JP4531417B2 - ストレプトマイセス属微生物における遺伝子高発現系 - Google Patents
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Description
Proc. Natl. Acad. Sci, 93, 4267(1996)
(1)H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーター又はその変異体、H-ニトリルヒドラターゼ転写調節タンパク質をコードする遺伝子又はその変異体、及び転写活性化タンパク質をコードする遺伝子又はその変異体を含むDNA構築物。
(2)マルチクローニングサイトをさらに含む(1)記載のDNA構築物。
(3)発現の目的遺伝子又はその変異体をさらに含む(1)又は(2)記載のDNA構築物。
(4)発現の目的遺伝子がH-ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子である(3)記載のDNA構築物。
(5)H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーター又はその変異体の上流にターミネーターを有することを特徴とする(1)〜(4)のいずれか1項に記載のDNA構築物。
(6)上記(1)〜(5)のいずれか1項に記載のDNA構築物を機能的に含むベクター。
(7)宿主菌が放線菌である(6)記載のベクター。
(8)宿主菌が放線菌以外の菌である(6)記載のベクター。
(9)放線菌が、ロドコッカス属に属する菌以外のものである(7)記載のベクター。
(10)放線菌がストレプトマイセス属に属するものである(8)記載のベクター。
(11)放線菌以外の菌が大腸菌である(8)記載のベクター。
(12)上記(6)〜(11)のいずれか1項に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
(13)上記(3)〜(5)のいずれか1項に記載のDNA構築物、及び宿主菌体内において自律複製に関与するDNAをそれぞれ機能的に含むベクターを宿主菌に導入することを特徴とする、目的遺伝子又はその変異体の発現方法。
(14)上記(3)〜(5)のいずれか1項に記載のDNA構築物、及び宿主菌体内において自律複製に関与するDNAをそれぞれ機能的に含むベクターが導入された宿主菌を培養し、得られる培養物から目的遺伝子又はその変異体の発現産物を採取することを特徴とする前記発現産物の生産方法。
(15)目的遺伝子がニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子である、上記(13)又は(14)記載の方法。
(16)宿主菌が放線菌又は大腸菌である上記(13)又は(14)記載の方法。
(17)放線菌が、ロドコッカス属に属する菌以外のものである(16)記載の方法。
(18)放線菌がストレプトマイセス属に属するものである(16)記載の方法。
1.発現用DNA構築物の作製
本発明は、H-NHase遺伝子のプロモーター、制御タンパク質NhhCをコードする遺伝子(NhhC遺伝子(nhhCと表示することもある))及び転写活性化タンパク質NhhDをコードする遺伝子(NhhD遺伝子(nhhDと表示することもある))を含むDNA構築物に関する。
NhhC遺伝子:422-1507(配列番号3)
NhhD遺伝子:1558-2004(配列番号5)(但し、この領域は相補鎖の配列を表示してある)
H-NHase遺伝子(βサブユニット):4631-5320(配列番号7)
H-NHase遺伝子(αサブユニット):5334-5945(配列番号9)
(1) H-NHase遺伝子のプロモーター
本発明のプロモーターは、H-NHase遺伝子を保有する菌体(後述)から、制限酵素を用いて切り出すことが可能であるが、切り出すために都合の良い制限酵素部位が存在するとは限らない。そこで、制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、PCRで所望のプロモーター領域を増幅することによりプロモーター領域のDNA断片を得ることができる。また、既に判明しているプロモーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のプロモーター領域を化学合成することも可能である。
本発明のNhhCは、NhhC遺伝子を保有する菌体から、制限酵素を用いて切り出すことが可能であるが、切り出すために都合の良い制限酵素部位が存在するとは限らない。そこで、制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、PCRで所望のNhhC遺伝子領域を増幅することによりNhhC遺伝子のDNA断片を得ることができる。また、既に判明しているNhhC遺伝子の塩基配列情報をもとにして、所望のNhhC遺伝子を化学合成することも可能である。
(b) NhhC遺伝子の塩基配列(配列番号3)のうち1個又は数個(例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度)の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子であってNhhC活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(c) NhhC遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NhhC制御タンパク質としての機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
ここで、「NhhC制御タンパク質としての機能」とは、NhhDタンパク質とともにH-NHaseの発現調節に関与することを意味する。
本発明のNhhDは、NhhD遺伝子を保有する菌体から、制限酵素を用いて切り出すことが可能であるが、切り出すために都合の良い制限酵素部位が存在するとは限らない。そこで、制限酵素認識部位を設けたプライマーを用い、PCRで所望のNhhD遺伝子領域を増幅することによりNhhD遺伝子のDNA断片を得ることができる。また、既に判明しているNhhD遺伝子の塩基配列情報をもとにして、所望のNhhD遺伝子を化学合成することも可能である。
