JPH0614781A - 酢酸資化性遺伝子 - Google Patents
酢酸資化性遺伝子Info
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- JPH0614781A JPH0614781A JP3212410A JP21241091A JPH0614781A JP H0614781 A JPH0614781 A JP H0614781A JP 3212410 A JP3212410 A JP 3212410A JP 21241091 A JP21241091 A JP 21241091A JP H0614781 A JPH0614781 A JP H0614781A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 酢酸資化に関与する遺伝子（アセテートＰ）
の単離及び構造解析を目的とする。 【構成】 大腸菌の染色体を用いて作成した遺伝子ライ
ブラリーより、ショットガンクローニングで酢酸資化に
関与する遺伝子（aceP）を単離した。この遺伝子を多コ
ピー型のベクターを用いて導入した大腸菌は、酢酸添加
したＬ培地において、宿主より良好な生育を示した。
の単離及び構造解析を目的とする。 【構成】 大腸菌の染色体を用いて作成した遺伝子ライ
ブラリーより、ショットガンクローニングで酢酸資化に
関与する遺伝子（aceP）を単離した。この遺伝子を多コ
ピー型のベクターを用いて導入した大腸菌は、酢酸添加
したＬ培地において、宿主より良好な生育を示した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は大腸菌 (Escherichia co
li) の酢酸資化性遺伝子に関する。
li) の酢酸資化性遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌の液体培養を行う際に培地中にグ
ルコースを加えておくと、これを資化することにより生
じる酢酸が菌体外に放出され、培養時間及び菌の生育と
共に培地の pH が低下することがよく知られている。 p
H の低下は菌の生育を抑制し、発酵によるアミノ酸等の
物質生産を行う上で大きな問題となっている。このため
菌の改良によりこの問題の解決を図る試みがいくつかの
グループによりなされてきた。バウアーらは、ホスホト
ランスアセチラーゼの変異株を用いることにより、酢酸
の合成経路に欠損を持つ株を IL-2 の発酵生産に利用し
た。この株では培地中に酢酸の蓄積がみられず、菌の生
育も阻害されなかった （Keith A. B. etal.,Appl. Env
iron. Microbiol. 56:1296,1990）。また、松山らは大
腸菌の酢酸合成経路に関与する、アセテート・キナーゼ
をコードする遺伝子（ackA）の単離を行った（Asahi M.
et sl.,J.Bacteriol. 171:577, 1989）。
ルコースを加えておくと、これを資化することにより生
じる酢酸が菌体外に放出され、培養時間及び菌の生育と
共に培地の pH が低下することがよく知られている。 p
H の低下は菌の生育を抑制し、発酵によるアミノ酸等の
物質生産を行う上で大きな問題となっている。このため
菌の改良によりこの問題の解決を図る試みがいくつかの
グループによりなされてきた。バウアーらは、ホスホト
ランスアセチラーゼの変異株を用いることにより、酢酸
の合成経路に欠損を持つ株を IL-2 の発酵生産に利用し
た。この株では培地中に酢酸の蓄積がみられず、菌の生
育も阻害されなかった （Keith A. B. etal.,Appl. Env
iron. Microbiol. 56:1296,1990）。また、松山らは大
腸菌の酢酸合成経路に関与する、アセテート・キナーゼ
をコードする遺伝子（ackA）の単離を行った（Asahi M.
et sl.,J.Bacteriol. 171:577, 1989）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明が解決し
ようとする課題は、発酵による物質生産において培地中
の酢酸の蓄積が原因で起こる菌の生育の阻害の問題を解
決することである。
ようとする課題は、発酵による物質生産において培地中
の酢酸の蓄積が原因で起こる菌の生育の阻害の問題を解
決することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌の酢酸資
化に関与すると思われる遺伝子の存在を突き止め（以
下、この遺伝子がコードするタンパク質をアセテートＰ
（AceP）と称する。）、その単離及び構造解析を行い、
本発明を完成するに至らしめた。即ち本発明は配列表の
配列番号１に示されたアミノ酸配列をコードする酢酸資
化性遺伝子（aceP）に係わる。以下、本発明について詳
細に説明する。
解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌の酢酸資
化に関与すると思われる遺伝子の存在を突き止め（以
下、この遺伝子がコードするタンパク質をアセテートＰ
（AceP）と称する。）、その単離及び構造解析を行い、
本発明を完成するに至らしめた。即ち本発明は配列表の
配列番号１に示されたアミノ酸配列をコードする酢酸資
化性遺伝子（aceP）に係わる。以下、本発明について詳
細に説明する。
【０００５】大腸菌を、グルコースを炭素源として培養
するとき、分解産物として酢酸が生じ、これが菌体外へ
分泌されるため、培養培地の pH 低下を招き、これによ
り菌の生育が阻害されることはよく知られている。そこ
で培地に緩衝液を加え、 pHを一定に保つ操作を行う
と、図１に示す通り大腸菌はグルコース添加培地におい
て、二段階増殖を示す。これは、ラクトースとグルコー
スが添加された培地中で大腸菌が見せる二段階増殖とよ
く類似している。発明者は、この現象はグルコースを消
費し終わった大腸菌が、培地中に分泌された酢酸を次の
炭素源として再び生育を開始することを反映していると
考えた。つまり、大腸菌にはグルコースの枯渇および酢
酸の蓄積とともに発現誘導を受ける酢酸資化関与の遺伝
子（群）が存在すると考えた。このように酢酸によって
誘導を受ける遺伝子産物についてはこれまで報告されて
いない。そこで発明者はこれら遺伝子（群）の解析を行
うことにより、酢酸資化に係わる新たな遺伝子、さらに
は酢酸資化機構についての新しい知見が得られると考
え、これらの遺伝子の単離及び構造決定を行った。
するとき、分解産物として酢酸が生じ、これが菌体外へ
分泌されるため、培養培地の pH 低下を招き、これによ
り菌の生育が阻害されることはよく知られている。そこ
で培地に緩衝液を加え、 pHを一定に保つ操作を行う
と、図１に示す通り大腸菌はグルコース添加培地におい
て、二段階増殖を示す。これは、ラクトースとグルコー
スが添加された培地中で大腸菌が見せる二段階増殖とよ
く類似している。発明者は、この現象はグルコースを消
費し終わった大腸菌が、培地中に分泌された酢酸を次の
炭素源として再び生育を開始することを反映していると
考えた。つまり、大腸菌にはグルコースの枯渇および酢
酸の蓄積とともに発現誘導を受ける酢酸資化関与の遺伝
子（群）が存在すると考えた。このように酢酸によって
誘導を受ける遺伝子産物についてはこれまで報告されて
いない。そこで発明者はこれら遺伝子（群）の解析を行
うことにより、酢酸資化に係わる新たな遺伝子、さらに
は酢酸資化機構についての新しい知見が得られると考
え、これらの遺伝子の単離及び構造決定を行った。
【０００６】これら遺伝子を単離する方法としては、プ
ラスミドベクターをベクターに用いて大腸菌染色体の遺
伝子ライブラリーを作成し、得られた組み換え体ＤＮＡ
混合物を大腸菌に導入した。この形質転換体を、グルコ
ース添加寒天Ｌ培地上に接種した。これを 37 ℃で培養
を行ったところ、大きなコロニーを形成する形質転換
体、すなわち酢酸の蓄積による生育の阻害を受けないコ
ロニーを得ることができた。実際、図２及び図３に示す
通りこの形質転換体（以下、3-69 株と称する）はグル
コース添加培養においても、酢酸の蓄積及びこれに起因
する pH の低下をもたらさず、生育もベクタープラスミ
ドＤＮＡのみで形質転換された株 3-22 株に比べ、良好
であった。更に3-69株の酢酸培地中での生育は、3-22株
に比べ有意に優勢であった。このため、この形質転換体
の保持する組み換え体ＤＮＡには、酢酸資化に関与する
遺伝子（以下、アセテートＰ遺伝子、acePと称する。）
が挿入されているものと推定し、以下のようにこの遺伝
子の単離及び構造決定を行った。
ラスミドベクターをベクターに用いて大腸菌染色体の遺
伝子ライブラリーを作成し、得られた組み換え体ＤＮＡ
混合物を大腸菌に導入した。この形質転換体を、グルコ
ース添加寒天Ｌ培地上に接種した。これを 37 ℃で培養
を行ったところ、大きなコロニーを形成する形質転換
体、すなわち酢酸の蓄積による生育の阻害を受けないコ
ロニーを得ることができた。実際、図２及び図３に示す
通りこの形質転換体（以下、3-69 株と称する）はグル
コース添加培養においても、酢酸の蓄積及びこれに起因
する pH の低下をもたらさず、生育もベクタープラスミ
ドＤＮＡのみで形質転換された株 3-22 株に比べ、良好
であった。更に3-69株の酢酸培地中での生育は、3-22株
に比べ有意に優勢であった。このため、この形質転換体
の保持する組み換え体ＤＮＡには、酢酸資化に関与する
遺伝子（以下、アセテートＰ遺伝子、acePと称する。）
が挿入されているものと推定し、以下のようにこの遺伝
子の単離及び構造決定を行った。
【０００７】最初に、アセテートＰ遺伝子を含有するＤ
ＮＡの調製について述べる。まず、野生型大腸菌例えば
大腸菌 W3110 株を培養して培養物を得る。上記微生物
を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良い
が、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。ま
た、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス、コーンスィープリカーあるいは大豆もしくは小麦
の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第１カリウ
ム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加した
物が用いられる。なお、培地の初発 pH は、7〜8 に調
製するのが適当である。また培養は 30〜42℃、好まし
くは 37 ℃前後で 4〜24 時間、通気攪拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により行う。このようにして得られ
た培養物を、例えば 3,000 r.p.m. 5 分間遠心分離して
大腸菌 W3110 株の菌体を得る。
ＮＡの調製について述べる。まず、野生型大腸菌例えば
大腸菌 W3110 株を培養して培養物を得る。上記微生物
を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良い
が、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。ま
た、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス、コーンスィープリカーあるいは大豆もしくは小麦
の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第１カリウ
ム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加した
