WO2014155566A1 - 耐熱性セロビオハイドロラーゼ - Google Patents

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WO2014155566A1
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acid sequence
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cellobiohydrolase
polypeptide
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みぎわ 竹田
二郎 大熊
明日香 西村
佳嗣 広瀬
近藤　康弘
友彦 加藤
柴田　大輔
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本田技研工業株式会社
公益財団法人かずさＤｎａ研究所
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Definitions

  • the present invention relates to the thermostability of cellobiohydrolase enzyme.
  • Cellobiohydrolase is one of the glucoside hydrolases involved in the process of hydrolyzing lignocellulose such as cellulose and hemicellulose to produce monosaccharides. More specifically, a novel thermostable cellobiohydrolase, a polynucleotide encoding the thermostable cellobiohydrolase, an expression vector for expressing the thermostable cellobiohydrolase, and a trait in which the expression vector is incorporated
  • the present invention relates to a converter and a method for producing a cellulose degradation product using the thermostable cellobiohydrolase.
  • biomass or lignocellulose
  • the main components of biomass dry weight are polysaccharides such as cellulose and hemicellulose and lignin.
  • polysaccharides are hydrolyzed into monosaccharides such as glucose and xylose by glucoside hydrolase, which is generically called cellulase enzyme, and then used as biofuels or raw materials for chemical products.
  • Lignocellulose having a complex structure is difficult to decompose and is difficult to be decomposed and saccharified by a single enzyme.
  • glucoside hydrolase endoglucanase cellulase or endo-1,4- ⁇ -D-glucanase, EC 3.2.1.4
  • exo-cellobiohydro Three types of enzymes are required: a lase (1,4- ⁇ -cellobiosidase or cellobiohydrolase, EC 3.2.1.91) and ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1.21).
  • saccharification treatment with a high solid load (30 to 60% solid loading) has been attempted for the purpose of high-efficiency conversion of ethanol.
  • Such saccharification with a high solid load has a high viscosity of the biomass saccharified liquid and the enzyme reaction is difficult to proceed, but the viscosity of the biomass saccharified liquid decreases by performing at a high temperature, resulting in shortening of the saccharification reaction time and reduction of the amount of enzyme. Is expected.
  • the chemical reaction increases by 2 to 3 times as the temperature increases by 10 ° C. according to the Van't Hoff-Arrhenius law.
  • thermostable cellulase enzyme when lignocellulose saccharification treatment is performed at a higher temperature than before using a thermostable cellulase enzyme, a high enzyme reaction rate will be obtained according to this rule of thumb. For these reasons, it is considered that by performing lignocellulose saccharification treatment at a high temperature using a thermostable enzyme, the amount of enzyme and the saccharification time are greatly reduced, and the enzyme cost can be greatly reduced.
  • thermophilic filamentous fungi which are eukaryotes, have a lower survival limit of about 55 ° C. compared to prokaryotic thermophilic bacteria and hyperthermophilic archaea. For this reason, the heat resistance of glucoside hydrolase expressed and secreted by thermophilic filamentous fungi is generally not very high.
  • the most thermophilic fungus-derived CBH (cellobiohydrolase) reported so far is the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum cellobiohydrolase CBHI, CBHII, which has optimum temperatures of 75 ° C and 70 ° C, respectively.
  • Thermoascus aurantiacus cellobiohydrolase CBHI has an optimum temperature of 65 ° C. (for example, see Non-Patent Document 2).
  • There is also a method for improving the heat resistance by substituting one or a plurality of amino acids in cellobiohydrolase see, for example, Patent Document 1 or 2), but the mutant cellobiohydroly obtained in this way. The heat resistance of ase is still insufficient.
  • thermophilic bacteria that grow at 55 ° C. or higher and hyperthermophilic bacteria that grow at 80 ° C. or higher are separated and cultured from extreme environments such as hot springs, hydrothermal vents, oil fields, and mines.
  • Most of these thermostable glucoside hydrolases derived from thermophilic bacteria and hyperthermophilic archaea are enzymes having endoglucanase activity, xylanase activity, xylosidase activity, or glucosidase activity.
  • thermophilic anaerobic bacterium Clostridium thermocellum presents an enzyme complex cellulosome having high lignocellulose hydrolysis activity outside the microbial cell.
  • thermophilic actinomycetes Thermobifida fusca E3 belonging to the GH6 family (see, for example, Non-Patent Document 6) and Cel48A belonging to the GH48 family (see, for example, Non-Patent Document 7).
  • E3 belonging to the GH6 family
  • Cel48A belonging to the GH48 family
  • These cellobiohydrolases are relatively thermostable, the temperature range showing 50% activity at the maximum is 40-60 ° C. and has stable activity at 55 ° C. for at least 16 hours.
  • these two types of cellobiohydrolase have insufficient activity at 70 ° C.
  • the upper limit of the saccharification treatment temperature is 60 to 65 ° C.
  • the enzyme exhibits endoglucanase-like substrate specificity and exhibits degradation activity only for amorphous cellulose and carboxymethylcellulose (CMC).
  • CMC carboxymethylcellulose
  • the present invention relates to a novel thermostable cellobiohydrolase exhibiting cellobiohydrolase activity at least at 75 ° C., a polynucleotide encoding the thermostable cellobiohydrolase, and expression for expressing the thermostable cellobiohydrolase. It aims at providing the manufacturing method of the degradation product of the cellulose using the vector, the transformant in which the said expression vector was integrated, and the said thermostable cellobiohydrolase.
  • the present inventors directly extracted DNA from hot spring high-temperature soil, and performed a large-scale metagenomic sequence of a difficult-to-cultivate microflora, thereby producing a thermostable cellobiohydrolase having a novel amino acid sequence.
  • the acquisition was successful and the present invention was completed.
  • the first aspect of the present invention is (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (B) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5. A polypeptide having ase activity, (C) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • E an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5
  • a polypeptide having ase activity (F) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and having cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C.
  • polypeptide having ase activity (G) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, (H) an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 are deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 A polypeptide having ase activity, (I) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and having cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C.
  • a polypeptide having ase activity It is a thermostable cellobiohydrolase having a cellobiohydrolase catalytic region.
  • a second aspect of the present invention is (A) a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (B) consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C.
  • a base sequence encoding a polypeptide having ase activity (C) Coding a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 Base sequence, (D) a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, (E) an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C.
  • a base sequence encoding a polypeptide having ase activity (F) coding for a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and having cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 Base sequence, (G) a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, (H) an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 have been deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C.
  • a base sequence encoding a polypeptide having ase activity (I) A polypeptide comprising the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and having cellobiohydrolase activity under the conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 Base sequence, (J) a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, (K) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 have been deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C.
  • a base sequence encoding a polypeptide having ase activity (L) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having cellobiohydrolase activity under the conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 Base sequence, (M) has 80% or more sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 and has cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5.
  • a base sequence encoding a polypeptide or (n) a base sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8.
  • the polynucleotide of [3] preferably further has a region encoding a cellulose binding module.
  • a fourth aspect of the present invention is a transformant into which the expression vector of [5] has been introduced.
  • the transformant of [6] is preferably a eukaryotic microorganism.
  • the transformant of [6] is preferably a plant.
  • a fifth aspect of the present invention is a method for producing a thermostable cellobiohydrolase, wherein the thermostable cellobiohydrolase is produced in the transformant according to any one of [6] to [8]. .
  • the sixth aspect of the present invention is the production of the thermostable cellobiohydrolase of [1], the thermostable cellobiohydrolase of [2], or the thermostable cellobiohydrolase of [9].
  • a cellulase mixture comprising a thermostable cellobiohydrolase produced by the method and at least one other cellulase.
  • the other cellulase is preferably at least one selected from the group consisting of hemicellulase and endoglucanase.
  • the material containing cellulose comprises the heat-resistant cellobiohydrolase of [1], the heat-resistant cellobiohydrolase of [2], and [6] to [8]. Production of a cellulose degradation product by contact with any one of the above transformants or the thermostable cellobiohydrolase produced by the method for producing a thermostable cellobiohydrolase of [9] above Is the method.
  • the method for producing a cellulose degradation product according to [12] it is preferable to further contact at least one other cellulase with the material containing cellulose.
  • the other cellulase is preferably at least one selected from the group consisting of hemicellulase and endoglucanase.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 is obtained using an organism-derived DNA or organism-derived RNA reverse transcription product as a template.
  • a heat-stable cellobiohydrolase that performs PCR using a reverse primer consisting of a base sequence to which a single base has been added, and obtains a polynucleotide containing a base sequence encoding a heat-stable cellobiohydrolase as an amplification product Is a method for producing a polynucleotide encoding.
  • a ninth aspect of the present invention relates to a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12, or a nucleotide sequence in which one or several bases are added to the 5 ′ end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12. Is a primer.
  • a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13 or a nucleotide sequence having one or several bases added to the 5 ′ end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 13. Is a primer.
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention has cellobiohydrolase activity at least at 75 ° C. and pH 5.5. For this reason, the thermostable cellobiohydrolase is suitable for saccharification treatment of cellulose under high temperature conditions.
  • the polynucleotide according to the present invention, the expression vector incorporating the polynucleotide, and the transformant into which the expression vector is introduced are preferably used for the production of the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention.
  • Example 1 a rooted molecule having an amino acid sequence deduced from four open reading frames (AR19G-166, AR19G-12 (and OJ1-2), OJ1-1) belonging to the GH6 family obtained by metagenomic analysis It is a phylogenetic tree. Since the amino acid sequence of OJ1-2 is 100% homologous (identical) to AR19G-12, OJ1-2 is presumed to be the same gene as AR19G-12 and a partial sequence of AR19G-12.
  • FIG. 2 is an amino acid sequence deduced from an open reading frame OJ1-1 and an amino acid sequence alignment diagram of a cellulose-binding module CBM3 of a thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans.
  • Polypeptides consisting of amino acid sequences deduced from open reading frames (AR19G-166, AR19G-12, OJ1-1), and the Chloroflexus mesophilic aerobic bacterium Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 having the highest sequence identity with these amino acid sequences
  • FIG. 2 is a schematic diagram of amino acids of a polypeptide consisting of an amino acid sequence deduced from the open reading frame OJ1-1, and a cellulose binding module CBM3 of a thermophilic aerobic bacterium, Caldibacillus cellulovorans.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of amino acids of a polypeptide consisting of an amino acid sequence deduced from the open reading frame OJ1-1, and a cellulose binding module CBM3 of a thermophilic aerobic bacterium, Caldibacillus cellulovorans.
  • Example 2 shows the results of SDS-PAGE analysis (A) and Western blot analysis (B) of AR19G-166-RA protein and AR19G-166-QV protein expressed in E. coli in Example 1.
  • A SDS-PAGE analysis
  • B Western blot analysis
  • E._coli by the high performance liquid chromatography (HPLC).
  • Example 1 it is the figure which showed the analysis result of the PSA hydrolysis reaction product of the family 6 cellobiohydrolase TrCBHII of filamentous fungus Trichoderma reesei by the high performance liquid chromatography (HPLC).
  • Example 1 it is the figure which showed the result of having measured the PSA hydrolysis activity in each temperature of the AR19G-166-RA protein expressed by E. coli. In Example 1, it is the figure which showed the result of having measured the PSA hydrolysis activity in each temperature of the AR19G-166-QV protein expressed by Escherichia coli. In Example 1, it is the figure which showed the result of having measured the PSA hydrolysis activity in each pH of AR19G-166-RA protein expressed by colon_bacillus
  • Example 1 it is the figure which showed the result of having measured the influence of the preincubation time of AR19G-166-RA protein expressed by colon_bacillus
  • Example 2 the medium supernatant of Aspergillus oryzae transformants introduced with the AR19G-166-RW gene and Aspergillus transformant introduced with the AR19G-166-QW gene, the AR19G-166-RA prepared in Example 1, and FIG. 6 shows the results of Western blot analysis of AR19G-166-QV recombinant E. coli disrupted supernatant.
  • PSA hydrolysis activity U / mg
  • FIG. 1 the medium supernatant of Aspergillus oryzae transformants introduced with the AR19G-166-RW gene and Aspergillus transformant introduced with the AR19G-166-QW gene, the AR19G-166-RA prepared in Example 1
  • FIG. 6 shows the results of Western blot analysis of AR
  • FIG. 3 is a graph showing the results of determining the PSA hydrolysis activity (relative value (%)) of protein and AR19G-166-QW protein.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of determining the PSA hydrolysis activity (relative value (%)) of protein and AR19G-166-QW protein.
  • Example 3 the tobacco chloroplast transformation cassette vectors pNtaGL and pNtaGLPL, the expression cassettes pPXT and pPXTPPL, and the expression vectors pNtaGL-QV and pNtaGLPL incorporating the expression cassette used for the production of tobacco chloroplast transformants were used.
  • Example 3 Southern hybridization results of two lines of chloroplast-transformed tobacco (QV-2, QV-17) and wild-type tobacco (WT (SR-1)) obtained by introduction of pNTaGL-QV FIG.
  • Example 3 three lines of chloroplast-transformed tobacco (RA-6-2-1, RA-6-2-2, RA-6-2-3) obtained by introduction of pNtaGLPL-RA and wild It is the figure which showed the result of Southern hybridization of type tobacco (WT (SR-1)).
  • WT type tobacco
  • Example 3 a photograph of AR19G-166-QV introduced chloroplast transformed tobacco plants 77 days after recombination body temperature chamber transplant (T 1 generation) and wild type tobacco (SR-1) (A) , It is a photograph (B) of an AR19G-166-RA-introduced chloroplast-transformed tobacco plant (T 1 generation) in the flowering stage.
  • thermostable cellobiohydrolase Many microorganisms including filamentous fungi, bacteria, and archaea are difficult to cultivate, and 99% of the bacteria that inhabit microbial environments such as soil are said to be unknown. In particular, it is extremely difficult to cultivate microorganisms that inhabit high-temperature environments, and it is considered that only 0.1% or less of microorganisms that inhabit the soil are isolated and cultured with current microorganism culture technology. . This difficulty in culturing high-temperature soil microorganisms is one of the reasons for the development of thermostable cellobiohydrolase.
  • genomic DNA (metagenomic DNA) of a microbial population from hot hot spring soil collected from five locations in Japan, performed a shotgun sequence and annotation of metagenomic DNA, 44 open reading frames (ORF) having amino acid sequences similar to known cellobiohydrolase enzymes were obtained. Primers were designed based on the base sequence information of these ORFs, and gene candidates were cloned from high temperature hot spring soil metagenomic DNA by PCR.
  • thermostable cellobiohydrolase having PSA decomposition activity was obtained from one ORF.
  • thermostable cellobiohydrolases in which two amino acids were substituted were obtained by PCR cloning.
  • the amino acid at position 299 is arginine (R) and the amino acid at position 351 is alanine (A) is AR19G-166-RA, and the amino acid at position 299 is glutamine (Q).
  • AR19G-166-QV was defined as the amino acid at position 351 being valine (V).
  • the nucleotide sequence of AR19G-166-RA is shown in SEQ ID NO: 2
  • amino acid sequence of AR19G-166-RA is shown in SEQ ID NO: 1, respectively.
  • AR19G-166-QV The base sequence of AR19G-166-QV is shown in SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence of AR19G-166-QV is shown in SEQ ID NO: 3, respectively. Since AR19G-166-RA and AR19G-166-QV obtained by PCR cloning did not have an initiating methionine, these are cellobiohydrolase gene cellos that the microorganisms contained in the high temperature hot spring soil had. It was inferred to be a partial gene only in the biohydrolase catalytic region.
  • AR19G-166-RA and AR19G-166-QV exhibit high hydrolytic activity for PSA, and are composed of a ⁇ -1,3 bond and a ⁇ -1,4 bond glucan. In addition, it showed degradation activity against Avicel, a crystalline cellulose, although it was weak. On the other hand, CMC and Laminarin composed of ⁇ -1,3 bond and ⁇ -1,6 bond glucan showed almost no degradation activity.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the amino acid sequence having the highest sequence identity was found to be a known chloroflexus mesophilic aerobic bacterium. It is a glucoside hydrolase (SEQ ID NO: 15) belonging to the GH6 family of Herpetosiphon aurantiacus DSM 785, and its sequence identity was only 66%.
  • AR19G-166-RA and AR19G-166-QV are part of the GH6 family due to substrate specificity, HPLC analysis of PSA hydrolysis reaction products, and sequence identity (homology) of the amino acid sequence with known cellobiohydrolase. It became clear to be a novel cellobiohydrolase to which it belongs.
  • Both AR19G-166-RA and AR19G-166-QV have cellobiohydrolase activity under the conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5. Actually, as will be described later in Example 1 ⁇ 13>, AR19G-166-RA and AR19G-166-QV both exhibit cellobiohydrolase activity within a wide temperature range of 30 to 100 ° C. However, the optimum temperature range for the cellobiohydrolase activity was different. The cellobiohydrolase activity of AR19G-166-RA expressed using E. coli as a host increases as the temperature increases within the range of 30 to 80 ° C., and increases as the temperature increases within the range of 80 to 100 ° C. Cellobiohydrolase activity tended to decrease.
  • the cellobiohydrolase activity of AR19G-166-QV increases as the temperature increases within the range of 30 to 70 ° C, peaks at around 70 ° C, and increases within the range of 70 to 100 ° C. It showed a tendency to decrease as it increased.
  • AR19G-166-RW in which the amino acid residue at position 351 of AR19G-166-RA is replaced with tryptophan (W), and AR19G-166 in which the amino acid residue at position 351 in AR19G-166-QV is replaced with tryptophan (W) -QW like AR19G-166-RA and AR19G-166-QV, also has cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5.
  • the amino acid sequence of AR19G-166-RW is shown in SEQ ID NO: 5, the nucleotide sequence encoding it is shown in SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence of AR19G-166-QW is shown in SEQ ID NO: 7, and the nucleotide sequence encoding it is sequenced. The number 8 is shown respectively.
  • the cellobiohydrolase activity of AR19G-166-RW and AR19G-166-QW expressed using Aspergillus oryzae as a host increases with increasing temperature within the range of 30 to 100 ° C., and the highest cellobio at 100 ° C. Showed hydrolase activity.
  • a protein having some physiological activity can be deleted, substituted or added with one or a plurality of amino acids without impairing the physiological activity.
  • AR19G-166-RA, AR19G-166-QV, AR19G-166-RW, or AR19G-166-QW can also contain one or more amino acids without losing cellobiohydrolase activity. It can be deleted, substituted or added.
  • thermostable cellobiohydrolase which is the first aspect of the present invention is a thermostable cellobiohydrolase having a cellobiohydrolase catalytic region consisting of any of the following (A) to (L).
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5.
  • a polypeptide having ase activity is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • D A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • E an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 are deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 A polypeptide having ase activity.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and having cellobiohydrolase activity under the conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5.
  • G A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • H an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 are deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 A polypeptide having ase activity.
  • J A polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • K It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 are deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5.
  • a polypeptide having ase activity A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and having cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5.
  • amino acids that are deleted, substituted, or added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 The number of is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • the position of the amino acid to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but the amino acid at position 299 is preferably arginine.
  • the sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7 is 80% or more. Although not particularly limited, it is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more.
  • sequence identity between amino acid sequences is the alignment obtained by juxtaposing two amino acid sequences side by side with a gap in the portion corresponding to insertion and deletion so that the corresponding amino acids most closely match. It is determined as the ratio of matched amino acids to the entire amino acid sequence excluding the gap in the middle.
  • sequence identity between amino acid sequences can be determined using various homology search software known in the art.
  • sequence identity value of the amino acid sequence in the present invention is obtained by calculation based on the alignment obtained by the known homology search software BLASTP.
  • polypeptides (B), (C), (E), (F), (H), (I), (K), and (L) may be artificially designed. It may be a homologue such as AR19G-166-QV or a partial protein thereof.
  • Each of the polypeptides (A) to (L) may be chemically synthesized on the basis of the amino acid sequence, and can be synthesized by a protein expression system using the polynucleotide according to the second aspect of the present invention described later. May be produced.
  • the polypeptides (B), (C), (E), (F), (H), (I), (K), and (L) are represented by SEQ ID NOs: 1, 3, 5, Alternatively, based on the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by 7, it can be artificially synthesized using a gene recombination technique for introducing an amino acid mutation.
  • the polypeptides (A) to (L) have cellobiohydrolase activity under the conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5. Therefore, a thermostable cellobiohydrolase can be obtained by having any of the polypeptides (A) to (L) as the cellobiohydrolase catalytic region. In particular, since it exhibits high cellobiohydrolase activity even at 70 to 100 ° C., any of the polypeptides (D) to (L) is preferably used as the cellobiohydrolase catalytic region.
  • thermostable cellobiohydrolase uses phosphoric acid swollen Avicel (PSA) as a substrate.
  • PSA phosphoric acid swollen Avicel
  • the thermostable cellobiohydrolase may use a ⁇ -glucan other than PSA as a substrate.
  • the other ⁇ -glucan include, for example, Lichenan, Avicel composed of ⁇ -1,3 bonds and ⁇ -1,4 bonds, crystalline bacterial cellulose (Bacterial microcrystalline cellulose, BMCCC), crystalline cellulose such as filter paper, carboxymethylcellulose, and the like.
  • thermostable cellobiohydrolase in addition to PSA, those using at least one of glucan consisting of ⁇ -1,3 bond and ⁇ -1,4 bond and crystalline cellulose as a substrate are preferable. More preferred are glucans composed of ⁇ -1,3 bonds and ⁇ -1,4 bonds, and crystalline cellulose as a substrate.
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention is in the range of pH 4.5 to 6.0 although it varies depending on the reaction temperature.
  • the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention preferably exhibits cellobiohydrolase activity at least within the range of pH 4.5 to 6.0, and cellobiohydrolase within the range of pH 4.0 to 6.5. Those exhibiting ase activity are more preferable, and those exhibiting cellobiohydrolase activity within the range of pH 3.5 to 7.0 are more preferable.
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention may have a cellulose hydrolysis activity other than the cellobiohydrolase activity.
  • Other cellulose hydrolyzing activities include endoglucanase activity, xylanase activity, or ⁇ -glucosidase activity.
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention may be an enzyme consisting only of the cellobiohydrolase catalytic region consisting of any of the polypeptides (A) to (L), and includes other regions. May be. Examples of the other region include regions other than the cellobiohydrolase catalyst region of known cellobiohydrolase.
  • the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention includes an enzyme obtained by substituting the cellobiohydrolase catalytic region with the polypeptides (A) to (L) as compared to known cellobiohydrolase. Is also included.
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention includes a region other than the cellobiohydrolase catalyst region, it is preferable to include a cellulose-binding module.
  • the cellulose binding module may be upstream (N-terminal side) or downstream (C-terminal side) of the cellobiohydrolase catalytic region.
