JP2018197193A - コーヒーノキの病害抵抗性増強剤および病害防除法 - Google Patents

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Abstract

【課題】コーヒーノキの病害の防除に有効な病害抵抗性増強剤を提供する。
【解決手段】リジンを含むコーヒーノキの病害抵抗性増強剤をコーヒーノキの葉等に施用することによって、コーヒーノキの病害を防除する。
【選択図】図１

Description

本発明は、コーヒーノキの病害抵抗性増強剤およびそれを用いた病害防除法に関する。
農作物の病害を防除するために、殺菌剤などを植物病原菌に直接作用させることで病害を防除する農薬や、植物自体が有する病害抵抗性を高めることで作物の病害を防除する農園芸組成物が使用されている。
近年、環境への影響や、コストの点などの問題から、環境への影響が少なく、安価な農園芸用組成物の成分として、アミノ酸及びアミノ酸発酵副生物が期待されている。
例えば、アミノ酸については、グルタミン酸、スレオニン、セリン及びプロリンからなる群から選ばれるアミノ酸を含むウリ科植物の病害抵抗性増強剤（特許文献１）や、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、スレオニン、アラニン、バリン、アルギニン、及びセリンからなる群から選ばれるアミノ酸を含むイネの病害抵抗性増強剤（特許文献２）が報告されている。また、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン、又はＬ−グリシンで水田を処理することによってイネの病害を抑制するとの報告もある（非特許文献１）。
また、アミノ酸発酵副生物については、アミノ酸発酵副生物を含有する、植物のアレロパシー効果、および／またはファイトアレキシン生産の増強用薬剤（特許文献３）、及び、アミノ酸発酵副生物を含むウイルス感染抑制剤（特許文献４）が報告されている。アミノ酸発酵副生物として、前者ではグルタミン酸が、後者ではグルタミン酸、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、またはアルギニンが挙げられている。また、前記ウイルスは、タバコ、トマト、ピーマン、トウガラシから選ばれる植物に対する、トバモウイルス（Tobamovirus）属ウイルス、又はククモウイルス(Cucumovirus)属ウイルスである。
さらに、リジン又はグルタミン酸の発酵液による病害防除について報告されているが（特許文献５）、データは記載されておらず、有効成分が不明であり、作用も明らかではない。
また、微生物菌体を酸性溶液中で加熱処理することにより得られる抽出液を含む、植物用病害耐性増強剤が開示されており（特許文献６）、前記抽出液としては、アミノ酸等の発酵を行なった後の各種微生物菌体残渣や有機性汚泥に含まれる微生物菌体を酸性溶液中で加熱処理したものが記載されている。
上記のように、農作物の病害を防除するために、アミノ酸、アミノ酸発酵副生物、及び微生物菌体が利用されている。また、リジンの前駆体であるピペコリン酸が、植物の病害抵抗性応答における因子であることが知られており（非特許文献２）、イネ、ジャガイモ、ダイズでは病原菌で誘導されるピペコリン酸が蓄積されることが知られている（非特許文献３）。一方、イネ、ウリ科植物、又はナス科植物等の病害抵抗性に対するアミノ酸の影響について研究がなされ、植物によって、グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン、又はグルタミン酸発酵副生物等によって病害抵抗性が誘導されることが報告されている（非特許文献４、５）。しかしながら、リジンによる顕著な効果は認められておらず、コーヒーノキの病害防除にリジン又はリジン発酵副生物が有効であることは知られていなかった。
EP2524597 WO2012/046758 特開2012-010694 US2014219993 中国特許公報第1155543C WO2009/088074
Voleti, S.R. et al., Crop Protection, 2008, 27:1398-1402 Navarova, H. et al., Plant Cell 24:5123-5141 Vogel-Adghough, D. et al., Plant Signal Behav. 2013 8(11): e26366 五十嵐大亮（Igarashi D.）ら、園芸学研究、第１２巻、別冊２、第４０６頁、２０１３年 角谷直樹（Kadotani N.）ら、植物感染生理談話会論文集第４７号、第３３〜４２頁
