JP3331472B2

JP3331472B2 - 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法

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Publication number: JP3331472B2
Application number: JP51192494A
Authority: JP
Inventors: 孝之輔佐野; 宏之児島; 由理尾川
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1992-11-10
Filing date: 1993-11-10
Publication date: 2002-10-07
Anticipated expiration: 2017-10-07
Also published as: ES2158867T3; WO1994011517A1; CN1107179A; RU94035744A; EP0643135A4; CZ285453B6; CZ165894A3; RU2113484C1; SK81994A3; ATE203769T1; DK0643135T3; CN1071378C; EP0643135B1; DE69330518D1; US5661012A; SK279915B6; DE69330518T2; EP0643135A1

Description

【発明の詳細な説明】（技術分野）本発明は微生物工業に関連したものであり、より詳し
くは発酵法によるＬ−スレオニンの製造法に関する。Ｌ
−スレオニンは必須アミノ酸であり、医療を目的とする
様々な栄養混合物のコンポーネントとして利用される。
さらに、動物用飼料添加物として、製薬業および化学工
業における試薬として、微生物によるリジンやホモセリ
ンなどのアミノ酸産生のための成長因子として利用され
る。

（背景技術）従来、発酵法によりＬ−スレオニンを製造する場合、
微生物としては自然界から分離した菌株または該菌株の
人工変異株が用いられている。Ｌ−スレオニンを生産す
る人工変異株は数多く知られており、その多くはα−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性があり、エシェリヒ
ア属、セラチア属、ブレビバクテリウム属、またはコリ
ネバクテリウム属に属している。エシェリヒア属につい
ては、特開昭55−131397号公報、特開昭59−31691号公
報、特開昭56−15696号公報、および特表平３−501682
号公報にスレオニンオペロンを含有した組換えプラスミ
ドにより形質転換された菌株によるＬ−スレオニンを製
造する方法が示されている。

また、これまでに知られているスレオニン生産菌のう
ちでは、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）BKII
M B−3996株のスレオニン生合成レベルおよび消費係数
はもっとも優れている（前掲特表平３−501682号公
報）。ここにいう消費係数とは、スレオニン1gを生産す
るのに必要とされる糖のｇ数である。pHセンサーからの
シグナルに基づいて栄養培地に糖−アンモニア添加物を
添加する実験発酵槽で本菌株を培養すると、最高85g/l
のスレオニンを生合成し、その消費係数は2g糖/1gスレ
オニンであった。

アスパルトキナーゼ（以下、AKと略することがある）
はアスパラギン酸をβホスホアスパラギン酸に変える酵
素であり、アスパラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主
な調節部位である。E.coliのAKは図１に示すように３種
あり（AK I,AK II,AK III）、うち２つはホモセリンデ
ヒドロゲナーゼ（以下、HDと略することがある）との複
合酵素である。ひとつは、thrA遺伝子にコードされるAK
I−HD Iであり、もう一方は、metL（Ｍ）遺伝子にコー
ドされるAK II−HD IIである。

AK IIIのみは単機能酵素であり、lysCと名付けられた
遺伝子の産物で、リジンによる抑制及びフィードバック
阻害を受けることが知られている。一方、AK Iはスレオ
ニンとイソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンに
よる阻害を受け、AK IIはメチオニンによる抑制を受け
る。菌体内での活性の割合はAK I:AK II:AK III＝約5:
1:4となっている。

E.coliのlysCはすでにクローニングされており、塩基
配列も決定されている（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.
N.,and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261、1052（198
6））。また、E.coliのAK IIIの活性が増強された株を
用いてＬ−スレオニンを発酵生産することについては、
Mizukamiらが報告している（Mizukami,T.et al.,Agric.
Biol.Chem.,50,1015（1986））。しかし、Mizukamiらの
報告にあるAK IIIはリジンによるフィードバック阻害の
解除が未だ十分ではなかった。

従って、本発明が解決しようとする課題は、リジンに
よるフィードバック阻害が十分に解除されたAK IIIを取
得し、従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ−ス
レオニンの製造法を提供することである。

（発明の開示）本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重
ねた結果、リジンによるフィードバック阻害が十分に解
除されたE.coliのAK IIIをコードする遺伝子（変異型ly
sC、即ちlysC^＊）を取得することに成功し、これをスレ
オニン生産菌株に導入することにより、該菌株がＬ−ス
レオニンを効率よく蓄積するようになることを見いだ
し、本願発明を完成するに至った。

すなわち、本願発明は、エシェリヒア属細菌のアスパ
ルトキナーゼIIIをコードし、該アスパルトキナーゼIII
のリジンによるフィードバック阻害を解除する変異をコ
ーディング領域内に有する遺伝子を含有するDNAに関す
るものであり、具体的には、例えば、アスパルトキナー
ゼIIIのリジンによるフィードバック阻害を解除する変
異が、アスパルトキナーゼIIIのＡ領域あるいはＢ領域
に位置するものである上記のDNAに関するものであり、
さらに具体的には、後掲配列表の配列番号１において、
例えば、アスパルトキナーゼIIIのリジンによるフィー
ドバック阻害を解除する変異が、323番目のGlyをAspに
置換させる変異、323番目のGlyをAspに置換させかつ408
番目のGlyをAspに置換させる変異、34番目のArgをCysに
置換させかつ323番目のGlyをAspに置換させる変異、325
番目のLeuをPheに置換させる変異、318番目のMetをIle
に置換させる変異、318番目のMetをIleに置換させかつ3
49番目のValをMetに置換させる変異、345番目のSerをLe
uに置換させる変異、347番目のValをMetに置換させる変
異、352番目のThrをIleに置換させる変異、352番目のTh
rをIleに置換させかつ369番目のSerをPheに置換させる
変異、164番目のGluをLysに置換させる変異、および417
番目のMetをIleに置換させかつ419番目のCysをTyrに置
換させる変異、よりなる変異の群から選ばれるものであ
る、前記のDNAに関するものである。さらに本願発明
は、前記のDNAが、エシェリヒア属細菌細胞内で自律複
製可能なベクターDNAに接続されてなる組換えDNAにも関
する。