(b) NhhD遺伝子の塩基配列(配列番号5)のうち1個又は数個(例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度)の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子であってNhhD活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(c) NhhD遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NhhD転写活性化タンパク質としての機能を有するタンパク質をコードする遺伝子
ここで、「NhhD転写活性化タンパク質としての機能」とは、NhhCタンパク質とともにH-NHaseの発現調節に関与することを意味する。
本発明のDNA構築物には、マルチクローニングサイト(MCS)を導入することができる。MCSは、複数種類の制限酵素サイトをもつDNA断片であり、発現の目的遺伝子をMCSに連結してベクターに挿入するために使用される。本発明においては、以下の制限酵素部位(少なくとも1個)を有するMCSを例示することができる。
(5) ターミネーター等
本発明のDNA構築物には、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、選択マーカー、ターミネーターなどを連結することができる。
2.目的構造遺伝子の発現
(1) 組換えベクターの作製
本発明の発現用組換えベクターは、プラスミド中に前記DNA構築物を機能的に含むものである。「機能的に」とは、本発明のDNA構築物が発現又は機能するように、という意味であり、後述の宿主に導入したときにそれぞれの遺伝子が発現し得る状態を意味する。
本発明において、発現の目的となるH-NHase構造遺伝子を有する細菌は、ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有し、ニトリル化合物を水和して対応するアミド化合物を生成させることができる細菌であれば特に制限はされるものではない。例えば、以下の微生物を好適な例として挙げることができる。
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J-1(特公平06-55148号)
クレブシエラ・エスピー(Klebsiella sp.)MCI2609(特開平05-30982号)
エアロモナス・エスピー(Aeromonas sp.)MCI2614(特開平05-30983号)
シトロバクター・フロンディ(Citrobacter freundii)MCI2615(特開平05-30984号)
アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)IAM13570及びアグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) (特開平05-103681号)
キサントバクター・フラブス(Xanthobacter flavas)JCM1204(特開平05-161495号)
エルウィニア・ニグリフルエンス(Erwinia nigrifluens)MAFF03-01435
エンテロバクター・エスピー(Enterobacter sp.)MCI2707(特開平05-236975号)
ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.)MCI2691(特開平05-236976号)
リゾビウム・エスピー(Rhizobium sp.)MCI2610、リゾビウム・エスピー MCI2643、リゾビウム・ロティ(Rhizobium loti)IAM13588、リゾビウム・レグミノサーラム(Rhizobium legminosarum)IAM12609及びリゾビウム・メリオティ(Rhizobium merioti)IAM12611(特開平05-236977号)
キャンディダ・グイリエモンディ(Candida guilliermondii)NH-2、パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)NH-3及びクレブシエラ・ニュウモニアエ・サブスピーシスニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae)NH-26T2(特開平05- 15384号)
アグロバクテリウム・ラジオバクター(Agrobacterium radiobacter)SC-C15-1(特開平06-14786号)
バチルス・スミシー(Bacillus smithii) SC-J05-1(特開平07-25494号)
シュードノカルディア・サーモフィラ(Pseudonocardia thermophila)ATCC19285(特開平08-56684号)
シュードノカルディア・サーモフィラ(Pseudonocardia thermophila)JCM3095(特開平09-275978号)
上記菌体からのH-NHase遺伝子のクローニングは、公知の任意の手法により得ることができる(Sabrook J., Molecular Cloning, CSHL Press (2001), Methods in Enzymology 194 (1991))。H-NHaseのアミノ酸配列を配列番号8(β-サブユニット)及び配列番号10(α-サブユニット)に、H-NHaseをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号7(β-サブユニット)及び配列番号9(α-サブユニット)に示す。
(b) H-NHase遺伝子の塩基配列(配列番号7又は9)のうち1個又は数個(例えば1個〜10個程度、好ましくは1個〜5個程度)の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子であってNHase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(c) H-NHase遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、NHase活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイズさせた後の洗浄条件を意味し、例えば、塩(ナトリウム)濃度が150〜900mMであり、温度が55〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mMであり、温度が60〜70℃での条件をいう。また、「NHase活性」とは、ニトリルを水和してアミドを生成する反応を触媒する活性を意味する(下記式I)。
