JP2015013812A - 植物ウイルスの感染抑制剤およびそれを用いた植物ウイルス感染抑制方法 - Google Patents

Abstract

【課題】消費者および使用者に対して安全性が高く、効果的かつ安価な植物ウイルス感染抑制剤とそれを用いた病害防除法を提供すること。【解決手段】アミノ酸発酵副生物及び核酸発酵副生物から選ばれる発酵副生物を含む植物ウイルス感染抑制剤を、タバコ、トマト、ピーマン、トウガラシから選ばれる植物の植物体に散布することにより、トバモウイルス属ウイルスやククモウイルス属ウイルスなどのウイルス感染による病害を防除する。【選択図】図１

Description

本発明は、植物ウイルスの感染抑制剤、およびそれを用いた植物ウイルス感染を抑制する方法に関する。本発明は、農園芸分野等で有用である。

植物に病害を引き起こす病原菌は、大きく糸状菌（カビ）、細菌（バクテリア）、そして、ウイルスの3つに大別される。

真核生物である糸状菌が原因となる病害の種類が最も多く、全植物病害の原因のうち約73％を占めるが、糸状菌は植物や動物との細胞構造、生活環などの相違が大きく特定の糸状菌に選択的かつ効果の高い農薬が開発されやすい。これに対しウイルス病は5〜7％程度であるが、病原体は生命の基本物質である核酸とタンパク質で構成されており、また、宿主植物の複製・転写・翻訳メカニズムを利用し増殖することから、ウイルスを選択的または特異的に不活性化する物質の開発は非常に困難である。そのためウイルス病は一般的に防除が困難であるとされ、一度罹病してしまうと治療できず、それを放置しておくと新たな感染源となり更なる蔓延を引き起こす。殺虫剤などを用いたウイルス感染経路の遮断や、罹病植物の迅速な除去、抵抗性遺伝子やRNA干渉などを利用した育種（遺伝子組み換え
体の作出）など、ウイルス防除を目的とした多くの試みがなされているが、実際にはウイルス病の防除は非常に難しいのが現状である。

植物病害防除上、ウイルスの属、種レベルでの分類または同定が非常に重要である。属および種が同一であれば、媒介者やウイルスの特性が想定でき、それによってウイルス病制御の方法や病害対策を講じることがある程度可能となるからである。

実用化が進んでいる防除方法の一つにウイルスの干渉作用を利用した手法が挙げられる。干渉作用とは、あるウイルスに感染した植物はウイルスの二次感染から保護されるという現象である。弱毒ウイルスの開発も進んでおり（特許文献１）、一部ではCMVの弱毒ウ
イルスを予め接種した苗が商業化されている。しかしながら、核酸配列の相同性が高い近縁のウイルスにしか効果を示さないことが本手法の大きな欠点である。

現在までに抗ウイルス効果がある物質として複数の物質が報告されている。例えば、カンジダ・ファマータT1株またはその変異体が生産する多糖類（特許文献２）や、アメリカヤマゴボウ由来のタンパク質（特許文献３）、ツリガネタケ属に属する担子菌によって生産される酸性高分子多糖類(特許文献４)、スエヒロタケ属菌が培養物中に生産する高分子多糖類（特許文献５）、アルキルジエチレントリアミノ酢酸およびその塩（特許文献６）、茶サポニン（特許文献７）、ポリリシン（特許文献８）など多数報告されているが、現在のところ広く普及していない。

現在のところ、弱毒ウイルスや土壌殺菌剤を除けば、日本で農薬登録されている抗ウイルス剤はレンテミン（野田食菌工業株式会社の商標）一種のみである（農薬登録番号15584、17774、19439、19440）。レンテミンRは固形の培地にシイタケ菌の菌糸を培養し、培
地全体に菌糸体が蔓延した培地を砕いて培地ごと抽出したシイタケ菌糸体培養培地抽出成分が主成分である。そのためか単位体積当たりの価格は比較的高価である。その上、ウイルスによるモザイク病防除を目的とした場合推奨されているレンテミン液剤Rの希釈倍率
は1〜10倍と低いため（非特許文献１）、他の一般的な農薬に比べ単位耕作面積辺りの散
布に必要な費用も非常に高い。