本願発明はまた、該組換えDNAが細胞内に導入される
ことにより形質転換された、エシェリヒア属に属する微
生物に関する。前記エシェリヒア属由来のアスパルトキ
ナーゼIIIをコードし、該アスパルトキナーゼIIIのリジ
ンによるフィードバック阻害を解除する変異をコーディ
ング領域内に有する遺伝子を含有するDNAが、特に染色
体DNA内に組み込まれて形質転換された微生物も、本願
発明に属する。

本願発明は、さらにまた前記微生物を発酵培地中で培
養し、該培養物中にＬ−スレオニンを生産蓄積させ、該
培養物からＬ−スレオニンを採取することを特徴とする
Ｌ−スレオニンの製造法に関するものである。

以下、本発明について詳細に説明する。

AK IIIをコードする遺伝子（lysC）を含有するDNAの
供与菌としては、エシェリヒア属に属する微生物であれ
ばいかなるものを用いてもかまわない。具体例には、ナ
イトハルトらの著書（Neidhardt,F.C.et.al.,Escherich
ia coli and Salmonella Typhimurium,American Societ
y for Microbiology,Washington D.C.,1208,Table 1）
にあげられるものが利用できる。たとえば、E.coli JM1
09株や、MC1061株などがあげられる。

AK IIIをコードする遺伝子（lysC）を含有するDNAの
供与菌として野生株を用いた場合、野生型のAK III遺伝
子を含むDNAが取得できる。この遺伝子に変異を導入し
てＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたAK
III遺伝子（lysC^＊）を得るには、DNAを直接ヒドロキ
シルアミンで処理するin vitro変異処理法を採用すれば
よい。ヒドロキシルアミンは、シトシンをN⁴−ヒドロキ
シシトシンに変えることによりＣ→Ｔの変異を起こす化
学変異処理剤である。

また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れたAK III遺伝子を含むDNAを取得するには、AK III活
性に対するＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除
された変異株をDNA供与菌に用いることによって取得す
ることができる。該変異株は、例えば、通常の変異処理
法、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−
ニとロソグアニジン（NTG）等の変異剤処理を施した変
異株の細胞群の中から取得することができる。

AK IIIをコードする遺伝子（lysC）を含有するDNAの
調製について述べる。

まず、野生型のlysCをもつE.coli、例えばMC1061株を
培養して培養物を得る。上記微生物を培養するには、通
常の固体培養法で培養しても良いが、液体培養法を採用
して培養するのが集菌効率の見地から好ましい。また、
培地としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキ
ス、コーンスィープリカーまたは大豆もしくは小麦の浸
出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第一カリウム、
リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄または
硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必
要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが
用いられる。なお、培地の初発pHは、７〜８に調整する
のが適当である。また、培養は30〜42℃、好ましくは37
℃前後で４〜24時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静
置培養等により行う。このようにして得られた培養物
を、例えば3,000r.p.m.で５分間遠心分離してE.coli MC
1061株の菌体を得る。

この菌体より、例えば斉藤らの方法（Biochem.Biophy
s.Acta.,72,619,（1963））、K.S.Kirbyの方法（Bioche
m.J.,64,405,（1956））等の方法により染色体DNAを得
ることができる。

lysC遺伝子を単離する方法は、上記方法により得られ
た染色体DNAを適当な制限酵素で切断する。切断反応時
間等を調節して切断の程度を調節すれば、幅広異種類の
制限酵素が使用できる。ついで、エシェリヒア属細菌細
胞内で増殖し得るベクターDNAに接続し、得られた組換
えDNAを用いてエシェリヒア属の微生物のアスパルトキ
ナーゼI,II,III全欠損変異株、例えばGT3を形質転換せ
しめ（遺伝子ライブラリー）、リジンを含有しない最少
培地上生育可能となった菌株を単離し、これよりlysC遺
伝子の組換えDNAを分離できる。

具体的には、染色体DNAを制限酵素、例えばSau3A I
を、温度30℃以上、好ましくは37℃、酵素濃度１〜10ユ
ニット/mlで様々な時間（１分〜２時間）作用させて消
化し、部分分解して種々の染色体DNA断片混合物を得
る。エシェリヒア属細菌細胞内で増殖し得るベクターDN
Aに、染色体DNAの切断に用いた制限酵素Sau3A Iと同一
末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamH Iを、
温度30℃以上、酵素濃度１〜100ユニット/mlで１時間以
上、好ましくは１〜３時間作用させて完全消化し、切断
開裂されたDNAを得る。次いで、上記のようにして得た
E.coli MC1061株由来で、lysC遺伝子を含有するDNA断片
を含む混合物と、開裂切断されたベクターDNAとを混合
し、これにDNAリガーゼ、このましくはT4 DNAリガーゼ
を、温度４〜16℃、酵素濃度１〜100ユニットで１時間
以上、好ましくは６〜24時間作用させて組換えDNAを得
る。

本願発明において用いることのできることのできるベ
クターDNAとしては、プラスミドベクターDNAが好まし
く、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、
RSF1010等が挙げられる。他もファージDNAのベクターも
利用できる。目的有用遺伝子の発現を効率的に実施する
ために、lac、trp、PL等の微生物内で働くプロモーター
を用いてもよい。尚、ここでいう組換えDNAには、該有
用遺伝子をトランスポゾン（Berg,D.E.and Berg,C.M.,B
io/Technol.,1,417（1983））、Muファージ（特開平２
−109985号公報）または相同性組換え（Experiments in
Molecular Genetics,Cold Spring Habor Lab.（197
2））を用いた方法で染色体に組み込んだものも含まれ
る。