本発明は、コーヒーノキの病害の防除に有効な病害抵抗性増強剤及びおよび病害防除法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、コーヒーノキの病害抵抗性に関与する遺伝子の発現がリジンによって誘導されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）リジンを含むコーヒーノキの病害抵抗性増強剤。
（２）病害がさび病である前記病害抵抗性増強剤。
（３）リジンの濃度が０．２ｍＭ〜１００ｍＭとなるようにコーヒーノキに施用される、前記病害抵抗性増強剤 。
（４）リジンがＬ−リジンである前記病害抵抗性増強剤。
（５）コーヒーノキが、アラビカコーヒーノキ、ロブスタコーヒーノキ、及びリベリカコーヒーノキからなる群から選ばれる、前記病害抵抗性増強剤。
（６）リジンをコーヒーノキに施用する、コーヒーノキの病害を防除する方法。
（７）病害がさび病である前記方法。
（８）施用時のリジンの濃度が０．２ｍＭ〜１００ｍＭである、前記方法。
病害抵抗性増強剤。
（９）リジンの量として、５０ｇ〜２００ｋｇ／ヘクタールの量で施用する、前記方法。（１０）リジンがＬ−リジンである前記方法。
（１１）コーヒーノキに対して病害抵抗性増強作用を有する、リジンを含む農業用組成物。
本発明の病害抵抗性増強剤は、コーヒーノキの病害抵抗性を増強することができ、病害防除に有効である。病害抵抗性増強剤の成分であるリジン又はリジン発酵副生物は、環境への影響が少なく、安全性が高い。
各種アミノ酸によるCaWRKY1遺伝子の発現誘導を示す図。CaGAPDH遺伝子に対する相対発現量を示す（以下、図８まで同様）。丸印は標準偏差を示す（以下、同様）。 各種アミノ酸によるCaNDR1遺伝子の発現誘導を示す図。 各種アミノ酸によるCaRLK遺伝子の発現誘導を示す図。 各種アミノ酸によるCaLOX13遺伝子の発現誘導を示す図。 Glu、Arg、Lys、Asp、Asn、ProによるCaWRKY1、CaNDR1遺伝子の発現誘導を示す図。バーは標準偏差を示す（以下、同様）。 Glu、Arg、Lys、Asp、Asn、ProによるCaRLK、CaLOX13遺伝子の発現誘導を示す図。 各種濃度のリジンによるCaWRKY1、CaNDR1遺伝子の発現誘導を示す図。 各種濃度のリジンによるCaRLK、CaLOX13遺伝子の発現誘導を示す図。 イネイモチ病防除に対する各種アミノ酸の効果を示す図。 キュウリの病害抵抗性関連酵素（キチナーゼ）の活性に対する各種アミノ酸の効果を示す図。 タバコの病害抵抗性遺伝子の誘導に対する各種アミノ酸（Glu、Ala、Lys）の効果を示す図。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、リジンを含むコーヒーノキの病害抵抗性増強剤である。病害抵抗性増強剤は病害防除剤でもあり得る。また、本発明は、農薬には限られず、リジンを含むコーヒーノキの病害抵抗性増強用、もしくは病害防除用の農業用組成物、又は、コーヒーノキに対して病害抵抗性増強作用を有する農業用組成物でもあり得る。
本発明の他の形態は、リジンをコーヒーノキに施用する、コーヒーノキの病害防除方法である。
コーヒーノキは、アカネ科（Rubiaceae）コーヒーノキ属（Coffea）に属する植物である。本発明においてコーヒーノキは特に制限されないが、種としては、例えばアラビカコーヒーノキ（Coffea arabica）、ロブスタコーヒーノキ（Coffea robusta、Coffea canephora）、リベリカコーヒーノキ（Coffea liberica）が挙げられる。本発明が適用されるコーヒーノキは、１種でもよく、２種以上であってもよい。
リジンは、Ｌ−体、Ｄ−体、及びその混合物のいずれでもよいが、Ｌ−リジンが好ましい。リジンは、塩酸塩、炭酸塩等の塩であってもよい。また、リジンは、精製又は粗精製されたものであってもよく、本発明の効果を損なわない限り、リジン発酵における精製途中の工程液やリジンを含む培養物（発酵液）もしくは発酵副生物、又はリジンを含むそれらの分画物であってもよい。病害抵抗性増強剤の製造に使用するリジンの性状も特に制限されず、結晶、粉体、粒体、スラリー、又は水溶液等の液状のいずれでもよい。