微生物菌体の酸性加熱処理液によるウイルス感染抑制が知られており（特許文献９）、ウイルス（ムギ類萎縮ウイルス、ダイズモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス、ジャガイモ葉巻ウイルス）の感染抑制効果について言及されている。しかしながら、トバモウイルス属ウイルス、ククモウイルス属ウイルスの感染を抑制については知られていない。

また、アミノ酸醗酵液、具体的にはプロリン発酵液を植物に散布することで植物病原菌類（病原性糸状菌）による病害を防除する方法が知られているが（特許文献１０）、アミノ酸発酵副生液のウイルス病を防除する効果については知られていない。

特開平1-281079 特開2001-72521 特開平5-137580 特公平6-21122 特開平1-272509 特開平2-121903 特開平7-25718 特開昭63-2901 国際公開WO2009-88074 特開平6-80530

農薬便覧第10版、米山ら、農文協、第387〜389頁

本発明は、従来防除が困難な植物のウイルス病のリスクを低減させるため、効果的かつ安価なウイルス感染抑制剤を提供することを課題とする。

本発明者らは、効果的な植物ウイルス感染抑制剤を開発すべく鋭意研究し、驚くべきことに発酵副生液にウイルス感染抑制効果があることを発見した。発酵副生液の施用は、それが直接塗布されていない植物の組織においてもウイルスに対する抵抗性を高めたが、発酵副生液が直接塗布されている領域では非常に高いウイルス感染抑制効果が認められた。すなわち、本ウイルス感染抑制剤は、植物の病害抵抗性を誘導し、さらに植物表面に直接施用することによってウイルスの感染を低減させることができる。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。

すなわち本発明は以下の通りである。
（１）タバコ、トマト、ピーマン、トウガラシから選ばれる植物に対する、トバモウイルス（Tobamovirus）属ウイルス、およびククモウイルス(Cucumovirus)属ウイルスから選ばれる１種以上のウイルスの感染を抑制するためのウイルス感染抑制剤であって、アミノ酸発酵副生物及び核酸発酵副生物から選ばれる発酵副生物を含むことを特徴とする、ウイルス感染抑制剤。
（２）前記発酵副生物がアミノ酸発酵副生物である、前記ウイルス感染抑制剤。
（３）前記発酵副生物が核酸発酵副生物である、前記ウイルス感染抑制剤。
（４）アミノ酸発酵副生物がグルタミン酸、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、またはアルギニン発酵における副生物であることを特徴とする前記ウイルス感染抑制剤。
（５）核酸発酵副生物がイノシン、グアノシン、アデノシン、イノシン酸、キサンチル酸、又はグアニル酸発酵における副生物であることを特徴とする前記ウイルス感染抑制剤。（６）前記トバモウイルス（Tobamovirus）属ウイルスが、トウガラシマイルドモットル
ウイルス（Pepper mild mottle virus）、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）、またはトマトモザイクウイルス（Tomato mosaic virus）であり、ククモウイルス(Cucumovirus)属ウイルスがキュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus）である
前記ウイルス感染抑制剤。
（７）タバコ、トマト、ピーマン、トウガラシから選ばれる植物の植物体に、前記ウイルス感染抑制剤を、発酵副生液換算で0.01〜10%(v/v)の濃度で散布することによって、植物へのウイルス感染を抑制する方法。
（８）前記植物体への散布が、ウイルス感染が予想される日の１日前〜１０日前に実施されることを特徴とする前記方法。

本発明により、効果的な植物ウイルス感染抑制剤を提供することが可能となり、さまざまな植物におけるウイルス病害が低減される。
本発明の植物ウイルス感染抑制剤は、アミノ酸発酵や核酸醗酵を行った後に残存する副生液を利用できるため、安価かつ容易に得られ、大量生産も可能である。