(3) 異種構造遺伝子
本発明においては、上記H-NHase遺伝子のみならず異種遺伝子を組み込んで、当該異種遺伝子を発現させることもできる。異種遺伝子はその種類に限定されるものではなく、任意に選択される。
目的遺伝子を発現させるため、目的遺伝子を含む本発明のDNA構築物を宿主に導入する。宿主に導入するためのベクターDNAは、宿主細胞に保持され、当該宿主菌体内において自立複製に関与するものであれば特に限定されるものではない。但し、インテグレーションベクターの場合、当該宿主菌体内において自立複製に関与しないベクターを使用することもできる。
ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)
ストレプトマイセス・アキヨシエンシス(Streptomyces akiyoshiensis)
ストレプトマイセス・アズレウス(Streptomyces azureus)
ストレプトマイセス・ハワイエンシス(Streptomyces hawaiiensis)
ストレプトマイセス・テンダエ(Streptomyces tendae)
ストレプトマイセス・バージニア(Streptomyces virginia)
ストレプトマイセス・アマクサエンシス(Streptomyces amakusaensis)
ストレプトマイセス・アンチビオティカス(Streptomyces antibioticus)
ストレプトマイセス・チバエンシス(Streptomyces chibaensis)
ストレプトマイセス・アルバス(Streptomyces albus)
ストレプトマイセス・リンコエンシス(Streptomyces lincolnensis)
ストレプトマイセス・カナマイセティカス(Streptomyces kanamyceticus)
ストレプトマイセス・カスガエンシス(Streptomyces kasugaensis)
ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)
ストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)
ストレプトマイセス・エバミチリス(Streptomyces avermitilis)
ロドコッカス属でもストレプトマイセス属でもない放線菌としては、例えば以下のものが挙げられる。
本発明において「放線菌」とは、1997年にStackebrandtらが16SrDNAの類縁性に基づいて創設したclass Actinobacteria(classは綱)の中のorderActinomycetales(orderは目)で定義されるものであり、10の亜目、35の科、約110の属、約1000の種を擁する(例えば以下の非特許文献参照)。非特許文献:日本放線菌学会編,「放線菌の分類と同定(Identification Manual of Actinomycetes)」,(日本),財団法人 日本学会事務センター刊,2001年2月,p.4-8
上記ストレプトマイセス属に属する放線菌やその他の放線菌は、IFOカタログ、ATCCカタログ、JCMカタログ等に掲載されており、当業者は容易に入手することができる。
3.遺伝子発現産物の生産
本発明において、H-NHase遺伝子若しくは異種遺伝子又はこれらの変異体の発現産物は、導入された目的遺伝子又はその変異型遺伝子を含む宿主(形質転換体)を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。上記NHaseなどの発現産物は、上記培養物中に蓄積される。
pWHM3-JH10は、pHJK19をXba I で制限酵素処理し、その後EcoR Iの部分消化によってニトリルヒドラターゼ遺伝子クラスター(6.5 kb)を切り出した。この断片をE.coli-Streptomyces Shuttle vectorである pWHM3(図2)のXba I-EcoR Iサイトへの挿入によって作製した。
プロトプラスト化したS. lividans TK24菌体50μlにプラスミド10μlを混合させた後、25% PEG-Pバッファーを200μl添加した。その後、軽く撹拌し、全量を再生培地(R3培地)に塗布した。28℃で16時間培養後、20γのチオストレプトン1 mlを重層し選択圧をかけた。なお、S. lividans TK24菌体は、JOHN INNES CENTRE(URL: http://www.jic.bbsrc.ac.uk/corporate/Home/index.htm)より一般的に入手することが可能である。
500 mlのバッフル付き三角フラスコ中のYEME培地(下記組成)100 mlに、CoCl2(最終濃度0.001%)、MgCl2・6H2O(最終濃度5 mM)、グリシン(0.5%)を添加した。この培地に20γチオストレプトンを添加したYMPD(下記組成)プレートで培養した形質転換体を1cm画植菌した。135rpmのロータリーシェーカーにて、28℃、120時間培養を行った。
実施例3において培養された培養液を4℃、6,000 rpmで遠心して培養菌体を集菌後、100 mM KPB 3 mlで懸濁した。その後、超音波破砕によって菌体破砕を行った。破砕液を4℃、15,000 rpmでで遠心後、上清を分画し無細胞抽出液とした。タンパク質濃度を測定し、1レーンあたりタンパク質量20μgを12%SDS-PAGEゲルにアプライし、泳動を行った。
<活性測定>
ベンゾニトリルを基質とした場合、ニトリルヒドラターゼの触媒反応により生成するベンズアミドを指標にしてHPLCによってH-NHaseの活性測定を行った。酵素反応液(2 ml)には100mMのKPB(pH7.5)バッファーで希釈した酵素液(1/50, 1/100, 1/200, 1/400)1mlと12mMのベンゾニトリル1mlが含まれる。酵素反応は25℃、10分で行った。反応終了後、酵素反応液より、200μl分取し、1 M HCl(40μl)で反応を止めた。この反応液をHPLCで解析した。1分間に1μmolのベンズアミドを生成する酵素量を1unitとした。
<N末決定>
サンプルをSDS-PAGEで泳動後、PVDF膜に転写し、プロテインシークエンサーによって解析した。
ロドコッカス属菌体内で誘導的に発現しているH-NHase系は、ストレプトマイセス属菌を宿主とした場合、尿素による誘導の有無に関わらず著量のH-NHaseを発現した。このことから、ストレプトマイセス属菌体内では非誘導時においてもH-NHase遺伝子プロモーターからの転写が起こっていることが示された。そこで、プロモーターの機能発現に必要な最小領域を決定するために、欠失断片を作製し、その活性測定を行った(図4)。