実施例に示されるように、リジンはコーヒーノキの病害抵抗性に関与する遺伝子の発現を誘導又は増強する。したがって、リジンをコーヒーノキに施用することによって病害抵抗性が増強され、病害を防除することができる。前記遺伝子としては、WRKY1、NDR1、RLK、及び、LOX13が挙げられる。また、「病害の防除」は、病害の予防、減弱、及び治療を含む。
本発明の病害抵抗性増強剤によって防除される病害としては、病害抵抗性遺伝子の発現増強によって防除され得るものであれば得に制限されないが、例えば、さび病（Hemileia
vastatrix）、Brown Eye Spot（Cercospora coffeicola）、コーヒー炭疽病（Colletotrichum coffeanum）、Seedling blight（Fusarium stilboides Wollenw）、コーヒー萎凋病（Fusarium xylarioides）、コーヒー斑点細菌病（Psedomonas syringae pv. Garcae）等が挙げられる。
本発明の病害抵抗性増強剤は、本発明の効果を損なわない限り、有効成分であるリジン以外に任意の成分を含んでいてもよい。このような成分としては、安定化剤、担体、pH調整剤、肥効を高めるためのミネラル等の肥料成分、農薬成分、バインダー、増量剤等が挙げられる。これらの成分としては、本発明の効果を損なわない限り、通常農薬、肥料等に用いられている成分を用いることができる。
また、病害抵抗性増強剤は、リジン以外の他のアミノ酸を含んでいてもよい。しかしながら、他のアミノ酸には、コーヒーノキの病害抵抗性遺伝子の発現を低減させるものがあるため、そのようなアミノ酸の病害抵抗性増強剤における含量は少ない方が好ましく、含まれないことがより好ましい。例えば、他のアミノ酸の含量は、病害抵抗性増強剤がコーヒーノキに施用されるときの濃度として、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下である。一方、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリンは、リジンと同様にコーヒーノキの病害抵抗性遺伝子の発現を増強する作用を有しており、これらの１種又は任意の２種以上をリジンと共に含有していてもよい。これらのアミノ酸の好ましい含量は、後述するリジンの含量と同様である。
病害抵抗性増強剤の剤型は、使用時にコーヒーノキに施用可能な溶液を調製することができる限り特に制限されず、液剤、粉剤、粒剤、乳剤等の何れの使用形態でも良い。
本発明の病害抵抗性増強剤は、後述するように、コーヒーノキに散布する場合は葉面及び／又は果実に散布することが好ましい。葉面又は果実への病害抵抗性増強剤の展着力を高めるために展着剤を、また、リジンの植物への浸透性を高めるために界面活性剤等の成分を添加してもよい。展着剤としては、例えばアプローチＢＩ TM（花王（株））、ミックスパワー TM（シンジェンタ ジャパン（株））、スカッシュ TM（丸和バイオケミカル（株））などが挙げられる。界面活性剤としては非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両イオン性のいずれも使用することが出来る。例を挙げると、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、オキシエチレンポリマー、オキシプロピレンポリマー、ポリオキシエチレンアルキルリン酸エステル、脂肪酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルリン酸塩、アルキルリン酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル、第四級アンモニウム塩、オキシアルキルアミン、レシチン、サポニン等である。また、必要に応じてゼラチン、カゼイン、デンプン、寒天、ポリビニルアルコール、アルギン酸ソーダなどを補助剤として用いることが出来る。
また、使用に際して、固体状又は粉体状の病害抵抗性増強剤を、水、アルコール類等の溶媒に溶解又は分散させてもよい。また、液状の病害抵抗性増強剤を、水、アルコール類等の溶媒で希釈してもよい。アルコール類としては、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。
病害抵抗性増強剤の使用時のリジンの濃度は、通常０．２ｍＭ〜１００ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭである。