グルタミン酸発酵副生液散布のキュウリモザイクウイルスのタバコへの感染を抑制する効果を示す図（生物の形態を示す写真）。接種葉および非接種上位葉の上部の数値（0%、0.1%、0.5%、1.0%）は処理したアミノ酸発酵副生液の濃度を示す。dpi；day post-inoculation、接種後日数（以下の図面でも同様）。 グルタミン酸発酵副生液散布によるキュウリモザイクウイルス病遅延効果を示す図（生物の形態を示す写真）。1.0% アミノ酸発酵副生液を葉面散布後、キュウリモザイクウイルスを接種して約１ヶ月後のタバコ植物の様子を示す。 グルタミン酸発酵副生液散布のタバコモザイクウイルスのタバコへの感染を抑制する効果を示す図（生物の形態を示す写真）。接種葉の上部の数値は処理したアミノ酸発酵副生液の濃度を示す。 グルタミン酸発酵副生液の直接散布による効果を示す図（生物の形態を示す写真）。模式図で発酵副生液の処理方法を示す。発酵副生液で処理した領域で顕著なウイルス感染効果が認められる。Mock接種；擬似接種 トマトにグルタミン酸発酵副生液を散布することによって起こるキュウリモザイクウイルスの感染阻害を示す図（生物の形態を示す写真）。接種葉を非接種上位葉の上部の数値は処理したアミノ酸発酵副生液の濃度を示す。 ピーマンにグルタミン酸発酵副生液を散布することによって起こるキュウリモザイクウイルスの感染阻害を示す図（生物の形態を示す写真）。接種葉を非接種上位葉の上部の数値は処理したアミノ酸発酵副生液の濃度を示す。 スレオニン発酵副生液の葉面散布によるキュウリモザイクウイルス感染抑制効果を示す図（生物の形態を示す写真）。接種上位葉の上部の数値（0%、0.1%、0.5%、1.0%）は処理したスレオニン発酵副生液の濃度を示す。 核酸発酵副生液（イノシン、グアノシン、アデノシン、イノシン酸、及びグアニル酸発酵副生液の混合物）の葉面散布によるキュウリモザイクウイルス感染抑制効果を示す図（生物の形態を示す写真）。接種上位葉の上部の数値（0%、0.1%、0.5%、1.0%）は処理した核酸発酵副生液の濃度を示す。

本発明の植物ウイルス感染抑制剤（以下、「本発明の薬剤」、又は単に「薬剤」ともいう。）は、アミノ酸発酵副生物、核酸発酵副生物、又はこれらの両方を含む。「ウイルス
感染抑制」とは、少なくとも病原ウイルスによる植物の罹病を防除又は低減することを意味し、その作用は制限されず、ウイルスの植物細胞への侵入の抑制、増殖の抑制、又はそれら以外のいずれによるものであってもよい。したがって、「ウイルス感染抑制剤」は、「ウイルス病防除剤」であってもよい。また、「植物へのウイルス感染を抑制する方法」は、「植物のウイルス病の防除方法」であってもよい。
本発明においてアミノ酸発酵副生物とは、発酵法によって製造されるアミノ酸を取り除いた後に残る副生液（アミノ酸発酵副生液）、又はその濃縮液もしくは乾固物、又はそれらの分画物等の総称である。このアミノ酸発酵副生物には、当該発酵によって製造されるアミノ酸及び／又はその誘導体が残存している。
本発明において核酸発酵副生物とは、発酵法によって製造される核酸を取り除いた後に生じる副生液（核酸発酵副生液）、又はその濃縮液もしくは乾固物、又はそれらの分画物等の総称である。核酸発酵副生物には、当該発酵によって製造される核酸及び／又はその誘導体が残存している。
発酵副生液は、培地から目的物質を採取するために酸等が添加されてもよく、除菌等のために加熱処理されてもよい。