  • the cellulose binding module and the cellobiohydrolase catalyst region may be directly bonded or may be bonded via a linker region having an appropriate length.
  • the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention is preferably one in which a cellulose binding module is present via a linker region upstream or downstream of the cellobiohydrolase catalyst region, and upstream of the cellobiohydrolase catalyst region. It is more preferable that the cellulose binding module is present via a linker region.
  • the cellulose binding module contained in the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention may be a region having binding ability with cellulose, for example, binding ability with PSA or crystalline Avicel, and its amino acid sequence is particularly limited. It is not a thing.
  • bonding module you may use the cellulose coupling module which a known protein has, or what changed it suitably, for example.
  • the cellulose binding module includes a polypeptide comprising 148 amino acids (T35-P182) from threonine (T) at position 35 to proline (P) at position 182 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids in the polypeptide are deleted, substituted or added, and having a cellulose binding ability.
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention has a cellobiohydrolase catalytic region and a cellulose binding module, it is preferable that these are bonded via a linker sequence.
  • the amino acid sequence of the linker sequence, its length, etc. are not particularly limited. Specific examples of such a linker sequence include, for example, 112 amino acids (S183-T294) from serine (S) at position 183 to threonine (T) at position 294 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11. Or a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids in the polypeptide are deleted, substituted or added.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 is the open reading frame OJ1-1 obtained from the high temperature hot spring soil metagenomic DNA and the novel gene OJ1-1-1 obtained therefrom by PCR cloning in Example 1 described later.
  • 11 is an amino acid sequence of a polypeptide encoded by 11; 148 amino acids (T35-P182) from threonine at position 35 to proline at position 182 of OJ1-1-11 are cellulose-binding module CBM3, and 112 amino acids (S183 from serine (S) at position 183 to threonine at position 294).
  • -T294) is considered to be a linker sequence.
  • thermostable cellobiohydrolase has, at the N-terminus or C-terminus, a signal peptide that can be localized by moving to a specific region in the cell, or a signal peptide that is secreted outside the cell. You may do it.
  • a signal peptide include an apoplast transfer signal peptide, an endoplasmic reticulum retention signal peptide, a nuclear transfer signal peptide, and a secretory signal peptide.
  • the apoplast transfer signal peptide is not particularly limited as long as it is a peptide capable of transferring a polypeptide to an apoplast, and a known apoplast transfer signal peptide can be appropriately used.
  • the apoplast transfer signal peptide include a potato protease inhibitor II signal peptide (see, for example, Wang et al., 2005, Transgenic Research, Vol. 14, pages 167 to 178).
  • the endoplasmic reticulum retention signal peptide is not particularly limited as long as it is a peptide capable of retaining the polypeptide in the endoplasmic reticulum, and a known endoplasmic reticulum retention signal peptide can be appropriately used.
  • the endoplasmic reticulum retention signal peptide include a signal peptide consisting of the amino acid sequence of HDEL.
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention has other tags added to the N-terminus and C-terminus, for example, so that it can be easily purified when produced using an expression system. Also good.
  • tags commonly used in the expression and purification of recombinant proteins such as His tag, HA (hemagglutinin) tag, Myc tag, and Flag tag can be used.
  • thermostable cellobiohydrolase encodes the thermostable cellobiohydrolase which is the first aspect of the present invention.
  • the thermostable cellobiohydrolase can be produced by using an expression system of the host by introducing an expression vector incorporating the polynucleotide into the host.
  • the polynucleotide according to the second aspect of the present invention is a polynucleotide having a region encoding a cellobiohydrolase catalytic region comprising any one of the following base sequences (a) to (n): is there.
  • A A base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5
  • a nucleotide sequence encoding a polypeptide having ase activity is there.
  • A A base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • B consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 have been deleted, substituted or added, and cellobiohydro under
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 and having cellobiohydrolase activity under the conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 Base sequence.
  • J a base sequence encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7,
  • K It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 have been deleted, substituted or added, and cellobiohydro under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5
  • a nucleotide sequence encoding a polypeptide having ase activity.
  • (L) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and having cellobiohydrolase activity under the conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5 Base sequence.
  • (M) has 80% or more sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 and has cellobiohydrolase activity under conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5.
  • N a nucleotide sequence of a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8, and a condition of at least 75 ° C. and pH 5.5
  • SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8
  • stringent conditions include, for example, a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • 6 ⁇ SSC composition of 20 ⁇ SSC: 3M sodium chloride, 0.3M citric acid solution, pH 7.0
  • 5 ⁇ Denhardt solution composition of 100 ⁇ Denhardt solution: 2% by weight bovine serum albumin, 2% by weight
  • the washing buffer used for washing after incubation is preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing 0.1% by mass SDS, and more preferably a 0.1 ⁇ SSC solution containing
  • the base sequence of (a) may be the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is not changed in the amino acid sequence in the host.
  • the base sequence may be modified to a frequently used codon.
  • the base sequences of (d), (g), and (j) may be the base sequences represented by SEQ ID NOs: 4, 6, and 8, respectively.
  • the base sequence may be modified from a heavy codon to a codon that is more frequently used in the host. Codon modification can be performed by a known gene recombination technique.
  • the polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 may be chemically synthesized based on the base sequence information, such as AR19G-166-RA, AR19G-166-QV, etc.
  • the full length of a gene to be encoded (sometimes referred to as “AR19G-166 gene”) or a partial region including a cellobiohydrolase catalytic region may be obtained from nature by gene recombination techniques.
  • the full length of AR19G-166 gene or a partial region thereof is represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 using, for example, a sample containing a microorganism from nature and using genomic DNA collected from the sample as a template.
  • CDNA synthesized by reverse transcription using the mRNA recovered from the sample as a template may be used as a template.
  • recovers the nucleic acid used as a template is a sample extract
  • the sequence identity with the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8 is not particularly limited as long as it is 80% or more, but may be 85% or more. Preferably, it is 90% or more, more preferably 95% or more.
  • sequence identity between base sequences is obtained by aligning two base sequences side by side with a gap in the portion corresponding to insertion and deletion so that the corresponding bases most closely match. It is determined as the ratio of the matched base to the entire base sequence excluding the gap in the middle.
  • sequence identity between base sequences can be determined using various homology search software known in the technical field.
  • sequence identity value of the base sequence in the present invention is obtained by calculation based on the alignment obtained by the known homology search software BLASTN.
  • the polynucleotide comprising the base sequence of (b), (c), (e), (f), (h), (i), (k), (l), or (m), respectively, It can be artificially synthesized by deleting, substituting or adding one or a plurality of bases to the polynucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8.
  • the base sequence of (b), (c), (e), (f), (h), (i), (k), or (l) includes the full length of the homologous gene of the AR19G-166 gene. It may be a sequence or a partial sequence thereof.
  • the homologous gene of the AR19G-166 gene can be obtained by a gene recombination technique used when obtaining a homologous gene of a gene whose base sequence is known.
  • the polynucleotide according to the second aspect of the present invention may have only a region encoding a cellobiohydrolase catalytic region.
  • a cellulose-binding module, a linker sequence, various signal peptides, You may have the area
  • the expression vector according to the third aspect of the present invention incorporates the polynucleotide according to the second aspect of the present invention, and the cellobiohydrolase activity in a host cell under the conditions of at least 75 ° C. and pH 5.5.
  • the polynucleotide can be incorporated into the expression vector by using a well-known gene recombination technique, and a commercially available expression vector preparation kit may be used.
  • the expression vector may be introduced into prokaryotic cells such as Escherichia coli, and is introduced into eukaryotic cells such as yeast, filamentous fungi, insect cultured cells, mammalian cultured cells, and plant cells. Also good. As these expression vectors, any expression vector usually used according to each host can be used.
  • thermostable cellobiohydrolase examples include binary vectors such as pIG121 and pIG121Hm.
  • promoters examples include nopaline synthase gene promoter and cauliflower mosaic virus 35S promoter.
  • usable terminators include nopaline synthase gene terminators.
  • promoters specific to tissues and organs may be used. By using such a tissue or organ-specific promoter, the thermostable cellobiohydrolase can be expressed only in a specific tissue or organ, not in the whole plant. For example, in a non-edible part of an edible plant Only thermostable cellobiohydrolase can be expected to be expressed.
  • the expression vector according to the present invention is preferably an expression vector in which not only the polynucleotide of the second aspect of the present invention but also a drug resistance gene or the like is incorporated. This is because it is possible to easily select a plant transformed with an expression vector and a plant not transformed.
  • the drug resistance gene include a kanamycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, and a bialaphos resistance gene.
  • thermostable cellobiohydrolase of the first aspect of the present invention can be expressed.
  • Conventionally known cellobiohydrolases have a narrow range of current hosts, that is, many of them are difficult to heterologously express.
  • the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention can be expressed in a wide range of expression hosts such as Escherichia coli, yeast, filamentous fungi, and higher plant chloroplasts.
  • the method for producing a transformant using an expression vector is not particularly limited, and can be carried out by a method usually used for producing a transformant.
  • Examples of the method include an Agrobacterium method, a particle gun method, an electroporation method, and a PEG (polyethylene glycol) method.
  • a host is a plant cell, it is preferable to carry out by the particle gun method or the Agrobacterium method.
  • the host into which the expression vector is introduced may be a prokaryotic cell such as Escherichia coli or a eukaryotic cell such as yeast, filamentous fungus, insect cultured cell, mammalian cultured cell, or plant cell.
  • a prokaryotic cell such as Escherichia coli
  • a eukaryotic cell such as yeast, filamentous fungus, insect cultured cell, mammalian cultured cell, or plant cell.
  • thermostable cellobiohydrolase when the transformant is a filamentous fungus such as Aspergillus or a eukaryotic microorganism such as yeast, a thermostable cellobiohydrolase with higher heat resistance can be produced in a relatively simple manner in large quantities.
  • the transformed plant into which the expression vector of the third aspect of the present invention has been introduced has a relatively large amount of thermostable cellobiohydrolase according to the present invention produced per individual, It is also possible to cultivate in large quantities, such as outdoors.
  • the transformed plant since the transformed plant originally contains a thermostable cellobiohydrolase in the plant body, it is suitable as a biomass resource.
  • the obtained transformant is generally used in the same manner as the host before transformation. It can be cultured by the method.
  • a plant cultured cell may be used as a host, or a plant organ or a plant tissue may be used.
  • a transformed plant can be obtained from transformed plant cells or callus.
  • a transformed plant cell can be obtained by culturing a transformed plant cell using a hormone-free regeneration medium or the like, and transplanting and cultivating the obtained rooted young plant body to soil or the like. it can.
  • the expression cassette for expressing the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention derived from the expression vector according to the third aspect of the present invention is a plant nuclear genome. May be incorporated into the chloroplast genome, but is preferably incorporated into the chloroplast genome.
  • the chloroplast transformant since the inserted foreign gene is cytoplasmically inherited, it is possible to prevent environmental leakage of the recombinant gene through pollen. In large-scale production of transformed plants by field cultivation, there is concern about environmental leakage of recombinant genes, but chloroplast transformants can suppress environmental leakage of recombinant genes more than nuclear genome transformants. There is an advantage in that.
  • the transformant according to the present invention when the transformant according to the present invention is a plant, the transformant includes the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention in the same manner as the plant in addition to the plant directly obtained by transformation. Also included are plants that are descendants of the plant in which they are expressed.
  • the plant progeny means a plant obtained by germinating seeds obtained from a plant, a plant obtained by cutting, and the like.
  • the type of plant used as a host is not particularly limited, and may be a dicotyledonous plant, a monocotyledonous plant, a fern or a moss, and an algae or microalgae. It may be.
  • plants belonging to Brassicaceae, Gramineae, Eggplant, Legume, Asteraceae, Convolvulaceae, Euphorbiaceae and the like can be mentioned. Since it is a plant suitable for transformation via Agrobacterium, a plant of the family Solanaceae, Brassicaceae or Gramineae is preferable.
  • solanaceous plants include tobacco, eggplant, potato, tomato, and bell pepper.
  • Examples of the cruciferous plants include Arabidopsis thaliana, rape, solouna, radish, cabbage, and wasabi.
  • Examples of the grass family include rice, corn, sorghum, wheat, barley, rye, and millet.
  • Other leguminous plants include peanuts, chickpeas, soybeans, kidney beans, and the like.
  • Examples of asteraceae plants include burdock, mugwort, calendula, cornflower, sunflower and the like.
  • Examples of the Convolvulaceae plant include the convolvulus, the convolvulus, the prunus, and the convolvulus.
  • Examples of Euphorbiaceae plants include Euphorbiaceae, Nuttodai, Takatodai, and the like.
  • thermostable cellobiohydrolase The method for producing a thermostable cellobiohydrolase according to the fifth aspect of the present invention is a method for producing a thermostable cellobiohydrolase in the transformant according to the fourth aspect of the present invention.
  • the present invention relates to Thermostable cellobiohydrolase is constantly expressed.
  • thermostable cellobiohydrolase is expressed in the transformant.
  • thermostable cellobiohydrolase produced by the transformant may be used while remaining in the transformant, or may be extracted and purified from the transformant.
  • the method for extracting and purifying the thermostable cellobiohydrolase from the transformant is not particularly limited as long as it does not impair the activity of the thermostable cellobiohydrolase.
  • it can extract by the method normally used.
  • Examples of the method include a method in which the transformant is immersed in an appropriate extraction buffer to extract heat-resistant cellobiohydrolase, and then separated into an extract and a solid residue.
  • the extraction buffer preferably contains a solubilizer such as a surfactant.
  • the transformant is a plant, the transformant may be shredded or pulverized in advance before being immersed in the extraction buffer.
  • thermostable cellobiohydrolase in the extract can be purified using a known purification method such as a salting out method, an ultrafiltration method, or a chromatography method.
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention When the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention is expressed in a state having a secretory signal peptide in the transformant, the transformant is cultured from the obtained culture after culturing the transformant. By collecting the removed culture supernatant, a solution containing a thermostable cellobiohydrolase can be easily obtained.
  • the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention has a tag such as a His tag
  • the thermostable cellobiohydrolase in the extract or culture supernatant is obtained by affinity chromatography using the tag. Can be easily purified.
  • the cellulase mixture according to the sixth aspect of the present invention is a heat-resistant cellobiohydrolase according to the first aspect of the present invention or a heat-resistant cellobiohydrolase produced according to the method according to the fifth aspect. Sex cellobiohydrolase and at least one other cellulase.
  • the thermostable cellobiohydrolase produced by the method for producing a thermostable cellobiohydrolase of the fifth aspect may be contained in a transformant, and extracted and purified from the transformant. It may be what was done.
  • the cellulase other than the thermostable cellobiohydrolase contained in the cellulase mixture is not particularly limited as long as it has a hydrolysis activity of cellulose.
  • examples thereof include hemicellulases such as xylanase and ⁇ -xylosidase, ⁇ -glucosidase, endoglucanase and the like.
  • the cellulase mixture according to the present invention preferably contains at least one of hemicellulase and endoglucanase, and more preferably contains both hemicellulase and endoglucanase.
  • those containing one or more selected from the group consisting of xylanase, ⁇ -xylosidase, ⁇ -glucosidase, and endoglucanase are preferable, and those containing all of xylanase, ⁇ -xylosidase, ⁇ -glucosidase, and endoglucanase are more preferable. preferable.
  • the other cellulase contained in the cellulase mixture is preferably a thermostable cellulase having cellulase activity at least at 70 ° C., and more preferably a thermostable cellulase having cellulase activity at 70 to 90 ° C. Since all the enzymes contained in the cellulase mixture are heat resistant, the cellulose decomposition reaction by the cellulase mixture can be efficiently performed under high temperature conditions. That is, when the cellulase mixture contains only heat-resistant cellulase, the cellulase mixture can be used for lignocellulose saccharification treatment to perform lignocellulose hydrolysis reaction in a high-temperature environment at a saccharification temperature of 70 to 90 ° C. . By this high-temperature saccharification, the amount of enzyme and saccharification time can be significantly reduced, and the saccharification cost is greatly reduced.
  • the manufacturing method of the cellulose degradation product which is the 7th aspect of this invention is a method of decomposing
  • a material containing cellulose is used as the thermostable cellobiohydrolase of the first aspect of the present invention, the transformant of the fourth aspect of the present invention, or the thermostable cello of the fifth aspect of the present invention.
  • a cellulose degradation product is produced by contacting with the thermostable cellobiohydrolase produced by the biohydrolase production method.
  • the material containing cellulose is not particularly limited as long as it contains cellulose.
  • Examples of the material include cellulosic biomass such as weeds and agricultural waste, and waste paper.
  • physical treatment such as crushing and shredding, chemical treatment such as acid and alkali, immersion or dissolution treatment in an appropriate buffer Etc. are preferably performed.
  • the reaction conditions for the hydrolysis reaction of cellulose by the thermostable cellobiohydrolase according to the present invention may be any conditions as long as the thermostable cellobiohydrolase exhibits cellobiohydrolase activity.
  • the reaction is preferably performed at 55 to 80 ° C. and pH 3.5 to 7.0, and more preferably at 70 to 100 ° C. and pH 4.0 to 6.0.
  • the reaction time is appropriately adjusted in consideration of the type of material containing cellulose subjected to hydrolysis, the pretreatment method, the amount, and the like. For example, when cellulosic biomass is decomposed for 10 minutes to 100 hours, the reaction time can be 1 to 100 hours.
  • thermostable cellobiohydrolase it is also preferable to use at least one other cellulase for the hydrolysis reaction of cellulose.
  • the other cellulase the same cellulase as that contained in the cellulase mixture can be used, and it is preferably a thermostable cellulase having cellulase activity at least at 70 ° C., preferably at least 70 to 100 ° C.
  • the method for producing a cellulose degradation product includes the heat-resistant cellobiohydrolase according to the first aspect of the present invention, the transformant according to the fourth aspect of the present invention, or the heat resistance according to the fifth aspect.
  • the thermostable cellobiohydrolase produced by the method for producing cellobiohydrolase, the cellulase mixture of the sixth aspect of the present invention may be used.
  • a method for producing a polynucleotide encoding a thermostable cellobiohydrolase according to the eighth aspect of the present invention comprises a base represented by SEQ ID NO: 12 using a biologically-derived DNA or a biologically-derived RNA reverse transcription product as a template.
  • a forward primer (primer according to the ninth aspect of the present invention) consisting of a sequence or a base sequence in which one or several bases are added to the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, and SEQ ID NO: 13
  • a reverse primer consisting of a base sequence in which one or several bases are added to the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 (primer according to the tenth aspect of the present invention) Is used to obtain a polynucleotide containing a base sequence encoding thermostable cellobiohydrolase as an amplification product.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 is a base sequence that is homologous (identical) to a partial sequence consisting of bases 1 to 22 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 is a base sequence complementary to a partial sequence consisting of bases at positions 1263 to 1284 of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. For this reason, a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 is used as a forward primer, and a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 is used as a reverse primer.
  • a polynucleotide encoding the cellobiohydrolase catalytic region of the AR19G-166 gene by performing PCR using a nucleotide as a template (for example, a polynucleotide consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8) Can be obtained as an amplification product.
  • the 5 'end of the primer may have an additional base sequence that is not used for hybridization with the template.
  • a forward primer consisting of a base sequence in which one or several bases are added to the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12, and 1 or 5 at the 5 ′ end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13
  • a reverse primer consisting of a base sequence to which several bases have been added
  • a polynucleotide to which a base is added and one or several bases derived from the reverse primer are added to the 3 ′ end can be obtained.
  • each primer examples include, for example, a sequence required for incorporating an amplification product into an expression vector, a restriction enzyme site, a base sequence encoding a tag, and a base encoding a signal peptide. Examples include sequences. It is also preferable to add initiation methionine (ATG) to the 5 'end of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12.
  • ATG initiation methionine
  • the DNA used as a template for PCR is a reverse transcription product (cDNA) of biological DNA or biological RNA.
  • the organism may be a microorganism artificially introduced with a plasmid in which a polynucleotide encoding the cellobiohydrolase catalytic region of the AR19G-166 gene is artificially introduced, or the transformant, and a sample collected from nature It may be an organism contained therein.
  • the sample is preferably a sample collected from a high temperature environment such as hot spring soil.
  • PCR conditions and the like can be appropriately determined by those skilled in the art in consideration of the type of polymerase to be used. If the nucleic acid used as a template contains genomic DNA of the AR19G-166 gene or cDNA synthesized from the mRNA of the gene, the PCR encodes the cellobiohydrolase catalytic region of the AR19G-166 gene.
  • the polynucleotide to be obtained can be obtained as an amplification product.
  • the amino acid sequence of the cellobiohydrolase catalytic region is highly conserved among homologous genes. Therefore, when the nucleic acid used as a template contains genomic DNA of the homologous gene of AR19G-166 gene or cDNA synthesized from mRNA of the homologous gene by using the forward primer and the reverse primer.
  • the polynucleotide encoding the cellobiohydrolase catalytic region of the AR19G-166 gene homolog gene can be obtained as an amplification product by the polynucleotide production method of the present invention.
  • a gene synthesized from a genomic DNA of a gene other than the AR19G-166 gene homologous gene and having a base sequence similar to the AR19G-166 gene or mRNA of the homologous gene is included. If it is contained, the polynucleotide encoding the entire region or a partial region of the gene can be obtained as an amplification product by the method for producing a polynucleotide according to the present invention. Therefore, the method for producing a polynucleotide according to the present invention is also useful for cloning a novel cellobiohydrolase having an amino acid sequence similar to the AR19G-166 gene.
  • thermostable cellobiohydrolase Cloning of novel thermostable cellobiohydrolase from hot spring soil ⁇ 1> DNA extraction from hot spring soil and whole genome sequence (Whole Genome Sequence, WGS) Collect soil DNA from neutral to weak alkaline hot springs for the purpose of gene search for thermostable cellobiohydrolase (optimum temperature: 55 ° C or higher) and super thermostable cellobiohydrolase (optimum temperature: 80 ° C or more) The base sequence of the microbiota metagenomic DNA constituting these soils was then deciphered.
  • DNA was extracted from 10 g of each collected hot spring soil sample using a DNA extraction kit (ISOIL Large for Beads ver. 2, manufactured by NIPPON GENE). Among genomic samples obtained with a DNA amount of 10 ⁇ g or more, 5 ⁇ g was used, and metagenomic sequencing was performed. That is, a shotgun sequence of metagenomic DNA and 16srDNA amplicon was performed on the extracted DNA using GS FLX Titanium 454 manufactured by Roche Diagnostics. The remaining DNA was used for PCR cloning of the cellulase gene.
