とが連結された耐熱性グリコシド加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性グリコシド加水分解酵素を発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該耐熱性グリコシド加水分解酵素を用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく、堆肥培養物からＤＮＡを抽出し、単離が困難な微生物叢の大規模ゲノムシーケンスを行うことにより、耐熱性セロビオハイドロラーゼ触媒領域と耐熱性エンドグルカナーゼ触媒領域とが連結された新規耐熱性グリコシド加水分解酵素の取得に成功し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法、セルラーゼ混合物及びセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１０］である。
［１］ （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチド、
からなるグリコシド加水分解酵素触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性グリコシド加水分解酵素。
［２］ カルシウムイオン存在下において、７０℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有する、前記［１］の耐熱性グリコシド加水分解酵素。
［３］ （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるグリコシド加水分解酵素触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［４］ 前記ポリペプチドが、カルシウムイオン存在下において、７０℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性とカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有する、前記［３］のポリヌクレオチド。
［５］ 前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］ 前記［５］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］ 真核微生物である、前記［６］の形質転換体。
［８］ 前記［６］又は［７］の形質転換体内で、耐熱性グリコシド加水分解酵素を生産することを含む、耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法。
［９］ 前記［１］若しくは［２］の耐熱性グリコシド加水分解酵素、又は前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性グリコシド加水分解酵素と、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１０］ セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］の耐熱性グリコシド加水分解酵素、又は前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性グリコシド加水分解酵素、前記［６］若しくは［７］の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
［１］ （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチド、
からなるグリコシド加水分解酵素触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性グリコシド加水分解酵素。
［２］ カルシウムイオン存在下において、７０℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有する、前記［１］の耐熱性グリコシド加水分解酵素。
［３］ （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるグリコシド加水分解酵素触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［４］ 前記ポリペプチドが、カルシウムイオン存在下において、７０℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性とカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有する、前記［３］のポリヌクレオチド。
［５］ 前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［６］ 前記［５］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［７］ 真核微生物である、前記［６］の形質転換体。
［８］ 前記［６］又は［７］の形質転換体内で、耐熱性グリコシド加水分解酵素を生産することを含む、耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法。
［９］ 前記［１］若しくは［２］の耐熱性グリコシド加水分解酵素、又は前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性グリコシド加水分解酵素と、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１０］ セルロースを含む材料を、前記［１］若しくは［２］の耐熱性グリコシド加水分解酵素、又は前記［３］若しくは［４］のポリヌクレオチドがコードする耐熱性グリコシド加水分解酵素、前記［６］若しくは［７］の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０において、カルシウムイオン存在下においては少なくとも７０℃、ｐＨ４．０において、セロビオハイドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼ活性を有する。このため、当該耐熱性グリコシド加水分解酵素は、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。さらには、１個の酵素で２種の触媒領域を有しているため、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を用いることにより、セルロースの糖化処理に必要な酵素種数を減らすことが可能である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造に好適に用いられる。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造に好適に用いられる。
［耐熱性グリコシド加水分解酵素］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物の単離を目指す培養技術では、自然界から採取された天然サンプル中に生息する微生物の０．１％以下を単離しているにすぎないと考えられている。この微生物の難培養性が、耐熱性グリコシド加水分解酵素の開発が進まない一因である。よって、耐熱性グリコシド加水分解酵素の開発には、従来のような単離培養技術に頼らないアプローチが必要である。
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物の単離を目指す培養技術では、自然界から採取された天然サンプル中に生息する微生物の０．１％以下を単離しているにすぎないと考えられている。この微生物の難培養性が、耐熱性グリコシド加水分解酵素の開発が進まない一因である。よって、耐熱性グリコシド加水分解酵素の開発には、従来のような単離培養技術に頼らないアプローチが必要である。
近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。しかしながら、有機物の分解が活発に行われている堆肥には数多くの微生物が存在しており、次世代ギガシーケンサーを用いても、網羅的にゲノムを解読するためには、より多くの解読量が必要となる。そこで、目的の性質を有する微生物叢を効率的に得るために、炭素源をセルロースのみとした培地で培養する手法を用いた。
本発明者らは、後記実施例１に示すように、日本国内において採取した堆肥の培養物から微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知セロビオハイドロラーゼ酵素と類似したアミノ酸配列と既知エンドグルカナーゼ酵素と類似したアミノ酸配列の両方を有するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。得られたＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、堆肥培養物のゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、リン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｗｏｌｌｅｎ Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）分解活性アッセイ及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からＰＳＡ分解活性とＣＭＣ分解活性の両方を持つ耐熱性グリコシド加水分解酵素（以下、「ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７」）を得た。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のアミノ酸配列を配列番号１に、塩基配列を配列番号２に、それぞれ表す。
後記実施例１に示すように、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は、ＰＳＡとＣＭＣの両方に対し加水分解活性を示した。また、β−１，３結合とβ−１，４結合グルカンからなるリケナン、ＰＮＰＣ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド）にも分解活性を示し、結晶性セルロースであるアビセルにも弱い分解活性を示した。この基質特異性と既知のセロビオハイドロラーゼ及びエンドグルカナーゼとのアミノ酸相同性とから、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７が、ＧＨファミリー６に属するセロビオハイドロラーゼ触媒領域とＧＨファミリー５に属するエンドグルカナーゼ触媒領域の両方を有する複合酵素であることが示唆された。