アミノ酸発酵副生物または核酸発酵副生物に含まれるアミノ酸又は核酸は特に制限されず、後述する各種アミノ酸及び核酸が含まれる。また、発酵副生物に含まれるアミノ酸又は核酸は、１種でもよく、２種以上であってもよい。アミノ酸発酵副生物として具体的には、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミンなどの塩基性または中性アミノ酸発酵液をｐＨ調整した後、強酸性陽イオン樹脂に通じ、当該アミノ酸を吸着させた後の貫流液及びその濃縮液、並びに、Ｌ−グルタミン酸などの酸性アミノ酸発酵液を鉱酸でｐＨを等電点に調整し、析出した当該アミノ酸結晶を固液分離したときに得られる母液、及びその濃縮液を例示することができる。

また、核酸発酵副生物として具体的には、イノシン酸又はグアニル酸等の核酸発酵液を、溶解度差を利用した冷却晶析及び濃縮晶析することで当該核酸を晶析し、析出した結晶を固液分離したときに得られる母液およびその濃縮液を例示することができる。また、核酸発酵副生液は、イノシン酸やグアニル酸等の核酸を直接発酵により生成させた発酵液から目的物を採取した後の副生液に限られず、イノシン又はグアノシン等の発酵液中のこれらのヌクレオシドを酵素的又は微生物学的にリン酸化して得られるヌクレオチドを含む発酵液から目的物を採取した後の副生液であってもよい。これら発酵副生物には、通常、固形分として、各種アミノ酸（5〜20倍濃縮液で5〜14重量%含有）、又は各種核酸（5〜20倍濃縮液で5〜15重量％含有）の他、糖類、発酵菌体、有機態窒素、無機態窒素、ビタミン
等の栄養分が多量に含まれている（固形分含量は30〜50重量%）。

アミノ酸の発酵副生物は、目的アミノ酸を分離した後、濃縮、乾固又は分画等の操作前の発酵副生液の状態で、好ましくは1mM以上、より好ましくは2mM以上、さらに好ましくは5mM以上、当該アミノ酸を含むことが好ましい。また、アミノ酸の発酵副生物は、発酵の
目的物質であるアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。さらに、アミノ酸の発酵副生物は、異なるアミノ酸を目的物質とする複数種の発酵副生物の混合物であってもよい。

核酸の発酵副生物は、目的核酸を分離した後、濃縮、乾固又は分画等の操作前の発酵副生液の状態で、好ましくは1mM以上、より好ましくは2mM以上、さらに好ましくは10mM以上、当該核酸を含むことが好ましい。また、核酸の発酵副生物は、発酵の目的物質である核酸以外の核酸を含んでいてもよい。さらに、アミノ酸の発酵副生物は、異なる核酸を目的物質とする複数種の発酵副生物の混合物であってもよい。

アミノ酸発酵副生液として具体的には、コリネバクテリウム属、パントエア属またはエシェリヒア属に属する微生物を使用し、スクロース、デンプン、サトウキビ、コーン、甜
菜、キャッサバ、ユーグレナ等の藻類等の糖源、或いは菜種油、パーム油、オリーブ油、ひまわり油、大豆油、コメ油、ヘンプ・オイル、魚油、豚脂、牛脂、ラフィド藻、ボトリオコッカス等の藻類等由来の油源を主原料とした炭素源、窒素源の他に、無機イオンその他の栄養素を適宜含有される培地を用いて培養を行ったものから、硫酸又は塩酸を用いてｐＨを低下させ、析出するアミノ酸を晶析回収後、更に濃縮加熱処理を行って調製されたものが挙げられる。このような発酵副生液の原液は、通常アミノ酸を約1〜10%(W/V)含有
している。

また、核酸発酵副生液として具体的には、バチルス属に属する微生物を使用し、スクロース、デンプン、サトウキビ、コーン、甜菜或いはキャッサバを主原料とした炭素源、窒素源の他に、無機イオンその他の栄養素を適宜含有される培地を用いて培養を行ったものから、硫酸又は塩酸を用いてｐＨを調整して析出するイノシン、グアノシンを晶析回収後、更に濃縮加熱処理を行って調製された発酵副生液に、先述のイノシン、グアノシンをモルガネラ属、セラチア属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、クロモバクテリウム属、セデシア属またはエシェリヒア属に属する微生物を使用してリン酸化し、生成するイノシン酸、グアニル酸を回収した後の濃縮加熱処理液を加えたものが挙げられる。このような発酵副生液の原液は、通常、イノシン酸、及びグアニル酸を、それぞれ約1〜8%(W/V)、及び1〜6%(W/V)含有している。