この組換えDNAを用いて、例えば大腸菌Ｋ−12株、好
ましくはGT3株等を形質転換して、AK活性が増大した株
あるいは栄養要求性が相補された株より、lysC遺伝子の
組換えDNAをもつ菌株を得る。この形質転換は、D.M.Mor
risonの方法（Methods in Enzymology 68,326,1979）あ
るいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透
過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,
53,159（1970））により行うことができる。そして、上
記菌株より、lysC遺伝子を含有するDNAがベクターDNAに
挿入された組換えDNAを、例えばP.Guerryらの方法（J.B
acteriol.,116,1064,（1973））、D.B.Clewellの方法
（J.Bacteriol.,110,667,（1972））などにより単離す
ることができる。

候補株が、実際にlysCがクローニングされた組換えDN
Aを保持するかどうかを確認するには、細胞抽出液を調
製し、そこより粗酵素液を調製してアスパルトキナーゼ
活性を確認することにより達成できる。アスパルトキナ
ーゼの酵素活性測定法は、スタットマンらの方法により
行うことができる（Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,
G.,and Robichon−Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236,2
033（1961））。

あるいは、lysC遺伝子の取得は、前記斎藤らの方法等
により取得された染色体DNAよりPCR（polymerase chain
reaction;White,T.J.et al;Trends Genet.5,185（198
9）参照）によりlysC遺伝子を増幅することによっても
行える。増幅に用いるDNAプライマーは、lysC遺伝子の
全領域あるいは一部領域を含有するDNA二重鎖の両３′
末端に相補するものを用いる。lysC遺伝子の一部領域だ
けを増幅した場合には、該DNA断片をプライマーとして
全領域を含むDNA断片を遺伝子ライブラリーよりスクリ
ーニングする必要がある。全領域を増幅した場合には、
該DNA断片をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的
のバンドを切り出すことによって、lysC遺伝子を含有す
るDNA断片を回収できる。

DNAプライマーとしては、例えばE.coliにおいて既知
となっている配列（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,a
nd Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052（1986））を基
にして適宜作成できるが、lysC遺伝子をコードする1347
baseの領域を増幅できる、５′−CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG
−３′（後掲配列表の配列番号２）および５′−GAATTC
CTTTGCGAGCAG−３′（後掲配列表の配列番号３）の２種
のプライマーが適当である。DNAの合成は、Applied Bio
systems社製「DNA合成機model 380B」を使用し、ホスホ
アミダイド法を用いて（Tetrahedron Letters,22,1859
（1981）参照）常法に従って行なうことができる。PCR
反応は、宝酒造社製「DNAサーマルサイクラーPJ2000
型」を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により
指定された方法に従って行うことができる。

PCR法により増幅されたlysC遺伝子は、エシェリヒア
属細菌細胞内において増幅し得るベクターDNAに接続さ
れ、エシェリヒア属細菌細胞に導入される。用いられる
ベクターDNAと形質転換法、さらにlysCの確認方法は上
述した方法と同じである。

得られたlysCにアミノ酸置換、挿入および欠失等の変
異を実施する方法としては、リコンビナントPCR法（Hig
uchi,R.,61,in PCR Technology（Erlich,H.A.Eds.,Stoc
kton press（1989））、部位特異的変異法（Kramer,W.a
nd Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350（1987）およ
びKunkel,T.A.et.al.,Meth.in Enzymol.,154,367（198
7））などがある。これらの方法を用いる場合には目的
部位に目的の変異を起こすことができる。さらに、染色
体もしくはプラスミド上の目的遺伝子DNAを直接ヒドロ
キシルアミン処理する方法（Hashimoto,T.and Sekiguch
i,M.,J.Bacteriol.,159,1039（1984））または該DNAを
保有する菌体を紫外線照射法もしくはＮ−メチル−Ｎ′
−ニトロソグアニジン、亜硝酸などの化学薬剤処理によ
る常法、目的遺伝子を化学合成する方法等を用いればラ
ンダムに変異を導入できる。

阻害解除型変異遺伝子lysC^＊の取得方法としては、ま
ず変異処理した組換えDNAをAK完全欠損株、例えばE.col
i GT3株に形質転換する。次に、著量のリジンを含む最
少培地、例えばM9に形質転換株を培養する。野生型のly
sCを持つプラスミドを保持する株は唯一のAKがリジンに
より阻害されるために、スレオニン、イソロイシン、メ
チオニン、及びジアミノピメリン酸（DAP）の合成が出
来なくなり生育が抑えられる。これに対し、リジンによ
る阻害の解除されたlysC^＊を持つプラスミド保持株は著
量のリジンが添加された最少培地上での生育が可能にな
るはずである。この現象を利用し、生育が、リジンある
いはリジンのアナログであるＳ−２−アミノエチルシス
テイン（AEC）に耐性となっている株、すなわち阻害の
解除されたlysC^＊を持つプラスミド保持株を選択するこ
とができる。

こうして得られた該変異型遺伝子を、組換えDNAとし
て適当な微生物（宿主）に導入し、発現させることによ
りフィードバック阻害が解除されたAKを保有する微生物
を取得できる。

スレオニンを生産するために、取得されたlysC遺伝子
あるいは変異型lysC遺伝子（lysC^＊）が導入され増幅さ
れる宿主としては、上記したエシャリヒア属細菌の野生
株があげられるが、これ以外にも、ここで構築した組換
えベクターDNAの複製起点とlysC遺伝子あるいは変異型l
ysC遺伝子（lysC^＊）が機能し、組換えベクターDNAが複
製可能でかつlysC遺伝子あるいは変異型lysC遺伝子（ly
sC^＊）の増強が可能な菌なら、全て宿主として利用でき
る。最も好ましい宿主は、E.coli B−3996株である。