なお、本発明及び本願明細書において、セロビオハイドロラーゼ活性とは、β−グルコシド結合を含むグルカンを基質とし、前記基質を加水分解することによりセロビオースを生成する活性を意味する。
また、エンドグルカナーゼ活性とは、β−１，４−グリコシド結合をエンド型に加水分解する活性を意味する。
また、エンドグルカナーゼ活性とは、β−１，４−グリコシド結合をエンド型に加水分解する活性を意味する。
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、既知のエキソグルカナーゼ及びエンドグルカナーゼとの配列同一性から、配列番号１のアミノ酸配列のうち、５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域がセロビオハイドロラーゼ触媒領域であり、５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域がエンドグルカナーゼ触媒領域であることがわかった。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のセロビオハイドロラーゼ触媒領域のアミノ酸配列と最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、既知のスチグマテラ・オーランチアカ（Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ）が持つＧＨファミリー６に属するエキソグルカナーゼＡ（配列番号６）のＧＨ６触媒領域であり、７６％の相同性（配列同一性）を示した。また、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のエンドグルカナーゼ触媒領域のアミノ酸配列と最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、既知のパエニバシラス・サブスピーシーズＫＳＭ−Ｎ１４５（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＫＳＭ−Ｎ１４５）が持つＧＨファミリー５に属するエンドグルカナーゼ（配列番号７）のＧＨ５触媒領域であり、７３％の配列同一性を示した。また、当該アミノ酸配列データベースには、セロビオハイドロラーゼ触媒領域とエンドグルカナーゼ触媒領域の両方を有する複合酵素はなく、かつセロビオハイドロラーゼ触媒領域と一致するアミノ酸配列からなるセロビオハイドロラーゼや、エンドグルカナーゼ触媒領域と一致するアミノ酸配列からなるエンドグルカナーゼもなかったことから、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は新規なグリコシド加水分解酵素であることが明らかとなった。
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性とエンドグルカナーゼ活性を有する。実際に、後記実施例１に示すように、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は、２０〜８５℃の広い温度範囲内、かつｐＨ３〜９の広いｐＨ範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示し、３０〜９０℃の広い温度範囲内、かつｐＨ３〜９の広いｐＨ範囲内でエンドグルカナーゼ活性を示す。
また、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は、２価の金属イオン存在下で、金属イオン非存在下よりもより高温でも高いセロビオハイドロラーゼ活性を示す。実際に、後記実施例１に示すように、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は、カルシウムイオン存在下で、少なくとも７０℃、ｐＨ４．０の条件下で、セロビオハイドロラーゼ活性を有する。特に、カルシウムイオン存在下では、７５℃においても非常に高いセロビオハイドロラーゼ活性を示す。
一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７に対しても、セロビオハイドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼ活性を失わせることなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
すなわち、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、下記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかからなるグリコシド加水分解酵素触媒領域を有する、耐熱性グリコシド加水分解酵素である。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドと、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドとが直接又はリンカーを介して連結されたポリペプチド、
（Ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドと、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドとが直接又はリンカーを介して連結されたポリペプチド。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドと、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドとが直接又はリンカーを介して連結されたポリペプチド、
（Ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドと、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドとが直接又はリンカーを介して連結されたポリペプチド。
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。同様に、前記（Ｄ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域のアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。同様に、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域のアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。
なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
前記（Ｂ）〜（Ｅ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
前記（Ａ）〜（Ｅ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）〜（Ｅ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
前記（Ａ）〜（Ｅ）のポリペプチドは、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼ活性を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのポリペプチドをグリコシド加水分解酵素触媒領域として有することにより、耐熱性グリコシド加水分解酵素が得られる。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、ＰＳＡとＣＭＣの両方を基質とする。当該耐熱性グリコシド加水分解酵素は、ＰＳＡとＣＭＣ以外のその他のβグルカンを基質としてもよい。当該その他のβグルカンとしては、例えば、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、セロビオース等のβ−１，４結合からなるグルカン；キシラン；ＰＮＰＧＡＬ；ＰＮＰＸ；リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）等のβ−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素としては、ＰＳＡ及びＣＭＣに加えてアビセル及びリケナンを基質とするものが好ましい。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、少なくともｐＨ４．０の条件で、ＰＳＡを基質とする加水分解活性（セロビオハイドロラーゼ活性）を、６０〜７０℃の温度範囲内で示すことが好ましく、５０〜７５℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、２０〜８５℃の広い温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素のセロビオハイドロラーゼ活性の至適温度は、５０〜７５℃の温度範囲内にあることが好ましく、６０〜７０℃の温度範囲内にあることがより好ましい。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素のセロビオハイドロラーゼ活性の至適ｐＨは、ｐＨ４．０〜５．０の範囲内にある。本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素としては、少なくともｐＨ３．５〜７．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ３．０〜９．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものがより好ましい。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、少なくともｐＨ４．０の条件で、ＣＭＣを基質とする加水分解活性（エンドグルカナーゼ活性）を、６０〜８０℃の温度範囲内で示すことが好ましく、５０〜８５℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、３０〜９０℃の広い温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ活性の至適温度は、６０〜８０℃の温度範囲内にあることが好ましく、６５〜８０℃の温度範囲内にあることがより好ましい。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ活性の至適ｐＨは、ｐＨ５．０〜７．０の範囲内にある。本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素としては、少なくともｐＨ４．０〜８．０の範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ３．０〜９．０の範囲内においてエンドグルカナーゼ活性を示すものがより好ましい。