前記発酵に用いる微生物及び培地は、例えば、欧州特許公開EP0643135B、EP0733712B、EP1477565A、EP0796912A、EP0837134A、EP1170376A、国際公開WO01/53459、WO2005/010175、WO96/17930等に記載されているものが例示できる。

後述の実施例で使用したＬ−グルタミン酸発酵副生液、Ｌ−スレオニン発酵副生液、及び核酸発酵副生液（イノシン、グアノシン、アデノシン、イノシン酸、及びグアニル酸発酵副生液の混合物）は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、又はバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）を用いて上記のようにして得られたものである。

発酵の目的物質としてのアミノ酸、又は発酵副生物に含まれるアミノ酸としては、リジン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、シトルリン等の塩基性アミノ酸、イソロイシン、アラニン、バリン、ロイシン、グリシン等の脂肪族アミノ酸、スレオニン、セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、プロリン等の環式アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン等の芳香族アミノ酸、システイン、シスチン、メチオニン等の含硫アミノ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸等の酸性アミノ酸、グルタミン、アスパラギン等の側鎖にアミド基を持つアミノ酸が挙げられる。また、アミノ酸は、アミノ酸誘導体、例えばトリメチルグリシン、カルニチン等のようなベタイン、モノメチルグリシン、ジメチルグリシン、又はGABA等であってもよい。

中でも、グルタミン酸、リジン、フェニルアラニン、アルギニン、アラニン、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、グリシン、GABA、ベタイン、ジメチルグリシン、ロイシン、メチオニン、システイン、チロシン、プロリン、シトルリン、バリン、セリン、バリン、イソロイシン、トリプトファンが好ましく、グルタミン酸、リジン、フェニルアラニン、及びアルギニンがより好ましい。
アミノ酸は、フリー体のアミノ酸及び／またはその塩、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩を含む。また、アミノ酸は、Ｌ−体であってもＤ−体であってもよいが、Ｌ−体が好ましい。

発酵の目的物質としての核酸、又は発酵副生物に含まれる核酸としては、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸塩基等が挙げられる。
核酸塩基は、プリン及びピリミジンのいずれであってもよい。また、ヌクレオシド及びヌクレオチドは、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌクレオシド、プリンヌクレオチド、ピリミジンヌクレオチドのいずれであってもよい。さらに、ヌクレオシド及びヌクレオチドを構成する糖は、リボースであってもデオキシリボースであってもよいが、リボースが好ましい。

核酸塩基としては、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンが挙げられる。

ヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、チミジン、シチジン、ウリジン、キサントシン、及びイノシン、並びにこれらの２’−デオキシ体が挙げられる。

ヌクレオシドとしては、アデニル酸（アデノシン−５’−リン酸）、グアニル酸（グアノシン−５’−リン酸）、チミジル酸（チミジン−５’−リン酸）、ウリジル酸（ウリジン−５’−リン酸）、キサンチル酸（キサントシン−５’−リン酸）、及びイノシン酸（イノシン−５’−リン酸）、並びにこれらの２’−デオキシ体が挙げられる。

ヌクレオシドとしては、プリンヌクレオシドが好ましく、イノシン又はグアノシンがより好ましい。
ヌクレオチドとしては、プリンヌクレオチドが好ましく、イノシン酸又はグアニル酸がより好ましい。