病害抵抗性増強剤は、好ましくは、コーヒーノキの葉、幹、茎、果実の表面、又は根圏に施用される。病害抵抗性増強剤は、これらの２箇所以上に施用してもよい。病害抵抗性増強剤を土壌に施用する場合であっても、病害抵抗性増強剤の成分、特にリジンが少なくとも根圏に到達する限り、「コーヒーノキに施用する」に含まれる。施用の方法としては、土壌への表面散布、潅注、鋤込み、果樹の葉面又は果実への散布もしくは展着、水耕溶液への添加等が挙げられる。これらの中では葉面又は果実への散布が好ましい。葉面散布は、少なくとも葉面に散布されればよいことを意味し、葉面と共に他の部位にも散布され
てもよい。果実についても同様である。
病害抵抗性増強剤中のリジンの含量は、使用時にリジンが前記した所定濃度の溶液として施用され得る限り特に制限されないが、例えば、乾燥物換算で１重量％以上、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上であり、塩害など不純物による障害の回避及び効果の顕在化の観点から、この範囲が好ましい。また、病害抵抗性増強剤の流通形態は固形物であっても溶液であってもよいが、溶液の場合は０．５ｍＭ〜飽和濃度であることが好ましい。
病害抵抗性増強剤の散布量は特に制限されないが、アミノ酸の量として、通常、50g〜200kg/ヘクタール、好ましくは125g〜40kg/ヘクタール、より好ましくは250g〜20kｇ/ヘクタールである。
コーヒーノキへの病害抵抗性増強剤の施用時期は、病害が発生する時期に先駆けて使用することが好ましい。ただし、病害の発生後であってもその拡大を抑制したり、病害を減弱する効果は期待できる。施用回数は特に制限されず、１回でもよく、２回以上であってもよい。
病害抵抗性増強剤を散布する場合、散布方法は特に制限されないが、茎葉、果実を含む植物の地上部全体、好ましくは葉面及び／又は果実に病害抵抗性増強剤が展着するように散布することが望ましい。人手により散布する場合は、病害抵抗性増強剤の噴霧口が葉表面ないしは裏面部位に向くような操作が望まれる。また、ブームスプレーヤーを使用する場合は、散布液量を１ヘクタール当たり１００リットル以上、好ましくは２００〜４０００リットル、より好ましくは３００〜３０００リットルとすることが望ましい。また、静電気を利用することにより噴霧液の植物体への付着を促進させるいわゆる静電噴霧機や静電噴霧ノズル口を用いてもよい。
病害抵抗性増強剤を葉面及び／又は果実に散布する場合、本発明の効果を損なわない限り、農業上通常用いられる葉面散布用肥料と混合してもよい。
コーヒーノキを栽培する土壌に施用する基肥、追肥は、その地域で通常行われている施肥量、施肥方法に準拠すればよい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例において、アミノ酸はＬ−体である。
〔実施例１コーヒーノキの病害抵抗性遺伝子の誘導に対するリジンの効果
１．アミノ酸処理したコーヒーノキの葉からのcDNAの調製
コーヒーノキの完全展開葉１枚より作製した1cm角のリーフディスクを用いて、20種類のアミノ酸の病害抵抗性遺伝子発現量に及ぼす影響を調べた。
20mMリン酸緩衝液（pH6.0）と10mMの各アミノ酸を単独で含む処理液、及び、mock（モック）として20mMリン酸緩衝液のみの処理液を、6 ウェルプレートに１ウェル当たり5mL入れ、リーフディスクを1枚ずつ、背軸面（葉の裏面）を下にして浮かべ、24時間放置した。その後、リーフディスク片から核酸精製キット（Promega社、Maxwell（登録商標） 16 LEV simplyRNA Tissue Kit）を用いてRNAを分離した。続いてリアルタイムPCR用cDNA合成試薬（東洋紡、ReverTra Ace（登録商標）qPCR RT Master Mix）を用いてcDNAを合成した。
２．コーヒーノキさび病抵抗性関連遺伝子発現の解析
さび病感染時に発現誘導が起こることが報告されている遺伝子（Ganesh D. et al., Plant Science 170:1045-1051 (2006) 、Diola V.et al., Eur J Plant Pathol, 133:141-157 (2013)、Diniz I. et al., Eur J Plant Pathol, 133:141-157 (2012)）について、アミノ酸による発現誘導を解析した。上記のcDNAを鋳型とし、表１に示したプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。CaWRKY1は転写因子（transcription factor）、CaNDR1はアラビドプシスに相同な種非特異的病害抵抗性NDR1（homology to Arabidopsis non-race