物が用いられる。なお、培地の初発 pH は、7〜8 に調
製するのが適当である。また培養は 30〜42℃、好まし
くは 37 ℃前後で 4〜24 時間、通気攪拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により行う。このようにして得られ
た培養物を、例えば 3,000 r.p.m. 5 分間遠心分離して
大腸菌 W3110 株の菌体を得る。
【０００８】この菌体より、例えば斉藤、三浦の方法
（Biochem. Biophys. Acta. 72:619,1963）、K. S. Kir
byの方法（Biochem. J. 64:405, 1956）等の方法により
染色体ＤＮＡを得ることができる。
（Biochem. Biophys. Acta. 72:619,1963）、K. S. Kir
byの方法（Biochem. J. 64:405, 1956）等の方法により
染色体ＤＮＡを得ることができる。
【０００９】ついで、この染色体ＤＮＡに、制限酵素、
例えば Sau3AＩを、温度 30 ℃以上、好ましくは 37
℃、酵素濃度 1〜10 ユニット／mlで様々な時間 1 分〜
2 時間作用させて消化し、部分分解して種々の染色体Ｄ
ＮＡ断片混合物を得る。一方、本発明において用いるこ
とのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラ
スミドベクターＤＮＡが好ましく、具体的には pUC19
等が挙げられる。上記ベクターＤＮＡに、染色体ＤＮＡ
の切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端塩基配列を
生じさせる制限酵素 BamHＩを、温度 30 ℃以上、酵素
濃度 10〜1,000 ユニット／mlで 1 時間以上、好ましく
は 1〜3 時間作用させて完全消化し、切断開裂されたＤ
ＮＡを得る。次いで、上記のようにして得た大腸菌 W31
10 株由来で、アセテートＰ遺伝子を含有するＤＮＡ断
片を含む混合物と、開裂切断されたベクターＤＮＡを混
合し、これにＤＮＡリガーゼ、このましくは T4 ＤＮＡ
リガーゼを、温度 4〜16 ℃、酵素濃度 1〜100 ユニッ
トで 1 時間以上、好ましくは6〜24 時間作用させて組
み換え体ＤＮＡを得る。
例えば Sau3AＩを、温度 30 ℃以上、好ましくは 37
℃、酵素濃度 1〜10 ユニット／mlで様々な時間 1 分〜
2 時間作用させて消化し、部分分解して種々の染色体Ｄ
ＮＡ断片混合物を得る。一方、本発明において用いるこ
とのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラ
スミドベクターＤＮＡが好ましく、具体的には pUC19
等が挙げられる。上記ベクターＤＮＡに、染色体ＤＮＡ
の切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端塩基配列を
生じさせる制限酵素 BamHＩを、温度 30 ℃以上、酵素
濃度 10〜1,000 ユニット／mlで 1 時間以上、好ましく
は 1〜3 時間作用させて完全消化し、切断開裂されたＤ
ＮＡを得る。次いで、上記のようにして得た大腸菌 W31
10 株由来で、アセテートＰ遺伝子を含有するＤＮＡ断
片を含む混合物と、開裂切断されたベクターＤＮＡを混
合し、これにＤＮＡリガーゼ、このましくは T4 ＤＮＡ
リガーゼを、温度 4〜16 ℃、酵素濃度 1〜100 ユニッ
トで 1 時間以上、好ましくは6〜24 時間作用させて組
み換え体ＤＮＡを得る。
【００１０】この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大
腸菌 K-12 株、好ましくは JM103株等を形質転換して菌
株を得る。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Meth
ods in Enzymology 68:326, 1979）により行うことがで
きる。そして、上記菌株よりアセテートＰ遺伝子を含有
するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮ
Ａを保持する大腸菌を、例えば P. Guerry らの方法
（J. Bacteriol.,116:1064, 1973）、D. B. Clewell の
方法（J. Bacteriol., 110:667, 1972）などにより得る
ことができ、またその大腸菌よりアセテートＰ遺伝子を
含有する組み換え体ＤＮＡを回収することができる。
腸菌 K-12 株、好ましくは JM103株等を形質転換して菌
株を得る。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Meth
ods in Enzymology 68:326, 1979）により行うことがで
きる。そして、上記菌株よりアセテートＰ遺伝子を含有
するＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮ
Ａを保持する大腸菌を、例えば P. Guerry らの方法
（J. Bacteriol.,116:1064, 1973）、D. B. Clewell の
方法（J. Bacteriol., 110:667, 1972）などにより得る
ことができ、またその大腸菌よりアセテートＰ遺伝子を
含有する組み換え体ＤＮＡを回収することができる。
【００１１】回収したパッセンジャーＤＮＡを 3'側、
5'側両方向より種々の程度にデリートさせ、短縮体ＤＮ
Ａを作成する。このときの短縮体ＤＮＡの作成には Mu
ng Bean Nuclease,ExonucleaseIII等を利用した手法な
どがある。この短縮体ＤＮＡをベクターにつないで再び
大腸菌を形質転換し、その形質転換体がグルコースを含
むL-Broth 寒天培地上で大きいコロニーを形成する能力
を持つことを指標にして、当該遺伝子の領域の限定化を
行える。
5'側両方向より種々の程度にデリートさせ、短縮体ＤＮ
Ａを作成する。このときの短縮体ＤＮＡの作成には Mu
ng Bean Nuclease,ExonucleaseIII等を利用した手法な
どがある。この短縮体ＤＮＡをベクターにつないで再び
大腸菌を形質転換し、その形質転換体がグルコースを含
むL-Broth 寒天培地上で大きいコロニーを形成する能力
を持つことを指標にして、当該遺伝子の領域の限定化を
行える。
【００１２】上記のようにして遺伝子領域の限定化を行
った短縮体ＤＮＡを含有する組み換え体ＤＮＡを用い
て、実施例の項目（８）に示すような方法によって、ア
セテートＰ遺伝子と考えられる部分の全塩基配列の解析
を行い、ついでこの塩基配列を有する遺伝子によって規
定されるポリペプタイドのアミノ酸配列を推定した（配
列表に示す）。このようにして確定されたアミノ酸配列
をコードする遺伝子が本発明のアセテートＰ遺伝子であ
る。（アセテートＰ遺伝子全領域を持つ最小短縮体ＤＮ
Ａ（以下pACEP-1と称する）を保持する大腸菌Escherich
ia coli AJ12642を通産省微生物技術研究所に寄託し、
寄託番号FERM P-12440を得た。）
った短縮体ＤＮＡを含有する組み換え体ＤＮＡを用い
て、実施例の項目（８）に示すような方法によって、ア
セテートＰ遺伝子と考えられる部分の全塩基配列の解析
を行い、ついでこの塩基配列を有する遺伝子によって規
定されるポリペプタイドのアミノ酸配列を推定した（配
列表に示す）。このようにして確定されたアミノ酸配列
をコードする遺伝子が本発明のアセテートＰ遺伝子であ
る。（アセテートＰ遺伝子全領域を持つ最小短縮体ＤＮ
Ａ（以下pACEP-1と称する）を保持する大腸菌Escherich
ia coli AJ12642を通産省微生物技術研究所に寄託し、
寄託番号FERM P-12440を得た。）
【００１３】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する
説明する
【００１４】（実施例１ 大腸菌 W3110 株の染色体Ｄ
ＮＡの調製）大腸菌 W3110 株を T-Y 培地［1％ Bacto-
trypton(Difco),0.5％ Bacto-yeastextract(Difco), 0.
5％ NaCl :(pH7.2)］100 ml に接種し、温度 37 ℃で 8
時間培養し、培養物を得た。この培養物を 3,000 r.p.
m.で 15 分間、常法により遠心分離処理し湿潤菌体 0.5
g を得た後、該菌体から斉藤、三浦の方法（Biochem. B
iophys. Acta., 72:619, 1963）により染色体ＤＮＡを
得た。次いで、この染色体ＤＮＡ 60μg 及び制限酵素
Sau3AＩ、3ユニットを 10 mM トリス−塩酸緩衝液（50m
M NaCl、10mM MgSO4 及び 1mM ヂチオスレイトール含
有：pH 7.4）におのおの混合し、温度 37 ℃で 30 分間
反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出
処理し、エタノール沈澱処理して Sau3AＩで消化された
大腸菌W3110株の染色体ＤＮＡ断片 50μg を得た。
ＮＡの調製）大腸菌 W3110 株を T-Y 培地［1％ Bacto-
trypton(Difco),0.5％ Bacto-yeastextract(Difco), 0.
5％ NaCl :(pH7.2)］100 ml に接種し、温度 37 ℃で 8
時間培養し、培養物を得た。この培養物を 3,000 r.p.
m.で 15 分間、常法により遠心分離処理し湿潤菌体 0.5
g を得た後、該菌体から斉藤、三浦の方法（Biochem. B
iophys. Acta., 72:619, 1963）により染色体ＤＮＡを
得た。次いで、この染色体ＤＮＡ 60μg 及び制限酵素
Sau3AＩ、3ユニットを 10 mM トリス−塩酸緩衝液（50m
M NaCl、10mM MgSO4 及び 1mM ヂチオスレイトール含
有：pH 7.4）におのおの混合し、温度 37 ℃で 30 分間
反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出
処理し、エタノール沈澱処理して Sau3AＩで消化された
大腸菌W3110株の染色体ＤＮＡ断片 50μg を得た。
【００１５】（実施例２ プラスミドベクターＤＮＡを
利用した大腸菌 W3110 株の遺伝子ライブラリーの作
製）プラスミドベクターＤＮＡ（pUC19）20μg 及び制
限酵素 BamHＩ200 ユニットを 50mM トリス−塩酸緩衝
液（100mM NaCl及び 10mM 硫酸マグネシウム含有：pH7.
4）に混合し、温度 37 ℃で 2 時間反応させて消化液を
得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈
澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ
フラグメントが再結合することを防止するため、Molecu
lar Cloningp133 の方法で Bacterial Alkaline Phosph
atase 処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常
法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処
理を行った。
利用した大腸菌 W3110 株の遺伝子ライブラリーの作
製）プラスミドベクターＤＮＡ（pUC19）20μg 及び制
限酵素 BamHＩ200 ユニットを 50mM トリス−塩酸緩衝
液（100mM NaCl及び 10mM 硫酸マグネシウム含有：pH7.