また、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、２価の金属イオン存在下で、金属イオン非存在下よりもより高温でも高いセロビオハイドロラーゼ活性を示すことが好ましく、少なくとも７０℃、ｐＨ４．０の条件下セロビオハイドロラーゼ活性を有することがより好ましく、３０〜８０℃の広い温度範囲内、かつｐＨ３．０〜９．０の広いｐＨ範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示すことがさらに好ましい。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、セロビオハイドロラーゼ活性とエンドグルカナーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、キシラナーゼ活性、β−ガラクトシダーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はβ−グルコシダーゼ活性等が挙げられる。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、前記（Ａ）〜（Ｅ）のポリペプチドのいずれかからなるグリコシド加水分解酵素触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のグリコシド加水分解酵素が有する、グリコシド加水分解酵素触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素には、公知のグリコシド加水分解酵素に対し、グリコシド加水分解酵素触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｅ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素がグリコシド加水分解酵素触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュール（ＣＢＭ）を含むことが好ましい。セルロース結合モジュールは、グリコシド加水分解酵素触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとグリコシド加水分解酵素触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素としては、グリコシド加水分解酵素触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、グリコシド加水分解酵素触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素が含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素がグリコシド加水分解酵素触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、その他にも、Ｎ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。
また、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えばＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。
［耐熱性グリコシド加水分解酵素をコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素をコードする。当該耐熱性グリコシド加水分解酵素は、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素をコードする。当該耐熱性グリコシド加水分解酵素は、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｈ)のいずれかの塩基配列からなるグリコシド加水分解酵素触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドと、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドとが直接又はリンカーを介して連結されたポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドと、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドとが直接又はリンカーを介して連結されたポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号２で表される塩基配列の１５３〜１４５５番目の塩基からなる領域と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、配列番号２で表される塩基配列の１５９０〜２４６９番目の塩基からなる領域と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列とが直接又はリンカーを介して連結された塩基配列。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドと、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドとが直接又はリンカーを介して連結されたポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５１〜４８５番目のアミノ酸からなる領域と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドと、配列番号１で表されるアミノ酸配列中の５３０〜８２３番目のアミノ酸からなる領域と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドとが直接又はリンカーを介して連結されたポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性及びＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号２で表される塩基配列の１５３〜１４５５番目の塩基からなる領域と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＰＳＡを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列と、配列番号２で表される塩基配列の１５９０〜２４６９番目の塩基からなる領域と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でＣＭＣを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列とが直接又はリンカーを介して連結された塩基配列。
なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
前記（ａ）〜（ｈ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。
配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７をコードする遺伝子（「ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子」ということがある。）の全長若しくはグリコシド加水分解酵素触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。
前記（ｆ）の塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。
なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
例えば、前記（ｂ）〜（ｈ)の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）〜（ｈ)の塩基配列としては、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
本発明に係るポリヌクレオチドは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域及びエンドグルカナーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を発現させ得る。従来公知のグリコシド加水分解酵素は、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、大腸菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。このため、発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性グリコシド加水分解酵素を生産し得る。
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を発現させ得る。従来公知のグリコシド加水分解酵素は、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、大腸菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。このため、発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性グリコシド加水分解酵素を生産し得る。
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
［耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法］