  • ISOIL Large for Beads ver. 2 manufactured by NIPPON GENE
  • genomic amplification was performed using a genomic DNA amplification kit (GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit, manufactured by GE Healthcare). The sequence was decoded. Decode the metagenomic DNA 3 to 4 times for each hot spring soil sample, a total of 19 times.
  • Whole genome sequence (WGS) with an average read length of 394 bp, total number of reads 26,295,463, and total genome decoding amount 10.3 Gbp A data set was obtained.
  • the quality filtered lead and the assembly contig of 100 bp or more were 2.5 Gbp in total, and this data set was used for cellulase enzyme gene analysis.
  • total 278,185 contigs total 278,185 contigs
  • Open reading frame (ORF) prediction of cellobiohydrolase EC number is 3.2.1.4 (cellulose) from UniProt database (http://www.uniprot.org/) 3.2.1. Download the sequence of 37 ( ⁇ -xylosidase), 3.2.1.91 (cellulose 1,4- ⁇ -cellobiosidase), 3.2.1.8 (endo 1,4- ⁇ -xylanase) (access date) : 2009/4/13), a proteome local database of these glucoside hydrolase genes was constructed.
  • the coding region of glucoside hydrolase was obtained. At this time, sequences having a coding region of 100 bp or less were removed.
  • the target contig is referred to the hit enzyme sequence on the local database, and the frame shift of the sequence is corrected by inserting or deleting a gap so that the alignment score is maximized.
  • glucoside hydrolase such as cellulase, endohemicellulase, debranching enzyme and the like thus obtained
  • the protein functional region sequence database pfam HMMs (Pfam version 23.0 and HMMER v2.3; Finn et al., Nucleic Acids Research Database , 2010, Issue 38, p.D211-222).
  • HMMER sequence homology search algorithm
  • Biological sequence analysis probabilistic models of proteins and nucleic acids', 1998, Cambridge University Press. hmmpfam (Ver.
  • Orphelia detects ORF using ATG (methionine), rare codons GTG (valine), TTG (leucine), and ATA (isoleucine) as start codons. For this reason, if the assembled contig does not include a full-length ORF with ATG as the start codon, an error occurs in Orphelia that recognizes the rare codon as the start codon.
  • ATG methionine
  • GTG valine
  • TTG leucine
  • ATA isoleucine
  • Table 1 shows the results of GH family classification of 44 ORFs estimated to be cellobiohydrolase genes.
  • the numbers in parentheses represent the number of full-length ORFs starting from methionine.
  • two cellobiohydrolase ORFs belonging to the GH6 family are from metagenome AR19 (AR19G-166 and AR19G-12) and from metagenome OJ1 (OJ1-1 and OJ1-2), a total of four Obtained.
  • an ORF sequence belonging to the GH7 family was not obtained.
  • 15 and 12 ORFs belonging to the GH9 and GH48 families were obtained, respectively.
  • Cellulase enzyme solutions for biofuels currently in practical use are Novozyme CELLIC (registered trademark) CTec2 (http://www.bioenergy.novozymes.com/cellulosic-ethanol/), Genencor Accelerase (registered trademark). TRIO (http://www.genencor.com/industries/biofuels/fuel_ethanol_from_biomass_cellulosic_biofuels/), which is based on an enzyme secreted by the wood-decaying fungus Trichoderma reesei.
  • the main constituent enzymes of glucoside hydrolase (GH) secreted by this filamentous fungus are cellobiohydrolases CBHI and CBHII, which belong to the GH7 family and GH6 family, respectively.
  • Open reading frames OJ1-1 and OJ1-2 The open reading frame OJ1-1 encoded a multidomain enzyme consisting of 548 amino acids and having a cellulose binding module CBM3 (149 bp) -linker (111 bp) -GH6 catalytic domain. However, the latter half of the catalytic region lacked a stop codon and was incomplete.
  • this cellulose binding module sequence has 63% sequence identity in terms of amino acid sequence with the cellulose binding module CBM3 (SEQ ID NO: 16) possessed by cellobiohydrolase (Genbank: AAF22273.1) of the thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans. A novel CBM3 sequence shown.
  • the cellobiohydrolase catalytic region of OJ1-1 shows 58% sequence identity in amino acid sequence with cellulose 1,4- ⁇ -cellobiosidase (Genbank: ADJ46954.1) of Amycolatopsis mediterranei U32 and has a strong cellulase enzyme.
  • the amino acid sequence showed 48% sequence identity with ⁇ -1,4-cellobiohydrolase (Genbank: AAA622211.1) of the thermophilic actinomycetes Thermobifida fusca YX.
  • OJ1-1-11 One gene clone (OJ1-1-11) was obtained from OJ1-1 by PCR cloning.
  • OJ1-1-11 consists of 548 amino acids, and 32 amino acids (M1-A32) from the start codon methionine (M) (position 1) to alanine at position 32 are secretion signals (signalP 4.0), 35 148 amino acids (T35-P183) from threonine at position 182 to proline at position 182 are cellulose binding module CBM3, and 112 amino acids (S183-T294) from serine (S) at position 183 to threonine at position 294 are linker sequences.
  • M1-A32 32 amino acids from the start codon methionine (M) (position 1) to alanine at position 32 are secretion signals (signalP 4.0)
  • 35 148 amino acids (T35-P183) from threonine at position 182 to proline at position 182 are cellulose binding module CBM3
  • the open reading frame OJ1-2 was a base sequence encoding a polypeptide consisting of 247 amino acids and consisting only of the GH6 catalytic region.
  • OJ1-2 is an incomplete sequence because OJ1-2 lacks both the start and stop codons, and cellobiohydrolase of the GH6 family is usually composed of 400 or more amino acids.
  • the amino acid sequence deduced from OJ1-2 is 100% identical to the amino acid sequence of AR19G-12. Therefore, OJ1-2 is the same gene as AR19G-12 and is a partial sequence of AR19G-12. it is conceivable that.
  • the gene clone obtained from OJ1-2 by PCR cloning incorporated its catalytic region into a transformation vector and expressed it in E. coli. As a result, no enzyme activity was obtained for both PSA and CMC substrates.
  • Open reading frames AR19G-166 and AR19G-12 The open reading frame AR19G-166 encoded a polypeptide consisting of 474 amino acids (SEQ ID NO: 9), but was an incomplete length sequence in which the start codon was lost, only the partial sequence of the linker and the GH6 catalytic region. Consisted of.
  • the GH6 catalytic region of AR19G-166 showed 66% amino acid sequence identity with the glucoside hydrolase (Genbank: ABX047776.1) of the Chloroflexus mesophilic aerobic bacterium Herpetosiphon aurantiacus DSM 785.
  • AR19G-166-RA and AR19G-166-QV differed only in the two amino acids at positions 299 and 351.
  • the amino acid at position 299 was arginine and the amino acid at position 351 was alanine (SEQ ID NO: 1).
  • the amino acid at position 299 was glutamine, and the amino acid at position 351 was valine (SEQ ID NO: 3).
  • the open reading frame AR19G-12 encoded a polypeptide consisting of 459 amino acids (SEQ ID NO: 10). Like AR19G-166, the open reading frame AR19G-12 is an incomplete length sequence in which the start codon is lost. And the GH6 catalyst region. The GH6 catalytic region of AR19G-12 showed 64% amino acid sequence identity with Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 family 6 glucoside hydrolase (Genbank: ABX04776.1). However, when a gene clone obtained by PCR from AR19G-12 was incorporated into a transformation vector and expressed in E. coli, no enzyme activity was obtained for either PSA or CMC substrate.
  • FIG. 1 is a rooted molecular phylogenetic tree of exo-type glucoside hydrolases (cellobiohydrolase, glucoside hydrolase, exoglucanase, and cellobiosidase) belonging to the GH6 family.
  • homology search was performed on Genbank by BLASTP, and the sequence of 21 family 6 exo-type glucoside hydrolases was obtained.
  • the endoglucanase Thermobifida fusca YX Cel6A (Genbank: AAC063888.1) belonging to the GH6 family was out-group.
  • the bootstrap probability was calculated from 1,000 replicas and indicated as a percentage at each branch point of the phylogenetic tree. In FIG. 1, the scale shown at the bottom is the genetic distance (average number of amino acid substitutions / site).
  • the enzyme name “CBH” in parentheses is an abbreviation for cellobiohydrolase
  • GH is an abbreviation for glucoside hydrolase.
  • Bacterial and filamentous fungal family 6 glucoside hydrolases used for the phylogenetic tree reference are as follows (in parentheses are Genbank, Protein Data bank (PDB) or EMBL-Bank accession numbers).
  • Fungal Family 6 glycoside hydrolase Acremonium cellulolyticus Y-94 cellobiohydrolase II (Genbank: BAA74458.1); Agaricus bisporus cellobiohydrolase (Genbank: AAA50608.1); Aspergillus kawachii IFO 4308 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase C ( Genbank: GAA89571.1); Aspergillus niger ATCC 1015 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase C (Genbank: EHA25828.1); Chathemium thermophile um cellobiohydrolase family 6 (Genbank: AAW64927.1); Colletotrichum higginsianum glucosid hydrolase family 6 (Genbank: CCF3325
  • Lupac 08 1,4-beta-cellobiohydrolase (Genbank: CCH20969.1); Paenibacillus curdlanolyticus YK9 1,4-beta-cellobiohydrolase (Genbank: EFM08880.1); Ralstonia solanacearum Po82 cellobiohydrolase A (Genbank: AEG71050.1); Salinispora arenicola CNS-205 glucosid hydrochloride family 6 (Genbank: ABV997773.1); Stackbrandtiana nasauensis DSM 44728 1,4-beta-cellobiosidase ( enbank: ADD42622.1); Stigmatella aurantiaca DW4 / 3-1 exoglucanase A (Genbank: EAU67050.1); Streptomyces avermitilis MA-4680 1,4-beta-cellobiosidase (Genbank: BAC69564.1); Teredinibacter turnerae T7901
  • raphani 756C exolucanase A (Genbank: AEL08359.1); Xanthomonas oryzae pv. oryzae KACC 10331 1,4-beta-cellobiosidase (Genbank: AAW77289.1); Xylanimonas cellulosilytica DSM 15894 glucosid hydrolase family 6 (Genbank: ACZ30181.1); Xylella fastidiosa Ann-1 cellobiohydrolase A (Genbank: EGO81204.1).
  • the exo-type glucoside hydrolase belonging to the GH6 family was divided into two branch groups having a large genetic distance from each other, that is, a branch group derived from bacteria and a branch group derived from filamentous fungi.
  • the lower branching group in FIG. 1 is all filamentous fungal family 6 glucoside hydrolase, while the upper branching group is all bacterial family 6 glucoside hydrolase.
  • the open reading frames AR19G-166, AR19G-12, and OJ1-1 are all located in the bacterial branch group, Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 family 6 glucoside hydrolase, Gram-negative wood-degrading bacterium Cellvibrio japonicus cellobiohydrolase cel6A It constitutes one branch group with cellobiohydrolase of the marine ⁇ proteobacterium Teredinibacter turnerae.
  • the four open reading frames (AR19G-166, AR19G-12 (OJ1-2), OJ1-1) belonging to the GH6 family obtained by metagenomic analysis are the thermophilic filamentous fungi Acremonium cellulolyticus, Chaetomium thermophilum, the biodegradable fungus Thermophilidus fusca serosidiotrophic thermotrophic thermoside fungus Thermosidia fusca and the serobioside thermosidiotrophic thermoside fungi Thermosophyllus fuscaside hydrotrophic thermoside fungus DS It was found to be closely related to hydrolase. From this, it is estimated that these four open reading frames belonging to the GH6 family are bacterial cellobiohydrolase genes. OJ1-1 has a bacterial-specific cellulose binding module CBM3 and strongly supports this assumption.
  • the Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 family 6 glucoside hydrolase that showed high amino acid sequence identity with AR19G-166-RA and AR19G-166-QV is composed of 1128 amino acids.
  • the gene starts with a transition signal sequence consisting of 29 amino acids from position 1 to position 29, cellulose binding module CBM2 consisting of 100 amino acids from position 37 to position 136, GH6 catalyst consisting of 370 amino acids from position 241 to position 611
  • Each of these GH6 catalytic regions shown by Pfam is composed of 370 amino acid residues, and more than 50 amino acid residues than the catalytic region of bacterial GH6 catalytic region, for example, Thermobifida fusca YX Cel6B composed of 423 amino acid residues. It was considered short and could not cover the actual catalyst area. Therefore, BLASTP was used to search for the GH6 catalytic region of Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 that is homologous to Thermobifida fusca YX Cel6B, and as shown in FIG. It consisted of 428 amino acid residues up to glutamine (Q).
  • the GH6 catalytic region of OJ1-1 has an incomplete length, but this partial sequence shows 57% amino acid sequence identity to the GH6 catalytic region of AR19G-166, and the family 6CBH (TrCBHII of the filamentous fungus Trichoderma ressei ) Only 25% sequence identity.
  • AR19G-166 has 47 amino acid residues before the GH6 catalytic region sequence. This amino acid sequence was considered to be part of the linker because proline (P) and threonine (T) were repeated many times. Therefore, AR19G-166 was presumed to be a multidomain gene having a cellulose-binding module CBM via a linker sequence upstream of the cellobiohydrolase catalytic region, similar to OJ1-1.
  • FIG. 2A shows an amino acid sequence alignment of a polypeptide consisting of an amino acid sequence deduced from open reading frames (AR19G-166, AR19G-12, OJ1-1), and a family 6 glucoside hydrolase of Herpetosiphon aurantiacus DSM 785.
  • FIG. 2B shows the amino acid sequence deduced from the open reading frame OJ1-1 and the amino acid sequence alignment of the cellulose-binding module CBM3 (Genbank: AAF22273.1) of the thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans.
  • CBM3 Genebank: AAF22273.1
  • the black-and-white inverted amino acids indicate the regions in which amino acid residues are conserved in all of these amino acid sequences, and the shaded amino acids are mostly partially mutated in these amino acid sequences. A region in which amino acid residues are conserved in an amino acid sequence is shown.
  • FIG. 3A shows an amino acid schematic diagram of a polypeptide consisting of an amino acid sequence deduced from open reading frames (AR19G-166, AR19G-12, OJ1-1), and the CBH gene of Herpetosiphon aurantiacus DSM 785.
  • FIG. 3B shows the amino acid sequence deduced from the open reading frame OJ1-1 and the amino acid schematic diagram of the cellulose-binding module CBM3 of the thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans.
  • “catalyst region (part)” and “linker (part)” indicate that only a part of each region is present.
  • a cellobiohydrolase candidate gene obtained by PCR cloning is amplified by PCR using a hot spring soil DNA amplified by a genomic DNA amplification kit (GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit, manufactured by GE Healthcare) as a template. did.
  • the amplified PCR product was inserted into the pET101 / D-TOPO vector of Champion pET Directional TOPO (registered trademark) Expression Kits (manufactured by Invitrogen), and transformed into One Shot TOP10 strain.
  • a positive clone was selected by colony PCR, and cultured in an LB liquid medium containing 100 mg / L ampicillin at 37 ° C. and 200 rpm for 17 to 20 hours.
  • a miniprep kit (Wizard® plus SV Minipreps DNA Purification System, Plasmids were prepared using Promega). The prepared plasmid was subjected to sequence confirmation using a Life Technologies 3730 DNA Analyzer sequencer.
  • IPTG Isopropyl- ⁇ -D ( ⁇ )-thiogalactopyroside
  • E. coli was collected by centrifugation, and suspended by adding 1/10 volume of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8) to the culture solution. Thereafter, using an ultrasonic crusher BioRuptorUCD-200T (manufactured by Cosmo Bio), a 30-second crushing-30-second pause process was repeated 10 cycles to obtain a crude extract of genetically modified E.
  • the gene recombinant E. coli disruption supernatant is packed in an ion exchange column HiTrap Q HP (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the medium-high pressure liquid chromatography system AKTA design ( GE Healthcare) was used to fractionate proteins with a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 M NaCl with a concentration gradient of 0 to 50%.
  • the fractions having cellobiohydrolase activity were mixed together and then mixed into 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 750 mM ammonium sulfate using a centrifugal ultrafiltration membrane VIVASPIN 20 (manufactured by Sartorius Stedim). The solution was changed.
  • the cellobiohydrolase activity fraction after the solution exchange is packed in a hydrophobic interaction separation column HiTrap Phnenyl HP (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with the same solution, and loaded in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0). Proteins were fractionated with a concentration gradient of 100-0%.
  • the fractions having cellobiohydrolase activity were mixed together and then concentrated using VIVASPIN 20 until the liquid volume reached about 8 mL.
  • the concentrated sample is added to a gel filtration column Hiload26 / 60 superdex200 pg (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 150 mM NaCl, and the column volume is changed to 1-1. Fractionation was performed by flowing 5 volumes of the same buffer at a flow rate of 2 to 3 mL / min.
  • the fractions having cellobiohydrolase activity were mixed together and then exchanged with a 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) and concentrated to obtain a purified enzyme having a final concentration of about 1 mg / mL.
  • the recombinant E. coli disrupted supernatant and purified cellobiohydrolase enzyme protein were confirmed by SDS-PAGE analysis and Western blotting.
  • SDS electrophoresis of the recombinant E. coli disrupted supernatant and the purified enzyme was performed using 4-20% mini-gradient gel and 10% mini-gel (manufactured by ATTO), respectively.
  • the supernatant and purified enzyme were mixed with Tris-SDS ⁇ ME treatment solution (COSMO BIO INC.) At a ratio of 1: 1 and then treated at 100 ° C. for 10 minutes. Respectively migrated 0.5 ⁇ L.
  • the immobilized gel was stained with Coomassie Brilliant Blue R250 (Merck) to visualize the protein band.
  • the Western blotting of the recombinant E. coli disrupted supernatant and the purified enzyme was performed by SDS electrophoresis using a 10% mini gel (manufactured by ATTO), and then using a transfer device Trans-Blot SD (manufactured by Bio-Rad). Transferred to a vinylidene chloride film (manufactured by ATTO). The protein on the membrane was reacted with a rabbit primary antibody diluted 1000 times.
  • the rabbit primary antibody is synthesized by synthesizing a polypeptide consisting of 20 amino acid residues (CDPNGSQSRYNSAYPTGALPN) at positions 384 to 403 encoded by AR19G-166-QV, and affinity-purifying the serum obtained by immunizing the rabbit. Prepared (manufactured by Operon Biotechnology). Detection of the primary antibody bound to the protein was performed using a Fast Western Blotting kit (Pierce), and an chemiluminescence signal was detected using an imaging device Ez-Capture MG (ATTO).
  • CDPNGSQSRYNSAYPTGALPN 20 amino acid residues
  • FIG. 4 shows the results of SDS-PAGE analysis (FIG. 4 (A)) and Western blot analysis (FIG. 4 (B)) of enzyme proteins obtained by expressing AR19G-166-RA and AR19G-166-QV in E. coli. Results are shown.
  • Lane 1 is protein molecular weight index
  • lanes 2 and 3 are AR19G-166-RA and AR19G-166-QV recombinant E. coli disrupted supernatants
  • lanes 4 and 5 are purified AR19G-166-RA protein and It is an electrophoresis pattern of AR19G-166-QV protein.
  • the cellobiohydrolase gene is generally very poorly expressed. For example, when the cellobiohydrolase gene is expressed using Escherichia coli as a host, the gene is hardly expressed regardless of whether it is derived from a filamentous fungus or a bacterium.
  • the PCR clones AR19G-166-RA and AR19G-166-QV were both well expressed in E. coli.
  • SDS-PAGE analysis of AR19G-166-RA and AR19G-166-QV recombinant E. coli disrupted supernatant a strong band was observed at a molecular weight of 46.7 kDa predicted from the amino acid sequence (SEQ ID NOs: 1 and 3). (Lanes 2 and 3 in FIG.
  • PSA hydrolysis activity Phosphate swollen Avicel (PSA) was used as a substrate for cellobiohadolase activity measurement.
  • PSA was prepared by once dissolving Avicel powder (microcrystalline cellulose powder, manufactured by Merck) with a phosphoric acid solution, adding sterilized distilled water to precipitate, and then washing until pH reached 5 or more. All the PSA used in the subsequent experiments were prepared by this method. The activity of the recombinant E.
  • coli disrupted supernatant or the enzyme sample during purification was measured by 50 ⁇ L of 1 mM PSA-containing 200 mM acetate buffer (pH 5.5) and 50 ⁇ L of the recombinant E. coli disrupted supernatant or the enzyme during purification.
  • the mixed solution consisting of the sample was reacted at 30 to 100 ° C. for 20 minutes.
  • a mixed solution in which 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) was added instead of the recombinant E. coli disrupted supernatant and reacted under the same conditions was used as a control group.
  • the substrate solution and the enzyme were separately kept at the reaction temperature for 5 minutes and then mixed to start the reaction.
  • any of the mixed solutions was stirred using an Eppendorf thermomixer (1400 rpm).
  • an equal volume of 3,5-dinitrosalicyclic acid reagent (DNS solution) was added, heat-treated at 100 ° C. for 5 minutes, and centrifuged after cooling for 5 minutes to obtain a supernatant.
  • the amount of reducing sugar in the supernatant is measured by measuring the absorbance at 540 nm using a spectrophotometer, calculated using a calibration curve prepared with glucose, and the amount of reducing sugar produced by hydrolysis of the enzyme from the difference from the control section Asked.
  • the enzyme activity for producing 1 ⁇ mol of reducing sugar per minute was defined as 1 U, and the value divided by the amount of protein was defined as the specific activity (U / mg).
  • Substrate specificity of cellobiohydrolase The hydrolysis activity of various cellulose substrates and hemicellulose substrates was examined for AR19G-166-RA and AR19G-166-QV, which were confirmed to have PSA hydrolysis activity.
  • the purified enzyme obtained in ⁇ 9> (final concentration of about 1 mg / mL) was used.
  • the substrate specificity of cellobiohydrolase AR19G-166 is as follows: PSA, Avicel powder, CMC (carboxymethylcellulose, Sigma), xylan (derived from beech material, Sigma), lichenan (MP Biomedicals), laminarin (Laminaria) Measured using digital data (manufactured by Sigma).
  • AR19G-166-RA and AR19G-166-QV showed high hydrolysis activity against water-soluble PSA. It also showed degradation activity against Lichinan composed of ⁇ -1,3 bonds and ⁇ -1,4 bond glucans and Avicel of crystalline cellulose.
  • CMC Laminarin consisting of ⁇ -1,3 bond and ⁇ -1,6 bond glucan, and xylan showed almost no degradation activity.
  • the enzyme substrate specificity of being very weak but having hydrolytic activity against crystalline cellulose Avicel and not degrading against xylan is that AR19G-166-RA and AR19G-166-QV are GH6 family It is a cellobiohydrolase belonging to the above.