4）に混合し、温度 37 ℃で 2 時間反応させて消化液を
得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈
澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ
フラグメントが再結合することを防止するため、Molecu
lar Cloningp133 の方法で Bacterial Alkaline Phosph
atase 処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常
法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処
理を行った。
【００１６】このBamHＩで消化された pUC 19 を１μ
g、上記項目（１）で得られた Sau3AＩで消化された大
腸菌 W3110 株の染色体ＤＮＡ断片を１μg、及び 2 ユ
ニットの T4 ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を、66mM 塩化
マグネシウム、10mM ヂチオスレイトール及び 10mM Ａ
ＴＰを含有する 66mM トリス−塩酸緩衝液 (pH 7.5)に
添加し、温度 16 ℃で 16 時間反応し、ＤＮＡを連結さ
せた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法により大腸菌 JM1
03 株を形質転換し、これを100μg/mlのアンピシリンを
含むＬ寒天培地上にまき、約 5,000 個のコロニーを
得、遺伝子ライブラリーとした。
g、上記項目（１）で得られた Sau3AＩで消化された大
腸菌 W3110 株の染色体ＤＮＡ断片を１μg、及び 2 ユ
ニットの T4 ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を、66mM 塩化
マグネシウム、10mM ヂチオスレイトール及び 10mM Ａ
ＴＰを含有する 66mM トリス−塩酸緩衝液 (pH 7.5)に
添加し、温度 16 ℃で 16 時間反応し、ＤＮＡを連結さ
せた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法により大腸菌 JM1
03 株を形質転換し、これを100μg/mlのアンピシリンを
含むＬ寒天培地上にまき、約 5,000 個のコロニーを
得、遺伝子ライブラリーとした。
【００１７】（実施例３ 遺伝子ライブラリー組み換え
体ＤＮＡの回収）上記で述べた約 5,000 個のコロニー
より、組み換え体ＤＮＡの回収を行なった。5,000 個の
コロニーを 100 コロニーずつに分け、50 のバッチとし
た後、ＤＮＡを採取した。回収の方法は上記に示した
P. Guerryらの方法に従った。
体ＤＮＡの回収）上記で述べた約 5,000 個のコロニー
より、組み換え体ＤＮＡの回収を行なった。5,000 個の
コロニーを 100 コロニーずつに分け、50 のバッチとし
た後、ＤＮＡを採取した。回収の方法は上記に示した
P. Guerryらの方法に従った。
【００１８】（実施例４ 大腸菌 JM103 株の形質転
換）50 のバッチに分けた組み換え体ＤＮＡ混合物を上
記に示した形質転換の常法に従い、JM103 株に導入し
た。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上にプレー
トし、37 ℃で静置培養を行なった。この中で他より大
きいコロニーを形成するもの１株を選び、3-69 株と命
名した。この株は、グルコース添加Ｌ液体培地で pH 低
下による生育阻害を受けなかった（図３）。
換）50 のバッチに分けた組み換え体ＤＮＡ混合物を上
記に示した形質転換の常法に従い、JM103 株に導入し
た。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上にプレー
トし、37 ℃で静置培養を行なった。この中で他より大
きいコロニーを形成するもの１株を選び、3-69 株と命
名した。この株は、グルコース添加Ｌ液体培地で pH 低
下による生育阻害を受けなかった（図３）。
【００１９】（実施例５ アセテートＰ遺伝子を多コピ
ーで保持する株の酢酸資化能の検定） 本発明で取得し
たアセテートＰ遺伝子が酢酸資化に関与するタンパク質
をコードしていることを確かめるため、ＬＢ＋グルコー
ス培地上で、3-69株（acePを多コピーで保持する株）
と、3-22株（pUC19を保持する株）のグルコース消費及
び酢酸の蓄積を調べた。結果は図２に示す通りである。
3-22株は野生株と同様にグルコースの消費にともない酢
酸を蓄積するが、3-69株はグルコースが枯渇した後に炭
素源として酢酸を消費していることがわかる。この結果
より、acePを多コピーで保持させることが大腸菌の酢酸
資化能を高めることが確認された。
ーで保持する株の酢酸資化能の検定） 本発明で取得し
たアセテートＰ遺伝子が酢酸資化に関与するタンパク質
をコードしていることを確かめるため、ＬＢ＋グルコー
ス培地上で、3-69株（acePを多コピーで保持する株）
と、3-22株（pUC19を保持する株）のグルコース消費及
び酢酸の蓄積を調べた。結果は図２に示す通りである。
3-22株は野生株と同様にグルコースの消費にともない酢
酸を蓄積するが、3-69株はグルコースが枯渇した後に炭
素源として酢酸を消費していることがわかる。この結果
より、acePを多コピーで保持させることが大腸菌の酢酸
資化能を高めることが確認された。
【００２０】（実施例６ 短縮体ＤＮＡの作製）3-69
株より組み換え体ＤＮＡを回収し、遺伝子領域の限定化
および塩基配列の決定を行うため短縮体ＤＮＡの作製を
行った。作製には宝酒造製のデリーションキットを用
い、使用方法は供給者のものに従った。この短縮体ＤＮ
Ａで再び大腸菌株を形質転換し、その形質転換体がグル
コースを含むＬ寒天培地上で大きいコロニーを形成する
能力を持つことを指標にして、遺伝子の領域の限定化を
行った。最終的には遺伝子の必要領域を約 1600bp に限
定できた。この領域を含む最小ＤＮＡ断片（1.9 kb）が
pUC19 に挿入されたものを pACEP-1 と命名した。限定
領域内の各種ＤＮＡ短縮体を塩基配列の決定に供した。
株より組み換え体ＤＮＡを回収し、遺伝子領域の限定化
および塩基配列の決定を行うため短縮体ＤＮＡの作製を
行った。作製には宝酒造製のデリーションキットを用
い、使用方法は供給者のものに従った。この短縮体ＤＮ
Ａで再び大腸菌株を形質転換し、その形質転換体がグル
コースを含むＬ寒天培地上で大きいコロニーを形成する
能力を持つことを指標にして、遺伝子の領域の限定化を
行った。最終的には遺伝子の必要領域を約 1600bp に限
定できた。この領域を含む最小ＤＮＡ断片（1.9 kb）が
pUC19 に挿入されたものを pACEP-1 と命名した。限定
領域内の各種ＤＮＡ短縮体を塩基配列の決定に供した。
【００２１】（実施例７ 各種短縮体ＤＮＡの調製）上
記で得られた各種短縮体ＤＮＡを含有する大腸菌JM103
株を、トリプトン 1%、酵母エキス 0.5 % 及び NaC l0.
5 % からなる培地 1ｌに、該培地を用い、温度 37 ℃で
24 時間前培養して得られた培養液 20 ml を接種し、
温度 37 ℃で3 時間培養したのち、0.2g のクロラムフ
ェニコールを添加し、更に同一温度で20 時間培養を行
い、培養液を得た。次いで、この培養液を、常法により
3,000r.p.m.で 10 分間遠心処理して湿潤菌体各 2 g
を得、これを 20 ml の 25 % ショ糖を含有する 350 mM
トリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)に懸濁したのち、更にこ
れにリゾチーム（シグマ社製）10 mg、0.25 M EDTA 溶
液(pH8.0) 8 ml 及び 20 %ドデシル硫酸ナトリウム溶液
8 ml を各々添加し、温度 60℃ で 30分間保温して溶
菌し、溶菌液を得た。この溶菌液に、5M NaCl 溶液 13m
l を添加し、温度 4℃で 16 時間処理した物を常法によ
り、 15,000 r.p.m.で 30 分間遠心分離した。上清液
を、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱
処理を行いＤＮＡを沈澱させた。
記で得られた各種短縮体ＤＮＡを含有する大腸菌JM103
株を、トリプトン 1%、酵母エキス 0.5 % 及び NaC l0.
5 % からなる培地 1ｌに、該培地を用い、温度 37 ℃で
24 時間前培養して得られた培養液 20 ml を接種し、
温度 37 ℃で3 時間培養したのち、0.2g のクロラムフ
ェニコールを添加し、更に同一温度で20 時間培養を行
い、培養液を得た。次いで、この培養液を、常法により
3,000r.p.m.で 10 分間遠心処理して湿潤菌体各 2 g
を得、これを 20 ml の 25 % ショ糖を含有する 350 mM
トリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)に懸濁したのち、更にこ
れにリゾチーム（シグマ社製）10 mg、0.25 M EDTA 溶
液(pH8.0) 8 ml 及び 20 %ドデシル硫酸ナトリウム溶液
8 ml を各々添加し、温度 60℃ で 30分間保温して溶
菌し、溶菌液を得た。この溶菌液に、5M NaCl 溶液 13m
l を添加し、温度 4℃で 16 時間処理した物を常法によ
り、 15,000 r.p.m.で 30 分間遠心分離した。上清液
を、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱
処理を行いＤＮＡを沈澱させた。
【００２２】この沈澱物の減圧乾燥処理したものを、1m
M EDTA を含有する 10 mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
6 ml に溶解し、さらにこれに塩化セシウム 6 g 及びエ
チジウムブロマイド（19 mg/ml）0.2 ml を添加した物
を、常法により 39,000 r.p.m.で 42 時間超遠心分離機
を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、各種短縮体
ＤＮＡを単離し、又更に、ｎ−ブタノールを使用してエ
チジウムブロマイドを除去した後、1 mM EDTA を含有す
る 10 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 7.5）に対して透析
を行い純化された組み換え体プラスミド各々約 500μg
を得た。
M EDTA を含有する 10 mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
6 ml に溶解し、さらにこれに塩化セシウム 6 g 及びエ
チジウムブロマイド（19 mg/ml）0.2 ml を添加した物
を、常法により 39,000 r.p.m.で 42 時間超遠心分離機
を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、各種短縮体
ＤＮＡを単離し、又更に、ｎ−ブタノールを使用してエ
チジウムブロマイドを除去した後、1 mM EDTA を含有す
る 10 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 7.5）に対して透析
を行い純化された組み換え体プラスミド各々約 500μg
を得た。
【００２３】（実施例８ アセテートＰ遺伝子を含有す
るＤＮＡの塩基配列の解析）項目（７）で得られた各種
短縮体ＤＮＡをアルカリ変性させ一本鎖ＤＮＡを調製し
た。
るＤＮＡの塩基配列の解析）項目（７）で得られた各種
短縮体ＤＮＡをアルカリ変性させ一本鎖ＤＮＡを調製し
た。
【００２４】得られた一本鎖ＤＮＡによるシークエンシ
ングは、M-13 シークエンスキット（宝酒造製）を用い
Sanger の方法にしたがって行った。得られたアセテー
トＰ遺伝子の塩基配列は配列表に示す通りである。塩基
配列より推定される、この遺伝子の産物のアミノ酸配列
も配列表に示した。遺伝子産物についてハイドロパシー
プロットを調べたところ、図４に示す通り、この遺伝子
産物は膜通過ドメイン様の構造を持つ。そこでこの遺伝
子のコードするポリペプチドは膜内在性のタンパク質で
あると考え、これをアセテートＰと命名し、遺伝子は a
ceP と命名した。
ングは、M-13 シークエンスキット（宝酒造製）を用い
Sanger の方法にしたがって行った。得られたアセテー
トＰ遺伝子の塩基配列は配列表に示す通りである。塩基
配列より推定される、この遺伝子の産物のアミノ酸配列
も配列表に示した。遺伝子産物についてハイドロパシー
プロットを調べたところ、図４に示す通り、この遺伝子
産物は膜通過ドメイン様の構造を持つ。そこでこの遺伝
子のコードするポリペプチドは膜内在性のタンパク質で
あると考え、これをアセテートＰと命名し、遺伝子は a
ceP と命名した。
【００２５】
【発明の効果】以上のように本発明は、大腸菌の酢酸資
化性遺伝子（アセテートＰ遺伝子）に関するものであ
る。この遺伝子を多コピーで大腸菌に導入することによ
り、その大腸菌は酢酸資化能の上昇が観察される。これ
により、本発明は、大腸菌を用いて発酵を行う際問題と
なる、pH の低下による菌の生育の阻害を解決するもの
である。
化性遺伝子（アセテートＰ遺伝子）に関するものであ
る。この遺伝子を多コピーで大腸菌に導入することによ
り、その大腸菌は酢酸資化能の上昇が観察される。これ
により、本発明は、大腸菌を用いて発酵を行う際問題と
なる、pH の低下による菌の生育の阻害を解決するもの
である。
【図１】 図１は、大腸菌 JM103 株をグルコース添加
Ｌ培地で培養したときの生育曲線を示したものである。
なお培地は、リン酸ナトリウム緩衝液により pH 7.2 に
保たれている。グルコースを添加した培地においての
み、二段階増殖が観察される。
Ｌ培地で培養したときの生育曲線を示したものである。
なお培地は、リン酸ナトリウム緩衝液により pH 7.2 に
保たれている。グルコースを添加した培地においての
み、二段階増殖が観察される。
【図２】 図２は、ショットガンクローニングで得た 3
-69 株の酢酸資化能を、ベクターのみを保持する 3-22
株のものと比較したものである。培地には各々グルコー
ス添加Ｌ培地を用いた。3-69株、3-22株おのおのについ