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性グリコシド加水分解酵素を生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素が恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性グリコシド加水分解酵素を発現させる。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性グリコシド加水分解酵素を生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素が恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性グリコシド加水分解酵素を発現させる。
形質転換体によって生産された耐熱性グリコシド加水分解酵素は、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
形質転換体から耐熱性グリコシド加水分解酵素を抽出又は精製する方法は、耐熱性グリコシド加水分解酵素のセロビオハイドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼ活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性グリコシド加水分解酵素を抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性グリコシド加水分解酵素は、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性グリコシド加水分解酵素を含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素が、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性グリコシド加水分解酵素を簡便に精製することができる。
すなわち、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性グリコシド加水分解酵素を生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性グリコシド加水分解酵素を抽出し精製することを含む。
［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素、又は前記本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法によって製造された耐熱性グリコシド加水分解酵素と、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法によって製造された耐熱性グリコシド加水分解酵素は、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
前記本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素、又は前記本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法によって製造された耐熱性グリコシド加水分解酵素と、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法によって製造された耐熱性グリコシド加水分解酵素は、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素を、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性グリコシド加水分解酵素以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性グリコシド加水分解酵素以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ、若しくはβ−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。
当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも６５℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、６５〜８０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度６５〜８０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
［セルロース分解物の製造方法］
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素により、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法によって製造された耐熱性グリコシド加水分解酵素に接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素により、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法によって製造された耐熱性グリコシド加水分解酵素に接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素と接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素によるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性グリコシド加水分解酵素がセロビオハイドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、２価金属イオン存在下又は非存在下において、３０〜８０℃、ｐＨ３．０〜８．０で反応を行うことが好ましく、５０〜７５℃、ｐＨ３．５〜８．０で反応を行うことがより好ましく、５０〜７５℃、ｐＨ４．０〜７．０で反応を行うことがさらに好ましく、６０〜７０℃、ｐＨ４．０〜７．０で反応を行うことがよりさらに好ましい。
前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。
セルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素に加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。当該その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも６５℃で、好ましくは少なくとも６５〜８０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法によって製造された耐熱性グリコシド加水分解酵素に代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］堆肥培養サンプルからの新規耐熱性グリコシド加水分解酵素のクローニング
＜１＞ 堆肥培養サンプルからのＤＮＡ抽出及び全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
耐熱性グリコシド加水分解酵素（至適温度：６５℃以上）の遺伝子探索を目的として、堆肥培養サンプルを構成する微生物叢ゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
堆肥培養サンプルは、次のようにして調製した。まず、堆肥を採取した。採取時の堆肥の温度は、２０〜６８℃であった。次いで、表１に記載の改変ＡＧＳ液体培地２０ｍＬに、採取した堆肥約０．５ｇと、炭素源として厚紙１．５ｃｍ角２枚（約２５０ｍｇ、Ｇｅｌ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｐａｐｅｒ ＧＢ００５、Ｗｈａｔｍａｎ社製）及び再生セルロース製透析チューブ（スペクトラＲＣ透析チューブ ポア７ 、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１．２ｃｍ×１．５ｃｍを１枚添加し、１２５ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを用いて６５℃、１２０ｒｐｍで回転振盪培養した。培養１週間後に、当該三角フラスコ内の炭素源の消失及び菌の増殖を確認した後、培養液０．５ｍＬを新たな改変ＡＧＳ液体培地２０ｍＬに植え継ぎ、前記と同様に炭素源を添加して培養した。植え継ぎを３回繰り返した後、遠心分離処理（５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって菌体を回収した。
＜１＞ 堆肥培養サンプルからのＤＮＡ抽出及び全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
耐熱性グリコシド加水分解酵素（至適温度：６５℃以上）の遺伝子探索を目的として、堆肥培養サンプルを構成する微生物叢ゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
堆肥培養サンプルは、次のようにして調製した。まず、堆肥を採取した。採取時の堆肥の温度は、２０〜６８℃であった。次いで、表１に記載の改変ＡＧＳ液体培地２０ｍＬに、採取した堆肥約０．５ｇと、炭素源として厚紙１．５ｃｍ角２枚（約２５０ｍｇ、Ｇｅｌ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｐａｐｅｒ ＧＢ００５、Ｗｈａｔｍａｎ社製）及び再生セルロース製透析チューブ（スペクトラＲＣ透析チューブ ポア７ 、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１．２ｃｍ×１．５ｃｍを１枚添加し、１２５ｍＬ容バッフル付き三角フラスコを用いて６５℃、１２０ｒｐｍで回転振盪培養した。培養１週間後に、当該三角フラスコ内の炭素源の消失及び菌の増殖を確認した後、培養液０．５ｍＬを新たな改変ＡＧＳ液体培地２０ｍＬに植え継ぎ、前記と同様に炭素源を添加して培養した。植え継ぎを３回繰り返した後、遠心分離処理（５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）によって菌体を回収した。