  • the hydrolysis reaction product was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was filtered through a filter having a pore size of 0.2 ⁇ m and subjected to HPLC analysis.
  • the HPLC apparatus used was Alliance e2695 (manufactured by Waters), and an RI detector (2414RI) was used for sugar detection. Empor version 3.0 was used as the control and analysis software for the HPLC apparatus.
  • the column was HPLC Carbohydrate Analysis Column 300 mm ⁇ 7.8 mm (manufactured by BIO-RAD), and the solvent was ultrapure water.
  • a hydrolysis sample of 10 ⁇ L was analyzed at a flow rate of 0.6 mL / min and a column temperature of 85 ° C.
  • a calibration curve was prepared using standard substances (glucose, cellobiose, cellotriose), and saccharides were quantified.
  • the maximum concentration of the calibration curve sample was 0.2% by mass for glucose, 0.4% by mass for cellobiose, and 0.5% by mass for cellotriose.
  • a dilution series was prepared to create a calibration curve with 6 points.
  • the measurement results of the component analysis by HPLC are shown in FIGS.
  • the product of PSA hydrolysis by AR19G-166-RA is mainly cellobiose (86.5%) and a small amount of cellotriose (13.5%) after 1 hour, and cellobiose 86.2% after 24 hours. And 13.0% of cellotriose and a very small amount of glucose (0.7%) (FIG. 5A).
  • the PSA hydrolysis reaction products by TrCBHII are mainly cellobiose (87.5%) and a small amount of cellotriose (12.5%). After 24 hours, cellobiose is 88.4% and cellotriose is 9.4%. There was a very small amount of glucose (2.2%) (FIG. 5B).
  • the results of this HPLC analysis also indicated that AR19G-166 is a cellobiohydrolase.
  • FIGS. 6A and 6B are diagrams showing the results of measuring the PSA hydrolysis activity at each temperature with the horizontal axis as the temperature.
  • FIGS. 7A and 7B show the PSA hydrolysis activity at each pH with the horizontal axis as the pH. It is the figure which showed the result. For the pH, the measured value of the mixed solution of the substrate, the buffer and the enzyme was plotted.
  • the purified enzyme AR19G-166-RA showed high PSA hydrolysis activity in the temperature range of 60-80 ° C. (FIG. 6A).
  • the optimum temperature (T opt ) showing the highest activity was 70 ° C. at pH 4.5 and 75 ° C. at pH 5.0 to 6.0.
  • the PSA hydrolysis activity of the purified enzyme AR19G-166-RA decreased sharply in any pH range.
  • purified enzyme AR19G-166-QV had a lower PSA hydrolysis activity than AR19G-166-RA at 65 ° C. or higher (FIG. 6B).
  • the optimum temperature (T opt ) showing the highest activity was 70 ° C. from pH 4.5 to pH 5.5 and 75 ° C. at pH 6.0. In any pH range, the PSA hydrolysis activity of the purified enzyme AR19G-166-RA rapidly decreased when the enzyme reaction temperature was 80 ° C. or higher.
  • purified AR19G-166-RA showed the highest PSA hydrolysis activity in the reaction temperature range of 65 to 80 ° C. and pH of 4 to 6 (FIG. 7A).
  • the optimum pH varies depending on the reaction temperature, pH 4.6 (actual value) at 60 to 65 ° C., pH 5.2 to 5.3 (actual value) at 70 to 75 ° C., and pH 5.8 at 80 ° C. (Actual measurement value).
  • pH 4.6 actual value
  • pH 5.2 to 5.3 actual value
  • pH 5.8 pH 5.8 at 80 ° C.
  • the purified enzyme AR19G-166-QV like AR19G-166-RA, exhibits the highest PSA hydrolysis activity in the pH range of 4 to 6, and in the pH ranges of 3.2 to 4.5 and pH 7 to 8, A low level of PSA hydrolysis activity was observed (FIG. 7B).
  • the pre-incubation of the purified enzyme was carried out using a mixed solution (pH 5.0) consisting of 10 ⁇ L of purified enzyme, 40 ⁇ L of purified water, and 50 ⁇ L of 200 mM acetate buffer at 0, 20, 40, 60, 120, Incubated for 240, 480, 960 or 1440 minutes.
  • PSA hydrolysis activity was measured except that the pre-incubation mixture and 1% by mass PSA aqueous solution were separately heated at 50 ° C. for 5 minutes, and then 100 ⁇ L of PSA aqueous solution was added to the mixture and reacted for 20 minutes.
  • PSA hydrolysis activity U / mg
  • Enzyme activity was shown as a relative value (relative activity,%) with the activity in the untreated section (no preincubation) as 100%.
  • the pre-incubation time during which the enzyme activity was reduced to 50% of the untreated group was defined as the half-life T half .
  • Purified AR19G-166-RA did not lose its PSA hydrolysis activity within the measurement time when the preincubation temperature was 50 to 60 ° C., and the half-life T half was 24 hours or more, the upper limit of measurement.
  • the half-life T half was calculated to be 226 minutes by the approximate curve by the exponential function shown by the thick line in FIG. 8A.
  • divalent metal ions stabilize protein structure and improve heat resistance by binding to protein.
  • Calcium (Ca 2+ ), manganese (Mn 2+ ), cobalt (Co 2+ ), barium (Ba 2+ ), magnesium (Mg 2+ ), nickel (Ni 2+ ), divalent iron (Fe 2+ ), trivalent iron (Fe 3+) ), Zinc (Zn 2+ ) divalent metal ions (concentration: 1 mM) were administered into the enzyme-substrate (PSA) reaction solution, and the effect of the enzyme protein on the PSA hydrolysis activity was measured.
  • PSA enzyme-substrate
  • AR19G-166-RA and AR19G-166-QV enzyme activities increased at a final concentration of 1 mM calcium ion or cobalt ion at 85 ° C. or higher, and manganese ion enzyme activity in a temperature range of 60-90 ° C. Markedly increased (not shown).
  • Other divalent metal ions had no effect (Ba 2+ , Mg 2+ , Ni 2+ ) or rather reduced enzyme activity (Fe 2+ , Fe 3+ , Zn 2+ ).
  • thermo degradation temperature T m thermal degradation temperature of enzyme protein
  • T m heat denaturation temperature
  • T m heat decay temperature
  • Preincubation temperature which the enzyme activity by a preliminary heating (pre-incubation) for a predetermined time is reduced to 50% of the untreated group is equal to the thermal degradation temperature T m of a protein, as indicated by the broken line drop line in FIG. 9A, the enzyme activity Can be obtained by measuring This method was determined thermal degradation temperature T m of a AR19G-166-RA and AR19G-166-QV.
  • Purified enzyme solution (concentration: about 1 mg / mL) 10 ⁇ L, purified water or 5 mM divalent metal ion chloride (CaCl 2 or MnCl 2 ) aqueous solution 40 ⁇ L, 200 mM acetate buffer 50 ⁇ L (pH 5.0) mixed solution at 30 ° C. for 30 minutes After incubation, preincubation was performed at 40-100 ° C. for 30 minutes. PSA hydrolysis activity was measured by separately heating the pre-incubation mixture and 1% by weight PSA aqueous solution for 5 minutes at 50 ° C., and then adding 100 ⁇ L of PSA aqueous solution to the mixture, followed by 20 minutes at 50 ° C.
  • Example 2 Except for the reaction, the procedure was carried out in the same manner as in ⁇ 10> of Example 1, the amount of reducing sugar produced by the hydrolysis of the enzyme was determined, and the PSA hydrolysis activity (U / mg) was calculated. The PSA hydrolysis activity value of the enzyme was measured three times for each pre-incubation temperature, and the average value and standard error were determined. Data were normalized by setting the average values of the hydrolysis activity in the low temperature region (40 to 65 ° C.) and the high temperature region (90 to 100 ° C.) where the hydrolysis activity is saturated to 1 and 0, respectively.
  • T m AR19G-166-RA Value of T m AR19G-166-RA is 76.4 ° C., whereas, value of T m AR19G-166-QV are 68.5 ° C., more of AR19G-166-RA is AR19G-166-QV than T m value Was about 8 ° C higher.
  • administration of manganese ions at a concentration of 1 mM increased the thermal decay temperatures T m of AR19G-166-RA and AR19G-166-QV by 3.0 ° C. and 4.1 ° C., respectively.
  • Example 2 When an arbitrary gene is introduced using a eukaryotic organism such as a filamentous fungus or a plant as a host, the optimum temperature of the expressed protein generally increases by about 5 to 10 ° C. This is due to a post-translational modification reaction in which a saccharide is added to a protein, called glycosylation (glycosylation modification), and the glycosylated protein becomes stable against heat.
  • AR19G-166 gene was introduced into Aspergillus oryzae, a filamentous fungus, and the effect of sugar chain modification on the heat resistance of the encoded enzyme protein was verified.
  • the PSA hydrolysis activity of the purified enzymes AR19G-166-RW and AR19G-166-QW expressed in E. coli was the same as that of ⁇ 10> of Example 1 in that the enzyme activity for producing 1 ⁇ mol of reducing sugar per minute was 1 U. And the value divided by the amount of protein, specific activity (U / mg) was calculated.
  • the PSA hydrolyzing activity of AR19G-166-RW and AR19G-166-QW produced by Aspergillus transformants is the amount of reducing sugar at 100 ° C. at which AR19G-166-RW showed the maximum hydrolytic activity.
  • the relative activity value (%) was calculated as%.
  • FIG. 11A shows the relative activity value (%) of the calculated PSA hydrolysis activity at each temperature.
  • FIG. 11A shows AR19G-166-RW and AR19G-166-QW expressed in E. coli as measured in ⁇ 13> of Example 1 (in the figure, “RW by E. coli” and “QW by E. coli, respectively).
  • the measurement results of PSA hydrolyzing activity (U / mg) are also shown.
  • the optimum temperatures (T opt ) of AR19G-166-RW and AR19G-166-QW expressed in E. coli were 80 ° C. and 75 ° C., respectively.
  • the optimum temperatures of AR19G-166-RW and AR19G-166-QW expressed in Aspergillus oryzae (“RW by A. oryzae” and “QW by A. oryzae” in the figure, respectively) are both 100 ° C. or higher. Met.
  • the AR19G-166 gene has an increase in molecular weight of about 10% by expressing Aspergillus oryzae and the optimum temperature increases by 20 to 30 ° C.
  • AR19G-166 expressed by Aspergillus oryzae had an optimum temperature higher by 30 ° C. or higher than cellobiohydrase derived from conventional thermophilic filamentous fungi, and was excellent in heat resistance.
  • thermostable cellobiohydrolase that exhibits high enzyme activity even at 80 to 100 ° C. together with other thermostable cellulases, saccharification treatment of lignocellulose can be performed under high temperature conditions of 80 ° C. or higher.
  • PSA hydrolysis activity U / mg was calculated.
  • AR19G-166-RW and AR19G-166-QW produced by Aspergillus transformants were subjected to a PSA hydrolysis reaction at a temperature of 80 ° C., and the PSA hydrolysis activity at each pH was adjusted to pH 5.2 where the maximum activity was obtained.
  • the relative activity value (%) was calculated with the PSA hydrolyzing activity of 100%.
  • FIG. 11B shows the relative activity value (%) of the calculated PSA hydrolysis activity at each pH.
  • FIG. 11B shows AR19G-166-RW and AR19G-166-QW expressed in E. coli measured in ⁇ 13> of Example 1 (in the figure, “RW by E. coli” and “QW by E. coli, respectively). The measurement results of PSA hydrolyzing activity (U / mg) are also shown.
  • AR19G-166 enzymes expressed in Aspergillus oryzae (“RW by A. oryzae” and “QW by A. oryzae” in the figure) are AR19G-166 enzymes expressed in E. coli ("RW by E. coli” and in the figure).
  • the pH was wider than that of “QW by E. coli”), and the pH showing 50% activity at the maximum value was in the range of 3.3 to 8.0 at a reaction temperature of 80 ° C. On the other hand, when E. coli was expressed, this pH range was 4.5 to 6.
  • Example 3 In general, protein production of a recombinant gene using a plant as a host yields a much higher expression level than bacterial expression systems such as Escherichia coli and Bacillus and filamentous fungi expression systems such as Aspergillus oryzae.
  • bacterial expression systems such as Escherichia coli and Bacillus and filamentous fungi expression systems such as Aspergillus oryzae.
  • a chloroplast transformant accumulates a foreign protein in a transformed leaf in a total soluble protein (TSP) ratio of 5 to 10% by mass, and sometimes shows a high accumulation of a TSP ratio of 40% by mass or more.
  • TSP total soluble protein
  • a foreign protein is accumulated in a transformant tissue at a TSP ratio of about 1% by mass.
  • tobacco chloroplast transformants were prepared by inserting AR19G-166-RA and AR19G-166-QV into the tobacco chloroplast genome.
  • tobacco chloroplast transformation cassette vectors pNtaGL and pNtaGLPL having the structure shown in the upper part of FIG. 12 were prepared.
  • This vector is a vector for introducing a target gene by homologous recombination into a trnI gene-trnA gene region in an inverted repeat sequence in a tobacco chloroplast genome.
  • aadA aminoglucoside 3′-adenyltransferase
  • CaI-BsiWI site expression cassette introduction site of the target gene downstream of the aadA gene expression cassette Have.
  • the pNtaGL vector has a promoter (Prrn) of tobacco-derived 16S ribosomal RNA gene inserted as an expression control region of the aadA gene, but the pNtaGLPL vector does not contain a promoter region, and the expression of the aadA gene is a homologous recombination region. Depends on the upstream endogenous promoter.
  • FIG. 12 shows the target gene expression cassettes pPXT and pPXTPPL in the middle of FIG. Both are designed to insert the target gene into the BamHI site, and have only the Prrn promoter and the gene10 (T7g10) sequence derived from bacteriophage T7 or the T7g10 sequence on the 5 'side of the target gene, respectively.
  • the T7g10 sequence is a sequence that has been suggested to be effective for high accumulation of foreign proteins in chloroplast expression of foreign genes.
  • the 3′-UTR (TrbcL) of the tobacco chloroplast rbcL gene is commonly placed on the 3 ′ side of the target gene, both of which are cassette vectors pNtaGL for chloroplast transformation by the ClaI site and BsiWI site at both ends of the cassette. Alternatively, it can be introduced into a pNtaGLPL vector.
  • PCR clones AR19G-166-RA and AR19G-166-QV were each amplified with a primer with a BamHI linker, and the obtained amplification products were inserted into the BamHI site of the expression cassette pPXT or pPXTPPL.
  • the expression cassette pPXT into which AR19G-166-QV has been inserted into pNtaGL using the ClaI site and the BsiWI site, the aadA gene expression cassette and the AR19G-166-QV expression cassette are located in the trnI gene-trnA gene region.
  • a chloroplast transformation construct pNtaGL-QV having a structure linked in tandem was prepared.
  • Tobacco chloroplast transformation was basically performed according to the method of Daniell et al. (Daniell et al., Methods Methods in Molecular Biology, 2005, Vol.286, pp.111-138). Specifically, tobacco aseptically seeded and grown in MS plate medium (Murashige and Skog (MS) medium (pH 5.8) containing 30 g / L sucrose solidified with 3 g / L gellan gum) Cut green leaves of Nicotiana tabacum cv.SR-1 to 0.5 cm square, and RMOP medium (Sbav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, Vol.87, p.8526-8530) was placed in the center of the petri dish.
  • MS plate medium Merashige and Skog (MS) medium (pH 5.8) containing 30 g / L sucrose solidified with 3 g / L gellan gum)
  • RMOP medium Sbav et al., Proc. Natl.
  • pNTaQV and pNtaRA were introduced using a particle gun (PDS-1000He, manufactured by BIO-RAD).
  • the particle gun used 0.6 ⁇ m gold particles and a 1100 psi rupture disk, and the distance from the rupture disk to the sample was about 9 cm.
  • Tobacco leaves after introduction of the gene construct are cultured in the dark at 25 ° C. for 3 days, then transplanted to an RMOP medium containing 500 mg / L of spectinomycin, and treated at 25 ° C. for 16 hours in the light period / 8 hours in the dark period. Planted every week. In the middle, the regenerated shoot leaves were cut, transplanted to an RMOP medium containing 500 mg / L spectinomycin, and repeatedly dedifferentiated and shoot redifferentiated to repeat homoplasmic of the plant body in a heteroplasmic state. Promoted.
  • the BglII-digested DNA was subjected to Southern blotting using a probe having the same base sequence as the trnI upstream region of about 1 kb, and the probe was chemiluminescently detected by AlkPhos Direct from GE Healthcare. Theoretically, the probe detects a DNA fragment of about 4.5 kb in wild-type tobacco and 7.1 kb in chloroplast-transformed tobacco.
  • a homoplasmic chloroplast transformant was further grown, transplanted to an 18 cm pot of culture soil at about 7 leaves, and cultivated in a recombinant greenhouse.
  • T 1 a result of analyzing the phenotype using a plant, although slightly delayed growth than wild-type, morphological abnormality was observed. In the flowering period, the plant height was 170 to 210 cm, about 25 to 35 leaves were developed, and the fresh weight was 195 to 270 g.
  • FIG. 14 (A) is a photograph of AR19G-166-QV introduction chloroplast transformed tobacco plants 77 days after the recombinant body temperature chamber transplant (T 1 generation) and wild-type tobacco (SR-1),
  • Figure 14 (B) is a photograph of AR19G-166-RA introduced chloroplast transformed tobacco plants flowering (T 1 generation).
  • thermostable cellobiohydrolase according to the present invention has cellobiohydrolase activity at least at 75 ° C. and pH 5.5, and is suitable for saccharification treatment of cellulose-containing biomass under high temperature conditions of 75 ° C. or higher.
  • the thermostable cellobiohydrolase and the polynucleotide used for the production thereof, the expression vector incorporating the polynucleotide, and the transformant into which the expression vector is introduced include, for example, energy from cellulose-containing biomass. It can be used in the field of production.

Abstract

この耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有し、配列番号１、３、５、若しくは７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列番号１、３、５、若しくは７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号１、３、５、若しくは７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。

Description

耐熱性セロビオハイドロラーゼ
　本発明は、セロビオハイドロラーゼ酵素の耐熱性に関する。セロビオハイドロラーゼは、セルロース、ヘミセルロース等のリグノセルロースを加水分解し、単糖を生成するプロセスに関わるグルコシド加水分解酵素の一つである。より詳細には、新規の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法に関する。
　地球温暖化や大気汚染などの環境上の問題に加えて、原油価格の大幅上昇や近い将来の原油枯渇予想（ピークオイル）など輸送用エネルギー供給に関わる懸念から、近年、石油代替エネルギー開発は非常に重要な課題である。植物バイオマス、若しくはリグノセルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源であり、石油代替資源として期待されている。バイオマス乾燥重量の主要構成要素は、セルロース、ヘミセルロース等の多糖類とリグニンである。例えば、多糖類は、セルラーゼ酵素と総称されるグルコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品原料として利用される。
　複雑な構造を持つリグノセルロースは難分解性であり、単一の酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、グルコシド加水分解酵素のエンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド－１，４－β－Ｄ－グルカナーゼ、ＥＣ　３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４－β－セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ　３．２．１．９１）、β－グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされる。リグノセルロースの加水分解には、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド－１，４－β－キシラナーゼ、ＥＣ　３．２．１．８）や、他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。
　リグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として高固体負荷（３０～６０％　ｓｏｌｉｄ　ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷による糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、酵素反応が進みにくいが、高温で行うことによってバイオマス糖化液の粘性が低下する結果、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が図られると期待される。また、一般に化学反応は、ファント・ホッフ－アレニウス（ｖａｎ’ｔ　Ｈｏｆｆ－Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ）の法則により、温度が１０℃上がると反応速度が２～３倍上がる。そこで、耐熱性セルラーゼ酵素を用いて従来よりも高い温度でリグノセルロース糖化処理を行った場合には、この経験則に従って高い酵素反応速度が得られるであろう。このような理由から、耐熱性酵素を用いてリグノセルロース糖化処理を高温で行うことにより、酵素量と糖化時間が大幅に削減され、酵素コストの大幅低減が可能であると考えられる。
　真核生物である好熱性糸状菌は、原核生物の好熱性細菌や超好熱性アーキアと比べ、その生存限界温度は低く、５５℃程度である。このため、好熱性糸状菌が発現、分泌するグルコシド加水分解酵素の耐熱性は、一般的にあまり高くない。これまで報告された中で最も耐熱性が高い糸状菌由来ＣＢＨ（セロビオハイドロラーゼ）は、好熱性糸状菌Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍのセロビオハイドロラーゼＣＢＨI、ＣＢＨIIが、それぞれ至適温度７５℃と７０℃を示し（例えば、非特許文献１参照。）、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのセロビオハイドロラーゼＣＢＨIは至適温度６５℃である（例えば、非特許文献２参照。）。セロビオハイドロラーゼ中の１個又は複数個のアミノ酸を置換することによって、より耐熱性を向上させる方法もあるが（例えば、特許文献１又は２参照。）、こうして得られた変異型セロビオハイドロラーゼの耐熱性は未だ不充分である。
　一方、温泉や熱水噴出孔、油田、鉱山などの極限環境から５５℃以上で増殖する好熱菌や８０℃以上で増殖する超好熱菌が分離、培養されている。これらの好熱性細菌や超好熱性アーキアに由来する耐熱性グルコシド加水分解酵素は、その大部分がエンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はグルコシダーゼ活性を持つ酵素である。リグノセルロース加水分解プロセスにおいて最も重要な役割を果たすセロビオハイドロラーゼは、わずか数個が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属に属する３種の好熱性細菌から分離されているにすぎない。例えば、好熱性嫌気性菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍは、高いリグノセルロース加水分解活性を持つ酵素複合体セルロソームを菌体外に提示する。セルロソームの主要酵素はセロビオハイドロラーゼであり、ＧＨ５ファミリーに属するＣｅｌＯ、ＧＨ９ファミリーに属するＣｂｈＡとＣｅｌＫの３種類が単離され、いずれも至適温度Ｔｏｐｔ＝６０～６５℃である（例えば、非特許文献３～５参照。）。好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａからＧＨ６ファミリーに属するＥ３（例えば、非特許文献６参照。）と、ＧＨ４８ファミリーに属するＣｅｌ４８Ａ（例えば、非特許文献７参照。）の２種類のセロビオハイドロラーゼ遺伝子が単離されている。これらのセロビオハイドロラーゼは比較的熱安定性が高く、最大値の５０％活性を示す温度範囲は４０～６０℃であり、５５℃で少なくとも１６時間安定した活性を有する。但し、これら２種類のセロビオハイドロラーゼは、７０℃以上では活性が不充分であり、これらを用いてセルロースの糖化処理を行う場合には、糖化処理温度は６０～６５℃が上限となる。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ属の好熱性細菌由来セロビオハイドロラーゼは最も耐熱性が高く、至適温度Ｔｏｐｔ＝１０５℃、活性半減期Ｔｈａｌｆが１０８℃で７０分と報告されている（例えば、非特許文献８参照。）。しかし、当該酵素は、エンドグルカナーゼ様の基質特異性を示し、アモルファス構造のセルロースとカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に対してのみ分解活性を示す。さらに、濾紙の加水分解活性が弱いことから、当該酵素によっては、結晶性リグノセルロースの効率的糖化は期待できない。
特表２００６－５１５５０６号公報 特開２０１２－３９９６７号公報
Ganju et al.，Biochim. Biophys. Acta，1989，vol.993，p.266-274. Hong et al.，Appl Microbiol Biotechnol.，2003，vol.63，p.42-50. Zverlov et al.，Microbiology，2002，vol.148，p.247-255. Zverlov et al.，Microbiology，1998，vol.143，p.3537-3542. Kataeva et al.，Journal of Bacteriology，1995，vol.181，p.5288-5295. Zhang et al.，Biochemistry，1995，vol.34，p.3386-3395. Irwin et al.，Eur J Biochem.，2000，vol.267，p.4988-4997. Ruttersmith and Daniel，Biochemical Journal，1991，vol.277，p.887-890.