て、培地中のグルコースの濃度と酢酸の濃度を経時的に
測定し、結果をグラフに示した。
-69 株の酢酸資化能を、ベクターのみを保持する 3-22
株のものと比較したものである。培地には各々グルコー
ス添加Ｌ培地を用いた。3-69株、3-22株おのおのについ
て、培地中のグルコースの濃度と酢酸の濃度を経時的に
測定し、結果をグラフに示した。
【図３】 図３は、ショットガンクローニングで得た 3
-69 株の生育を、ベクターのみを保持する 3-22 株のも
のと比較したものである。培地には各々グルコース添加
Ｌ培地と、グルコース無添加Ｌ培地とを用いた。又、グ
ラフには生育曲線と同時に、培地の pH の変化も経時的
に示した。
-69 株の生育を、ベクターのみを保持する 3-22 株のも
のと比較したものである。培地には各々グルコース添加
Ｌ培地と、グルコース無添加Ｌ培地とを用いた。又、グ
ラフには生育曲線と同時に、培地の pH の変化も経時的
に示した。
【図４】 図４は、本該発明であるアセテートＰ遺伝子
がコードする翻訳産物のハイドロパシープロットを示し
たものである。
がコードする翻訳産物のハイドロパシープロットを示し
たものである。
配列の長さ：1632bp 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：GenomicDNA 配列の特徴 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：216-1436 GTGGTTGGTC TGGCCGAAAC ATCATGAACA AAGTCCGGCT GCGGTAACTT TCGTATTCAT 60 CTGCTGAATG CTCTCAGGTG AGGGAAATTT CAACGAAAAA GCCCGAAAAA TGTGCTGTTA 120 ATCACATGCC TAAGTAAAAA TTTGACGACA CGTATTGAAG TGCTTCACCA TAGCCTACAG 180 ATTATTTCGG AGCGCGAAAA TATAGGGAGT ATGCG GTG GTT GCT GAA AAC CAG 233 Met Val Ala Glu Asn Gln 5 CCT GGG CAC ATT GAT CAA ATA AAG CAG ACC AAC GCG GGC GCG GTT TAT 281 Pro Gly His Ile Asp Gln Ile Lys Gln Thr Asn Ala Gly Ala Val Tyr 10 15 20 CGC CTG ATT GAT CAG CTT GGT CCA GTC TCG CGT ATC GAT CTT TCC CGT 329 Arg Leu Ile Asp Gln Leu Gly Pro Val Ser Arg Ile Asp Leu Ser Arg 25 30 35 CTG GCG CAA CTG GCT CCT GCC AGT ATC ACT AAA ATT GTC CGT GAG ATG 377 Leu Ala Gln Leu Ala Pro Ala Ser Ile Thr Lys Ile Val Arg Glu Met 40 45 50 CTC GAA GCA CAC CTG GTG CAA GAG CTG GAA ATC AAA GAA GCG GGG AAC 425 Leu Glu Ala His Leu Val Gln Glu Leu Glu Ile Lys Glu Ala Gly Asn 55 60 65 70 CGT GGC CGT CCG GCG GTG GGG CTG GTG GTT GAA ACT GAA GCC TGG CAC 473 Arg Gly Arg Pro Ala Val Gly Leu Val Val Glu Thr Glu Ala Trp His 75 80 85 TAT CTT TCT CTG CGC ATT AGT CGC GGG GAG ATT TTC CTT GCT CTG CGC 521 Tyr Leu Ser Leu Arg Ile Ser Arg Gly Glu Ile Phe Leu Ala Leu Arg 90 95 100 GAT CTG AGC AGC AAA CTG GTG GTG GAA GAG TCG CAG GAA CTG GCG TTA 569 Asp Leu Ser Ser Lys Leu Val Val Glu Glu Ser Gln Glu Leu Ala Leu 105 110 115 AAA GAT GAC TTG CCA TTG CTG GAT CGT ATT ATT TCC CAT ATC GAT CAG 617 Lys Asp Asp Leu Pro Leu Leu Asp Arg Ile Ile Ser His Ile Asp Gln 120 125 130 TTT TTT ATC CGC CAC CAG AAA AAA CTT GAG CGT CTA ACT TCG ATT GCC 665 Phe Phe Ile Arg His Gln Lys Lys Leu Glu Arg Leu Thr Ser Ile Ala 135 140 145 150 ATA ACC TTG CCG GGA ATT ATT GAT ACG GAA AAT GGT ATT GTA CAT CGC 713 Ile Thr Leu Pro Gly Ile Ile Asp Thr Glu Asn Gly Ile Val His Arg 155 160 165 ATG CCG TTC TAC GAG GAT GTA AAA GAG ATG CCG CTC GCG GAG GCG CTG 761 Met Pro Phe Tyr Glu Asp Val Lys Glu Met Pro Leu Ala Glu Ala Leu 170 175 180 GAG CAG CAT ACC GGC GTT CCG GTT TAT ATT CAG CAT GAT ATC AGC GCA 809 Glu Gln His Thr Gly Val Pro Val Tyr Ile Gln His Asp Ile Ser Ala 185 190 195 TGG ACG ATG GCA GAG GCC TTG TTT GGT GCC TCA CGC GGG GCG CGC GAT 857 Trp Thr Met Ala Glu Ala Leu Phe Gly Ala Ser Arg Gly Ala Arg Asp 200 205 210 GTG ATT CAG GTG GTT ATC GAT CAC AAC GTG GGG GCG GGC GTC ATT ACC 905 Val Ile Gln Val Val Ile Asp His Asn Val Gly Ala Gly Val Ile Thr 215 220 225 230 GAT GGT CAT CTG CTA CAC GCA GGC AGC AGT AGT CTC GTG GAA ATA GGC 953 Asp Gly His Leu Leu His Ala Gly Ser Ser Ser Leu Val Glu Ile Gly 235 240 245 CAC ACA CAG GTC GAC CCG TAT GGG AAA CGC TGT TAT TGC GGG AAT CAC 1001 His Thr Gln Val Asp Pro Tyr Gly Lys Arg Cys Tyr Cys Gly Asn His 250 255 260 GGC TGC CTC GAA ACC ATC GCC AGC GTG GAC AGT ATT CTT GAG CTG GCA 1049 Gly Cys Leu Glu Thr Ile Ala Ser Val Asp Ser Ile Leu Glu Leu Ala 265 270 275 CAG CTG CGT CTT AAT CAA TCC ATG AGC TCG ATG TTA CAT GGA CAA CCG 1097 Gln Leu Arg Leu Asn Gln Ser Met Ser Ser Met Leu His Gly Gln Pro 280 285 290 TTA ACC GTG GAC TCA TTG TGT CAG GCG GCA TTG CGC GGC GAT CTA CTG 1145 Leu Thr Val Asp Ser Leu Cys Gln Ala Ala Leu Arg Gly Asp Leu Leu 295 300 305 310 GCA AAA GAC ATC ATT ACC GGG GTG GGC GCG CAT GTC GGG CGC ATT CTT 1193 Ala Lys Asp Ile Ile Thr Gly Val Gly Ala His Val Gly Arg Ile Leu 315 320 325 GCC ATC ATG GTG AAT TTA TTT AAC CCA CAA AAA ATA CTG ATT GGC TCA 1241 Ala Ile Met Val Asn Leu Phe Asn Pro Gln Lys Ile Leu Ile Gly Ser 330 335 340 CCG TTA AGT AAA GCG GCA GAT ATC CTC TTC CCG GTC ATC TCA GAC AGC 1289 Pro Leu Ser Lys Ala Ala Asp Ile Leu Phe Pro Val Ile Ser Asp Ser 345 350 355 ATC CGT CAG CAG GCC CTT CCT GCG TAT AGT CAG CAC ATC AGC GTT GAG 1337 Ile Arg Gln Gln Ala Leu Pro Ala Tyr Ser Gln His Ile Ser Val Glu 360 365 370 AGT ACT CAG TTT TCT AAC CAG GGC ACG ATG GCA GGC GCT GCA CTG GTA 1385 Ser Thr Gln Phe Ser Asn Gln Gly Thr Met Ala Gly Ala Ala Leu Val 375 380 385 390 AAA GAC GCG ATG TAT AAC GGT TCT TTG TTG ATT CGT CTG TTG CAG GGT 1433 Lys Asp Ala Met Tyr Asn Gly Ser Leu Leu Ile Arg Leu Leu Gln Gly 395 400 405 TAA CATT TTTTAACTGT TCTACCAAAA TTTGCGCTAT CTCAATTTGG GCCAGGAAAG 1490 CATAACTTAG ACTTTCAAGG TTAATTATTT TCCTGGTTTA TATTTGTGAA GCATAACGGT 1550 GGAGTTAGTG ATGCTGAANN NTTTCTTTAT TACCGGTACA GTCACTTATG TAGGGAAAAC 1610 GGTGGTTTCC CGCGCCGATT TC 1632
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年３月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大
腸菌 K-12 株、好ましくは JM103株等を形質転換して菌
株を得る。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Meth
ods in Enzymology 68:326, 1979）により行うことがで
きる。そして、この形質転換体を、グルコース添 加寒天
Ｌ培地上に接種した。これを 37 ℃で培養を行 ったとこ
ろ、大きなコロニーを形成する形質転換体、すなわち酢
酸の蓄積による生育の阻 害を受けないコロニーを得るこ
とができた。上記菌株よりアセテートＰ遺伝子を含有す
る ＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡ
を、例えば P. Guerry らの方法（J. Bacteriol.,116:1
064, 1973）、D. B. Clewell の方法（J. Bacteriol.,
110:667, 1972）などにより回収することができる。
腸菌 K-12 株、好ましくは JM103株等を形質転換して菌
株を得る。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Meth
ods in Enzymology 68:326, 1979）により行うことがで
きる。そして、この形質転換体を、グルコース添 加寒天
Ｌ培地上に接種した。これを 37 ℃で培養を行 ったとこ
ろ、大きなコロニーを形成する形質転換体、すなわち酢
酸の蓄積による生育の阻 害を受けないコロニーを得るこ
とができた。上記菌株よりアセテートＰ遺伝子を含有す
る ＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡ
を、例えば P. Guerry らの方法（J. Bacteriol.,116:1
064, 1973）、D. B. Clewell の方法（J. Bacteriol.,
110:667, 1972）などにより回収することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成５年７月２０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は大腸菌 (Escherichia co
li) の酢酸資化性遺伝子に関する。
li) の酢酸資化性遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】大腸菌の液体培養を行う際に培地中にグ
ルコースを加えておくと、これを資化することにより生
じる酢酸が菌体外に放出され、培養時間及び菌の生育と
共に培地の pH が低下することがよく知られている。 p
H の低下は菌の生育を抑制し、発酵によるアミノ酸等の
物質生産を行う上で大きな問題となっている。このため
菌の改良によりこの問題の解決を図る試みがいくつかの
グループによりなされてきた。バウアーらは、ホスホト
ランスアセチラーゼの変異株を用いることにより、酢酸
の合成経路に欠損を持つ株を IL-2 の発酵生産に利用し
た。この株では培地中に酢酸の蓄積がみられず、菌の生
育も阻害されなかった （Keith A. B. etal.,Appl. Env
iron. Microbiol. 56:1296,1990）。また、松山らは大
腸菌の酢酸合成経路に関与する、アセテート・キナーゼ
をコードする遺伝子（ackA）の単離を行った（Asahi M.