Ｌ−スレオニンを製造するには、以上の方法で取得し
た、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された
アスパルトキナーゼIIIをコードする遺伝子を含有する
組換えベクターDNAを保有する形質転換株を培養し、培
養液に目的のＬ−スレオニンを生成蓄積せしめ、これを
採取することにより行なう。

使用するＬ−スレオニン生産用の培地は、炭素源、窒
素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含
有する通常の培地でよい。炭素源としては、グルコー
ス、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷ
んの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトー
ルなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク
酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源として
は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アン
モニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物など
の有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いる
ことができる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1、
Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適
量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応
じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、
マンガンイオン等が少量添加される。

培養は好気的条件下で16〜72時間実施するのがよく、
この間、培養温度は25℃〜45℃に、そしてpHは５〜８に
制御するとよい。尚、pH調整には無機もしくは有機の酸
性またはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用
することができる。発酵液からのＬ−スレオニンの採取
は、通常のイオン交換樹脂法、沈澱法、その他の公知の
方法を組み合わせることにより実施することができる。

（図面の簡単な説明）図１は、スレオニンの生合成経路の略図を示す。

図２は、pLYSC1とpLYSC2の制限酵素地図を示す（実施
例１参照）。

図３は、lysCに対するヒドロキシルアミンによる変異
導入の効果をグラフにして示す（実施例２（２−４）参
照）。

図４は、各種lysC^＊遺伝子がコードするアスパルトキ
ナーゼのリジンによる阻害の程度を示す（実施例３（３
−４）参照）。横軸のリジン濃度は対数で表わしてあ
る。縦軸の比活性は、野生型AK IIIのリジン0mM添加時
の活性を100％とした比で表わしてある。

図５は、pLLC^＊の構築図を示す（実施例４（４−１）
参照）。

図６は、pVICLC^＊ＡとpVICLC^＊Ｂの構築図を表わす
（実施例４（４−３）参照）。

図７は、各lysC^＊の変異点を配置した（実施例５（５
−３）参照）。

（発明を実施するための最良の形態）以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明す
る。

実施例１（野生型lysC遺伝子のクローニング） E.coliのlysC遺伝子の塩基配列は既に報告されており
（前掲Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,J.
C.,J.Biol.Chem.,261,1052（1986））、オープンリーデ
イングフレーム（ORF）は1347base、449アミノ酸をコー
ドしていることがわかっている。オペレーターが存在
し、リジンによる抑制を受けるため、このオペレーター
領域は除き、SD配列とORFのみを含む領域をPCR法を用い
て増幅し、クローニングすることにした。

５′−CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG−３′（配列番号２）お
よび５′−GAATTCCTTTGCGAGCAG−３′（配列番号３）の
２種のプライマーを作製し、E.coli K−12 MC1061株の
全ゲノムDNAを前掲斉藤らの方法（Biochem.Biophys.Act
a.,72,619（1963））により回収した。これらを用い
て、エルリッチらの方法（PCR Technology,Stockton pr
ess（1989））に従ってPCR反応を行い、目的DNAの増幅
を行った。得られたDNAをBamH IとAse Iで消化した後、
平滑末端にし、多コピーベクターpUC18のSma Iサイトに
挿入した。その際、lacZプロモーターに対して逆方向
（pLYSC1）および正方向（pLYSC2）の２種のプラスミド
を得た（図２）。

これらのプラスミドをAK I,II,III完全欠損株である
E.coli GT3（thrA1016^b,metLM1005,lysC1004）に形質転
換したところ、GT3のホモセリン＋ジアミノピメリン酸
の要求性を相補したので、活性のある、AK IIIをコード
する遺伝子lysCであると確認した。

実施例２（阻害解除型変異遺伝子lysC^＊の取得）（２−１） lysCの阻害解除型遺伝子（lysC^＊）を効率よく取得す
るために、実施例１で作製した組換えプラスミドDNA上
の遺伝子に変異処理を行なうことにした。

阻害解除型変異遺伝子lysC^＊の取得方法としては、ま
ず野生型lysC組換えプラスミドをAX完全欠損株E.coli G
T3に形質転換した。そして、下記第１表に示す組成を有
する最少培地M9に著量のリジンを加え、これに形質転換
株を培養した。野生型のlysCを持つプラスミドを保持す
る株は唯一のAKがリジンにより阻害されるために、スレ
オニン、イソロイシン、メチオニン、及びジアミノピメ
リン酸（DAP）の合成ができなくなり生育が抑えられ
た。

これに対し、リジンによる阻害の解除されたlysC^＊を
持つプラスミド保持株は著量のリジンが添加された最少
培地M9上での生育が可能になるはずである。この現象を
利用し、生育が、リジンあるいはリジンのアナログであ
るＳ−２−アミノエチルシステイン（AEC）に耐性とな
っている株、すなわち阻害の解除されたlysC^＊を持つプ
ラスミド保持株を選択することにした。

（２−２）lysCのフィードバック阻害耐性変異体（lysC
^＊）の選択条件の検討まず、E.coli GT3にpLYSC1またはpLYSC2を、それぞ
れ、形質転換して２種の形質転換株を得、リジンあるい
はAECを含有する最少培地M9寒天平板培地上で培養を行
なった。そして、リジンあるいはAECによる生育阻止濃
度を調べ、lysC^＊の選択条件の検討を行なった。

下記第２表に示すように、pLYSC2はlacZプロモーター
で発現量が増幅されているためlysCが野生型のままでも
かなり高濃度のリジンおよびAECに、それぞれ、耐性だ
ったが、pLYSC1のlysC遺伝子は、lacZプロモーターに対
して逆方向であり、自身のプロモーターも欠失している
ため発現量が少なく、より低濃度のリジンおよびAECの
それぞれで生育が阻害されることがわかった（リジンま
たはAECを0.2mM添加すると、両区ともに生育が完全に抑
えられる。表中の＋は形質転換株が生育することを示
し、−は生育しなかったことを示す）。なお、この生育
阻害はホモセリン及びDAPの同時添加により回復するこ
とを確認した。