　本発明は、少なくとも７５℃でセロビオハイドロラーゼ活性を示す新規な耐熱性セロビオハイドロラーゼ、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性セロビオハイドロラーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。
［１］本発明の第一の態様は、
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
（Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
（Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼである。
［２］前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、さらに、セルロース結合モジュールを有することが好ましい。
［３］本発明の第二の態様は、
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｍ) 配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
（ｎ) 配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
［４］前記［３］のポリヌクレオチドとしては、さらに、セルロース結合モジュールをコードする領域を有することが好ましい。
［５］本発明の第三の態様は、前記［３］又は［４］のポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクターである。
［６］本発明の第四の態様は、前記［５］の発現ベクターが導入されている形質転換体である。
［７］前記［６］の形質転換体は、真核微生物であることが好ましい。
［８］前記［６］の形質転換体は、植物であることが好ましい。
［９］本発明の第五の態様は、前記［６］～［８］のいずれかの形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法である。
［１０］本発明の第六の態様は、前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［２］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記［９］の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物である。
［１１］前記［１０］のセルラーゼ混合物において、前記その他のセルラーゼはヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［１２］本発明の第七の態様は、セルロースを含む材料を、前記［１］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［２］の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記［６］～［８］のいずれかの形質転換体、又は前記［９］の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることによりセルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法である。
［１３］前記［１２］のセルロース分解物の製造方法において、前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを接触させることが好ましい。
［１４］前記［１３］のセルロース分解物の製造方法において、前記その他のセルラーゼは、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上であることが好ましい。
［１５］　本発明の第八の態様は、生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法である。
［１６］　本発明の第九の態様は、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマーである。
［１７］　本発明の第十の態様は、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマーである。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５においてセロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
　また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造に好適に用いられる。
実施例１において、メタゲノム解析により得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２（及びＯＪ１－２）、ＯＪ１－１）から推定されるアミノ酸配列の有根分子系統樹である。ＯＪ１－２は、アミノ酸配列がＡＲ１９Ｇ－１２と１００％相同（同一）であることから、ＡＲ１９Ｇ－１２と同一遺伝子であり、ＡＲ１９Ｇ－１２の部分配列である、と推察される。 オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２、ＯＪ１－１）から推定されるアミノ酸配列、及びこれらアミノ酸配列と最も配列同一性の高いクロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼの触媒領域のアミノ酸配列アライメント図である。 オープンリーディングフレームＯＪ１－１から推定されるアミノ酸配列及び好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合モジュールＣＢＭ３のアミノ酸配列アライメント図である。 オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２、ＯＪ１－１）から推定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びこれらアミノ酸配列と最も配列同一性の高いクロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼの塩基配列から推定されるポリペプチドのアミノ酸模式図である。 オープンリーディングフレームＯＪ１－１から推定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合モジュールＣＢＭ３のアミノ酸模式図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡタンパク質及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析結果（Ａ）とウェスタンブロット解析結果（Ｂ）を示した図である。 実施例１において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡタンパク質のＰＳＡ加水分解反応産物の分析結果を示した図である。 実施例１において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉのファミリー６セロビオハイドロラーゼＴｒＣＢＨIIのＰＳＡ加水分解反応産物の分析結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡタンパク質の各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶタンパク質の各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡタンパク質の各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶタンパク質の各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡタンパク質のプリインキュベーション時間の影響を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶタンパク質のプリインキュベーション時間の影響を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡタンパク質のプリインキュベーション温度の影響を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶタンパク質のプリインキュベーション温度の影響を計測した結果を示した図である。 実施例２において、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ遺伝子を導入したコウジカビ形質転換体及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷ遺伝子を導入したコウジカビ形質転換体の培地上清と、実施例１で調製したＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの遺伝子組換え大腸菌破砕上清のウェスタンブロット解析結果を示した図である。 各温度における、実施例１において大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷタンパク質及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）と、実施例２においてコウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷタンパク質及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（相対値（％））を求めた結果を示した図である。 各ｐＨにおける、実施例１において大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷタンパク質及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）と、実施例２においてコウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷタンパク質及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷタンパク質のＰＳＡ加水分解活性（相対値（％））を求めた結果を示した図である。 実施例３において、タバコ葉緑体形質転換体作製に用いた、タバコ葉緑体形質転換用カセットベクターｐＮｔａＧＬ及びｐＮｔａＧＬＰＬ、発現カセットｐＰＸＴ及びｐＰＸＴＰＬ、並びに発現カセットを組込んだ発現ベクターｐＮｔａＧＬ－ＱＶとｐＮｔａＧＬＰＬ－ＲＡの模式図を示す。 実施例３において、ｐＮＴａＧＬ－ＱＶの導入により得られた２系統の葉緑体形質転換タバコ（ＱＶ－２、ＱＶ－１７）と野生型タバコ（ＷＴ（ＳＲ－１））のサザンハイブリダイゼーションの結果を示した図である。 実施例３において、ｐＮｔａＧＬＰＬ－ＲＡの導入により得られた３系統の葉緑体形質転換タバコ（ＲＡ－６－２－１、ＲＡ－６－２－２、ＲＡ－６－２－３）と野生型タバコ（ＷＴ（ＳＲ－１））のサザンハイブリダイゼーションの結果を示した図である。 実施例３において、組換え体温室移植後７７日目のＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ導入葉緑体形質転換タバコ植物体 (Ｔ１世代)と野生型タバコ（ＳＲ－１）の写真（Ａ）と、開花期のＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ導入葉緑体形質転換タバコ植物体（Ｔ１世代)の写真（Ｂ）である。
［耐熱性セロビオハイドロラーゼ］
　糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性セロビオハイドロラーゼの開発が進まない一因である。
　近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。
　本発明者らは、後記実施例１に示すように、日本国内５ヶ所から採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知セロビオハイドロラーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）４４個を得た。これらのＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）分解活性及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、１個のＯＲＦからＰＳＡ分解活性を持つ耐熱性セロビオハイドロラーゼを得た。
　当該ＯＲＦからは、ＰＣＲクローニングにより、２アミノ酸が置換されている２種類の耐熱性セロビオハイドロラーゼが得られた。この２種類の遺伝子型のうち、２９９位のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）であり、３５１位のアミノ酸がアラニン（Ａ）であるものをＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡとし、２９９位のアミノ酸がグルタミン（Ｑ）であり、３５１位のアミノ酸がバリン（Ｖ）であるものをＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶとした。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡの塩基配列を配列番号２に、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡのアミノ酸配列を配列番号１にそれぞれ示す。また、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの塩基配列を配列番号４に、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶのアミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。ＰＣＲクローニングにより得られたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡとＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、開始メチオニンがなかったため、これらは、前記高温温泉土壌に含まれていた微生物が有していたセロビオハイドロラーゼ遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域のみの部分遺伝子であると推察された。
　後記実施例１等に示すように、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示し、β－１，３結合とβ－１，４結合グルカンからなるＬｉｃｈｉｎａｎや結晶性セルロースのアビセルに対し、弱いながらも分解活性を示した。一方、ＣＭＣやβ－１，３結合とβ－１，６結合グルカンからなるＬａｍｉｎａｒｉｎに対し、ほとんど分解活性は示さなかった。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行ったところ、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡはＰＳＡを加水分解し、セロビオースと少量のセロトリオースを生成した。また、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶのアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、既知のクロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のＧＨ６ファミリーに属するグルコシドハイドロラーゼ（配列番号１５）であり、その配列同一性はわずか６６％しかなかった。基質特異性、ＰＳＡ加水分解反応産物のＨＰＬＣ分析、及び既知のセロビオハイドロラーゼとのアミノ酸配列の配列同一性（相同性）から、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、ＧＨ６ファミリーに属する新規なセロビオハイドロラーゼであることが明らかとなった。
　ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶはいずれも、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。実際に、後記実施例１＜１３＞に示すように、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、いずれも３０～１００℃の広い温度範囲内でセロビオハイドロラーゼ活性を示す。但し、両者のセロビオハイドロラーゼ活性の至適温度範囲は異なっていた。大腸菌を宿主として発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡのセロビオハイドロラーゼ活性は、３０～８０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、８０～１００℃の範囲内では、温度が高くなるにつれてセロビオハイドロラーゼ活性は低下する傾向にあった。これに対し、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶのセロビオハイドロラーゼ活性は、３０～７０℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、７０℃付近でピークとなり、７０～１００℃の範囲内では温度が高くなるにつれて低下する傾向を示した。
　ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡの３５１位のアミノ酸残基をトリプトファン（Ｗ）に置換したＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷと、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの３５１位のアミノ酸残基をトリプトファン（Ｗ）に置換したＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷも、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶと同様に、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷのアミノ酸配列を配列番号５に、それをコードする塩基配列を配列番号６にそれぞれ示し、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷのアミノ酸配列を配列番号７に、それをコードする塩基配列を配列番号８にそれぞれ示す。コウジカビを宿主として発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷのセロビオハイドロラーゼ活性は、３０～１００℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、１００℃で、最も高いセロビオハイドロラーゼ活性を示した。
　一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ、又はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷに対しても、セロビオハイドロラーゼ活性を失わせることなく、１個又は複数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。
　すなわち、本発明の第一の態様である耐熱性セロビオハイドロラーゼは、下記（Ａ）～（Ｌ）のいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼである。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
（Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
　前記（Ｂ）、（Ｅ）、（Ｈ）、及び（Ｋ）のポリペプチドにおいて、配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１～２０個が好ましく、１～１０個がより好ましく、１～５個がさらに好ましい。各アミノ酸配列において、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の位置は特に限定されるものではないが、２９９位のアミノ酸はアルギニンであることが好ましい。
　前記（Ｃ）、（Ｆ）、（Ｉ）、及び（Ｌ）のポリペプチドにおいて、配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上であれば特に限定されないが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
　なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
　前記（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｋ）、及び（Ｌ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。
　前記（Ａ）～（Ｌ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明の第二の態様に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｈ）、（Ｉ）、（Ｋ）、及び（Ｌ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。
　前記（Ａ）～（Ｌ）のポリペプチドは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有する。このため、前記（Ａ）～（Ｌ）のいずれかのポリペプチドをセロビオハイドロラーゼ触媒領域として有することにより、耐熱性セロビオハイドロラーゼが得られる。中でも、７０～１００℃においても高いセロビオハイドロラーゼ活性を示すことから、前記（Ｄ）～（Ｌ）のいずれかのポリペプチドをセロビオハイドロラーゼ触媒領域とすることが好ましい。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、リン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｗｏｌｌｅｎ　Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）を基質とする。当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、ＰＳＡ以外のその他のβグルカンを基質としてもよい。当該その他のβグルカンとしては、例えば、β－１，３結合とβ－１，４結合からなるＬｉｃｈｅｎａｎ、Ａｖｉｃｅｌ、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＣＭＣ）、β－１，３結合とβ－１，６結合からなるグルカン、β－１，３結合からなるグルカン、β－１，６結合からなるグルカン、及びキシラン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、ＰＳＡに加えて、β－１，３結合とβ－１，４結合からなるグルカンと結晶性セルロースの少なくとも一方を基質とするものが好ましく、ＰＳＡ、β－１，３結合とβ－１，４結合からなるグルカン、及び結晶性セルロースを基質とするものがより好ましい。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの至適ｐＨは、反応温度に依存して変化するものの、ｐＨ４．５～６．０の範囲内にある。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、少なくともｐＨ４．５～６．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ４．０～６．５の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものがより好ましく、ｐＨ３．５～７．０の範囲内においてセロビオハイドロラーゼ活性を示すものがさらに好ましい。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、セロビオハイドロラーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、エンドグルカナーゼ活性、キシラナーゼ活性、又はβ－グルコシダーゼ活性等が挙げられる。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、前記（Ａ）～（Ｌ）のポリペプチドのいずれかからなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のセロビオハイドロラーゼが有する、セロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼには、公知のセロビオハイドロラーゼに対し、セロビオハイドロラーゼ触媒領域を前記（Ａ）～（Ｌ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことが好ましい。セルロース結合モジュールは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼとしては、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。本発明においては、当該セルロース結合モジュールとしては、配列番号１１で表されるアミノ酸配列の３５位のトレオニン（Ｔ）から１８２位のプロリン（Ｐ）までの１４８アミノ酸（Ｔ３５－Ｐ１８２）からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチド中の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルロース結合能を有するポリペプチドであることが好ましい。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。このようなリンカー配列としては、具体的には、例えば、配列番号１１で表されるアミノ酸配列の１８３位のセリン（Ｓ）から２９４位のトレオニン（Ｔ）までの１１２アミノ酸（Ｓ１８３－Ｔ２９４）からなるポリペプチド、又は当該ポリペプチド中の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。
　なお、配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、後記実施例１において、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから取得されたオープンリーディングフレームＯＪ１－１、及びそれからＰＣＲクローニングによって得られた新規な遺伝子ＯＪ１－１－１１がコードするポリペプチドのアミノ酸配列である。ＯＪ１－１－１１の３５位のトレオニンから１８２位のプロリンまでの１４８アミノ酸（Ｔ３５－Ｐ１８２）がセルロース結合モジュールＣＢＭ３であり、１８３位のセリン（Ｓ）から２９４位のトレオニンまでの１１２アミノ酸（Ｓ１８３－Ｔ２９４）がリンカー配列であると考えられる。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、Ｎ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、分泌型シグナルペプチド等がある。Ｎ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを付加することにより、形質転換植物中で発現させた耐熱性セロビオハイドロラーゼを、アポプラストや細胞中の小胞体等に局在させることができる。
　アポプラスト移行シグナルペプチドは、ポリペプチドをアポプラストに移行させ得るペプチドであれば、特に限定されるものではなく、公知のアポプラスト移行シグナルペプチドを適宜用いることができる。アポプラスト移行シグナルペプチドとして、例えば、ジャガイモのプロテアーゼインヒビターIIのシグナルペプチド（例えば、Wang et al. ２００５年、Transgenic Research、第１４巻、１６７～１７８ページ参照。）等がある。また、小胞体保留シグナルペプチドは、ポリペプチドを小胞体に保留させ得るペプチドであれば、特に限定されるものではなく、公知の小胞体保留シグナルペプチドを適宜用いることができる。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。
　また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えばＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。
［耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチド］
　本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、本発明の第一の態様である耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする。当該耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。
　具体的には、本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、下記（ａ）～（ｎ)のいずれかの塩基配列からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｍ) 配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
（ｎ) 配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。
　なお、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２～７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
　前記（ａ）～（ｌ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号２で表される塩基配列であってもよく、配列番号２で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。同様に、前記（ｄ）、（ｇ）、及び（ｊ）の塩基配列としては、それぞれ配列番号４、６、及び８で表される塩基配列であってもよく、これらの塩基配列中の縮重コドンを、宿主においてより使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。なお、コドンの改変は、公知の遺伝子組換え技術によって行うことができる。
　配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ等をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子」ということがある。）の全長若しくはセロビオハイドロラーゼ触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
　前記（ｍ）の塩基配列において、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上であれば特に限定されないが、８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
　なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。
　例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｋ）、（ｌ）、又は（ｍ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は複数個の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｋ）、又は（ｌ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。
　本発明の第二の態様であるポリヌクレオチドは、セロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。
［発現ベクター］
　本発明の第三の態様である発現ベクターは、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る。すなわち、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチド、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットとして発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができ、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
　当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。
　植物細胞へ導入される発現ベクターとしては、例えば、ｐＩＧ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等のバイナリーベクター等がある。使用可能なプロモーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター等がある。また、使用可能なターミネーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター等がある。その他、組織や器官に特異的なプロモーターを用いてもよい。このような組織又は器官特異的プロモーターを用いることにより、植物全体ではなく、特定の組織や器官にのみ、耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させることができるため、例えば、食用植物の非食用部分にのみ耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得ることが期待できる。
　本発明に係る発現ベクターは、前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
［形質転換体］
　本発明の第四の態様である形質転換体は、前記本発明の第三の態様の発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させ得る。従来公知のセロビオハイドロラーゼは、現宿主のレンジが狭い、つまり、異種発現が難しいものが多い。これに対して、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、大腸菌、酵母、糸状菌、高等植物葉緑体等、広範な発現宿主に発現させることができる。
　発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。
　発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産できる。特に、当該形質転換体がコウジカビ等の糸状菌や酵母等の真核微生物である場合には、より耐熱性に優れた耐熱性セロビオハイドロラーゼを比較的簡便に大量生産することができる。また、前記本発明の第三の態様の発現ベクターが導入された形質転換植物は、一個体当たりに生産される本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼの量が比較的多いことに加えて、野外栽培等で大量栽培することも可能である。さらに、当該形質転換植物は、元々植物体内に耐熱性セロビオハイドロラーゼを含むため、バイオマス資源として好適である。
　宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。
　本発明に係る形質転換体が植物である場合、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。周知の植物組織培養法等を用いることにより、形質転換された植物細胞やカルス等から形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
　本発明に係る形質転換体が植物である場合、前記本発明の第三の態様の発現ベクターに由来する本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現するための発現カセットは、植物の核ゲノムに組込ませてもよいが、葉緑体ゲノムに組込ませることが好ましい。葉緑体形質転換体では、挿入された外来遺伝子が細胞質遺伝するため、花粉を通した組換え遺伝子の環境漏洩を防ぐことができる。形質転換植物の野外栽培による大規模生産においては、組換え遺伝子の環境漏えいが懸念されるが、葉緑体形質転換体は、核ゲノム形質転換体よりも、組換え遺伝子の環境漏えいが抑えられるという点で優位性がある。
　また、本発明に係る形質転換体が植物である場合、当該形質転換体には、形質転換により直接得られた植物に加えて、当該植物と同様に本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現している当該植物の子孫である植物も含まれる。ここで、植物の子孫とは、植物から得られた種子を発芽して得られる植物や、挿し木により得られた植物等を意味する。
　宿主とされる植物の種類は、特に限定されるものではなく、双子葉植物であってもよく、単子葉植物であってもよく、シダ類やコケ類であってもよく、藻類や微小藻類であってもよい。例えば、アブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、キク科、ヒルガオ科、トウダイグサ科等に属する植物が挙げられる。アグロバクテリウムを介した形質転換に好適な植物であるため、ナス科、アブラナ科、又はイネ科の植物が好ましい。ナス科の植物として、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、ピーマン等がある。アブラナ科の植物として、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ、ナズナ、ダイコン、キャベツ、ワサビ等がある。また、イネ科の植物として、例えば、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ等がある。その他、マメ科の植物として、例えば、ラッカセイ、ヒヨコマメ、ダイズ、インゲンマメ等がある。キク科の植物として、例えば、ゴボウ、ヨモギ、キンセンカ、ヤグルマギク、ヒマワリ等がある。ヒルガオ科の植物として、例えば、ヒルガオ、ハマヒルガオ、ネナシカズラ、セイヨウヒルガオ等がある。トウダイグサ科の植物として、例えば、トウダイグサ、ナツトウダイ、タカトウダイ等がある。
［耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法］
　本発明の第五の態様である耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法は、前記本発明の第四の態様の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する方法である。前記本発明の第二の態様のポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性セロビオハイドロラーゼを発現させる。
　形質転換体によって生産された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。
　形質転換体から耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出・精製する方法は、耐熱性セロビオハイドロラーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性セロビオハイドロラーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性セロビオハイドロラーゼは、塩析法、限外濾過法、クロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性セロビオハイドロラーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性セロビオハイドロラーゼを簡便に精製することができる。
［セルラーゼ混合物］
　本発明の第六の態様であるセルラーゼ混合物は、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は前記第五の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含む。前記第五の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出・精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他のセルラーゼとの混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。
　当該セルラーゼ混合物に含まれる前記耐熱性セロビオハイドロラーゼ以外のその他のセルラーゼとしては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。例えば、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、β－グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るセルラーゼ混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、β－グルコシダーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、β－グルコシダーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。
　当該セルラーゼ混合物に含まれるその他のセルラーゼは、少なくとも７０℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましく、７０～９０℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることがより好ましい。当該セルラーゼ混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該セルラーゼ混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該セルラーゼ混合物が耐熱性セルラーセのみを含む場合、当該セルラーゼ混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０～９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。
［セルロース分解物の製造方法］
　本発明の第七の態様であるセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記本発明の第四の態様の形質転換体、又は前記第五の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。
　セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼと接触させる前に、破砕・細断等の物理的処理、酸・アルカリ等の化学処理、適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼがセロビオハイドロラーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、５５～８０℃、ｐＨ３．５～７．０で反応を行うことが好ましく、７０～１００℃、ｐＨ４．０～６．０で反応を行うことがより好ましい。反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間～１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１～１００時間の反応時間で行うことができる。
　セルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼに加えて、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを用いることも好ましい。当該その他のセルラーゼとしては、前記セルラーゼ混合物に含められるセルラーゼと同様のものを用いることができ、少なくとも７０℃で、好ましくは少なくとも７０～１００℃でセルラーゼ活性を有する耐熱性セルラーゼであることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、前記本発明の第一の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、前記本発明の第四の態様の形質転換体、又は前記第五の態様の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに代えて、前記本発明の第六の態様のセルラーゼ混合物を用いてもよい。
［ポリヌクレオチドの製造方法及びそれに用いるプライマー］
　本発明の第八の態様である耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法は、生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマー（本発明の第九の態様であるプライマー）と、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマー（本発明の第十の態様であるプライマー）とを用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る方法である。
　配列番号１２で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１～２２位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号１３で表される塩基配列は、配列番号２で表される塩基配列の１２６３～１２８４位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。このため、配列番号１２で表される塩基配列からなるプライマーをフォワードプライマーとし、配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーをリバースプライマーとして用い、配列番号２で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）を増幅産物として得ることができる。
　ＰＣＲにおいては、プライマーの５’末端側には、鋳型とのハイブリダイズには供しない付加的な塩基配列を有していてもよい。例えば、配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを用いることにより、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域の５’末端に当該フォワードプライマー由来の１若しくは数個の塩基が付加されており、３’末端に当該リバースプライマー由来の１若しくは数個の塩基が付加されているポリヌクレオチドを得ることができる。各プライマーの５’末端に付加される塩基配列としては、例えば、増幅産物を発現ベクターへ組込む際に必要とされる配列や、制限酵素部位、タグをコードする塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列等が挙げられる。また、配列番号１２で表される塩基配列の５’末端には、開始メチオニン（ＡＴＧ）を付加することも好ましい。
　ＰＣＲの鋳型とするＤＮＡは、生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物（ｃＤＮＡ）である。当該生物は、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードするポリヌクレオチドが組込まれたプラスミドを人工的に導入した微生物や、前記形質転換体であってもよく、自然界から採取されたサンプル中に含まれている生物であってもよい。自然界から採取されたサンプルから鋳型となるＤＮＡを調製する場合には、当該サンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。
　本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法において、ＰＣＲの条件等は、当業者であれば、使用するポリメラーゼの種類等を考慮して、適宜決定することができる。鋳型とした核酸中に、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のゲノムＤＮＡ又は当該遺伝子のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが含まれていた場合には、当該ＰＣＲにより、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードするポリヌクレオチドを増幅産物として得ることができる。
　セロビオハイドロラーゼ触媒領域のアミノ酸配列は、ホモログ遺伝子間での保存性が高い。このため、前記フォワードプライマーと前記リバースプライマーを用いることにより、鋳型とした核酸中に、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のホモログ遺伝子のゲノムＤＮＡ又は当該ホモログ遺伝子のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが含まれていた場合には、本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法により、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のホモログ遺伝子のセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードするポリヌクレオチドを増幅産物として得ることができる。
　また、鋳型とした核酸中に、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のホモログ遺伝子以外の遺伝子であって、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子と類似した塩基配列を有する遺伝子のゲノムＤＮＡ又は当該ホモログ遺伝子のｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡが含まれていた場合には、本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法により、当該遺伝子の全領域又は部分領域をコードするポリヌクレオチドを増幅産物として得ることができる。このため、本発明に係るポリヌクレオチドの製造方法は、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子と類似したアミノ酸配列からなる新規セロビオハイドロラーゼのクローニングにも有用である。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性セロビオハイドロラーゼのクローニング
＜１＞　温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
　耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：５５℃以上）、超耐熱性セロビオハイドロラーゼ（至適温度：８０℃以上）の遺伝子探索を目的として、中性～弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
　中性～弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８～７８℃、ｐＨ７．２～８のレンジにあった。
　採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ　Ｌａｒｇｅ　ｆｏｒ　Ｂｅａｄｓ　ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ　ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ量が１０μｇ以上得られたゲノム試料では、このうち５μｇを使用し、メタゲノムシーケンスを行った。すなわち、抽出されたＤＮＡに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のＧＳ　ＦＬＸ　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　４５４を用いて、メタゲノムＤＮＡ及び１６ｓｒＤＮＡアンプリコンのショットガンシーケンスを行った。残りのＤＮＡは、セルラーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングに用いた。一方、ＤＮＡ量が少なかった試料（１０μｇ以下）では、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ　Ｖ２　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてゲノム増幅を行い、得られた増幅産物に対して、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行った。
　各温泉土壌サンプル当たり３～４回、計１９回、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３９４ｂｐ、総リード数２６，２９５，４６３、総ゲノム解読量１０．３Ｇｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。
＜２＞　温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
　温泉メタゲノムから抽出したゲノムＤＮＡを使い、Ｒｏｃｈｅ社製　４５４　ＧＳ　ＦＬＸ　Ｔｉｔａｎｉｕｍ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙショットガンシーケンス用の標準プロトコールに従って、シーケンスライブラリーを構築した。Ｒｏｃｈｅ　４５４の出力（ｓｆｆファイル）をＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４　Ｌｉｆｅ　ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２．３又は２．５．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ　ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｍａｔｃｈ　（ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：－ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ　ｌａｒｇｅ　ｏｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ　ｕｐ　ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ　ｒｅｄｕｃｅｓ　ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
　Ｑｕａｌｉｔｙフィルター処理したリードと１００ｂｐ以上のアセンブルコンティグは、合計２．５Ｇｂｐあり、このデータセットをセルラーゼ酵素遺伝子解析に用いた。リード総数２６，２９４，１９３リードのうち１７，９９１，５６７リードが、平均で１ｋｂ以上のコンティグにアセンブルされ（計２７８，１８５コンティグ）、このうち最大コンティグ長は２７８，１８５ｂｐであった。
　アセンブル後の配列は、ＫＥＧＧデータベース（Kanehisa, M. Science & Technology Japan，1996，No.59，p.34-38、http://www.genome.jp/kegg/、2011/5/11（検索））に参照し、全てのコンティグ及びシングルトンを、バクテリア、アーキア（古細菌）、真核生物、ウィルス、いずれにも属さないものの５カテゴリーに系統分類した。アセンブル後の配列長（＝総コンティグ長＋総シングルトン長）２．５Ｇｂｐのうち、バクテリアにヒットした配列長２５８Ｍｂｐ、アーキアにヒットした配列長２７Ｍｂｐ、真核生物にヒットした配列長１９３，５６１ｂｐ（アセンブル後の全配列長の０．００８％）、ウィルスにヒットした配列長６８５，６４０ｂｐ（アセンブル後の全配列長の０．０２７％）であった。真核生物に属する配列が少なかった理由は、温泉土壌メタゲノムの温度が５８～７０℃の範囲にあり、糸状菌等の真核生物の生存限界温度を超えていることを反映しているため、と考えられた。これらの結果から、このメタゲノムデータベースは、わずか１１．３％の既知ＤＮＡ配列を含んでいるにすぎないことがわかった。いずれにも属さない配列長は２．２Ｇｂｐあり、アセンブル後の配列全体の８８．７％を占めた。これらは、バクテリア、アーキア、又は真核生物のいずれかに由来する、新規な配列である。従来の微生物ゲノム研究アプローチ、すなわち、微生物を培養、単離し、その後、全ゲノムＤＮＡのサンガーシーケンスを行い、ゲノムを記述する方法では、ある特定環境の微生物コミュニティーを構成するゲノムＤＮＡの大半が捉えられていない、というHandelsman らの指摘（Handelsman et al.，Chem Biol.，1998，vol.5，p.R245-R249)を追認する結果となった。
＜３＞　セロビオハイドロラーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
　ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルロース）、３．２．１．３７（β－キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース　１，４－β－セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４－β－キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２００９／４／１３）、これらグルコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。メタゲノムＡＲ１５及びＡＲ１９ではアノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ（Hoff et al.，Nucleic Acids Research，2009，37(Web Server issue：W101-W105)を使用し、メタゲノムＨ１、Ｎ２、ＯＪ１ではＭｅｔａｇｅｎｅ（Noguchi et al., DNA Research，2008,15(6)）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した（Ｏｒｐｈｅｌｉａ　ｏｐｔｉｏｎ：ｄｅｆａｕｌｔ（ｍｏｄｅｌ＝Ｎｅｔ７００，ｍａｘｏｖｅｒｌａｐ＝６０）、Ｍｅｔａｇｅｎｅ　ｏｐｔｉｏｎ：－ｍ）。推定されたＯＲＦからグルコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ　ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ　ｑｕｅｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ　ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ－２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ａ　ｇａｐ＝－１、Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｇａｐ＝－１、Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｆｏｒ　ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ　ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ　ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、ヒットした配列をグルコシド加水分解酵素遺伝子として収集した。
　アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ及びＭｅｔａｇｅｎｅは、読み取りエラー等によって生じるフレームシフトに対応していないため、以下に述べる方法でフレームシフト補正を行った。まず、コンティグを１ｋｂｐずらしながら２ｋｂｐの長さに切断した。このため、切断された配列は前後の配列と１ｋｂｐ配列が重なっていた。切断した各コンティグ配列を、前述したグルコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースに参照し（Ｅ＜１ｅ－２０）、Ｂｌａｓｔｘによりスクリーングした。ヒットしたコンティグ配列に対してＧｅｎｅｗｉｓｅ（Ｗｉｓｅ２　ｐａｃｋａｇｅ：http://www.ebi.ac.uk/Tools/Wise2/）を使い、グルコシド加水分解酵素のコーディング領域を取得した。このとき、１００ｂｐ以下のコーディング領域を持つ配列は除去した。Ｇｅｎｅｗｉｓｅソフトウェアでは、ターゲットコンティグについて、ローカルデータベース上のヒットした酵素配列と参照し、アライメントスコアーが最大になるように空白（ｇａｐ）を挿入又は削除することによって、配列のフレームシフトが補正される。
　こうして得られたセルラーゼ、エンドヘミセルラーゼ、脱分岐酵素等のグルコシド加水分解酵素について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ　ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ　２３．０　ａｎｄ　ＨＭＭＥＲ　ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、隠れマルコフモデルを応用した配列相同性検索アルゴリズムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ－ｖａｌｕｅ　ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ－５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ　ｔｈａｔ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｆｉｎｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｉｎ　ａ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグルコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。ＢＬＡＳＴＰによるスクリーニングを行い、ＣＢＨ（セロビオハイドロラーゼ）配列としてヒットした４４個のＯＲＦをＧＨファミリーに分類した。
＜４＞　Ｏｌｐｈｅｒｉａ出力に見られるレア開始コドンの補正
　アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａは、ＡＴＧ（メチオニン）の他、レアコドンのＧＴＧ（バリン)、ＴＴＧ（ロイシン）、及びＡＴＡ（イソロイシン)を開始コドンとしてＯＲＦ検出する。このため、アセンブルされたコンティグにＡＴＧを開始コドンとする完全長ＯＲＦが含まれない場合、Ｏｒｐｈｅｌｉａはレアコドンを開始コドンとして認識するエラーが発生する。前記＜３＞においてＯｒｐｈｅｌｉａにより完全長と出力されたＯＲＦのうち、レアコドンＧＴＧ、ＴＴＧ、ＡＴＡを開始コドンとするＯＲＦは８個あった。ｇｅｎｅｗｉｓｅによるＯＲＦ出力とＯＲＦが含まれるコンティグのアミノ酸配列を参照し、これらのＯＲＦがレアコドンを開始コドンとする完全長配列か、あるいは、出力エラーであるか、確認を行った。その結果、Ｏｒｐｈｅｌｉａが出力したレアコドンを開始コドンとする８個のＯＲＦは、全て出力エラーであること、すなわち不完全長配列であることが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
セロビオハイドロラーゼ遺伝子と推定されたＯＲＦ４４個のＧＨファミリー分類結果を表１に示す。表１中、括弧内はメチオニンを開始コドンとする完全長ＯＲＦ数を表している。表１に示すように、ＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼＯＲＦがメタゲノムＡＲ１９から２個（ＡＲ１９Ｇ－１６６とＡＲ１９Ｇ－１２）、メタゲノムＯＪ１から２個（ＯＪ１－１とＯＪ１－２）、合計４個得られた。一方、ＧＨ７ファミリーに属するＯＲＦ配列は得られなかった。ＧＨ９、ＧＨ４８ファミリーに属するＯＲＦはそれぞれ、１５個と１２個得られた。その他のＧＨファミリー（ＧＨ１０、ＧＨ１２、ＧＨ２６）に属するセロビオハイドロラーゼ遺伝子ＯＲＦは合計１３個得られた。これら、セロビオハイドロラーゼ遺伝子と推定された、不完全長配列を含むすべてのＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。
　なお、現在、実用化されているバイオ燃料用のセルラーゼ酵素液は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ　ＣＥＬＬＩＣ（登録商標）ＣＴｅｃ２(http://www.bioenergy.novozymes.com/cellulosic-ethanol/)、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ　Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（登録商標）ＴＲＩＯ（http://www.genencor.com/industries/biofuels/fuel_ethanol_from_biomass_cellulosic_biofuels/）であり、いずれも木材腐朽菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉが分泌する酵素をベースにしている。この糸状菌が分泌するグルコシド加水分解酵素（ＧＨ）の主要な構成酵素は、セロビオハイドロラーゼＣＢＨI、ＣＢＨIIであり、それぞれ、ＧＨ７ファミリーとＧＨ６ファミリーに属している。
＜５＞　オープンリーディングフレームＯＪ１－１及びＯＪ１－２
　オープンリーディングフレームＯＪ１－１は、５４８アミノ酸からなり、セルロース結合モジュールＣＢＭ３（１４９ｂｐ）－リンカー（１１１ｂｐ）－ＧＨ６触媒領域を持つマルチドメイン酵素をコードしていた。但し、触媒領域の後半部は終止コドンが欠落し、不完全長であった。また、このセルロース結合モジュール配列は、好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセロビオハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＦ２２２７３．１）が有するセルロース結合モジュールＣＢＭ３（配列番号１６）とアミノ酸配列で６３％の配列同一性を示す新規なＣＢＭ３配列である。ＯＪ１－１のセロビオハイドロラーゼ触媒領域は、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ　Ｕ３２のセルロース１，４－β－セロビオシダーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＪ４６９５４．１）とアミノ酸配列で５８％の配列同一性を示し、強力なセルラーゼ酵素を有している好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸのβ－１，４－セロビオハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６２２１１．１)とアミノ酸配列で４８％の配列同一性を示した。
　ＰＣＲクローニングにより、ＯＪ１－１から１個の遺伝子クローン（ＯＪ１－１－１１）が得られた。ＯＪ１－１－１１は、５４８アミノ酸からなり、開始コドンのメチオニン（Ｍ）（１位）から３２位のアラニンまでの３２アミノ酸（Ｍ１－Ａ３２）が分泌シグナル（ｓｉｇｎａｌＰ　４．０）であり、３５位のトレオニンから１８２位のプロリンまでの１４８アミノ酸（Ｔ３５－Ｐ１８３）がセルロース結合モジュールＣＢＭ３であり、１８３位のセリン（Ｓ）から２９４位のトレオニンまでの１１２アミノ酸（Ｓ１８３－Ｔ２９４）がリンカー配列であり、２９５位のヒスチジン（Ｈ）から最後までの２５４アミノ酸がＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼ触媒領域の部分的なアミノ酸配列を示すポリペプチドをコードしている。但し、後記実施例１＜１０＞において、当該遺伝子クローンの全長を大腸菌発現させ、ＰＳＡ、ＣＭＣ分解活性をアッセイしたところ、いずれの基質に対する加水分解活性も確認されなかった。
　オープンリーディングフレームＯＪ１－２は、２４７アミノ酸からなり、ＧＨ６触媒領域だけからなるポリペプチドをコードする塩基配列であった。ＯＪ１－２は開始コドン、終止コドンいずれも欠いていること、ＧＨ６ファミリーのセロビオハイドロラーゼは、通常、４００以上のアミノ酸から構成されていることから、ＯＪ１－２は不完全配列である。ＯＪ１－２から推定されるアミノ酸配列はＡＲ１９Ｇ－１２のアミノ酸配列と１００％同一の配列であり、このことから、ＯＪ１－２はＡＲ１９Ｇ－１２と同一遺伝子であり、ＡＲ１９Ｇ－１２の部分配列であると考えられる。ＯＪ１－２からＰＣＲクローニングにより得た遺伝子クローンは、その触媒領域を形質転換ベクターに組込み、大腸菌発現させたところ、ＰＳＡ、ＣＭＣいずれの基質に対しても酵素活性は得られなかった。
＜６＞　オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ－１６６とＡＲ１９Ｇ－１２
　オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ－１６６は、４７４アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号９）をコードしていたが、開始コドンが失われている不完全長配列であって、リンカーの部分配列とＧＨ６触媒領域だけから構成されていた。ＡＲ１９Ｇ－１６６のＧＨ６触媒領域は、クロロフレクサス門中温性好気性細菌Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のグルコシドハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）と６６％のアミノ酸配列同一性を示した。配列番号１４で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’－ＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＡＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＣＧＧＡＧ－３’：配列番号１２で表される塩基配列の５’末端側に７塩基（ＣＡＣＣＡＴＧ）付加したもの。当該付加配列中、３’側のＡＴＧは開始コドンであり、５’側のＣＡＣＣはベクターに挿入するための配列である。）と配列番号１３で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’－ＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＡＴＡＧ－３’）を用いたＰＣＲクローニングにより、ＡＲ１９Ｇ－１６６から２個の遺伝子クローン（ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡとＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ）が得られた。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡとＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、２９９位と３５１位の２アミノ酸のみが相違していた。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡは、２９９位のアミノ酸がアルギニンであり、３５１位のアミノ酸がアラニンであった（配列番号１）。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、２９９位のアミノ酸がグルタミンであり、３５１位のアミノ酸がバリンであった（配列番号３）。
　オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ－１２は、４５９アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号１０）をコードしていたが、ＡＲ１９Ｇ－１６６と同様、開始コドンが失われている不完全長配列であり、リンカーの部分配列とＧＨ６触媒領域から構成されていた。ＡＲ１９Ｇ－１２のＧＨ６触媒領域はＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）と６４％のアミノ酸配列同一性を示した。但し、ＡＲ１９Ｇ－１２からＰＣＲにより得た遺伝子クローンは、その触媒領域を形質転換ベクターに組込み、大腸菌発現させたところ、ＰＳＡ、ＣＭＣいずれの基質に対しても、酵素活性は得られなかった。
＜系統遺伝学解析＞
　培養分離された菌体からクローニングされた遺伝子とは違い、メタゲノム解析によりクローニングされた遺伝子の由来は不明である。高温土壌メタゲノムから得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２（ＯＪ１－２）、ＯＪ１－１）が、バクテリアやアーキア（古細菌）など原核生物に由来するのか、あるいは、糸状菌やキノコなど真核生物に由来するのか、わからない。そこで、触媒領域アミノ酸配列のマルチプルアライメントと分子系統樹による系統遺伝学解析を行い、これらオープンリーディングフレームの由来を推定した。
図１はＧＨ６ファミリーに属するエキソ型グルコシドハイドロラーゼ（セロビオハイドロラーゼ、グルコシドハイドロラーゼ、エキソグルカナーゼ、及びセロビオシダーゼ）の有根分子系統樹である。オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２（ＯＪ１－２）、ＯＪ１－１）から推定されるアミノ酸配列及びセルロース分解能を有する好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸ　Ｃｅｌ６Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６２２１１．１）の触媒領域アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰによりＧｅｎｂａｎｋに対しホモロジー検索を行い、ファミリー６エキソ型グルコシドハイドロラーゼ２１種の配列を得た。次に、好熱性糸状菌Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ　Ｃｅｌ６Ａ（ＰＤＢ：１ＶＢＷ）の触媒領域アミノ酸配列について、同様にホモロジー検索を行い、１９種の配列を得た。これらホモロジー検索によりヒットしたバクテリア２１配列と糸状菌１９配列、及びオープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２（ＯＪ１－２）、ＯＪ１－１）から推定されるアミノ酸配列について、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ　Ｐｒｏ　５．６．５を用いてマルチプルアライメント（Cost Matrix = Blosum80; Gap open penalty = 12; Gap extension penalty = 3; Alignment type = Global alignment with free end gaps）を行った後、近隣接続法により系統樹を作成した。ＧＨ６ファミリーに属するエンドグルカナーゼＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸ　Ｃｅｌ６Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＣ０６３８８．１）をアウトグループとした。ブートストラップ確率は１，０００レプリカにより算出し、系統樹の各分岐点にパーセントで示した。図１中、下部に示したスケールは遺伝距離（平均アミノ酸置換数／サイト）である。また、括弧内に示した酵素名の「ＣＢＨ」はセロビオハイドロラーゼ、「ＧＨ」はグルコシドハイドロラーゼの省略である。
　系統樹のレファレンスに用いたバクテリア及び糸状菌のファミリー６グルコシドハイドロラーゼは以下の通りである（カッコ内は、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｐｒｏｔａｉｎ　Ｄａｔａ　ｂａｎｋ（ＰＤＢ）又はＥＭＢＬ－Ｂａｎｋのアクセッション番号。）。