<欠失断片の作製>
pWHM3-JH10は、pHJK19をXba I で制限酵素処理し、その後EcoR Iの部分消化によってニトリルヒドラターゼ遺伝子クラスター(6.5 kb)を切り出した。この断片をE.coli-Streptomyces Shuttle vectorである pWHM3のXba I-EcoR Iサイトへの挿入によって作製した。
発現ベクターは、pUC19をベースにし、PCR増幅した制御因子であるNhhC及びNhhDを挿入し、H-NHaseプロモーター領域及びマルチクローニングサイトを順次挿入し、最後にpIJ101由来のrep、ori及びtsri遺伝子を挿入した(図5)。
BamH I:5'-CCCGGATCCCCATGGCGATCCGCGCCAAC-3'(配列番号14) Tm=68℃
Pro-R:5'-GGGTCTAGACATATGCTCATTCCTTTCATCGGAGC-3'(配列番号15) Tm=62℃
Pro-F:5'-GGGAGATCTGAACGAGAACCGGCCGGTAC-3'(配列番号16) Tm=60℃
MCS-1:5'-GGGACTAGTCATATGAGATCTGGGGAATTCGAGCT -3'(配列番号17) Tm=60℃
MCS-2:5'-GGGCAGCTGATGCATAAGCTTGCATGCCTGCAGGT-3'(配列番号18) Tm=62℃
上記の通り構築した発現ベクターpSJH18は、全長約8.7kbであり、選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子及びチオストレプトン耐性遺伝子が挿入されている(図6)。マルチクローニングサイトはNdeI、BglII、BamHI及びXbaIサイトが利用可能である。
配列番号14:プライマー
配列番号15:プライマー
配列番号16:プライマー
配列番号17:プライマー
配列番号18:プライマー
Claims (11)
- 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなるH-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーター、以下の(d)又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子、以下の(f)又は(g)のタンパク質をコードする遺伝子、及びマルチクローニングサイトを含む、ストレプトマイセス属に属する放線菌により目的遺伝子を発現させるためのベクターであって、下記式:
で示される制限酵素地図を有する前記発現ベクター。
(a) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号2に示す塩基配列のうち1個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、プロモーター活性を有するDNA
(c) 配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNA
(d) 配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(e) 配列番号4に示すアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下の(f)又は(g)のタンパク質の発現を促進するタンパク質
(f) 配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(g) 配列番号6に示すアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性を促進するタンパク質 - 前記(d)又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子が以下の(j)、(k)又は(l)の遺伝子である請求項1に記載の発現ベクター。
(j) 配列番号3に示す塩基配列からなる遺伝子
(k) 配列番号3に示す塩基配列のうち1個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、前記(f)又は(g)のタンパク質の発現を促進するタンパク質をコードする遺伝子
(l) 配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記(f)又は(g)のタンパク質の発現を促進するタンパク質をコードする遺伝子 - 前記(f)又は(g)のタンパク質をコードする遺伝子が以下の(m)、(n)又は(o)の遺伝子である請求項1に記載の発現ベクター。
(m) 配列番号5に示す塩基配列からなる遺伝子
(n) 配列番号5に示す塩基配列のうち1個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、前記H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性を促進するタンパク質をコードする遺伝子
(o) 配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性を促進するタンパク質をコードする遺伝子 - 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなるH-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーター、以下の(d)又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子、以下の(f)又は(g)のタンパク質をコードする遺伝子、及び以下の(h)又は(i)のニトリルヒドラターゼタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターをストレプトマイセス属に属する放線菌に導入してなる形質転換体。
(a) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号2に示す塩基配列のうち1個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、プロモーター活性を有するDNA