et sl.,J.Bacteriol. 171:577, 1989）。
ルコースを加えておくと、これを資化することにより生
じる酢酸が菌体外に放出され、培養時間及び菌の生育と
共に培地の pH が低下することがよく知られている。 p
H の低下は菌の生育を抑制し、発酵によるアミノ酸等の
物質生産を行う上で大きな問題となっている。このため
菌の改良によりこの問題の解決を図る試みがいくつかの
グループによりなされてきた。バウアーらは、ホスホト
ランスアセチラーゼの変異株を用いることにより、酢酸
の合成経路に欠損を持つ株を IL-2 の発酵生産に利用し
た。この株では培地中に酢酸の蓄積がみられず、菌の生
育も阻害されなかった （Keith A. B. etal.,Appl. Env
iron. Microbiol. 56:1296,1990）。また、松山らは大
腸菌の酢酸合成経路に関与する、アセテート・キナーゼ
をコードする遺伝子（ackA）の単離を行った（Asahi M.
et sl.,J.Bacteriol. 171:577, 1989）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明が解決し
ようとする課題は、発酵による物質生産において培地中
の酢酸の蓄積が原因で起こる菌の生育の阻害の問題を解
決することである。
ようとする課題は、発酵による物質生産において培地中
の酢酸の蓄積が原因で起こる菌の生育の阻害の問題を解
決することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌の酢酸資
化に関与すると思われる遺伝子の存在を突き止め（以
下、この遺伝子がコードするタンパク質をアセテートＰ
（AceP）と称する。）、その単離及び構造解析を行い、
本発明を完成するに至らしめた。即ち本発明は配列表の
配列番号１に示されたアミノ酸配列をコードする酢酸資
化性遺伝子（aceP）に係わる。以下、本発明について詳
細に説明する。
解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌の酢酸資
化に関与すると思われる遺伝子の存在を突き止め（以
下、この遺伝子がコードするタンパク質をアセテートＰ
（AceP）と称する。）、その単離及び構造解析を行い、
本発明を完成するに至らしめた。即ち本発明は配列表の
配列番号１に示されたアミノ酸配列をコードする酢酸資
化性遺伝子（aceP）に係わる。以下、本発明について詳
細に説明する。
【０００５】大腸菌を、グルコースを炭素源として培養
するとき、分解産物として酢酸が生じ、これが菌体外へ
分泌されるため、培養培地の pH 低下を招き、これによ
り菌の生育が阻害されることはよく知られている。そこ
で培地に緩衝液を加え、 pHを一定に保つ操作を行う
と、図１に示す通り大腸菌はグルコース添加培地におい
て、二段階増殖を示す。これは、ラクトースとグルコー
スが添加された培地中で大腸菌が見せる二段階増殖とよ
く類似している。発明者は、この現象はグルコースを消
費し終わった大腸菌が、培地中に分泌された酢酸を次の
炭素源として再び生育を開始することを反映していると
考えた。つまり、大腸菌にはグルコースの枯渇および酢
酸の蓄積とともに発現誘導を受ける酢酸資化関与の遺伝
子（群）が存在すると考えた。このように酢酸によって
誘導を受ける遺伝子産物についてはこれまで報告されて
いない。そこで発明者はこれら遺伝子（群）の解析を行
うことにより、酢酸資化に係わる新たな遺伝子、さらに
は酢酸資化機構についての新しい知見が得られると考
え、これらの遺伝子の単離及び構造決定を行った。
するとき、分解産物として酢酸が生じ、これが菌体外へ
分泌されるため、培養培地の pH 低下を招き、これによ
り菌の生育が阻害されることはよく知られている。そこ
で培地に緩衝液を加え、 pHを一定に保つ操作を行う
と、図１に示す通り大腸菌はグルコース添加培地におい
て、二段階増殖を示す。これは、ラクトースとグルコー
スが添加された培地中で大腸菌が見せる二段階増殖とよ
く類似している。発明者は、この現象はグルコースを消
費し終わった大腸菌が、培地中に分泌された酢酸を次の
炭素源として再び生育を開始することを反映していると
考えた。つまり、大腸菌にはグルコースの枯渇および酢
酸の蓄積とともに発現誘導を受ける酢酸資化関与の遺伝
子（群）が存在すると考えた。このように酢酸によって
誘導を受ける遺伝子産物についてはこれまで報告されて
いない。そこで発明者はこれら遺伝子（群）の解析を行
うことにより、酢酸資化に係わる新たな遺伝子、さらに
は酢酸資化機構についての新しい知見が得られると考
え、これらの遺伝子の単離及び構造決定を行った。
【０００６】これら遺伝子を単離する方法としては、プ
ラスミドベクターをベクターに用いて大腸菌染色体の遺
伝子ライブラリーを作成し、得られた組み換え体ＤＮＡ
混合物を大腸菌に導入した。この形質転換体を、グルコ
ース添加寒天Ｌ培地上に接種した。これを 37 ℃で培養
を行ったところ、大きなコロニーを形成する形質転換
体、すなわち酢酸の蓄積による生育の阻害を受けないコ
ロニーを得ることができた。実際、図２及び図３に示す
通りこの形質転換体（以下、3-69 株と称する）はグル
コース添加培養においても、酢酸の蓄積及びこれに起因
する pH の低下をもたらさず、生育もベクタープラスミ
ドＤＮＡのみで形質転換された株 3-22 株に比べ、良好
であった。更に3-69株の酢酸培地中での生育は、3-22株
に比べ有意に優勢であった。このため、この形質転換体
の保持する組み換え体ＤＮＡには、酢酸資化に関与する
遺伝子（以下、アセテートＰ遺伝子、acePと称する。）
が挿入されているものと推定し、以下のようにこの遺伝
子の単離及び構造決定を行った。
ラスミドベクターをベクターに用いて大腸菌染色体の遺
伝子ライブラリーを作成し、得られた組み換え体ＤＮＡ
混合物を大腸菌に導入した。この形質転換体を、グルコ
ース添加寒天Ｌ培地上に接種した。これを 37 ℃で培養
を行ったところ、大きなコロニーを形成する形質転換
体、すなわち酢酸の蓄積による生育の阻害を受けないコ
ロニーを得ることができた。実際、図２及び図３に示す
通りこの形質転換体（以下、3-69 株と称する）はグル
コース添加培養においても、酢酸の蓄積及びこれに起因
する pH の低下をもたらさず、生育もベクタープラスミ
ドＤＮＡのみで形質転換された株 3-22 株に比べ、良好
であった。更に3-69株の酢酸培地中での生育は、3-22株
に比べ有意に優勢であった。このため、この形質転換体
の保持する組み換え体ＤＮＡには、酢酸資化に関与する
遺伝子（以下、アセテートＰ遺伝子、acePと称する。）
が挿入されているものと推定し、以下のようにこの遺伝
子の単離及び構造決定を行った。
【０００７】最初に、アセテートＰ遺伝子を含有するＤ
ＮＡの調製について述べる。まず、野生型大腸菌例えば
大腸菌 W3110 株を培養して培養物を得る。上記微生物
を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良い
が、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。ま
た、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス、コーンスィープリカーあるいは大豆もしくは小麦
の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第１カリウ
ム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加した
物が用いられる。なお、培地の初発 pH は、7〜8 に調
製するのが適当である。また培養は 30〜42℃、好まし
くは 37 ℃前後で 4〜24 時間、通気攪拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により行う。このようにして得られ
た培養物を、例えば 3,000 r.p.m. 5 分間遠心分離して
大腸菌 W3110 株の菌体を得る。
ＮＡの調製について述べる。まず、野生型大腸菌例えば
大腸菌 W3110 株を培養して培養物を得る。上記微生物
を培養するには、通常の固体培養法で培養しても良い
が、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。ま
た、培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス、コーンスィープリカーあるいは大豆もしくは小麦
の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第１カリウ
ム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あ
るいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、
更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加した
物が用いられる。なお、培地の初発 pH は、7〜8 に調
製するのが適当である。また培養は 30〜42℃、好まし
くは 37 ℃前後で 4〜24 時間、通気攪拌深部培養、振
盪培養、静置培養等により行う。このようにして得られ
た培養物を、例えば 3,000 r.p.m. 5 分間遠心分離して
大腸菌 W3110 株の菌体を得る。
【０００８】この菌体より、例えば斉藤、三浦の方法
（Biochem. Biophys. Acta. 72:619,1963）、K. S. Kir
byの方法（Biochem. J. 64:405, 1956）等の方法により
染色体ＤＮＡを得ることができる。
（Biochem. Biophys. Acta. 72:619,1963）、K. S. Kir
byの方法（Biochem. J. 64:405, 1956）等の方法により
染色体ＤＮＡを得ることができる。
【０００９】ついで、この染色体ＤＮＡに、制限酵素、
例えば Sau3AＩを、温度 30 ℃以上、好ましくは 37
℃、酵素濃度 1〜10 ユニット／mlで様々な時間 1 分〜
2 時間作用させて消化し、部分分解して種々の染色体Ｄ
ＮＡ断片混合物を得る。一方、本発明において用いるこ
とのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラ
スミドベクターＤＮＡが好ましく、具体的には pUC19
等が挙げられる。上記ベクターＤＮＡに、染色体ＤＮＡ
の切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端塩基配列を
生じさせる制限酵素 BamHＩを、温度 30 ℃以上、酵素
濃度 10〜1,000 ユニット／mlで 1 時間以上、好ましく
は 1〜3 時間作用させて完全消化し、切断開裂されたＤ
ＮＡを得る。次いで、上記のようにして得た大腸菌 W31
10 株由来で、アセテートＰ遺伝子を含有するＤＮＡ断
片を含む混合物と、開裂切断されたベクターＤＮＡを混
合し、これにＤＮＡリガーゼ、このましくは T4 ＤＮＡ
リガーゼを、温度 4〜16 ℃、酵素濃度 1〜100 ユニッ
トで 1 時間以上、好ましくは6〜24 時間作用させて組
み換え体ＤＮＡを得る。
例えば Sau3AＩを、温度 30 ℃以上、好ましくは 37
℃、酵素濃度 1〜10 ユニット／mlで様々な時間 1 分〜
2 時間作用させて消化し、部分分解して種々の染色体Ｄ
ＮＡ断片混合物を得る。一方、本発明において用いるこ
とのできることのできるベクターＤＮＡとしては、プラ
スミドベクターＤＮＡが好ましく、具体的には pUC19
等が挙げられる。上記ベクターＤＮＡに、染色体ＤＮＡ
の切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端塩基配列を
生じさせる制限酵素 BamHＩを、温度 30 ℃以上、酵素
濃度 10〜1,000 ユニット／mlで 1 時間以上、好ましく
は 1〜3 時間作用させて完全消化し、切断開裂されたＤ
ＮＡを得る。次いで、上記のようにして得た大腸菌 W31
10 株由来で、アセテートＰ遺伝子を含有するＤＮＡ断
片を含む混合物と、開裂切断されたベクターＤＮＡを混
合し、これにＤＮＡリガーゼ、このましくは T4 ＤＮＡ
リガーゼを、温度 4〜16 ℃、酵素濃度 1〜100 ユニッ
トで 1 時間以上、好ましくは6〜24 時間作用させて組
み換え体ＤＮＡを得る。
【００１０】この組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大
腸菌 K-12 株、好ましくは JM103株等を形質転換して菌
株を得る。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Meth
odsin Enzymology 68:326, 1979）により行うことがで
きる。そして、この形質転換体を、グルコース添加寒天
Ｌ培地上に接種した。これを37℃で培養を行ったとこ
ろ、大きなコロニーを形成する形質転換体、すなわち酢
酸の蓄積による生育の阻害を受けないコロニーを得るこ
とができた。上記菌株よりアセテートＰ遺伝子を含有す
るＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡ
を、例えば P. Guerry らの方法（J. Bacteriol.,116:1
064, 1973）、D. B. Clewell の方法（J.Bacteriol., 1
10:667, 1972）などにより回収することができる。
腸菌 K-12 株、好ましくは JM103株等を形質転換して菌
株を得る。この形質転換は D.M.Morrison の方法（Meth
odsin Enzymology 68:326, 1979）により行うことがで
きる。そして、この形質転換体を、グルコース添加寒天
Ｌ培地上に接種した。これを37℃で培養を行ったとこ
ろ、大きなコロニーを形成する形質転換体、すなわち酢
酸の蓄積による生育の阻害を受けないコロニーを得るこ
とができた。上記菌株よりアセテートＰ遺伝子を含有す
るＤＮＡをベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡ
を、例えば P. Guerry らの方法（J. Bacteriol.,116:1
064, 1973）、D. B. Clewell の方法（J.Bacteriol., 1
10:667, 1972）などにより回収することができる。
【００１１】回収したパッセンジャーＤＮＡを 3'側、
5'側両方向より種々の程度にデリートさせ、短縮体ＤＮ
Ａを作成する。このときの短縮体ＤＮＡの作成には Mu
ng Bean Nuclease,ExonucleaseIII等を利用した手法な
どがある。この短縮体ＤＮＡをベクターにつないで再び
大腸菌を形質転換し、その形質転換体がグルコースを含
むL-Broth 寒天培地上で大きいコロニーを形成する能力
を持つことを指標にして、当該遺伝子の領域の限定化を
行える。
5'側両方向より種々の程度にデリートさせ、短縮体ＤＮ
Ａを作成する。このときの短縮体ＤＮＡの作成には Mu
ng Bean Nuclease,ExonucleaseIII等を利用した手法な
どがある。この短縮体ＤＮＡをベクターにつないで再び
大腸菌を形質転換し、その形質転換体がグルコースを含
むL-Broth 寒天培地上で大きいコロニーを形成する能力
を持つことを指標にして、当該遺伝子の領域の限定化を
行える。
【００１２】上記のようにして遺伝子領域の限定化を行
った短縮体ＤＮＡを含有する組み換え体ＤＮＡを用い
て、実施例の項目（８）に示すような方法によって、ア
セテートＰ遺伝子と考えられる部分の全塩基配列の解析
を行い、ついでこの塩基配列を有する遺伝子によって規
定されるポリペプタイドのアミノ酸配列を推定した（配
列表に示す）。このようにして確定されたアミノ酸配列
をコードする遺伝子が本発明のアセテートＰ遺伝子であ
る。（アセテートＰ遺伝子全領域を持つ最小短縮体ＤＮ
Ａ（以下pACEP-1と称する）を保持する大腸菌Escherich
ia coli AJ12642を通産省微生物技術研究所に寄託し、
寄託番号FERM P-12440を得た。）
った短縮体ＤＮＡを含有する組み換え体ＤＮＡを用い
て、実施例の項目（８）に示すような方法によって、ア
セテートＰ遺伝子と考えられる部分の全塩基配列の解析
を行い、ついでこの塩基配列を有する遺伝子によって規
定されるポリペプタイドのアミノ酸配列を推定した（配
列表に示す）。このようにして確定されたアミノ酸配列
をコードする遺伝子が本発明のアセテートＰ遺伝子であ
る。（アセテートＰ遺伝子全領域を持つ最小短縮体ＤＮ
Ａ（以下pACEP-1と称する）を保持する大腸菌Escherich
ia coli AJ12642を通産省微生物技術研究所に寄託し、
寄託番号FERM P-12440を得た。）
【００１３】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する
説明する
【００１４】（実施例１ 大腸菌 W3110 株の染色体Ｄ
ＮＡの調製）大腸菌 W3110 株を T-Y 培地［1％ Bacto-
trypton(Difco),0.5％ Bacto-yeastextract(Difco), 0.
5％ NaCl :(pH7.2)］100 ml に接種し、温度 37 ℃で 8
時間培養し、培養物を得た。この培養物を 3,000 r.p.
m.で 15 分間、常法により遠心分離処理し湿潤菌体 0.5
g を得た後、該菌体から斉藤、三浦の方法（Biochem. B
iophys. Acta., 72:619, 1963）により染色体ＤＮＡを
得た。次いで、この染色体ＤＮＡ 60μg 及び制限酵素
Sau3AＩ、3ユニットを 10 mM トリス−塩酸緩衝液（50m
M NaCl、10mM MgSO4 及び 1mM ヂチオスレイトール含
有：pH 7.4）におのおの混合し、温度 37 ℃で 30 分間
反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出
処理し、エタノール沈澱処理して Sau3AＩで消化された
大腸菌W3110株の染色体ＤＮＡ断片 50μg を得た。
ＮＡの調製）大腸菌 W3110 株を T-Y 培地［1％ Bacto-
trypton(Difco),0.5％ Bacto-yeastextract(Difco), 0.
5％ NaCl :(pH7.2)］100 ml に接種し、温度 37 ℃で 8
時間培養し、培養物を得た。この培養物を 3,000 r.p.
m.で 15 分間、常法により遠心分離処理し湿潤菌体 0.5
g を得た後、該菌体から斉藤、三浦の方法（Biochem. B
iophys. Acta., 72:619, 1963）により染色体ＤＮＡを
得た。次いで、この染色体ＤＮＡ 60μg 及び制限酵素
Sau3AＩ、3ユニットを 10 mM トリス−塩酸緩衝液（50m
M NaCl、10mM MgSO4 及び 1mM ヂチオスレイトール含
有：pH 7.4）におのおの混合し、温度 37 ℃で 30 分間
反応させた。反応終了液を常法により、フェノール抽出
処理し、エタノール沈澱処理して Sau3AＩで消化された
大腸菌W3110株の染色体ＤＮＡ断片 50μg を得た。
【００１５】（実施例２ プラスミドベクターＤＮＡを
利用した大腸菌 W3110 株の遺伝子ライブラリーの作
製）プラスミドベクターＤＮＡ（pUC19）20μg 及び制
限酵素 BamHＩ200 ユニットを 50mM トリス−塩酸緩衝
液（100mM NaCl及び 10mM 硫酸マグネシウム含有：pH7.
4）に混合し、温度 37 ℃で 2 時間反応させて消化液を
得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈
澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ
フラグメントが再結合することを防止するため、Molecu
lar Cloningp133 の方法で Bacterial Alkaline Phosph
atase 処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常
法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処
理を行った。
利用した大腸菌 W3110 株の遺伝子ライブラリーの作
製）プラスミドベクターＤＮＡ（pUC19）20μg 及び制
限酵素 BamHＩ200 ユニットを 50mM トリス−塩酸緩衝
液（100mM NaCl及び 10mM 硫酸マグネシウム含有：pH7.