核酸はフリー体であってもよく、ナトリウム塩、カリウム塩等の塩であってもよい。

上記核酸の発酵副生物は、前記したように、さらにリン酸化された核酸を含んでいてもよい。

本発明の植物ウイルス感染抑制剤は、上記のような、アミノ酸発酵副生物、又は核酸発酵副生物を含む。
本発明の薬剤は、後述の実施例２に示されるように、それが直接塗布されていない植物の組織においてもウイルスに対する抵抗性を高めることができるため、植物への施用方法は特に制限されないが、薬剤が直接塗布されている領域では非常に高いウイルス感染抑制効果が認められることから、植物体、例えば植物体全体又は葉面への散布が特に好ましい。

薬剤の剤型は散布可能な形態であることが好ましく、液剤、例えば乳剤、水和剤、油剤、エアゾール、フロアブル剤等の何れの使用形態でも良いが、散布した部分で特に効果が高いため、植物表面に満遍なく均一に散布できることが好ましい。また、薬剤は、使用時に散布可能に調製できる限り、粉剤、又は固形剤であってもよい。「散布」は、液剤においては「噴霧」を含む。

薬剤中のアミノ酸発酵副生物、核酸発酵副生物、又はアミノ酸、もしくは核酸の含量は特に制限されず、植物の種類又は植物への施用量等によって適宜設定することができる。具体的には例えば、アミノ酸発酵副生物又は核酸発酵副生物については、薬剤が液体の場合、又は薬剤が固体であって使用時に液体として用いられる場合は、発酵副生液換算で、好ましくは0.01重量%以上、より好ましくは0.1重量%が以上好ましい。含有量の上限は特
に制限されないが、好ましくは10重量%以下、より好ましくは１重量％以下、さらに好ま
しくは0.5重量%以下が好ましい。「発酵副生液換算で」とは、発酵副生物が発酵副生液の濃縮物又は乾固物等である場合、もとの発酵副生液の重量に換算した値であることを意味する。

本発明の薬剤は、前記のとおり、ウイルスに対する誘導抵抗性を引き起す作用に加えて、薬剤を散布又は塗布等により直接施用した部位へのウイルス感染を顕著に防除する作用を有している。
薬剤の施用は、ウイルス感染が予想される日の１日前〜１０日前に実施されることが好ましいが、上述したような誘導抵抗性の維持、及び、薬剤施用部位でのウイルス感染の防除の観点から、散布はなるべく高頻度で行うことが望ましく、3〜7日に１度、最低でも2
週間に１度の頻度で散布することが推奨される。液剤の場合、一般的に適正な散布液濃度は発酵副生液換算で0.1〜1.0%(v/v)であるが、植物によっては必要以上に高濃度で散布すると薬害が出る場合があり、厳密には散布濃度は保護する農作物によってそれぞれ異なる。例えばタバコでは0.2%〜2.0%(v/v)、トマトは0.05〜1.0%(v/v)が好ましい。
また、散布量としては、作物の種類、葉の総面積、希釈倍率にもよるが、通常、発酵副生物の固形物換算で、1kg〜100kg／ヘクタールが好ましい。

発酵副生液中には通常消泡剤成分が残存しており、これに展着効果があるため展着剤を添加することなく使用できるが、農作物表面をより効果的に施用するためには最終濃度が0.01 〜0.5重量%になるよう、新たに展着剤を加えることが推奨される。

本発明より防除されうる植物ウイルスとしては、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）、トマトモザイクウイルス（Tomato mosaic virus）、トウガラシマイルド
モットルウイルス（Pepper mild mottle virus）などトバモウイルス（Tobamovirus）属
ウイルスや、キュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus）などのククモウイル
ス(Cucumovirus)属ウイルスが挙げられる。

ウイルス病を効果的に抑制するためには、本剤の植物体全体への施用に加え、殺虫剤による感染経路の遮断、罹病作物の早期除去、弱毒ウイルスの予防接種などを総合的に組み合わせることが好ましい。