よって、変異導入実験にはpLYSC1を用い、lysC^＊の選
択に用いる選択培地は、最少培地M9にリジン10mM、もし
くはAEC 0.2mMを添加したものとした。

（２−３）変異処理ヒドロキシルアミンは、シトシンをN⁴−ヒドロキシシ
トシンに変えることによりＣ→Ｔの変異を起こす化学変
異処理剤である。プラスミドへの変異の導入には、プラ
スミドを直接ヒドロキシルアミンで処理するin vitto変
異処理法に加え、変異に多様性を与えるため、即ちＣ→
Ｔ以外の変異を期待して、プラスミドを保持した菌体を
ニトロソグアニジン（NTG）で処理した後プラスミドを
抽出するin vivo変異処理法の２種の方法を用いた。

（２−４）ヒドロキシルアミンによるin vitro変異処理
法２μｇのDNAを、下記第３表に示す組成の反応液、す
なわち0.4Mヒドロキシルアミン中で75℃、１〜４時間処
理した。処理後のDNAをガラスパウダーで精製後、AK完
全欠損株GT3に形質転換し、完全培地（Ｌ−broth:1％ B
acto trypton,0.5％ Yeast extract,0.5％ NaCl,1.5％
agar）に撒きコロニーを形成させた。これを（２−１）
で得た選択培地にレプリカした。形質転換体の出現率と
変異率は図３のような推移がみられた。４時間処理では
0.5〜0.8％とかなり高率で変異株が得られた。

（２−５）ニトロソグアニジン（NTG）によるin vivo変
異処理法 pLYSC1をE.coli MC1061に形質転換し、菌体ごとNTG処
理を行なった。処理後の菌体を一夜培養して変異を固定
した後、プラスミドを抽出し、GT3に形質転換し、（２
−４）におけると同様にスクリーニングを行い、Lys^Rま
たはAEC^Rの変異体を得た。

処理法の概要を下記第４表に示す。

上記TM bufferの組成： Tris 50mM マレイン酸 50mM （NH₄）₂SO₄ 1g/L MgSO₄・7H₂O 0.1g/L Ca（NO₃）_２ 5mg/L FeSO₄・7H₂O 0.25mg/L NaOHを用いてpH6.0に調整実施例３（lysC^＊遺伝子の単離）（３−１）実施例２で得られた候補株合計180株（ヒドロキシル
アミン処理48株、NTG処理132株）を再度選択培地にスポ
ットし、AEC及びリジン耐性を確認して153株を得た。培
地中のアミノ酸蓄積パターンの違いに注目して153株を1
4群に分け、各群の代表株を選んでAK活性を測定するこ
とにした。なお、ヒドロキシルアミン処理およびNTG処
理の変異株の間では大きな差はなかったので、それぞれ
を区別することなく実験を行なった。

（３−２）アスパルトキナーゼ活性の測定宿主にAK完全欠損株GT3を用い、これに上記14種の変
異型pLYSC1（pLYSC1^＊シリーズと命名）および野生型pL
YSC1を形質転換したものから無細胞抽出液を調製し、AK
IIIの酵素活性を測定した。酵素活性測定方法を以下に
示す。

（３−３）AK III酵素活性測定法（３−３−１）粗酵素液の調製法（１）菌体を２×TY培地で培養、O.D.660nm＝約0.8
で集菌（２）０℃、0.02M KH₂PO₄（pH6.75）−0.03Mβメ
ルカプトエタノールで洗浄（３）ソニック（０℃、100W、30秒×４）で菌体を
破砕（４）０℃、33krpm、１時間遠心し、上清に80％飽
和になるよう硫安を添加（５）遠心後ペレットを（２）のバッファーに溶解
し、保存（−20℃）（３−３−２）酵素活性測定法酵素活性測定法は、スタットマンらの方法にしたがっ
た（Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,G.,and Robicho
n−Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236,2033（196
1））。

反応液は、下記第５表に示す組成とした。

測定法の概要を下記第６表に示す。

測定結果は、図４に示す。

（３−４）リジンによる阻害解除度 AKの酵素活性を測定する際、酵素反応液中に種々の濃
度のリジンを加え、リジンによる阻害の度合を調べた。
野生型AK IIIはリジンによる阻害を非常に強く受け、リ
ジン約0.45mMで50％阻害され、5mMになるとほぼ100％阻
害されてしまった（図４）。

それに対し、今回得られた変異型AK IIIは解除の度合
は様々ではあったが、14種ともリジンによる阻害が解除
されていた（図４および第７表）。特にNo.24、80、11
7、169および172では、リジン100mMでも阻害はほとんど
みられず、50％阻害濃度は200倍以上であった。

また、蛋白当りの比活性については、菌体の生育状況
や試料の調製に影響される点を考慮しても、ほとんどが
野生型と同等もしくはそれ以上のものであり、変異導入
による活性低下の問題はほとんどなかった（第７表）。
このことより、AK IIIの活性中心とリジンによる調節部
位がそれぞれ独立していることが予想される。

第７表中、阻害解除度とは、反応液中リジン非存在下
の活性に対するリジン100mM存在下の活性（％）であ
り、熱安定性とは55℃で1.5時間処理後の活性保持率
（％）である。

（３−５）熱安定性ある酵素を改良して活性を上げる場合、細胞内で安定
に保持されることが重要である。細胞内外でのプロテア
ーゼの活動の違いや、保存用バッファーの影響などもあ
るため、in vivoでの測定が望ましいが、簡便のため１
つのパラメーターとして変異型AK IIIの熱安定性につい
てin vitroで検討した。