4）に混合し、温度 37 ℃で 2 時間反応させて消化液を
得、該液を常法によりフェノール抽出及びエタノール沈
澱処理した。この後、プラスミドベクター由来のＤＮＡ
フラグメントが再結合することを防止するため、Molecu
lar Cloningp133 の方法で Bacterial Alkaline Phosph
atase 処理により、ＤＮＡ断片の脱リン酸化を行い、常
法によりフェノール抽出処理し、更にエタノール沈澱処
理を行った。
【００１６】このBamHＩで消化された pUC 19 を１μ
g、上記項目（１）で得られた Sau3AＩで消化された大
腸菌 W3110 株の染色体ＤＮＡ断片を１μg、及び 2 ユ
ニットの T4 ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を、66mM 塩化
マグネシウム、10mM ヂチオスレイトール及び 10mM Ａ
ＴＰを含有する 66mM トリス−塩酸緩衝液 (pH 7.5)に
添加し、温度 16 ℃で 16 時間反応し、ＤＮＡを連結さ
せた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法により大腸菌 JM1
03 株を形質転換し、これを100μg/mlのアンピシリンを
含むＬ寒天培地上にまき、約 5,000 個のコロニーを
得、遺伝子ライブラリーとした。
g、上記項目（１）で得られた Sau3AＩで消化された大
腸菌 W3110 株の染色体ＤＮＡ断片を１μg、及び 2 ユ
ニットの T4 ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を、66mM 塩化
マグネシウム、10mM ヂチオスレイトール及び 10mM Ａ
ＴＰを含有する 66mM トリス−塩酸緩衝液 (pH 7.5)に
添加し、温度 16 ℃で 16 時間反応し、ＤＮＡを連結さ
せた。次いで該ＤＮＡ混合物で、常法により大腸菌 JM1
03 株を形質転換し、これを100μg/mlのアンピシリンを
含むＬ寒天培地上にまき、約 5,000 個のコロニーを
得、遺伝子ライブラリーとした。
【００１７】（実施例３ 遺伝子ライブラリー組み換え
体ＤＮＡの回収）上記で述べた約 5,000 個のコロニー
より、組み換え体ＤＮＡの回収を行なった。5,000 個の
コロニーを 100 コロニーずつに分け、50 のバッチとし
た後、ＤＮＡを採取した。回収の方法は上記に示した
P. Guerryらの方法に従った。
体ＤＮＡの回収）上記で述べた約 5,000 個のコロニー
より、組み換え体ＤＮＡの回収を行なった。5,000 個の
コロニーを 100 コロニーずつに分け、50 のバッチとし
た後、ＤＮＡを採取した。回収の方法は上記に示した
P. Guerryらの方法に従った。
【００１８】（実施例４ 大腸菌 JM103 株の形質転
換）50 のバッチに分けた組み換え体ＤＮＡ混合物を上
記に示した形質転換の常法に従い、JM103 株に導入し
た。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上にプレー
トし、37 ℃で静置培養を行なった。この中で他より大
きいコロニーを形成するもの１株を選び、3-69 株と命
名した。この株は、グルコース添加Ｌ液体培地で pH 低
下による生育阻害を受けなかった（図３）。
換）50 のバッチに分けた組み換え体ＤＮＡ混合物を上
記に示した形質転換の常法に従い、JM103 株に導入し
た。形質転換体をグルコース添加寒天Ｌ培地上にプレー
トし、37 ℃で静置培養を行なった。この中で他より大
きいコロニーを形成するもの１株を選び、3-69 株と命
名した。この株は、グルコース添加Ｌ液体培地で pH 低
下による生育阻害を受けなかった（図３）。
【００１９】（実施例５ アセテートＰ遺伝子を多コピ
ーで保持する株の酢酸資化能の検定） 本発明で取得し
たアセテートＰ遺伝子が酢酸資化に関与するタンパク質
をコードしていることを確かめるため、ＬＢ＋グルコー
ス培地上で、3-69株（acePを多コピーで保持する株）
と、3-22株（pUC19を保持する株）のグルコース消費及
び酢酸の蓄積を調べた。結果は図２に示す通りである。
3-22株は野生株と同様にグルコースの消費にともない酢
酸を蓄積するが、3-69株はグルコースが枯渇した後に炭
素源として酢酸を消費していることがわかる。この結果
より、acePを多コピーで保持させることが大腸菌の酢酸
資化能を高めることが確認された。
ーで保持する株の酢酸資化能の検定） 本発明で取得し
たアセテートＰ遺伝子が酢酸資化に関与するタンパク質
をコードしていることを確かめるため、ＬＢ＋グルコー
ス培地上で、3-69株（acePを多コピーで保持する株）
と、3-22株（pUC19を保持する株）のグルコース消費及
び酢酸の蓄積を調べた。結果は図２に示す通りである。
3-22株は野生株と同様にグルコースの消費にともない酢
酸を蓄積するが、3-69株はグルコースが枯渇した後に炭
素源として酢酸を消費していることがわかる。この結果
より、acePを多コピーで保持させることが大腸菌の酢酸
資化能を高めることが確認された。
【００２０】（実施例６ 短縮体ＤＮＡの作製）3-69
株より組み換え体ＤＮＡを回収し、遺伝子領域の限定化
および塩基配列の決定を行うため短縮体ＤＮＡの作製を
行った。作製には宝酒造製のデリーションキットを用
い、使用方法は供給者のものに従った。この短縮体ＤＮ
Ａで再び大腸菌株を形質転換し、その形質転換体がグル
コースを含むＬ寒天培地上で大きいコロニーを形成する
能力を持つことを指標にして、遺伝子の領域の限定化を
行った。最終的には遺伝子の必要領域を約 1600bp に限
定できた。この領域を含む最小ＤＮＡ断片（1.9 kb）が
pUC19 に挿入されたものを pACEP-1 と命名した。限定
領域内の各種ＤＮＡ短縮体を塩基配列の決定に供した。
株より組み換え体ＤＮＡを回収し、遺伝子領域の限定化
および塩基配列の決定を行うため短縮体ＤＮＡの作製を
行った。作製には宝酒造製のデリーションキットを用
い、使用方法は供給者のものに従った。この短縮体ＤＮ
Ａで再び大腸菌株を形質転換し、その形質転換体がグル
コースを含むＬ寒天培地上で大きいコロニーを形成する
能力を持つことを指標にして、遺伝子の領域の限定化を
行った。最終的には遺伝子の必要領域を約 1600bp に限
定できた。この領域を含む最小ＤＮＡ断片（1.9 kb）が
pUC19 に挿入されたものを pACEP-1 と命名した。限定
領域内の各種ＤＮＡ短縮体を塩基配列の決定に供した。
【００２１】（実施例７ 各種短縮体ＤＮＡの調製）上
記で得られた各種短縮体ＤＮＡを含有する大腸菌JM103
株を、トリプトン 1%、酵母エキス 0.5 % 及び NaC l0.
5 % からなる培地 1ｌに、該培地を用い、温度 37 ℃で
24 時間前培養して得られた培養液 20 ml を接種し、
温度 37 ℃で3 時間培養したのち、0.2g のクロラムフ
ェニコールを添加し、更に同一温度で20 時間培養を行
い、培養液を得た。次いで、この培養液を、常法により
3,000r.p.m.で 10 分間遠心処理して湿潤菌体各 2 g
を得、これを 20 ml の 25 % ショ糖を含有する 350 mM
トリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)に懸濁したのち、更にこ
れにリゾチーム（シグマ社製）10 mg、0.25 M EDTA 溶
液(pH8.0) 8 ml 及び 20 %ドデシル硫酸ナトリウム溶液
8 ml を各々添加し、温度 60℃ で 30分間保温して溶
菌し、溶菌液を得た。この溶菌液に、5M NaCl 溶液 13m
l を添加し、温度 4℃で 16 時間処理した物を常法によ
り、 15,000 r.p.m.で 30 分間遠心分離した。上清液
を、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱
処理を行いＤＮＡを沈澱させた。
記で得られた各種短縮体ＤＮＡを含有する大腸菌JM103
株を、トリプトン 1%、酵母エキス 0.5 % 及び NaC l0.
5 % からなる培地 1ｌに、該培地を用い、温度 37 ℃で
24 時間前培養して得られた培養液 20 ml を接種し、
温度 37 ℃で3 時間培養したのち、0.2g のクロラムフ
ェニコールを添加し、更に同一温度で20 時間培養を行
い、培養液を得た。次いで、この培養液を、常法により
3,000r.p.m.で 10 分間遠心処理して湿潤菌体各 2 g
を得、これを 20 ml の 25 % ショ糖を含有する 350 mM
トリス−塩酸緩衝液(pH 8.0)に懸濁したのち、更にこ
れにリゾチーム（シグマ社製）10 mg、0.25 M EDTA 溶
液(pH8.0) 8 ml 及び 20 %ドデシル硫酸ナトリウム溶液
8 ml を各々添加し、温度 60℃ で 30分間保温して溶
菌し、溶菌液を得た。この溶菌液に、5M NaCl 溶液 13m
l を添加し、温度 4℃で 16 時間処理した物を常法によ
り、 15,000 r.p.m.で 30 分間遠心分離した。上清液
を、常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱
処理を行いＤＮＡを沈澱させた。
【００２２】この沈澱物の減圧乾燥処理したものを、1m
M EDTA を含有する 10 mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
6 ml に溶解し、さらにこれに塩化セシウム 6 g 及びエ
チジウムブロマイド（19 mg/ml）0.2 ml を添加した物
を、常法により 39,000 r.p.m.で 42 時間超遠心分離機
を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、各種短縮体
ＤＮＡを単離し、又更に、ｎ−ブタノールを使用してエ
チジウムブロマイドを除去した後、1 mM EDTA を含有す
る 10 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 7.5）に対して透析
を行い純化された組み換え体プラスミド各々約 500μg
を得た。
M EDTA を含有する 10 mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)
6 ml に溶解し、さらにこれに塩化セシウム 6 g 及びエ
チジウムブロマイド（19 mg/ml）0.2 ml を添加した物
を、常法により 39,000 r.p.m.で 42 時間超遠心分離機
を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、各種短縮体
ＤＮＡを単離し、又更に、ｎ−ブタノールを使用してエ
チジウムブロマイドを除去した後、1 mM EDTA を含有す
る 10 mM トリス−塩酸緩衝液（pH 7.5）に対して透析
を行い純化された組み換え体プラスミド各々約 500μg
を得た。
【００２３】（実施例８ アセテートＰ遺伝子を含有す
るＤＮＡの塩基配列の解析）項目（７）で得られた各種
短縮体ＤＮＡをアルカリ変性させ一本鎖ＤＮＡを調製し
た。
るＤＮＡの塩基配列の解析）項目（７）で得られた各種
短縮体ＤＮＡをアルカリ変性させ一本鎖ＤＮＡを調製し
た。
【００２４】得られた一本鎖ＤＮＡによるシークエンシ
ングは、M-13 シークエンスキット（宝酒造製）を用い
Sanger の方法にしたがって行った。得られたアセテー
トＰ遺伝子の塩基配列は配列表に示す通りである。塩基
配列より推定される、この遺伝子の産物のアミノ酸配列
も配列表に示した。遺伝子産物についてハイドロパシー
プロットを調べたところ、図４に示す通り、この遺伝子
産物は膜通過ドメイン様の構造を持つ。そこでこの遺伝
子のコードするポリペプチドは膜内在性のタンパク質で
あると考え、これをアセテートＰと命名し、遺伝子は a
ceP と命名した。
ングは、M-13 シークエンスキット（宝酒造製）を用い
Sanger の方法にしたがって行った。得られたアセテー
トＰ遺伝子の塩基配列は配列表に示す通りである。塩基
配列より推定される、この遺伝子の産物のアミノ酸配列
も配列表に示した。遺伝子産物についてハイドロパシー
プロットを調べたところ、図４に示す通り、この遺伝子
産物は膜通過ドメイン様の構造を持つ。そこでこの遺伝
子のコードするポリペプチドは膜内在性のタンパク質で
あると考え、これをアセテートＰと命名し、遺伝子は a
ceP と命名した。
【００２５】
【発明の効果】以上のように本発明は、大腸菌の酢酸資
化性遺伝子（アセテートＰ遺伝子）に関するものであ
る。この遺伝子を多コピーで大腸菌に導入することによ
り、その大腸菌は酢酸資化能の上昇が観察される。これ
により、本発明は、大腸菌を用いて発酵を行う際問題と
なる、pH の低下による菌の生育の阻害を解決するもの
である。
化性遺伝子（アセテートＰ遺伝子）に関するものであ
る。この遺伝子を多コピーで大腸菌に導入することによ
り、その大腸菌は酢酸資化能の上昇が観察される。これ
により、本発明は、大腸菌を用いて発酵を行う際問題と
なる、pH の低下による菌の生育の阻害を解決するもの
である。
【００２６】