回収された菌体から、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ、ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）を用いてＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡのうち１μｇに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のＧＳ ＦＬＸ＋ ４５４を用いて、ゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。
堆肥培養サンプルＳＤ５ＡＨ４ＧについてゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長５３２ｂｐ、総リード数２，４７１，２６７個、総ゲノム解読量１．３２４Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
堆肥培養サンプルＳＤ５ＡＨ４ＧについてゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長５３２ｂｐ、総リード数２，４７１，２６７個、総ゲノム解読量１．３２４Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
＜２＞ 堆肥培養サンプルのゲノムデータのアセンブルと統計量
Ｒｏｃｈｅ ４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｏｖｅｒｌａｐ ｍａｔｃｈ （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ ｕｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
１００ｂｐ以上にアセンブルされた総コンティグ長は、 合計３８，０７８，５５１ｂｐであり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数２，４７１，２６７リードのうち２，８５８，０１８リードが、平均で２，６１７ｂｐ以上のコンティグにアセンブルされ（計１４，５５１コンティグ）、このうち最大コンティグ長は１１４，８２６ｂｐであった。
Ｒｏｃｈｅ ４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．５．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｏｖｅｒｌａｐ ｍａｔｃｈ （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ ｕｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
１００ｂｐ以上にアセンブルされた総コンティグ長は、 合計３８，０７８，５５１ｂｐであり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数２，４７１，２６７リードのうち２，８５８，０１８リードが、平均で２，６１７ｂｐ以上のコンティグにアセンブルされ（計１４，５５１コンティグ）、このうち最大コンティグ長は１１４，８２６ｂｐであった。
＜３＞ グリコシド加水分解酵素のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＭｅｔｅＧｅｎｅＡｎｏｔａｔｏｒ（Noguchi et al.，MetaGeneAnnotator: Detecting Species-Specific Patterns of Ribosomal Binding Site for Precise Gene Prediction in Anonymous Prokaryotic and Phage Genomes, DNA Res. 2008, 15, 387-396.)を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇａｐ＝−１、Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットした配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＭｅｔｅＧｅｎｅＡｎｏｔａｔｏｒ（Noguchi et al.，MetaGeneAnnotator: Detecting Species-Specific Patterns of Ribosomal Binding Site for Precise Gene Prediction in Anonymous Prokaryotic and Phage Genomes, DNA Res. 2008, 15, 387-396.)を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇａｐ＝−１、Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットした配列をグリコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。
＜４＞ 遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集されたセルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含む配列についてについて、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２３．０ ａｎｄ ＨＭＭＥＲ ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。
前記＜３＞で収集されたセルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグリコシド加水分解酵素を含む配列についてについて、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２３．０ ａｎｄ ＨＭＭＥＲ ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。
堆肥培養サンプルＳＤ５ＡＨ４Ｇシーケンスデータを用いたＢＬＡＳＴＰによる相同性検索及びｐｆａｍ ＨＭＭｓにより、１５個のＯＲＦ（完全長ＯＲＦが８個、不完全長ＯＲＦが７個）がセロビオハイドロラーゼ遺伝子又はエンドグルカナーゼ遺伝子と予測された。これらの１５個の遺伝子のＧＨファミリー分類を表２に示す。ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものをカウントした。表２に示すように、ゲノムＳＤ５ＡＨ４Ｇから、ＧＨファミリー５に属する完全長ＯＲＦが２個、ＧＨファミリー６に属する領域とＧＨファミリー５に属する領域が連結した完全長ＯＲＦが２個、ＧＨファミリー９及びＧＨファミリー１２、ＧＨファミリー２６、ＧＨファミリー４８に属する完全長ＯＲＦが１個ずつ、それぞれ得られた。全てのＯＲＦについて、プライマーを設計し、堆肥培養サンプル由来ＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。この結果、ＧＨファミリー６に属する領域とＧＨファミリー５に属する領域が連結した配列を持つオープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４から、グリコシド加水分解酵素遺伝子ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７が単離された。
＜５＞ オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４
オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４は、８６３アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号１）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニン（Ｍ）から開始し、３’末端はリンカー配列で終わる終始コドンのないアミノ酸配列であった。５１位のトリプトファン（Ｗ）から４８５位のイソロイシン（Ｉ）までの４３５アミノ酸残基がＧＨファミリー６のドメインをコードしていると推測され、プロテオバクテリア門スチグマテラ・オーランチアカが持つエキソグルカナーゼＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＷＰ＿００２６１３３６８．１）とＧＨ６触媒領域について７６％の配列同一性を示す配列である。また、リンカー配列を介して５３０番目のバリン（Ｖ）から８２３番目のアルギニン（Ｒ）までの２９４アミノ酸残基がＧＨファミリー５のドメインをコードしていると推測され、ファーミキューテス門パエニバシラス・サブスピーシーズＫＳＭ−Ｎ１４５が持つエンドグルカナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＦ６２０８５．１）とＧＨ５触媒領域について７３％の配列同一性を示す配列である。配列同一性は、いずれも、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した。それぞれの領域ごとに相同性を有するアミノ酸配列は存在するが、ＧＨファミリー６のセロビオハイドロラーゼ触媒ドメインの後ろにＧＨファミリー５のエンドグルカナーゼ触媒ドメインを持つアミノ酸配列は今までに報告されておらず、オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４は全く新規な配列である。なお、オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４には、分泌シグナル予測ソフト（ＳｉｇｎａｌＰ ４．１）による分泌シグナル配列は予測されなかった。
オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４は、８６３アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号１）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニン（Ｍ）から開始し、３’末端はリンカー配列で終わる終始コドンのないアミノ酸配列であった。５１位のトリプトファン（Ｗ）から４８５位のイソロイシン（Ｉ）までの４３５アミノ酸残基がＧＨファミリー６のドメインをコードしていると推測され、プロテオバクテリア門スチグマテラ・オーランチアカが持つエキソグルカナーゼＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＷＰ＿００２６１３３６８．１）とＧＨ６触媒領域について７６％の配列同一性を示す配列である。また、リンカー配列を介して５３０番目のバリン（Ｖ）から８２３番目のアルギニン（Ｒ）までの２９４アミノ酸残基がＧＨファミリー５のドメインをコードしていると推測され、ファーミキューテス門パエニバシラス・サブスピーシーズＫＳＭ−Ｎ１４５が持つエンドグルカナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＦ６２０８５．１）とＧＨ５触媒領域について７３％の配列同一性を示す配列である。配列同一性は、いずれも、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した。それぞれの領域ごとに相同性を有するアミノ酸配列は存在するが、ＧＨファミリー６のセロビオハイドロラーゼ触媒ドメインの後ろにＧＨファミリー５のエンドグルカナーゼ触媒ドメインを持つアミノ酸配列は今までに報告されておらず、オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４は全く新規な配列である。なお、オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４には、分泌シグナル予測ソフト（ＳｉｇｎａｌＰ ４．１）による分泌シグナル配列は予測されなかった。
図１に、オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４から推定されるアミノ酸配列（配列番号１）と、スチグマテラ・オーランチアカのエキソグルカナーゼＡのアミノ酸配列（配列番号６）のアラインメントを、図２にオープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４から推定されるアミノ酸配列（配列番号１）とパエニバシラス・サブスピーシーズＫＳＭ−Ｎ１４５のエンドグルカナーゼのアミノ酸配列（配列番号７）のアライメントを示す。図１及び２中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。
＜６＞ 遺伝子クローニング
配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴ−３’：配列番号３で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）付加したもの。当該付加配列中、５’側のＣＡＣＣはベクターに挿入するための配列である。）と配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＴＡＡＣＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＧＧＣＧＴＣ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製)で増幅した堆肥培養サンプル由来ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。配列番号３で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１〜２１位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号４で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の２，５７１〜２，５８９位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物はＣｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、シーケンサー（ライフテクノロジーズ社の３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて配列確認を行った。
配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴ−３’：配列番号３で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）付加したもの。当該付加配列中、５’側のＣＡＣＣはベクターに挿入するための配列である。）と配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＴＡＡＣＣＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＧＧＣＧＴＣ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製)で増幅した堆肥培養サンプル由来ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。配列番号３で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１〜２１位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号４で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の２，５７１〜２，５８９位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物はＣｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、シーケンサー（ライフテクノロジーズ社の３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて配列確認を行った。
ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４から３個の遺伝子クローンＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−４４、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−４５を得た。セロビオハイドロラーゼ活性とエンドグルカナーゼ活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素の候補遺伝子クローンＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７の塩基配列（配列番号２）は、オープンリーディングフレームクローンＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４と同様に２，５８９ｂｐを含み、予測されたＯＲＦと全て同じ配列であった。
＜７＞ 耐熱性グリコシド加水分解酵素タンパク質の発現及び精製
酵素タンパク質の精製には、Ｃ末端側にヒスチジンタグを付加させたタンパク質を用いた。前記ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに耐熱性グリコシド加水分解酵素候補遺伝子ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のストップコドンを外したものを挿入することにより、ヒスチジンタグを付加したＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子を持つプラスミドを得、得られたプラスミドをヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離処理を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８サイクル繰返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
酵素タンパク質の精製には、Ｃ末端側にヒスチジンタグを付加させたタンパク質を用いた。前記ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに耐熱性グリコシド加水分解酵素候補遺伝子ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のストップコドンを外したものを挿入することにより、ヒスチジンタグを付加したＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子を持つプラスミドを得、得られたプラスミドをヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離処理を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８サイクル繰返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のセロビオハイドロラーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ Ｐｈｎｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０ ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０によって１ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）への溶液交換と濃縮を行い、同バッファーで平衡化したヒドロキシアパタイトカラムＣＨＴ５−１（バイオラッド社）に充填し、４００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素（精製した耐熱性グリコシド加水分解酵素タンパク質）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。前記上清５μｇ又は精製酵素０．５μｇに対し、それぞれ２−メルカプトエタノール含有試料用緩衝４倍濃縮液（和光純薬社製）を１倍になるように混合した泳動用サンプルを、９５℃で４分間処理した後、１０％のクライテリオンＴＧＸステインフリーゲル（バイオラッド社製）を用いてＳＤＳ電気泳動を行った。泳動終了後、画像撮影システムＣｈｅｍｉＤｏｃ（バイオラッド社製）により、タンパク質のバンドを可視化した。