(c) 配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNA
(d) 配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(e) 配列番号4に示すアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下の(f)又は(g)のタンパク質の発現を促進するタンパク質
(f) 配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(g) 配列番号6に示すアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性を促進するタンパク質
(h) 配列番号8及び10に示すアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼタンパク質
(i) 配列番号8及び10に示すアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、H-ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質 - 前記(d)又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子が以下の(j)、(k)又は(l)の遺伝子である請求項4に記載の形質転換体。
(j) 配列番号3に示す塩基配列からなる遺伝子
(k) 配列番号3に示す塩基配列のうち1個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、前記(f)又は(g)のタンパク質の発現を促進するタンパク質をコードする遺伝子
(l) 配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記(f)又は(g)のタンパク質の発現を促進するタンパク質をコードする遺伝子 - 前記(f)又は(g)のタンパク質をコードする遺伝子が以下の(m)、(n)又は(o)の遺伝子である請求項4に記載の形質転換体。
(m) 配列番号5に示す塩基配列からなる遺伝子
(n) 配列番号5に示す塩基配列のうち1個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、前記H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性を促進するタンパク質をコードする遺伝子
(o) 配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性を促進するタンパク質をコードする遺伝子 - ニトリルヒドラターゼタンパク質をコードする遺伝子が以下の(p)、(q)又は(r)の遺伝子である請求項4に記載の形質転換体。
(p) 配列番号7及び9に示す塩基配列からなる遺伝子
(q) 配列番号7及び9に示す塩基配列のうち1個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
(r) 配列番号7及び9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の発現ベクターに目的遺伝子が導入されたDNA構築物を、ストレプトマイセス属に属する放線菌に導入することを特徴とする、目的遺伝子の発現方法。
- 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなるH-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーター、以下の(d)又は(e)のタンパク質をコードする遺伝子、以下の(f)又は(g)のタンパク質をコードする遺伝子、及び以下の(h)又は(i)のニトリルヒドラターゼタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターをストレプトマイセス属に属する放線菌に導入することを特徴とする、H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子の発現方法。
(a) 配列番号2に示す塩基配列からなるDNA
(b) 配列番号2に示す塩基配列のうち1個若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、プロモーター活性を有するDNA
(c) 配列番号2に示す塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロモーター活性を有するDNA
(d) 配列番号4に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(e) 配列番号4に示すアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下の(f)又は(g)のタンパク質の発現を促進するタンパク質
(f) 配列番号6に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(g) 配列番号6に示すアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記H-ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性を促進するタンパク質
(h) 配列番号8及び10に示すアミノ酸配列からなるニトリルヒドラターゼタンパク質
(i) 配列番号8及び10に示すアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、H-ニトリルヒドラターゼ活性を有するタンパク質 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の発現ベクターに目的遺伝子が導入されたDNA構築物をストレプトマイセス属に属する放線菌に導入してなる形質転換体を培養し、得られる培養物から目的遺伝子の発現産物を採取することを特徴とする目的遺伝子産物の生産方法。
- 請求項4〜7のいずれか1項に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からH-ニトリルヒドラターゼを採取することを特徴とするH-ニトリルヒドラターゼの生産方法。
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