【配列表】 配列の長さ：1632bp 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表わす記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：216-1436 GTGGTTGGTC TGGCCGAAAC ATCATGAACA AAGTCCGGCT GCGGTAACTT TCGTATTCAT 60 CTGCTGAATG CTCTCAGGTG AGGGAAATTT CAACGAAAAA GCCCGAAAAA TGTGCTGTTA 120 ATCACATGCC TAAGTAAAAA TTTGACGACA CGTATTGAAG TGCTTCACCA TAGCCTACAG 180 ATTATTTCGG AGCGCGAAAA TATAGGGAGT ATGCG GTG GTT GCT GAA AAC CAG 233 Met Val Ala Glu Asn Gln 5 CCT GGG CAC ATT GAT CAA ATA AAG CAG ACC AAC GCG GGC GCG GTT TAT 281 Pro Gly His Ile Asp Gln Ile Lys Gln Thr Asn Ala Gly Ala Val Tyr 10 15 20 CGC CTG ATT GAT CAG CTT GGT CCA GTC TCG CGT ATC GAT CTT TCC CGT 329 Arg Leu Ile Asp Gln Leu Gly Pro Val Ser Arg Ile Asp Leu Ser Arg 25 30 35 CTG GCG CAA CTG GCT CCT GCC AGT ATC ACT AAA ATT GTC CGT GAG ATG 377 Leu Ala Gln Leu Ala Pro Ala Ser Ile Thr Lys Ile Val Arg Glu Met 40 45 50 CTC GAA GCA CAC CTG GTG CAA GAG CTG GAA ATC AAA GAA GCG GGG AAC 425 Leu Glu Ala His Leu Val Gln Glu Leu Glu Ile Lys Glu Ala Gly Asn 55 60 65 70 CGT GGC CGT CCG GCG GTG GGG CTG GTG GTT GAA ACT GAA GCC TGG CAC 473 Arg Gly Arg Pro Ala Val Gly Leu Val Val Glu Thr Glu Ala Trp His 75 80 85 TAT CTT TCT CTG CGC ATT AGT CGC GGG GAG ATT TTC CTT GCT CTG CGC 521 Tyr Leu Ser Leu Arg Ile Ser Arg Gly Glu Ile Phe Leu Ala Leu Arg 90 95 100 GAT CTG AGC AGC AAA CTG GTG GTG GAA GAG TCG CAG GAA CTG GCG TTA 569 Asp Leu Ser Ser Lys Leu Val Val Glu Glu Ser Gln Glu Leu Ala Leu 105 110 115 AAA GAT GAC TTG CCA TTG CTG GAT CGT ATT ATT TCC CAT ATC GAT CAG 617 Lys Asp Asp Leu Pro Leu Leu Asp Arg Ile Ile Ser His Ile Asp Gln 120 125 130 TTT TTT ATC CGC CAC CAG AAA AAA CTT GAG CGT CTA ACT TCG ATT GCC 665 Phe Phe Ile Arg His Gln Lys Lys Leu Glu Arg Leu Thr Ser Ile Ala 135 140 145 150 ATA ACC TTG CCG GGA ATT ATT GAT ACG GAA AAT GGT ATT GTA CAT CGC 713 Ile Thr Leu Pro Gly Ile Ile Asp Thr Glu Asn Gly Ile Val His Arg 155 160 165 ATG CCG TTC TAC GAG GAT GTA AAA GAG ATG CCG CTC GCG GAG GCG CTG 761 Met Pro Phe Tyr Glu Asp Val Lys Glu Met Pro Leu Ala Glu Ala Leu 170 175 180 GAG CAG CAT ACC GGC GTT CCG GTT TAT ATT CAG CAT GAT ATC AGC GCA 809 Glu Gln His Thr Gly Val Pro Val Tyr Ile Gln His Asp Ile Ser Ala 185 190 195 TGG ACG ATG GCA GAG GCC TTG TTT GGT GCC TCA CGC GGG GCG CGC GAT 857 Trp Thr Met Ala Glu Ala Leu Phe Gly Ala Ser Arg Gly Ala Arg Asp 200 205 210 GTG ATT CAG GTG GTT ATC GAT CAC AAC GTG GGG GCG GGC GTC ATT ACC 905 Val Ile Gln Val Val Ile Asp His Asn Val Gly Ala Gly Val Ile Thr 215 220 225 230 GAT GGT CAT CTG CTA CAC GCA GGC AGC AGT AGT CTC GTG GAA ATA GGC 953 Asp Gly His Leu Leu His Ala Gly Ser Ser Ser Leu Val Glu Ile Gly 235 240 245 CAC ACA CAG GTC GAC CCG TAT GGG AAA CGC TGT TAT TGC GGG AAT CAC 1001 His Thr Gln Val Asp Pro Tyr Gly Lys Arg Cys Tyr Cys Gly Asn His 250 255 260 GGC TGC CTC GAA ACC ATC GCC AGC GTG GAC AGT ATT CTT GAG CTG GCA 1049 Gly Cys Leu Glu Thr Ile Ala Ser Val Asp Ser Ile Leu Glu Leu Ala 265 270 275 CAG CTG CGT CTT AAT CAA TCC ATG AGC TCG ATG TTA CAT GGA CAA CCG 1097 Gln Leu Arg Leu Asn Gln Ser Met Ser Ser Met Leu His Gly Gln Pro 280 285 290 TTA ACC GTG GAC TCA TTG TGT CAG GCG GCA TTG CGC GGC GAT CTA CTG 1145 Leu Thr Val Asp Ser Leu Cys Gln Ala Ala Leu Arg Gly Asp Leu Leu 295 300 305 310 GCA AAA GAC ATC ATT ACC GGG GTG GGC GCG CAT GTC GGG CGC ATT CTT 1193 Ala Lys Asp Ile Ile Thr Gly Val Gly Ala His Val Gly Arg Ile Leu 315 320 325 GCC ATC ATG GTG AAT TTA TTT AAC CCA CAA AAA ATA CTG ATT GGC TCA 1241 Ala Ile Met Val Asn Leu Phe Asn Pro Gln Lys Ile Leu Ile Gly Ser 330 335 340 CCG TTA AGT AAA GCG GCA GAT ATC CTC TTC CCG GTC ATC TCA GAC AGC 1289 Pro Leu Ser Lys Ala Ala Asp Ile Leu Phe Pro Val Ile Ser Asp Ser 345 350 355 ATC CGT CAG CAG GCC CTT CCT GCG TAT AGT CAG CAC ATC AGC GTT GAG 1337 Ile Arg Gln Gln Ala Leu Pro Ala Tyr Ser Gln His Ile Ser Val Glu 360 365 370 AGT ACT CAG TTT TCT AAC CAG GGC ACG ATG GCA GGC GCT GCA CTG GTA 1385 Ser Thr Gln Phe Ser Asn Gln Gly Thr Met Ala Gly Ala Ala Leu Val 375 380 385 390 AAA GAC GCG ATG TAT AAC GGT TCT TTG TTG ATT CGT CTG TTG CAG GGT 1433 Lys Asp Ala Met Tyr Asn Gly Ser Leu Leu Ile Arg Leu Leu Gln Gly 395 400 405 TAA CATT TTTTAACTGT TCTACCAAAA TTTGCGCTAT CTCAATTTGG GCCAGGAAAG 1490 CATAACTTAG ACTTTCAAGG TTAATTATTT TCCTGGTTTA TATTTGTGAA GCATAACGGT 1550 GGAGTTAGTG ATGCTGAANN NTTTCTTTAT TACCGGTACA GTCACTTATG TAGGGAAAAC 1610 GGTGGTTTCC CGCGCCGATT TC 1632
【提出日】平成５年７月２０日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】 図４は、本該発明であるアセテートＰ遺伝子
がコードする翻訳産物のハイドロパシープロットを示し
たものである。
がコードする翻訳産物のハイドロパシープロットを示し
たものである。
Claims (2)
- 【請求項１】 配列表の配列番号（１）に示されている
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを有する酢酸資化性遺
伝子 - 【請求項２】 配列表の配列番号（１）に示される塩基
配列を有する請求項（１）記載の遺伝子
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3212410A JP2526836B2 (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 酢酸資化性遺伝子 |
| US08/155,906 US5405777A (en) | 1991-08-23 | 1993-11-23 | Acetic acid assimilating gene and a method for preventing accumulation of acetic acid in culture medium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3212410A JP2526836B2 (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 酢酸資化性遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0614781A true JPH0614781A (ja) | 1994-01-25 |
| JP2526836B2 JP2526836B2 (ja) | 1996-08-21 |
Family
ID=16622128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3212410A Expired - Fee Related JP2526836B2 (ja) | 1991-08-23 | 1991-08-23 | 酢酸資化性遺伝子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5405777A (ja) |
| JP (1) | JP2526836B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7563606B2 (en) | 2003-09-17 | 2009-07-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing non-amino organic acid |
| US7763447B2 (en) | 2003-08-28 | 2010-07-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing succinic acid with bacterium comprising a modified fumarate reductase gene or a modified succinate dehydrogenase gene |
| US7829316B2 (en) | 2005-10-18 | 2010-11-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for production of succinic acid |
| US7833763B2 (en) | 2003-07-09 | 2010-11-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing organic acid |
| US7972823B2 (en) | 2004-05-20 | 2011-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid |
| US7993888B2 (en) | 2006-02-24 | 2011-08-09 | Mitsubishi Chemical Corporation | Bacterium having enhanced 2-oxoglutarate dehydrogenase activity |
| US8628941B2 (en) | 2004-11-25 | 2014-01-14 | Ajinomoto Co., Inc. | L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid |
-
1991
- 1991-08-23 JP JP3212410A patent/JP2526836B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-11-23 US US08/155,906 patent/US5405777A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7833763B2 (en) | 2003-07-09 | 2010-11-16 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing organic acid |
| US7763447B2 (en) | 2003-08-28 | 2010-07-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing succinic acid with bacterium comprising a modified fumarate reductase gene or a modified succinate dehydrogenase gene |
| US7563606B2 (en) | 2003-09-17 | 2009-07-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing non-amino organic acid |
| US7972823B2 (en) | 2004-05-20 | 2011-07-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Succinic acid-producing bacterium and process for producing succinic acid |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5405777A (en) | 1995-04-11 |
| JP2526836B2 (ja) | 1996-08-21 |
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