図３に、ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号１）及びｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターのヒスチジンタグから予想される質量９６．７ｋＤａ近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーン３）では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。
＜８＞ ＰＳＡを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７）のＰＳＡを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７）のＰＳＡを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。
基質として用いるＰＳＡは、リン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
反応容器には２．０ｍＬ容のサンプルチューブを使用した。反応液の組成は、１５μＬの希釈した精製酵素、１０μＬの精製水、 ２５μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、５０μＬの１質量％ ＰＳＡ溶液とした。全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と精製酵素溶液は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温（プリインキュベーション）した後に混合し、反応開始とした。反応中はいずれの混合液もサーモミキサー（エッペンドルフ社製）を用いて所定の温度とした。１５〜２０分間の反応終了後は、各混合液に対して等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心分離処理し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準偏差を求めた。
＜９＞ ＣＭＣを基質としたエンドグルカナーゼ活性
酵素タンパク質ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製）を基質としたエンドグルカナーゼ活性を調べた。測定は、反応液の組成を、１５μＬの希釈した精製酵素、１０μＬの精製水、 ２５μＬの２００ｍＭ マッキルベインバッファー（ｐＨ４．０）、５０μＬの１質量％ ＣＭＣ溶液とした以外は、前記＜８＞と同様にして、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
酵素タンパク質ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製）を基質としたエンドグルカナーゼ活性を調べた。測定は、反応液の組成を、１５μＬの希釈した精製酵素、１０μＬの精製水、 ２５μＬの２００ｍＭ マッキルベインバッファー（ｐＨ４．０）、５０μＬの１質量％ ＣＭＣ溶液とした以外は、前記＜８＞と同様にして、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
＜１０＞ ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７の基質特異性
酵素タンパク質ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７に対して、様々なセルロース基質及びヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。基質として、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製)、キシラン（カバノキ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＣ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
酵素タンパク質ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７に対して、様々なセルロース基質及びヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。基質として、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製)、キシラン（カバノキ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＣ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド、Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、キシラン、リケナン、又はラミナリンを基質とした加水分解活性の測定は、反応液に５０μＬの１質量％の基質水溶液を添加し、反応温度を５０℃とした以外は、前記＜８＞と同様にして、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。なお、キシランの測定においては、キシロースで作成した検量線を用いた。
ＰＮＰＣ又はＰＮＰＧを基質とした加水分解活性の測定は、まず、反応液に５０μＬの３．４ｍＭの基質水溶液を添加し、反応温度を５０℃とし、反応時間を２０分間とした以外は、前記＜８＞と同様にして酵素反応を行った。反応終了後の反応液に等量の２００ｍＭ 炭酸ナトリウム水溶液を加えて、５分間遠心分離処理し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量を、分光光度計を用いて４２０ｎｍの吸光度を計測し、ｐ−ニトロフェノールで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
測定結果を図４に示す。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は、ＰＳＡ、ＣＭＣ、リケナン、ＰＮＰＣに対し加水分解活性を示した。また、アビセルやＰＮＰＧにも弱い分解活性を示したが、ラミナリン、キシランに対し、ほとんど分解活性を示さなかった。
＜１１＞ ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のセロビオハイドロラーゼ活性及びエンドグルカナーゼ活性の温度及びｐＨ依存性
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を調べた。具体的には、反応温度を、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５℃とした以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
また、１０μＬの精製水の代わりに１０ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液を加えた反応液でも同様に測定し、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を調べた。具体的には、反応温度を、２０、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、又は８５℃とした以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
また、１０μＬの精製水の代わりに１０ｍＭ ＣａＣｌ２水溶液を加えた反応液でも同様に測定し、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
測定結果を図５に示す。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は、温度範囲２０〜８５℃においてＰＳＡ加水分解活性を示した。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、カルシウムイオン非存在下（図中、「ＰＳＡ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ｐＨ４．０」）と存在下（図中、「＋１ｍＭ Ｃａ２＋」）で、それぞれ６５℃と７０℃であった。
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のＣＭＣ加水分解活性の温度依存性を調べた。具体的には、反応温度を、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００℃とした以外は、前記＜９＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＣＭＣ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
測定結果を図６に示す。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７は、温度範囲３０〜９０℃においてＣＭＣ加水分解活性を示した。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は７０℃であった。
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のＰＳＡ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。具体的には、バッファーとして、２００ｍＭグリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．２〜３．０）、マッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）、酢酸バッファー（ｐＨ３．５〜６）、２００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６〜８）、又はトリス塩酸バッファー（ｐＨ８〜９）を用い、５０℃で反応させた以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