AK IIIの失活の温度を種々検討の結果、55℃に設定
し、90分処理後の活性保持率を測定した。上記第７表に
併記して示したように、半数がむしろ野生型よりも優れ
ていた。通常、変異型蛋白質は野生型に比べ不安定なも
のが多いが、今回得られた変異型AK IIIには安定性が野
生型を上回るものもあり、Ｌ−スレオニン生産の実用酵
素としてかなり有力と思われるものが多かった。

実施例４（lysC^＊を導入した株によるＬ−スレオニン
の発酵生産）（４−１） E.coliスレオニン生産菌としては、Ｂ−3996株が現在
知られている内で最も高い生産能を持っている。そこ
で、lysC^＊を評価するに当たり、Ｂ−3996株を宿主に用
いることとした。Ｂ−3996株は、Reserch Institute fo
r Genetics and Industrial Microorganism Breedingに
登録番号BKIIM B−3996のもとで寄託されている。ま
た、評価するlysC^＊としては、酵素の阻害解除度および
比活性のタイプの異なるもの６種（第７表中のNo.24、4
3、60、80、149および167）を選び、以下の実験に供し
た。

まず、lysC^＊の発現量を増すため、pLYSC1^＊上にあっ
た上記６種のlysC^＊をおのおのpUC18の逆位挿入からベ
クターpHSG399（宝酒造社製）のlacZプロモーター下流
につなぎかえた。こうして作成された新規プラスミドを
pLLC^＊シリーズと命名し（図５）、このうちNo.80とNo.
167のlysC^＊を保持するプラスミドをE.coli HB101株に
導入したものを、それぞれ、AJ12750およびAJ12751と命
名し、工業技術院生命工学工業技術研究所（日本）に寄
託した（1992年９月１日）。AJ12750には寄託番号FERM
Ｐ−13136（国際寄託への転換日:1993年11月４日、寄
託番号:FERM BP−4462）、AJ12751には番号FERM Ｐ−
13137（国際寄託への転換日:1993年11月４日、寄託番
号:FERM BP−4463）が付与されている。残りのものに
ついては寄託をしなかったが、後述するように各lysC^＊
の変異点はすべて明らかになっているので上記寄託菌よ
りプラスミドをマニアティスらの方法（Sambrook,J.,Fr
itsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning,Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press,1.21（1989））により回
収し、サイト・ダイレクテッド・ミュータジェネシス法
（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular C
loning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,15.63
（1989））により目的遺伝子を得ることは当業者にとり
容易である。これらプラスミドを常法に従がいＢ−3996
株に導入し、評価を行なった。

培養は、下記第８表に示す成分Ａ〜Ｃ（各別にオート
クレーブしたもの）およびＤからなる培地を用い、培養
時間38時間、温度37℃および攪拌114〜116rpmの条件で
行なった。

（４−２）lysC^＊の評価Ｂ−3996株にpLLC^＊シリーズ６種を形質転換したもの
のそれぞれについて、リジン1g/L添加および無添加の２
通りの条件で培養を行なった。コントロールとしては、
宿主Ｂ−3996株のみのものと野生型のlysCを保持するプ
ラスミド（pLLC1）を持つものとをおいた。

結果を下記第９表に示す。第９表中、対消費糖収率に
併記したカッコ内の数値は、Ｂ−3996（コントロール）
のリジン無添加の対消費糖収率を1.00としたときの比で
あり、リジン感受性とは、（リジン添加時の対消費糖収
率）／（リジン無添加時の対消費糖収率）である。

リジン添加培養時にみられる対消費糖収率の低下は、
Ｂ−3996株では無添加区に対し約0.7である。しかしな
がら、lysC^＊が導入された株、例えばpLLC^＊149では、
リジン添加培養時にみられる対消費糖収率の低下は無添
加区に対し約0.96である。このことより、lysCにコード
されるAK IIIがスレオニンの生合成に寄与しており、リ
ジンの添加によるAK IIIの活性の阻害がスレオニン生合
成の阻害につながることが推測される。この現象は、本
発明に係わるlysC^＊を用いた場合に緩和される。

また、リジン無添加区のスレオニン生産能について
も、野生型lysCプラスミドを持つ株はそうでないＢ−39
96株に比べて生産能が向上し、変異型lysC^＊ではさらに
アップすることがわかった（No.80で宿主の約1.3倍）。
これらの結果は、Ｂ−3996株におけるスレオニン生産の
律速点の一つはAKであることを示している。野生型lysC
を導入した場合に比べて変異型lysC^＊を導入した場合、
リジン無添加培養でも収率が向上しているが、これは野
生型lysC導入の場合は、自ら合成した菌体内のリジンに
より野生型AK IIIが阻害されるためと考えられる。

（４−３）変異型lysC^＊プラスミドの安定化Ｂ−3996株が保持するプラスミドpVIC40のBamH Iサイ
トにlysC^＊を両方向で組み込んで図６のようなプラスミ
ドを作製した。Ｂ−3996株よりpVIC40を回収する方法
は、上述の通りである。lysC^＊としてはスレオニン生産
能の高かったNo.80と、比較としてNo.43を選び、pVICLC
^＊80A、pVICLC^＊80B、pVICLC^＊43AおよびpVICLC^＊43Bの
４種を得た。

宿主となるＢ−399株（Ｂ−3996株よりpVIC40を除い
たもの）は、Ｂ−3996株をcuringして新たに作製した。
curingは、Ｂ−3996株の培養液をストレプトマイシン非
含有のＬ−brothを用いて３回1/100希釈行なうことによ
り達成された。このときの培養温度は40℃とした。こう
して得られたＢ−399株に、lysC^＊が組み込まれたプラ
スミド４種のうち、pVICLC^＊80AまたはpVICLC^＊43Aを導
入し、培養を行なった。結果を下記第10表に示す。