　糸状菌ファミリー６グルコシドハイドロラーゼ：Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ　Ｙ－９４　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＡ７４４５８．１）；　Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ５０６０８．１）；　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｋａｗａｃｈｉｉ　ＩＦＯ　４３０８　１，４－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃａｎ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＧＡＡ８９５７１．１）；　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＡＴＣＣ　１０１５　１，４－ｂｅｔａ－Ｄ－ｇｌｕｃａｎ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ｃ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＨＡ２５８２８．１）；　Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＷ６４９２７．１）；　Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｈｉｇｇｉｎｓｉａｎｕｍ　ｇｌｕｃｏｓｉｄ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＣＦ３３２５２．１）；　Ｆｏｍｉｔｉｐｏｒｉａ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ　ＭＦ３／２２　ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ＣＥＬ６Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＪＤ０２２０１．１）； Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ　Ｍ１．００１　ｇｌｕｃｏｓｙｌ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＦＱ２５８０７．１）；　Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ　Ｃｅｌ６Ａ　（ＰＤＢ：１ＢＶＷ）；　Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｍａｃｕｌａｎｓ　ＪＮ３　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＩＩ（ＥＭＢＬ－Ｂａｎｋ：ＣＢＸ９７０３９．１）；　Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｇｒｉｓｅａ　７０－１５　ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＨＡ５７７７３．１）；　Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ　ＡＴＣＣ　４２４６４　ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６　（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＯ５５７８７．１）；　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ　ＯＲ７４Ａ　ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　２（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＡＡ３１５３４．１）；　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＸ８６８９５．１）；　Ｐｕｎｃｔｕｌａｒｉａ　ｓｔｒｉｇｏｓｏｚｏｎａｔａ　ＨＨＢ－１１１７３　ＳＳ５　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＩＮ０７０９８．１）；　Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ　ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＬ３３６０４．４）；　Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ　ＮＲＲＬ　８１２６　ｇｌｕｃｏｓｉｄ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＯ６２２１０．１）；　Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ３４２１０．１）；　Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｄａｈｌｉａｅ　ＶｄＬｓ．１７　ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ－６Ａ　（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＧＹ１６０４６．１）。
　バクテリアファミリー６グルコシドハイドロラーゼ：Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ　１１Ｂ　ｇｌｕｃｏｓｉｄ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＫ５２３８８．１）；　Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ　Ｕ３２　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ　（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＪ４６９５４．１）；　Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　ｆｉｍｉ　ＡＴＣＣ　４８４　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＥ４６０５５．１）；　Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ　Ｕｅｄａ　１０７　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｃｅｌ６Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＥ８５９７８．１）；　Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５　ｇｌｕｃｏｓｉｄ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＸ０４７７６．１）；　Ｊｏｎｅｓｉａ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　ＤＳＭ　２０６０３　ｇｌｕｃｏｓｉｄ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＶ０８３９９．１）；　Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ ＤＳＭ　４４９６３　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＦＨ８５８６４．１）；　Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｌｕｐｉｎｉ　ｓｔｒ．　Ｌｕｐａｃ　０８　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＣＨ２０９６９．１）；　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｕｒｄｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｓ　ＹＫ９　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＦＭ０８８８０．１）；　Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ　Ｐｏ８２　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＧ７１０５０．１）；　Ｓａｌｉｎｉｓｐｏｒａ　ａｒｅｎｉｃｏｌａ　ＣＮＳ－２０５　ｇｌｕｃｏｓｉｄ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＢＶ９９７７３．１）；　Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ　ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ　ＤＳＭ　４４７２８　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＤＤ４２６２２．１）；　Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ　ＤＷ４／３－１　ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＡＵ６７０５０．１）；　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ　ＭＡ－４６８０　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＣ６９５６４．１）；　Ｔｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｔｕｒｎｅｒａｅ　Ｔ７９０１　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＲ１２７２３．１）；　Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ｃｅｌ６Ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＡ６２２１１．１）；　Ｖｅｒｒｕｃｏｓｉｓｐｏｒａ　ｍａｒｉｓ　ＡＢ－１８－０３２　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＢ４６９４４．１）；　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．　ｒａｐｈａｎｉ　７５６Ｃ　ｅｘｏｇｌｕｃａｎａｓｅ　Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＥＬ０８３５９．１）；　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｐｖ．　ｏｒｙｚａｅ　ＫＡＣＣ　１０３３１　１，４－ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄａｓｅ　（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＷ７７２８９．１）；　Ｘｙｌａｎｉｍｏｎａｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ　ＤＳＭ　１５８９４　ｇｌｕｃｏｓｉｄ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ　６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＣＺ３０１８１．１）；　Ｘｙｌｅｌｌａ　ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ　Ａｎｎ－１　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ　Ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＥＧＯ８１２０４．１）。
　ＧＨ６ファミリーに属するエキソ型グルコシドハイドロラーゼは、互いに遺伝距離が大きく離れた２つの分岐群、すなわち、バクテリアに由来する分岐群と糸状菌に由来する分岐群に分かれた。図１下部の分岐群はすべて糸状菌のファミリー６グルコシドハイドロラーゼであり、一方、上部の分岐群はすべてバクテリアのファミリー６グルコシドハイドロラーゼである。 オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２、及びＯＪ１－１は、いずれもバクテリア分岐群に位置し、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼ、グラム陰性木質分解バクテリアＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓのセロビオハイドロラーゼｃｅｌ６Ａ、海洋性γプロテオバクテリアＴｅｒｅｄｉｎｉｂａｃｔｅｒ　ｔｕｒｎｅｒａｅのセロビオハイドロラーゼと１つの分岐群を構成している。
　図１に示すように、メタゲノム解析により得られたＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２（ＯＪ１－２）、ＯＪ１－１）は、好熱性糸状菌Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓやＣｈａｅｔｏｍｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ、木材腐朽菌Ｈｙｐｏｃｅｒｅａ　ｊｅｃｏｒｉｎａ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオハイドロラーゼ遺伝子とは遺伝的距離が大きく離れ、バクテリアの好熱性放線菌Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸのセロビオハイドロラーゼやＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼと近縁であることがわかった。このことから、これらＧＨ６ファミリーに属する４個のオープンリーディングフレームはバクテリアのセロビオハイドロラーゼ遺伝子であると推定される。ＯＪ１－１はバクテリア特異的なセルロース結合モジュールＣＢＭ３を持っており、この推定を強く支持している。
＜７＞　アミノ酸配列アラインメント
　ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶと高いアミノ酸配列同一性を示したＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼは、１１２８アミノ酸から構成されている。当該遺伝子は、１位から２９位までの２９アミノ酸からなる移行シグナル配列から始まり、３７位から１３６位までの１００アミノ酸からなるセルロース結合モジュールＣＢＭ２、２４１位から６１１位までの３７０アミノ酸からなるＧＨ６触媒領域、さらに、その下流に７１３位から１０８２位までの３７０アミノ酸からなるもう一つのＧＨ６触媒領域から構成されるマルチドメイン遺伝子である。Ｐｆａｍが示したこれらＧＨ６触媒領域は、いずれも３７０アミノ酸残基から構成され、バクテリアＧＨ６触媒領域、例えば、４２３アミノ酸残基から構成されるＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸ　Ｃｅｌ６Ｂの触媒領域よりも５０アミノ酸残基以上も短く、実際の触媒領域をカバーできていないと考えられた。そこで、ＢＬＡＳＴＰにより、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ　ｆｕｓｃａ　ＹＸ　Ｃｅｌ６Ｂと相同なＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のＧＨ６触媒領域を検索したところ、図２Ａにあるように、１番目のＧＨ６触媒領域は２３０位のバリン（Ｖ）から６５７位のグルタミン（Ｑ）までの４２８アミノ酸残基から構成されていた。
　また、ＯＪ１－１のＧＨ６触媒領域は不完全長であるが、この部分配列は、ＡＲ１９Ｇ－１６６のＧＨ６触媒領域に対し５７％のアミノ酸配列同一性を示し、糸状菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｓｅｉのファミリー６ＣＢＨ（ＴｒＣＢＨII）に対し、わずか２５％の配列同一性を示しただけだった。
　オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ－１６６は、ＧＨ６触媒領域配列の前に４７アミノ酸残基が存在する。このアミノ酸配列は、多数回、プロリン（Ｐ）とトレオニン（Ｔ）が繰り返されることから、リンカーの一部であると考えられた。したがって、ＡＲ１９Ｇ－１６６は、ＯＪ１－１と同様に、セロビオハイドロラーゼ触媒領域の上流に、リンカー配列を介してセルロース結合モジュールＣＢＭを持つマルチドメイン遺伝子であると推測された。
　図２Ａに、オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２、ＯＪ１－１）から推定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のファミリー６グルコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列アライメントを示す。また、図２Ｂに、オープンリーディングフレームＯＪ１－１から推定されるアミノ酸配列及び好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合モジュールＣＢＭ３（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＦ２２２７３．１）のアミノ酸配列アライメントを示す。図２Ａ及びＢ中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列においてアミノ酸残基が保存されている領域を示し、網掛けのアミノ酸は、これらのアミノ酸配列において一部変異はあるものの大部分のアミノ酸配列においてアミノ酸残基が保存されている領域を示す。
　図３Ａに、オープンリーディングフレーム（ＡＲ１９Ｇ－１６６、ＡＲ１９Ｇ－１２、ＯＪ１－１）から推定されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及びＨｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ　ＤＳＭ　７８５のＣＢＨ遺伝子のアミノ酸模式図を示す。また、図３Ｂに、オープンリーディングフレームＯＪ１－１から推定されるアミノ酸配列及び好熱性好気性細菌Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓのセルロース結合モジュールＣＢＭ３のアミノ酸模式図を示す。図３Ａ及びＢ中、「触媒領域（部分）」、「リンカー（部分）」は、それぞれ各領域の一部分のみが在ることを示す。
＜８＞　遺伝子クローニング
　ＰＣＲクローニングにより得られたセロビオハイドロラーゼ候補遺伝子を、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ　Ｖ２　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製)で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲにより増幅した。増幅したＰＣＲ産物はＣｈａｍｐｉｏｎ　ｐＥＴ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ－ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ　Ｓｈｏｔ　ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７～２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）　ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサを用いて配列確認を行った。
＜９＞　遺伝子発現及びセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の精製
　シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、ＣｈａｍｐｉｏｎＴＭ　ｐＥＴ　Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ＴＯＰＯ（登録商標）　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｋｉｔｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に付属のＢＬ２１　Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株若しくはＲｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（Ｍｅｒｃｋ社製）を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００＝０．２～０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ（－）－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５～２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｏｒＵＣＤ－２００Ｔ（コスモバイオ社製)を用いて、３０秒間破砕－３０秒間休止工程を１０サイクル繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。
　当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ　Ｑ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ　ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０～５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ　２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のセロビオハイドロラーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ　Ｐｈｎｅｎｙｌ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて１００～０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ　２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０　ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００　ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１～１．５倍容の同バッファーを流速２～３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。セロビオハイドロラーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
　遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製したセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析とウェスタンブロッティングにより確認した。
　遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、それぞれ４－２０％のミニグラジェントゲルと１０％のミニゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いて行った。前記上清及び精製酵素とＴｒｉｓ－ＳＤＳβＭＥ処理液（コスモバイオ社製）を１：１で混合した後に１００℃で１０分間処理し、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は５μＬ、精製酵素は０．５μＬをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、固定化したゲルをクマシーブリリアントブルーＲ２５０（Ｍｅｒｃｋ社製）で染色し、タンパク質のバンドを可視化した。
　遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のウェスタンブロッティングは、１０％ミニゲル（ＡＴＴＯ社製）を用いてＳＤＳ電気泳動を行った後、転写装置Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ　ＳＤ（バイオラッド社製）を用いてポリフッ化ビニリデン膜（ＡＴＴＯ社製）へ転写した。膜上のタンパク質は１０００倍に希釈したウサギ１次抗体と反応させた。当該ウサギ１次抗体は、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶがコードする３８４～４０３位の２０アミノ酸残基（ＣＤＰＮＧＱＳＲＹＮＳＡＹＰＴＧＡＬＰＮ）からなるポリペプチドを合成し、ウサギを免疫して得られた血清をアフィニティー精製することによって作製した（オペロンバイオテクノロジー社製）。タンパク質と結合した１次抗体の検出は、ＦａｓｔＷｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて行い、化学発光シグナルの検出には、イメージング装置Ｅｚ－Ｃａｐｔｕｒｅ　ＭＧ（ＡＴＴＯ社製）を使用した。
　図４に、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡとＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶを大腸菌に発現させて得られた酵素タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析（図４（Ａ））とウェスタンブロット解析（図４（Ｂ））の結果を示す。レーン１はタンパク質分子量指標であり、レーン２及び３はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの遺伝子組換え大腸菌破砕上清であり、レーン４及び５は精製したＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡタンパク質及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶタンパク質の電気泳動パターンである。
　セロビオハイドロラーゼ遺伝子は、一般に、発現性が非常に悪い。例えば、セロビオハイドロラーゼ遺伝子を、大腸菌を宿主として発現させた場合、当該遺伝子が糸状菌由来、あるいはバクテリア由来に関わらずほとんど発現しない。ところが、ＰＣＲクローンＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、いずれも大腸菌内で良く発現した。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの遺伝子組換え大腸菌破砕上清のＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析において、アミノ酸配列（配列番号１及び３）から予想される分子量４６．７ｋＤａに強いバンドが認められた(図４（Ａ）のレーン２と３)。当該タンパク質を精製したところ、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶでは、いずれも、上記バンドに対応する単一バンドが認められた (図４（Ａ）のレーン４と５)。ＡＲ１９Ｇ－１６６の３８４～４０３位の２０アミノ酸残基からなるポリペプチドに対する抗体を用いたウェスタンブロットにより、遺伝子組換え大腸菌破砕上清 (図４（Ｂ）のレーン２、３)と精製酵素 (図４（Ｂ）のレーン４、５)の双方において、４６．７ｋＤａに酵素タンパク質の単一バンドが検出された。
＜１０＞　ＰＳＡを基質としたセロビオハイドロラーゼ活性測定（ＰＳＡ加水分解活性）
　セロビオハオドラーゼ活性測定には、リン酸膨潤アビセル（ＰＳＡ）を基質として用いた。ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。
　遺伝子組換え大腸菌破砕上清、又は精製途中の酵素試料の活性測定は、５０μＬの１質量％ＰＳＡ含有２００ｍＭ　酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と５０μＬの遺伝子組換え大腸菌破砕上清、又は精製途中の酵素試料からなる混合液を、３０～１００℃で２０分間反応させることにより行った。
　全ての計測において、遺伝子組換え大腸菌破砕上清の代わりに５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と酵素は、反応温度で５分間それぞれ別々に保温した後に混合し、反応開始とした。反応中、いずれの混合液も不溶性基質の沈殿を防ぐため、エッペンドルフ社のサーモミキサー（１４００ｒｐｍ）を用いて攪拌した。反応終了後は、等量の３，５－ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。
　この結果、ＰＣＲクローニングにより得られた４４個のセロビオハイドロラーゼ候補遺伝子のうち、ＧＨ６ファミリーに属するＣＢＨ遺伝子のオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ－１６６がコードするポリペプチドのみが、ＰＳＡ加水分解活性を示した。ＡＲ１９Ｇ－１６６から得られた２種類のＰＣＲクローン（ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ）は、いずれもＰＳＡ加水分解活性を示した。
＜１１＞　セロビオハイドロラーゼの基質特異性
　ＰＳＡ加水分解活性が確認されたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶに対して、様々なセルロース基質とヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜９＞で得られた精製酵素（終濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
　セロビオハイドロラーゼＡＲ１９Ｇ－１６６の基質特異性は、ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース、Ｓｉｇｍａ社製)、キシラン（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）、リケナン（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）、ラミナリン（Ｌａｍｉｎａｒｉａ　ｄｉｇｉｔａｔａ由来、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて計測した。具体的には、５０μＬの２００ｍＭ　酢酸バッファー（ｐＨ５．５）と４０μＬの精製水と１０μＬの精製酵素からなる混合液を５０℃で５分間プリインキュベーションした後、さらに１００μＬの各基質の１質量％水溶液を添加し、５０℃で２０分間（アビセル粉末を基質とした場合は２時間）反応させることにより行った。前記＜１０＞と同様にして酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準偏差を求めた。さらに、ＰＳＡに対する比活性を１００％とした場合の各基質に対する比活性の相対活性値（％）を算出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは水溶性ＰＳＡに対し高い加水分解活性を示した。また、β－１，３結合とβ－１，４結合グルカンからなるＬｉｃｈｉｎａｎや結晶性セルロースのアビセルに対しても分解活性を示した。一方、ＣＭＣ、β－１，３結合とβ－１，６結合グルカンからなるＬａｍｉｎａｒｉｎ、及びキシランに対しては、ほとんど分解活性は示さなかった。非常に弱いながらも結晶性セルロースのアビセルに対して加水分解活性を示し、かつキシランに対し分解活性を示さなかったという酵素基質特異性は、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶがＧＨ６ファミリーに属するセロビオハイドロラーゼであることを示している。
＜１２＞ＰＳＡ分解産物のＨＰＬＣ分析
　リン酸膨潤アビセルＰＳＡを基質とし、セロビオハイドロラーゼＡＲ１９Ｇ－１６６―ＲＡ及び木材腐朽糸状菌Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのファミリー６ＣＢＨ（ＴｒＣＢＨII）による加水分解反応産物について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による成分分析を行った。ＡＲ１９Ｇ－１６６―ＲＡでは０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、７０℃で、ＴｒＣＢＨIIでは０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、４０℃で、それぞれ１時間と２４時間、ＰＳＡの加水分解反応を行った後、０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液の添加により反応を停止させた。加水分解反応産物を４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を孔径０．２μｍのフィルターでろ過し、ＨＰＬＣ分析に供試した。ＨＰＬＣ装置はＡｌｌｉａｎｃｅ　ｅ２６９５（Ｗａｔｅｒｓ社製）を使用し、糖の検出にはＲＩ検出器（２４１４ＲＩ）を用いた。ＨＰＬＣ装置の制御及び解析ソフトはＥｍｐｏｗｅｒバージョン３．０を使用した。カラムはＨＰＬＣ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｃｏｌｕｍｎ　３００ｍｍ×７．８ｍｍ（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用い、溶媒は超純水を使用した。流速０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度８５℃で加水分解試料１０μＬを分析した。検量線は標準物質（グルコース、セロビオース、セロトリオース）を用いて作成し、糖類の定量を行った。検量線サンプルの最大濃度は、グルコースでは０．２質量％、セロビオースでは０．４質量％、セロトリオースでは０．５質量％であり、希釈系列を作成して６点で検量線を作成した。
　ＨＰＬＣによる成分分析の計測結果を図５Ａ及びＢに示す。ＡＲ１９Ｇ－１６６―ＲＡによるＰＳＡ加水分解反応産物は、１時間後では、主にセロビオース（８６．５％）と少量のセロトリオース（１３．５％）であり、２４時間後では、セロビオース８６．２％、セロトリオース１３．０％と極めて少量のグルコース（０．７％）であった（図５Ａ）。一方、ＴｒＣＢＨIIによるＰＳＡ加水分解反応産物は、主にセロビオース（８７．５％）と少量のセロトリオース（１２．５％）であり、２４時間後では、セロビオース８８．４％、セロトリオース９．４％と極めて少量のグルコース（２．２％）であった（図５Ｂ）。このＨＰＬＣ分析の結果からも、ＡＲ１９Ｇ－１６６はセロビオハイドロラーゼであることが示された。
＜１３＞　セロビオハイドロラーゼ活性の温度及びｐＨ依存性
　ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶによるＰＳＡ加水分解活性の温度依存性及びｐＨ依存性及を調べた。計測には、前記＜９＞で得られた精製酵素（終濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。
　精製酵素のＰＳＡ加水分解活性の測定は、１００μＬの１質量％ＰＳＡ水溶液と、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３～８）と、４０μＬの精製水と、１０μＬの精製酵素からなる混合液を、３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又は１００℃で２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
　計測結果を図６及び７に示す。図６Ａ及びＢは、横軸を温度として、各温度におけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図であり、図７Ａ及びＢは、横軸をｐＨとして各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を計測した結果を示した図である。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。
　精製酵素ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡは、温度範囲６０～８０℃において高いＰＳＡ加水分解活性を示した（図６Ａ）。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ４．５で７０℃、ｐＨ５．０～６．０で７５℃であった。酵素反応温度を８５℃以上にした場合には、いずれのｐＨ範囲においても、精製酵素ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡのＰＳＡ加水分解活性は急激に減少した。一方、精製酵素ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、６５℃以上において、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡよりもＰＳＡ加水分解活性が低かった（図６Ｂ）。最も高い活性を示した至適温度（Ｔｏｐｔ）は、ｐＨ４．５～ｐＨ５．５で７０℃、ｐＨ６．０で７５℃であった。いずれのｐＨ範囲においても、精製酵素ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡのＰＳＡ加水分解活性は、酵素反応温度が８０℃以上で急激に減少した。