測定結果を図７に示す。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ− ４Ａ−１７は、ｐＨ３〜９の範囲において、ＰＳＡ加水分解活性を示した。至適ｐＨは４．１９（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７のＣＭＣ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。具体的には、バッファーとして、２００ｍＭグリシン塩酸バッファー（ｐＨ２．６〜３．０）、マッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）、又はトリス塩酸バッファー（ｐＨ８〜９）を用い、５０℃で反応させた以外は、前記＜９＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＣＭＣ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
測定結果を図８に示す。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。ＳＤ５ＡＨ４Ｇ− ４Ａ−１７は、ｐＨ３〜９の範囲において、ＣＭＣ加水分解活性を示した。至適ｐＨは範囲が広く、４．６８〜６．５（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。
＜１２＞ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙによるグリコシド加水分解酵素の熱安定性測定
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ （ＤＳＦ）は、蛍光色素とリアルタイムＰＣＲ装置を用いて、タンパク質の熱変性を計測する方法の一つであり、様々なタンパク質に応用可能である。ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ等、ＤＳＦに使われる蛍光色素は、疎水性部位と結合する無極性条件下で蛍光を発し、一方、水に溶けた極性条件下では発光が抑えられる。通常、タンパク質はその熱変性温度において折畳み構造が解け、内部にある疎水性部位がタンパク質表面に露出する。この露出した疎水性部位にＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇが結合すると、波長４７０〜４８０ｎｍの励起光により、波長５９５ｎｍ付近にピークを持つ強い蛍光を発する。タンパク質溶液の温度を一定間隔で段階的に上昇させ、蛍光強度を計測することにより、熱崩壊温度（＝蛍光強度の変化点）が算出される。
計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７を水で１ｍｇ／ｍＬに調整した精製酵素溶液を用いた。
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ９６ Ｗｅｌｌ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬの精製酵素溶液を１μＬ、２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ４．０）を５μＬ、精製水、又は精製水と１０ｍＭ ＣａＣｌ２を１：１で混合した溶液、又は精製水と５０ｍＭ ＥＤＴＡを２：１で混合した溶液を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で０．２℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから１０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０〜４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。
具体的には、９６穴ＰＣＲプレート（Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ９６ Ｗｅｌｌ ＰＣＲ Ｐｌａｔｅ ＭＬＬ−９６５１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）のウェルに１００倍希釈したＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ（ライフテクノロジーズ社製）を２μＬ、濃度１ｍｇ／ｍＬの精製酵素溶液を１μＬ、２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ４．０）を５μＬ、精製水、又は精製水と１０ｍＭ ＣａＣｌ２を１：１で混合した溶液、又は精製水と５０ｍＭ ＥＤＴＡを２：１で混合した溶液を１２μＬ加え、各ウェルの容積を２０μＬとした。ＰＣＲプレートはＯｐｔｉｃａｌ ８連フラットキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）でシールし、リアルタイムＰＣＲ装置（ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で０．２℃ずつ、３０℃から１００℃までウェルの温度を上昇させ、ターゲット温度が達成されてから１０秒間経過した後、各ウェルの蛍光強度を同時計測した。波長帯域４５０〜４９０ｎｍの光発光ダイオード（ＬＥＤ）によりＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅを励起し、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ放射光は５６０〜５８０ｎｍレンジの帯域通過フィルターを通し、ＣＣＤカメラで蛍光強度の計測を行い、蛍光強度変化を温度の関数としてプロットした。リアルタイムＰＣＲに付属の解析ソフトウェアＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製)を使い、データ解析を行った。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。
図９には、ＤＳＦ法により計測したＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７の酵素タンパク質が示す、熱変性に伴って引き起こされるＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅの蛍光強度変化を示す。図９の上段グラフは実測データであり、図９の下段グラフには、図９の上段グラフの蛍光強度変化曲線の１階微分「−ｄ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）／ｄｔ」を示している。各計測は、３回の独立した試行により行った。
ＳＤ５ＡＨ４Ｇ−４Ａ−１７の蛍光強度の一階微分は、７６．５℃付近にピークを持ち、この温度で熱変性が起こることを示した。また、ＣａＣｌ２を加えた条件では、８３℃付近にピークを示したことから、カルシウムイオンによって熱変性温度が約６．５℃上昇したことが明らかとなった。熱変性温度の平均値は、それぞれ７６．５±０．４℃（ＣａＣｌ２無添加）、８２．９±０．２℃（３ｍＭ ＣａＣｌ２添加）、７５．５ ±０．３℃（１０ｍＭ ＥＤＴＡ添加）であり、ＰＳＡ加水分解活性から求めたこの酵素の至適温度６５℃（ＣａＣｌ２無添加）と７０℃（ＣａＣｌ２添加）より少し高い値を示した。
本発明に係る耐熱性グリコシド加水分解酵素は、少なくとも６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、ＰＳＡを基質とした加水分解活性とＣＭＣを基質とした加水分解活性の両方を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性グリコシド加水分解酵素及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。
Claims (10)
- （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチド、
からなるグリコシド加水分解酵素触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性グリコシド加水分解酵素。 - カルシウムイオン存在下において、７０℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有する、請求項１に記載の耐熱性グリコシド加水分解酵素。
- （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｆ）配列番号２で表される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ６５℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるグリコシド加水分解酵素触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドが、カルシウムイオン存在下において、７０℃、ｐＨ４．０の条件下で、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性とカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を少なくとも有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、リン酸膨潤アビセルを基質とした加水分解活性及びカルボキシメチルセルロースを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。 - 請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
- 真核微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
- 請求項６又は７に記載の形質転換体内で、耐熱性グリコシド加水分解酵素を生産することを含む、耐熱性グリコシド加水分解酵素の製造方法。
- 請求項１若しくは２に記載の耐熱性グリコシド加水分解酵素、又は請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性グリコシド加水分解酵素と、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
- セルロースを含む材料を、請求項１若しくは２に記載の耐熱性グリコシド加水分解酵素、請求項３若しくは４に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性グリコシド加水分解酵素、又は請求項６若しくは７に記載の形質転換体に接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。
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