コントロールのpVIC40形質転換株（Ｂ−3996株）に比
べ、pVICLC^＊80AまたはpVICLC^＊43Aを導入した株では収
率の向上がみられた（pVICLC^＊80Aにおいては1.10倍、
そしてpVICLC^＊43Aにおいては1.07倍）。

収率向上の度合が（４−２）における結果より低下し
たのはベクターをpVIC40にかえたことによるコピー数の
減少によるものと考えられるが、生育はＢ−3996株と同
等であり、プラスミドも安定に保持されていた。

（４−４）lysC^＊変異型遺伝子の染色体への組み込みスレオニン生産菌Ｂ−3996の染色体上の野生型lysC遺
伝子を標的に、変異型lysC^＊を相同組換え現象を利用し
て導入した。ここで用いた手法は、ラッセルらの方法の
変法である（Russel,M.and Model,P.,J.Bacteriol.,15
9,1034（1984））。

E.coliの変異株MM383（polA^ts,E.coli genetic stock
center U.S.A.より入手可能）が宿主の場合、プラスミ
ドpHSG399は37℃では増殖できるが、42℃のような高温
では増殖できない。このことを利用し相同組換えを行な
った。

変異株MM383を宿主に、まず増殖可能温度37℃でpLLC4
3^＊とpLLC80^＊を導入し、MM383/pLLC^＊43およびMM383/p
LLC^＊80を得た。これらの形質転換株を42℃で培養し、
プラスミドを失ってはいるが、クロラムフェニコルには
耐性のままでいるものを選択した。これらの株ではプラ
スミドが染色体上に組み込まれている。得られた株を、
それぞれ、MM383−C43およびMM383−C80と名付けた。こ
れらの株にP1ファージを感染させ、ファージ液を調製
し、Ｂ−3996株に感染させた。クロラムフェニコル耐性
を指標にlysC^＊が染色体上に形質導入された株を運び、
Ｂ−3996−C43およびＢ−3996−C80と名付けた。

（４−１）と同様の条件でＢ−3996−Ｃ−43およびＢ
−3996−Ｃ−80の培養を行い、下記第11表に示す結果を
得た。収率で約４％のスレオニン生産の改善が見られ
た。

実施例５（野生型lysCおよび変異型lysC^＊の塩基配列
の決定）（５−１）「DNAシークエンサーABI Model 373A」（ABI社製）を
使用して、常法に従い、野生型lysC遺伝子の塩基配列の
決定を行なったところ、後掲配列表の配列番号１に示す
通りであった。これは、既に発表されているE.coli K−
12 JC411株のlysCの配列（前掲Cassan,M.,Parsot,C.,Co
hen,G.N.,and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052（198
6））と６ヶ所（アミノ酸レベルでは２ヶ所）の相違が
あった。６ヶ所の相違は使用菌株の違いによるものであ
ると考えられる。

（５−２）フィードバック阻害耐性変異型lysC^＊の塩基
配列実施例３で調べた14種のlysC^＊について、（５−２）
と同様に塩基配列を決定し、変異点を明らかにした。結
果を第12表に示す。

14種のうち全く同一の変異型が２組あったので変異は
12種類である。No.149、150、156、158、167、169およ
び172はヒドロキシルアミン、そしてNo.24、43、48、6
0、80、117および126はNTG処理によって得た変異型だ
が、変異のパターンはいずれもＣ→Ｔあるいは裏鎖変異
によるＧ→Ａであった。

（５−３）フィードバック阻害解除に関与する領域の決
定変異点はＣ末側に多く存在し、特に図７のＡ領域（31
8番目のMet残基から325番目のLeu残基まで）、Ｂ領域
（345番目のSer残基から352番目のThr残基まで）に集中
していた（第12表の変異点の欄参照）。E.coliには、ly
sC（AK III）の他にthrA（AK I−HD I）およびmetL
（Ｍ）（AK II−HD II）の２つのAKがあるが、これらと
のホモロジーの高い領域が２ヶ所あり、この領域がAKの
活性中心であると考えられている（前掲Cassan,M.,Pars
ot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1
052（1986））。Ｃ末側のＡおよびＢ領域はこの共通領
域外にあり、AK IIIに特異的なリジンによる制御領域で
ある可能性が高い。特にＢ領域には阻害解除度の高いN
o.24/80、172、169および117があり、重要なポイントで
あると思われる。12種のうち10種はＡおよびＢ領域のい
ずれかに変異を持っており、例外はNo.60および156の２
種のみだが、これらは酵素の阻害解除度および熱安定性
とも低く（上記第７表）、変異によって酵素全体の構造
が変化することにより部分的な阻害解除に到ったものと
考えられる。また、複数変異を持つものについては、ど
ちらの変異点が有効であるかという問題があるが、同じ
場所に単独変異を持つものとの比較により、次のように
解釈できる。

（１）No.126（１ヶ所）、No.43（２ヶ所）および149
（２ヶ所）Ａ領域内のNo.126の変異点がこの３種の変異型に共通
しており、阻害解除度はNo.149はNo.126と同等、そして
No.43は変異点が増えることによりかえって落ちている
ことから、Ａ領域のNo.126の変異点が阻害解除に寄与し
ていると考えられる。

（２）No.24/80（１ヶ所）および169（２ヶ所） No.169の２つの変異点のうちＢ領域内の変異点はNo.2
4/80と同一である。どちらも阻害解除度100％であるた
め、No.24/80の変異点だけで充分である。

（３）No.150（１ヶ所）および172（２ヶ所） No.150はＡ領域に１つ、そしてNo.172はＡ領域（No.1
50と同一）とＢ領域に１つずつ変異点を持つ。阻害解除
度はNo.172のほうが高く、Ａ領域およびＢ領域の両者が
阻害解除に効果があることがわかる。