　また、精製ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡは、反応温度６５～８０℃、ｐＨ４～６の範囲において最も高いＰＳＡ加水分解活性を示した（図７Ａ）。最適ｐＨは反応温度に依存して変化し、６０～６５℃でｐＨ４．６（実測値）、７０～７５℃でｐＨ５．２～５．３（実測値）であり、８０℃でｐＨ５．８（実測値）であった。ｐＨ３．２～４．５、ｐＨ７～８の範囲においては、低レベルのＰＳＡ加水分解活性が認められた。一方、精製酵素ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶは、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡと同様、ｐＨ４～６の範囲において最も高いＰＳＡ加水分解活性を示し、ｐＨ３．２～４．５、ｐＨ７～８の範囲においては、低レベルのＰＳＡ加水分解活性が認められた（図７Ｂ）。
＜１４＞　セロビオハイドロラーゼの熱安定性（酵素活性の半減期）
　ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの熱安定性（耐熱性）を調べるため、２０分間～１４４０分間プリインキュベーションを行い、各温度における酵素タンパク質のＰＳＡ加水分解活性を計測した。
　測定には、前記＜９＞で得られた精製酵素（終濃度約１ｍｇ／ｍＬ）を用いた。精製酵素のプリインキュベーションは、精製酵素１０μＬと、精製水４０μＬと、２００ｍＭ酢酸バッファー５０μＬからなる混合液（ｐＨ５．０）を、５０～８０℃の各温度で０、２０、４０、６０、１２０、２４０、４８０、９６０、又は１４４０分間保温し、行った。ＰＳＡ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と１質量％ＰＳＡ水溶液をそれぞれ別々に５０℃で５分間加温した後、ＰＳＡ水溶液１００μＬを前記混合液に加え、２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
　計測結果を図８Ａ及びＢに示す。酵素活性は、無処理区（プリインキュベーション無し）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。図８Ａの破線ドロップラインで示すように、酵素活性が無処理区の５０％に低下するプリインキュベーション時間を半減期Ｔｈａｌｆとした。
　精製ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡは、プリインキュベーション温度５０～６０℃の場合、計測時間内にＰＳＡ加水分解活性が失われることはなく、半減期Ｔｈａｌｆは計測上限の２４時間以上であった。７０℃では、図８Ａの太線で示した指数関数による近似曲線により半減期Ｔｈａｌｆが２２６分と算出された。８０℃では、プリインキュベーションにより酵素活性は直ちに失われた（図８Ａ）。
一方、精製ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの耐熱性はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡと比べ、かなり低かった。プリインキュベーション温度５０℃では、計測時間内にＰＳＡ加水分解活性はほとんど失われず、半減期Ｔｈａｌｆは２４時間以上であった。プリインキュベーション温度の上昇とともに酵素活性半減期Ｔｈａｌｆは短くなり、６０℃で１６時間、７０℃でさらに短くなり、４０分であった。８０℃では、酵素活性は直ちに失われた（図８Ｂ）。
＜１５＞　セロビオハイドロラーゼの熱安定性（二価金属イオンの効果）
　一般に二価金属イオンは、タンパク質に結合することでタンパク質の構造を安定させ、耐熱性を向上させることが知られている。カルシウム（Ｃａ２＋）、マンガン（Ｍｎ２＋）、コバルト（Ｃｏ２＋）、バリウム（Ｂａ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、ニッケル（Ｎｉ２＋）、二価鉄（Ｆｅ２＋）、三価鉄（Ｆｅ３＋）、亜鉛（Ｚｎ２＋）の各二価金属イオン（濃度１ｍＭ）を酵素－基質（ＰＳＡ）反応液中に投与し、酵素タンパク質のＰＳＡ加水分解活性に対する効果を計測した。まず、精製酵素液（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１０μＬ、精製水又は各二価金属の５ｍＭ塩化物水溶液４０μＬ、２００ｍＭ酢酸バッファー５０μＬ（ｐＨ５．５）の混合液を、３０℃で３０分間プリインキュベーションした。ＰＳＡ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と１質量％ＰＳＡ水溶液をそれぞれ別々に３０～１００℃の各温度で５分間加温した後、ＰＳＡ水溶液１００μＬを前記混合液に加え、各温度で２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
　その結果、最終濃度１ｍＭのカルシウムイオン又はコバルトイオン投与により、８５℃以上でＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの酵素活性が上昇し、マンガンイオンでは６０～９０℃の温度範囲において酵素活性が著しく上昇した（図示省略。）。他の二価金属イオンは効果が見られないか（Ｂａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｎｉ２＋）、むしろ、酵素活性を低下させた（Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋）。
＜１６＞　セロビオハイドロラーゼの熱安定性（酵素タンパク質の熱崩壊温度）
　タンパク質の熱安定性に関わるもう一つの指標は、熱変性温度又は熱崩壊温度Ｔｍ（ｍｅｌｔｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である。一定時間の予備加温（プリインキュベーション）により酵素活性が無処理区の５０％に減少するプリインキュベーション温度はタンパク質の熱崩壊温度Ｔｍに等しく、図９Ａの破線ドロップラインが示すように、酵素活性を計測することにより求めることができる。この方法により、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの熱崩壊温度Ｔｍを求めた。
　精製酵素液（濃度約１ｍｇ／ｍＬ） １０μＬ、精製水又は５ｍＭ二価金属イオン塩化物（ＣａＣｌ２又はＭｎＣｌ２）水溶液４０μＬ、２００ｍＭ酢酸バッファー５０μＬ（ｐＨ５．０）の混合液を３０℃で３０分間インキュベーションした後に、４０～１００℃で３０分間プリインキュベーションした。ＰＳＡ加水分解活性の測定は、プリインキュベーション後の混合液と１質量％ＰＳＡ水溶液をそれぞれ別々に５０℃で５分間加温した後、１００μＬのＰＳＡ水溶液を前記混合液に加え、５０℃で２０分間反応させた以外は、実施例１の＜１０＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求め、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。各プリインキュベーション温度に対し、酵素のＰＳＡ加水分解活性値を３回計測し、平均値及び標準誤差を求めた。加水分解活性が飽和する低温度領域（４０～６５℃）及び高温度領域（９０～１００℃）の加水分解活性の平均値を、それぞれ１と０として、データの正規化を行った。
　各プリインキュベーション温度におけるＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡタンパク質及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶタンパク質のＰＳＡ加水分解活性、及びシグモイド関数による近似曲線を図９Ａ及びＢに示した。この近似曲線から酵素タンパク質の熱崩壊温度Ｔｍ値（すなわち、Ｎｏｒｍａｒｉｚｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ＝０．５時点のプリインキュベーション温度）を求めた。ＰＳＡ加水分解活性データの近似曲線から算出した酵素タンパク質の熱崩壊温度Ｔｍ値を表３に示す。表３中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は５ｍＭ二価金属イオン塩化物水溶液に代えて精製水を添加した反応の結果である。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡのＴｍ値は７６．４℃、一方、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶのＴｍ値は６８．５℃であり、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡのほうがＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶよりＴｍ値が約８℃高かった。また、濃度１ｍＭのマンガンイオン投与により、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの熱崩壊温度Ｔｍが、それぞれ３．０℃と４．１℃上昇した。濃度１ｍＭのカルシウムイオン投与により、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡのＴｍ値はわずかに（０．７℃）上昇したのに対し、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶのＴｍ値は３．１℃上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［実施例２］
　糸状菌や植物など真核生物を宿主として任意の遺伝子を導入すると、発現したタンパク質は一般に至適温度が５～１０℃程度上昇する。これは、グリコシル化（糖鎖修飾）と呼ばれる、タンパク質へ糖類が付加する翻訳後修飾反応によるものであり、グリコシル化されたタンパク質は熱に対し安定的になる。糸状菌であるコウジカビＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅにＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子を導入し、コードする酵素タンパク質の耐熱性に対する糖鎖修飾の効果を検証した。
＜１＞　コウジカビ形質転換体の作製
ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの３５１位アミノ酸残基をトリプトファン（Ｗ）に置換した変異体ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ（アミノ酸配列：配列番号５、塩基配列：配列番号６）及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷ（アミノ酸配列：配列番号７、塩基配列：配列番号８）を作製し、これらを含む発現カセットをコウジカビに導入し、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ又はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷを発現するコウジカビ形質転換体を作製した。
　これらのＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子のアミノ酸置換変異体を形質転換ベクターに組込んで発現ベクターを構築し、これを用いてコウジカビを宿主として形質転換した。コウジカビ形質転換体は、大関株式会社のタンパク質受託発現サービス（http://www.ozeki.co.jp/）により作製された。当該サービスによるコウジカビ形質転換は相同組換え法を特徴とし、導入遺伝子が染色体の特定部位に組込みこまれるため、糸状菌の形質転換効率は低いが、一旦染色体上に組込まれると導入遺伝子は安定して保持され、導入遺伝子がコードするタンパク質を安定的に生産できる。また、分泌シグナルが付加されているため、導入遺伝子がコードするタンパク質は、培養液中に菌体外分泌される。
＜２＞　コウジカビ形質転換体により生成されたタンパク質の濃縮
　こうして得られたコウジカビ形質転換体を培養した後、培養液上清を回収した。この培養上清を、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ　２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ｓｔｅｄｉｍ社製）を用いて１／１０容量への濃縮と５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換を行い、これを濃縮上清とした。
　各コウジカビ形質転換体の濃縮上清各５μＬと、実施例１で調製したＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの遺伝子組換え大腸菌破砕上清５μＬに対しウェスタンブロット解析を行った。ウェスタンブロット解析は実施例１の＜９＞と同様に行い、その結果を図１０に示す。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ導入コウジカビ形質転換体とＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷ導入コウジカビ形質転換体の濃縮上清からは、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子組換え大腸菌破砕上清（図１０中のレーン２と３）の単一バンドに対応した非常に弱いバンドが４６．７ｋＤに認められ、さらに５０～５５ｋＤａにブロードな強いバンドが現れた（図１０中のレーン２と３）。このように、コウジカビを宿主として発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子がコードするタンパク質の大部分は、見かけの分子量が３～８ｋＤａ程度増加し、この分子量増加は糖鎖付加によるものと考えられる。
＜３＞　ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷ遺伝子の大腸菌形質転換体の作製、及びセロビオハイドロラーゼ酵素タンパク質の精製
　実施例１の＜８＞と同様にして、変異体ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷをｐＥＴ１０１／Ｄ－ＴＯＰＯベクターに挿入したプラスミドを作製した。実施例１の＜９＞と同様にして、これらのプラスミドをタンパク質発現用大腸菌へ導入した大腸菌形質転換体を作製し、得られた大腸菌形質転換体に対して発現誘導を行い、培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、目的タンパク質を含む組換え大腸菌粗抽出物を得、これを濾過して大腸菌破砕上清を得た。実施例１の＜９＞と同様にして、イオン交換カラム、疎水性相互作用分離カラム、及びゲル濾過カラムによって分画、精製し、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。
＜４＞　セロビオハイドロラーゼ活性の温度依存性
　当該遺伝子組換えコウジカビ形質転換体及び当該遺伝子組換え大腸菌により生産されたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷのＰＳＡ加水分解活性の温度依存性を調べた。計測には、前記＜２＞で得られた濃縮上清及び＜３＞で得られた精製酵素を用いた。
　各温度におけるＰＳＡ加水分解活性の計測は、前記＜２＞で得られた濃縮上清を用い、反応液のｐＨを５．５とした以外は、実施例１の＜１３＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。大腸菌発現させた精製酵素ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷのＰＳＡ加水分解活性は、実施例１の＜１０＞と同様にして、１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。一方、コウジカビ形質転換体により生産されたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷのＰＳＡ加水分解活性は、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷが最大加水分解活性を示した１００℃での還元糖量を１００％として、相対活性値（％）を算出した。
　算出された各温度におけるＰＳＡ加水分解活性の相対活性値（％）を図１１Ａに示す。図１１Ａには、実施例１の＜１３＞で計測した大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷ（図中、それぞれ、「ＲＷ　ｂｙ　Ｅ．ｃｏｌｉ」及び「ＱＷ　ｂｙ　Ｅ．ｃｏｌｉ」）のＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）の計測結果も共に示す。大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷの至適温度（Ｔｏｐｔ）は、それぞれ、８０℃と７５℃であった。一方、コウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷ（図中、それぞれ、「ＲＷ　ｂｙ　Ａ．ｏｒｙｚａｅ」及び「ＱＷ　ｂｙ　Ａ．ｏｒｙｚａｅ」）の至適温度は、いずれも１００℃以上であった。このように、ＡＲ１９Ｇ－１６６遺伝子はコウジカビ発現させることで１０％程度分子量が増大し、至適温度が２０～３０℃上昇することが判明した。コウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６は、従来の好熱性糸状菌に由来するセロビオハイドラーゼよりも至適温度が３０℃以上も高く、耐熱性に優れていた。
　これらの結果から、本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼを、糸状菌等の真核生物の発現系によって発現させることにより、８０℃以上でも良好なセロビオハイドロラーゼ活性を有する酵素を得ることができることが明らかである。８０～１００℃においても高い酵素活性を示す耐熱性セロビオハイドロラーゼを、その他の耐熱性セルラーゼと共に用いることによって、リグノセルロースの糖化処理を８０℃以上の高温条件で行うことが可能になる。
＜５＞　セロビオハイドロラーゼ活性のｐＨ特性
　コウジカビ形質転換体及び大腸菌形質転換体により生産された、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷのＰＳＡ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。計測には、前記＜２＞で得られた濃縮上清と、前記＜３＞で得られた精製酵素を用いた。
　各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性の計測は、前記＜２＞で得られた濃縮上清を用いた以外は、実施例１の＜１３＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。大腸菌形質転換体により生産されたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷは、それぞれ８０℃と７５℃でＰＳＡ加水分解反応を行い、ＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。コウジカビ形質転換体により生産されたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷでは、温度８０℃でＰＳＡ加水分解反応を行い、各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性を、最大活性が得られたｐＨ５．２のＰＳＡ加水分解活性を１００％とした相対活性値（％）として算出した。
　算出された各ｐＨにおけるＰＳＡ加水分解活性の相対活性値（％）を図１１Ｂに示す。図１１Ｂには、実施例１の＜１３＞で計測した大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＷ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＷ（図中、それぞれ、「ＲＷ　ｂｙ　Ｅ．ｃｏｌｉ」及び「ＱＷ　ｂｙ　Ｅ．ｃｏｌｉ」）のＰＳＡ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）の計測結果も共に示す。コウジカビ発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６酵素（図中、「ＲＷ　ｂｙ　Ａ．ｏｒｙｚａｅ」及び「ＱＷ　ｂｙ　Ａ．ｏｒｙｚａｅ」）は、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ－１６６酵素（図中、「ＲＷ　ｂｙ　Ｅ．ｃｏｌｉ」及び「ＱＷ　ｂｙ　Ｅ．ｃｏｌｉ」）よりも広いｐＨ特性を示し、最大値の５０％活性を示すｐＨは反応温度８０℃で３．３～８．０のレンジにあった。一方、大腸菌発現させた場合、このｐＨレンジは４．５～６．８であった。
［実施例３］
　一般的に、植物を宿主とする組換え遺伝子のタンパク質生産は、大腸菌、バチルス等の細菌発現系やコウジカビ等の糸状菌発現系と比べ、はるかに高い発現量が得られる。特に、葉緑体形質転換体は、形質転換葉中に外来タンパク質を全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）比５～１０質量％蓄積させ、時にはＴＳＰ比４０質量％以上の高い蓄積を示すことがある。一方、核ゲノム形質転換は、形質転換体組織に外来タンパク質をＴＳＰ比１質量％程度蓄積する。このように、植物によるタンパク質生産、特に葉緑体形質転換体による外来タンパク質生産は、従来のタンパク質生産プラットフォームである細菌や糸状菌培養をはるかに凌ぐ経済メリットがある。そこで、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶをタバコ葉緑体ゲノム内に挿入したタバコ葉緑体形質転換体を作製した。
＜１＞　タバコ葉緑体形質転換体の作製
　葉緑体形質転換コンストラクトを構成する葉緑体ゲノム内導入領域、５’／３’発現調節領域、選抜マーカー遺伝子等は、これまでに報告されている外来タンパク質の高発現例を参考に設計した（Daniell et al., Methods in Molecular Biology, 2005, Vol.286, p.111-138; Verma and Daniell, Plant Physiol. ,2007, Vol.145, p.1129-1143)。
　まず、図１２の上段に示す構造を持つタバコ葉緑体形質転換用カセットベクターｐＮｔａＧＬ及びｐＮｔａＧＬＰＬを作製した。当該ベクターは、タバコ葉緑体ゲノム内の逆位反復配列内のｔｒｎＩ遺伝子－ｔｒｎＡ遺伝子間領域に、相同組換えにより目的遺伝子を導入するためのベクターである。スペクチノマイシン耐性を指標とする選抜マーカーとして、ａａｄＡ（アミノグルコシド３’－アデニルトランスフェラーゼ）遺伝子の発現カセットを持ち、ａａｄＡ遺伝子発現カセットの下流に目的遺伝子の発現カセット導入部位（ＣｌａＩ－ＢｓｉＷＩ部位）を持つ。ｐＮｔａＧＬベクターにはａａｄＡ遺伝子の発現制御領域としてタバコ由来１６ＳリボゾームＲＮＡ遺伝子のプロモーター（Ｐｒｒｎ）が挿入されているが、ｐＮｔａＧＬＰＬベクターはプロモーター領域を含まないベクターであり、ａａｄＡ遺伝子の発現は相同組換え領域上流の内生プロモーターに依存する。
　図１２の中段に、目的遺伝子の発現カセットｐＰＸＴ及びｐＰＸＴＰＬを示す。いずれもＢａｍＨＩ部位に目的遺伝子を挿入するよう設計されており、目的遺伝子の５’側にはそれぞれＰｒｒｎプロモーターとバクテリオファージＴ７由来のｇｅｎｅ１０（Ｔ７ｇ１０）配列、又はＴ７ｇ１０配列のみを持つ。Ｔ７ｇ１０配列は、外来遺伝子の葉緑体内発現において外来タンパク質の高蓄積に有効であることが示唆されている配列である。目的遺伝子の３’側には共通してタバコ葉緑体ｒｂｃＬ遺伝子の３’－ＵＴＲ（ＴｒｂｃＬ）を配置し、いずれもカセット両端のＣｌａＩ部位及びＢｓｉＷＩ部位により、葉緑体形質転換用カセットベクターｐＮｔａＧＬまたはｐＮｔａＧＬＰＬベクターに導入することができる。
　ＰＣＲクローンＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶを、それぞれＢａｍＨＩリンカー付きプライマーにより増幅し、得られた増幅産物を発現カセットｐＰＸＴ又はｐＰＸＴＰＬのＢａｍＨＩ部位に挿入した。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶを挿入した発現カセットｐＰＸＴを、ＣｌａＩ部位及びＢｓｉＷＩ部位を利用してｐＮｔａＧＬに組込むことにより、ｔｒｎＩ遺伝子－ｔｒｎＡ遺伝子間領域にａａｄＡ遺伝子発現カセットとＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの発現カセットがタンデムに連結された構造を持つ葉緑体形質転換コンストラクトｐＮｔａＧＬ－ＱＶを作製した。同様にして、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡを挿入した発現カセットｐＰＸＴＰＬをｐＮｔａＧＬＰＬに組込み、葉緑体形質転換コンストラクトｐＮｔａＧＬＰＬ－ＲＡを作製した。図１２後段に、葉緑体形質転換コンストラクトｐＮｔａＧＬ－ＱＶ及びｐＮｔａＧＬＰＬ－ＲＡの構造を模式的に示す。図１２後段中、「ＱＶ」はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶを、「ＲＡ」はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡを、それぞれ意味する。
　タバコ葉緑体の形質転換は、基本的にDaniell らの方法（Daniell et al., Methods in Molecular Biology, 2005, Vol.286, p.111-138）に準じて行った。具体的には、ＭＳ平板培地（３０ｇ／Ｌのスクロースを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地（ｐＨ５．８）を３ｇ／Ｌのゲランガムで固化した培地）で無菌的に播種、育成させたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ．ＳＲ－１）の緑葉を、０．５ｃｍ四方に切断し、葉の向軸側が培地に接するようにＲＭＯＰ培地（Sbav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1990, Vol.87, p.8526-8530）を充填したシャーレの中央に並べた。１６時間明期／８時間暗期条件で１日間培養した後、パーティクルガン（ＰＤＳ－１０００Ｈｅ、ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用いてｐＮＴａＱＶ及びｐＮｔａＲＡをそれぞれ導入した。パーティクルガンには０．６μｍの金粒子と１１００ｐｓｉのラプチャーディスクを用い、ラプチャーディスクからサンプルまでの距離を約９ｃｍとして行った。
　遺伝子コンストラクト導入後のタバコ葉は、暗所２５℃で３日間培養した後、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含むＲＭＯＰ培地に移植し、２５℃で１６時間明期／８時間暗期条件で２週間おきに植え継いだ。途中、再生したシュートの葉を切断して、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含むＲＭＯＰ培地に移植し、脱分化及びシュート再分化を繰り返すことにより、へテロプラズミック状態の植物体のホモプラズミック化を促進した。
　３、４回の脱分化及び再分化を経て得られたスペクチノマイシン耐性シュートから約１００ｍｇの葉片を採取し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として、ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ又はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶに特異的なプライマーと、ｔｒｎＩ／ｔｒｎＡに特異的なプライマーとを用いたＰＣＲを行い、ｔｒｎＩ－ｔｒｎＡ間にＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ又はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡが導入された個体を選抜した。
　ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ又はＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶの導入が確認された個体を、５００ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含むＭＳ培地に移植し、発根及び植物体の成長を促した。１０ｃｍ程度の大きさになった植物体から、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＤＮＡを抽出し、サザンブロッティングにより導入遺伝子のホモプラズミック状態を調べた。具体的には、まず、葉緑体形質転換タバコ又は野生型タバコ（ＷＴ（ＳＲ－１））の葉から抽出したＤＮＡ各１μｇを、制限酵素ＢｇｌＩＩで消化した。ＢｇｌＩＩ消化後のＤＮＡに対して、ｔｒｎＩ上流領域約１ｋｂと同一の塩基配列からなるプローブを用いてサザンブロッティングを行い、ＧＥヘルスケア社のＡｌｋＰｈｏｓ　Ｄｉｒｅｃｔにより、当該プローブを化学発光検出した。理論的には、当該プローブにより、野生型タバコでは約４．５ｋｂ、葉緑体形質転換タバコでは７．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出される。ｐＮＴａＧＬ－ＱＶの導入により得られた２系統の葉緑体形質転換タバコ（ＱＶ－２、ＱＶ－１７）とｐＮｔａＧＬＰＬ－ＲＡの導入により得られた３系統の葉緑体形質転換タバコ（ＲＡ－６－２－１、ＲＡ－６－２－２、ＲＡ－６－２－３）のサザンハイブリダイゼーションの結果を図１３Ａ及びＢに示す。葉緑体形質転換タバコでは、いずれも組換え型葉緑体由来の７．１ｋｂのバンドのみが検出され、野生型葉緑体に由来する約４．５ｋｂのバンドは検出されなかったことから、これらの系統が、全ての葉緑体が組換え型であるホモプラズミックな葉緑体形質転換体であることが確認された。
　ホモプラズミック葉緑体形質転換体をさらに成長させ、７葉程度の時期に１８ｃｍポットの培養土に移植し、組換え体温室で栽培した。ＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ及びＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡをそれぞれ導入した葉緑体形質転換体は、その後の生長において形態的な異常は見られず結実した。Ｔ１植物を用いて表現型を解析した結果、野生型より生育が若干遅れるものの、形態異常は確認されなかった。開花期には草丈１７０から２１０ｃｍで、２５から３５枚程度の葉を展開し、新鮮重は１９５から２７０ｇであった。図１４（Ａ）は、組換え体温室移植後７７日目のＡＲ１９Ｇ－１６６－ＱＶ導入葉緑体形質転換タバコ植物体 (Ｔ1世代)と野生型タバコ（ＳＲ－１）の写真であり、図１４（Ｂ）は開花期のＡＲ１９Ｇ－１６６－ＲＡ導入葉緑体形質転換タバコ植物体（Ｔ1世代)の写真である。
　本発明に係る耐熱性セロビオハイドロラーゼは、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５においてセロビオハイドロラーゼ活性を有しており、７５℃以上の高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性セロビオハイドロラーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。

Claims (17)

  1. （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
    （Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
    （Ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
    （Ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
    （Ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
    （Ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
    （Ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
    （Ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、又は
    （Ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
    からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域を有する、耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
  2. 　さらに、セルロース結合モジュールを有する、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ。
  3. 　（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｄ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｅ）配列番号３で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｆ）配列番号３で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｇ）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｈ）配列番号５で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｉ）配列番号５で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｊ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｋ）配列番号７で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｌ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    （ｍ) 配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、又は
    （ｎ) 配列番号２、４、６、又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
    からなるセロビオハイドロラーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
  4. 　さらに、セルロース結合モジュールをコードする領域を有する、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
  5. 　請求項３又は４に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
    宿主細胞において、少なくとも７５℃、ｐＨ５．５の条件下でセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
  6. 　請求項５に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
  7. 　真核微生物である、請求項６に記載の形質転換体。
  8. 　植物である、請求項６に記載の形質転換体。
  9. 　請求項６～８のいずれか一項に記載の形質転換体内で、耐熱性セロビオハイドロラーゼを生産する、耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法。
  10. 　請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項２に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、又は請求項９に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼと、少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを含む、セルラーゼ混合物。
  11. 　前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上である、請求項１０に記載のセルラーゼ混合物。
  12. 　セルロースを含む材料を、請求項１に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項２に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼ、請求項６～８のいずれか一項に記載の形質転換体、又は請求項９に記載の耐熱性セロビオハイドロラーゼの製造方法によって製造された耐熱性セロビオハイドロラーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する、セルロース分解物の製造方法。
  13. 　前記セルロースを含む材料に、さらに少なくとも１種以上のその他のセルラーゼを接触させる、請求項１２に記載のセルロース分解物の製造方法。
  14. 　前記その他のセルラーゼが、ヘミセルラーゼ及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上である、請求項１３に記載のセルロース分解物の製造方法。
  15. 　生物由来のＤＮＡ又は生物由来のＲＮＡの逆転写産物を鋳型として、配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行い、増幅産物として、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを得る、耐熱性セロビオハイドロラーゼをコードするポリヌクレオチドの製造方法。
  16. 　配列番号１２で表される塩基配列、又は配列番号１２で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマー。
  17. 　配列番号１３で表される塩基配列、又は配列番号１３で表される塩基配列の５’末端に１若しくは数個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマー。
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