以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕アミノ酸発酵副生液の植物ウイルス感染抑制効果
播種後約5週間生育させたタバコ（Nicotiana tabacum cv. Samsun）全体に、0%（滅菌
水）、0.1%(v/v)、0.5%(v/v)、1.0%(v/v)に希釈したＬ−グルタミン酸発酵副生液を散布
し2日間培養した。適度な大きさの下位葉の1枚にカーボランダム（ナカライテスク株式会社）を、薄く一面にふりかけた後、5μg/mlのキュウリモザイクウイルス（CMV）Y系統溶
液、または2.5μg/mlタバコモザイクウイルス（TMV）を、葉一枚あたり100μl滴下し、ゴム手袋をはめた指で葉の全面を撫でるように溶液を塗り広げることで人工接種を行った。接種5日後に接種葉を、接種9日後に上位葉を、各々採取した。各々の葉から調製した葉汁液をろ紙に転写し、抗CMV抗血清または抗TMV抗血清による免疫染色（TPI）により、CMVおよびTMVの局在を検出した。

その結果、接種葉では発酵副生液の処理濃度依存的に感染サイト数が減少する傾向が認められた（図１）。また、0.5〜1.0%発酵副生液処理区でCMVの上位葉移行抑制が認められた。本実験では、上位葉でCMVが全く観察されなかったわけではないが、発酵副生液の濃
度依存的に染色シグナルが低い傾向にあった。また処理区では病徴を呈するまでの時間にも遅延が見られた(図２)。これらと同様の現象がTMVを感染させた実験においても確認さ
れた（図３）。これらの実験結果から、発酵副生液には葉面散布によりウイルス感染を阻
害する効果があること、その結果ウイルスの侵入量が減ることで全身移行の遅延が起こっていることが推測された。

〔実施例２〕アミノ酸発酵副生液を植物に直接施用することによる効果的なウイルス感染抑制
ウイルスに対する病害応答の一つにサリチル酸経路の活性化が挙げられる。例えば、サリチル酸を分解する酵素を強発現させた植物体ではウイルスに対する感受性が高まることが広く知られており、サリチル酸経路の活性化は植物のウイルスに対する抵抗性機構の一つだと考えられている。またこのサリチル酸は植物のシグナル因子であり、全身的な抵抗性誘導（全身獲得抵抗性）を引き起こす植物ホルモンである。発酵副生液によるウイルス感染がこの経路の活性化によるものであるのか検証するため、次の実験を行った。

実施例１と同様の条件で生育させたタバコの葉の表面半分（図４模式図）に1.0%(v/v)
のグルタミン酸発酵副生液または滅菌水を塗布し、2日間培養した。実施例１と同様の手
順で葉全体にCMV、またはTMVを接種し3日間培養後、接種葉を採取した。葉汁液をろ紙に
転写し、抗CMV抗血清または抗TMV抗血清を用いたTPIにより、各ウイルスの局在を検出し
た。

サリチル酸の生合成や全身獲得抵抗性がウイルス感染抑制の原因であるならば、直接発酵副生液を塗布されていない半面でも顕著な感染スポットの現象が観察されるはずである。
その結果、発酵副生液を塗布した葉のうち、直接発酵副生液が塗布されていない葉面半分では、滅菌水を処理した葉に比べ、感染スポットの数が減少していた（図４）。発酵副生液中に含まれる発酵菌体の残渣は抵抗性を誘導するエリシター活性をもつことが明らかになっていることから（WO2009/88074）、塗布されていない右半面にも抵抗性が誘導され、その結果として一定レベルのウイルス感染抑制効果が観察されたものと考えられた。

またさらに、予想に反し、発酵副生液が直接接触している部分で特異的に、より顕著な感染スポット数の減少が認められた（図４）。これらの結果から発酵副生液によるウイルス感染抑制は、発酵副生液中に含まれるエリシターによって誘導される植物の病害抵抗性誘導に加え、発酵副生液が直接塗布されている領域で特徴的に起こる何らかの反応もしくは応答が原因であると考えられた。

〔実施例３〕トマトにおけるウイルス感染阻害効果
トマト（Solanum lycopersicum、品種：桃太郎ファイト）の葉面にグルタミン酸発酵副生液を散布してから2日後、実施例１と同様の手順で5μg/mlのCMVを接種した。4日後に抗CMV抗血清によるTPIによりCMVの局在を検出した。その結果、発酵副生液の濃度依存的な
ウイルスの感染スポット数の減少が認められた（図５）。