以上のように、本願発明者らは、リジンによるアスパ
ルトキナーゼ活性の阻害解除に係わる領域をアミノ酸残
基におけるＡ領域（318番目のMet残基から325番目のLeu
残基まで）とＢ領域（345番目のSer残基から352番目のT
hr残基まで）に特定した。つまり、本願発明者らは、リ
ジンによるアスパルトキナーゼ活性の阻害解除が特定の
アミノ酸残基を特定の他のアミノ酸残基に変異した場合
にのみ生じると結論したのではない。例えば、第12表に
は323番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に変異
した場合にフィードバック阻害の解除が起こることが開
示されているが、アスパラギン酸残基の代わりにグルタ
ミン酸残基に置換した場合にも同様な解除が起こること
は当業者に取って自明である。なぜなら、アスパラギン
酸とグルタミン酸のように構造が類似したアミノ酸の集
まりを同族アミノ酸と称し、同族アミノ酸同士の置換は
タンパク質の機能に大きな変化を与えないとされている
からである（「プロテインエンジニアリング」31頁シ
ーエムシー社（1985）に同族アミノ酸の一覧が掲載され
ている）。

同族アミノ酸以外への置換が同族アミノ酸へ置換した
ときと同様な効果をもたらすこともしばしば見られる。
逆に、同族アミノ酸への置換によってタンパク質機能に
劇的な変化を与えることもある（Estell,D.A.,Graycar,
T.P.,and Wells,J.A.,J.Biol.Chem.,260,6518（1986）:
Schultz,S.C.,and Richards,J.H.,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,83,1588（1986）:Yutani,K.,et al,J.Biol.Chem.,2
62,13429（1987）:Yutani,K.,et al,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,84,4441（1987）:Nishiyama,M.,et al,J.Biol.Ch
em.,266,14294（1991））。

また、本願発明ではＡおよびＢ領域の中のいくつかの
アミノ酸残基について変異を行なわなかったが、タンパ
ク質の機能は領域（ドメイン）単位で決定付けられるた
め、領域内のアミノ酸残基で今回変異を行なわなかった
ものに変異を導入することによりフィードバック阻害の
解除が観察されることは十分考えられる。実際その様な
例がいくか報告されている（Furuya,H.,etal,Biochemis
try,28,6848（1989）:Furuya,H.,et al,Biochem.Biophy
s.Res.Commun.,160,669（1989）:Cunningham,B.C.and W
ells,J.A.,Science,244,1081（1989））。

要するに、本発明においては、フィードバック阻害に
係わる領域を見い出したことが特徴である。実施例では
領域内の数パターンの変異のみ開示しているが、上記の
通り、他のパターンの変異を実施した場合にも同様な効
果が得られることは当業者にとり自明である。従って、
その様な変異も本願発明の範囲内に包含される。

（産業上の利用可能性）リジンによるフィードバック阻害が十分に解除された
エシェリヒア属細菌由来AK III遺伝子を取得した。これ
らの遺伝子をスレオニン生産菌に導入することにより、
従来よりもさらに改良されたスレオニン生産菌を得るこ
とができた。このスレオニン生産菌を用いることによっ
て従来より優れた発酵法によるＬ−スレオニンの製造法
を提供することに成功した。

（配列表）配列番号:1 配列の長さ:2147 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:genomic DNA 起源生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）株名:MC1061 配列の特徴：特徴を表わす記号：−35 signal 存在位置:242..249 特徴を決定した方法:S 配列の特徴：特徴を表わす記号：−10 signal 存在位置:265..273 特徴を決定した方法:S 配列の特徴：特徴を表わす記号:primer bind 存在位置:536..555 特徴を決定した方法:E 配列の特徴：特徴を表わす記号:primer bind 存在位置:2128..2147 特徴を決定した方法:E 配列の特徴：特徴を表わす記号:RBS 存在位置:575..578 特徴を決定した方法:S 配列の特徴：特徴を表わす記号:mat peptide 存在位置:584..1930 特徴を決定した方法:S 配列の特徴：特徴を表わす記号:terminator 存在位置:1941..1968 特徴を決定した方法:S 配列番号:2 配列の長さ:20 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列配列番号:3 配列の長さ:18 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１において、323番目のG
lyをAspに置換させる変異、323番目のGlyをAspに置換さ
せかつ408番目のGlyをAspに置換させる変異、34番目のA
rgをCysに置換させかつ323番目のGlyをAspに置換させる
変異、325番目のLeuをPheに置換させる変異、318番目の
MetをIleに置換させる変異、318番目のMetをIleに置換
させかつ349番目のValをMetに置換させる変異、345番目
のSerをLeuに置換させる変異、347番目のValをMetに置
換させる変異、352番目のThrをIleに置換させる変異、3
52番目のThrをIleに置換させかつ369番目のSerをPheに
置換させる変異、164番目のGluをLysに置換させる変
異、および417番目のMetをIleに置換させかつ419番目の
CysをTyrに置換させる変異、よりなる群から選ばれる、
エシェリヒア属細菌のアスパルトキナーゼIIIをコード
し、該アスパルトキナーゼIIIのリジンによるフィード
バック阻害を解除する変異をコーディング領域内に有す
る遺伝子を含有することを特徴とするDNA。
【請求項２】特許請求の範囲第１項に記載のDNAが、エ
シェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDNA
に接続されてなることを特徴とする組換えDNA。
【請求項３】特許請求の範囲第２項記載の組換えDNAが
細胞内に導入されることにより形質転換されたことを特
徴とするエシェリヒア属に属する微生物。
【請求項４】特許請求の範囲第１項に記載のDNAが染色
体DNA内に組み込まれて形質転換されたことを特徴とす
る特許請求の範囲第３項記載の微生物。
【請求項５】特許請求の範囲第３項あるいは第４項記載
の微生物を発酵培地中で培養し、該培養物中にＬ−スレ
オニンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−スレオニンを
採取することを特徴とするＬ−スレオニンの製造法。