〔実施例４〕ピーマンにおけるウイルス感染阻害効果
ピーマン（Capsicum annuum、品種：昌介）の葉面にグルタミン酸発酵副生液を散布し
てから2日後、実施例１と同様の手順で5μg/mlのCMVを接種した。4日後に抗CMV抗血清に
よるTPIによりCMVの局在を検出した。その結果、ピーマンにおいても、タバコやトマト同様、発酵副生液の濃度に依存した感染スポット数の減少が観察された（図６）。

〔実施例５〕グルタミン酸以外のアミノ酸発酵副生液によるウイルス感染阻害
上述の実験では全てグルタミン酸の発酵副生液を供試してきたが、グルタミン酸以外の発酵副生液にも同様の作用があるのか検証するため、Ｌ−スレオニンの発酵副生液を実施例１と同様の手順でタバコに処理した後CMVを接種し、3日後に同ウイルスの局在を検出した。その結果、グルタミン酸発酵副生液と同様、濃度依存的に感染スポット数の減少が観
察された（図７）。このことは、グルタミン酸以外のアミノ酸発酵副生液にもウイルスの感染を抑制する効果があることを示唆している。

〔実施例５〕核酸酸発酵副生液によるウイルス感染阻害
核酸醗酵副生液でも効果があるのか検証するため核酸発酵副生液（イノシン、グアノシン、アデノシン、イノシン酸、及びグアニル酸発酵副生液の混合物）をタバコに葉面散布後、実施例１と同様の手順で5μg/mlのCMVを接種し、4日後に抗CMV抗血清によるTPIによ
りCMVの局在の検出を行った。その結果、アミノ酸発酵副生液と同様、濃度依存的に感染
スポット数の減少が観察された（図８）。このことは、核酸酸発酵副生液にもウイルスの感染を抑制する効果があることを示している。

Claims (8)

1. タバコ、トマト、ピーマン、トウガラシから選ばれる植物に対する、トバモウイルスTobamovirus（Tobamovirusトバモウイルス）属ウイルス、およびククモウイルスCucumovirus(Cucumovirusククモウイルス)属ウイルスから選ばれる１種以上のウイルスの感染を抑制するためのウイルス感染抑制剤であって、アミノ酸発酵副生物及び核酸発酵副生物から選ばれる発酵副生物を含むことを特徴とする、ウイルス感染抑制剤。
2. 前記発酵副生物がアミノ酸発酵副生物である、請求項１に記載のウイルス感染抑制剤。
3. 前記発酵副生物が核酸発酵副生物である、請求項１に記載のウイルス感染抑制剤。
4. アミノ酸発酵副生液物がグルタミン酸、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、またはアルギニン発酵における副生物であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のウイルス感染抑制剤。
5. 核酸発酵副生物がイノシン、グアノシン、アデノシン、イノシン酸、又はグアニル酸発酵における副生物であることを特徴とする請求項１又は３に記載のウイルス感染抑制剤。
6. 前記トバモウイルス（Tobamovirus）属ウイルスが、トウガラシマイルドモットルウイ
   ルス（Pepper mild mottle virus）、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus）、またはトマトモザイクウイルス（Tomato mosaic virus）であり、ククモウイルス(Cucumovirus)属ウイルスがキュウリモザイクウイルス（Cucumber mosaic virus）である、請
   求項１〜５のいずれか一項に記載のウイルス感染抑制剤。
7. タバコ、トマト、ピーマン、トウガラシから選ばれる植物の植物体に、請求項１〜６のいずれか一項に記載のウイルス感染抑制剤を、発酵副生液換算で0.01〜10%(v/v)の濃度で散布することによって、前記植物へのウイルス感染を抑制する方法。
8. 前記植物体への散布が、ウイルス感染が予想される日の１日前〜１０日前に実施されることを特徴とする請求項７に記載の方法。