specific disease resistance NDR1）、CaRLKは受容体様キナーゼ（receptor-like kinase）、CaLOX13はリポキシゲナーゼ、CaGAPDHはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子である。各遺伝子名の語頭の「Ca」はアラビカコーヒーノキ（Coffee arabica）の遺伝子であることを示す。
遺伝子の発現量は、内部標準として用いられるCaGAPDH遺伝子に対する相対的な発現量で表した。20種類のアミノ酸を10種類ずつに分け、２回の試験（n=2）で評価した。結果を図１〜図４に示す。
mockと比較し、グルタミン酸（Glu）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）、アスパラギン酸（Asp）、アスパラギン（Asn）、プロリン（Pro）によるさび病抵抗性関連遺伝子の発現誘導活性が高い傾向が確認された。
次に、コーヒーノキ病害抵抗性関連遺伝子の発現誘導活性が認められたアミノ酸６種類（Glu、Arg、Lys、Asp、Asn、Pro）について、活性を比較するための試験を、上記と同様にして行った。３回の試験（n=3）で評価した。結果を図５および図６に示す。コーヒーノキ病害抵抗性遺伝子の発現誘導において、Lysに顕著に高い活性があることが示された。
〔実施例２〕リジン処理濃度の検討
Lysのコーヒーノキ病害抵抗性遺伝子の発現誘導効果について、濃度依存性を確認するため、コーヒーノキのリーフディスクを0.1mM、1mM、2mM、4mM、10mM、20mMのLysで、実施例１と同様の方法で処理し、24時間後の遺伝子発現を解析した。３回の試験（n=3）で評価した。結果を図７、図８に示す。
いずれの遺伝子も0.1mMでは遺伝子発現誘導活性がみられず、1mM以上では明確な活性が認められた。遺伝子発現はLys濃度依存的に高まり、概ね4mM又は10mMで閾値に達した。
〔参考例〕リジンの他の植物に対する効果
１．イネイモチ病防除に対する各種アミノ酸の効果
イネのイモチ病菌の感染に対する各種アミノ酸の効果を調べた。
播種２週間後のイネの根組織を、10mMの各種アミノ酸水溶液に48時間浸漬した後、病菌（Magnaporthe oryzae）の分生胞子懸濁液（1×105分生胞子/mL）を葉面に噴霧することにより、病菌を接種した。その後、暗所、湿室下に24時間静置することにより病菌を感染させた。ネガティブコントロールとして水を施用した。接種４日後に各アミノ酸で処理したイネの葉に発生した罹病性病斑数を測定し、ネガティブコントロールの罹病性病斑数に対する割合を図９に示した。その結果、グルタミン酸、アスパラギン酸やアスパラギン等は抵抗性誘導効果が高いのに対して、リジンの効果は高くなかった（角谷直樹（Kadotani
N.）ら、植物感染生理談話会論文集第47号、第33〜42頁参照）。
２．キュウリのキチナーゼ活性に対する各種アミノ酸の効果
キュウリの病害抵抗性関連酵素であるキチナーゼの活性に対する各種アミノ酸の効果を調べた（五十嵐大亮（Igarashi D.）ら、園芸学研究、第１２巻、別冊２、第４０６頁、２０１３年参照）。
人工気象器内で栽培したキュウリ（四葉）の子葉または本葉に各種アミノ酸溶液を散布し、48時間後のキチナーゼの活性を指標として病害抵抗性応答を調べた。結果を図１０に示す。グルタミン酸、アスパラギン酸、セリン等いくつかのアミノ酸でキチナーゼ活性を上昇させる効果が認められた。しかし、リジンの効果はコントロールと同程度であった。
３．タバコの病害抵抗性遺伝子の誘導に対するアミノ酸の効果
播種後20日間生育させたタバコ（Nicotiana tabacum cv. Samsun）全体に、2mM、5mM、又は10mMのグルタミン酸、アラニン、又はリジンを散布して培養した。散布処理24時間後の第4本葉より200mgの組織片を採取し、実施例１と同様の方法にてRNA抽出、cDNA合成、ならびにリアルタイムPCRによるNtWRKY遺伝子発現の解析を行った。使用したプライマーの配列を、表２に示す。ネガティブコントロールとして水を散布した。
３回の試験（n=3）で評価した結果を図１１に示す。遺伝子の発現量は、NtActin遺伝子に対する相対的な発現量で表した。その結果、コントロールに比べ、グルタミン酸、アラニンによる明確な遺伝子発現誘導活性が確認されたが、リジンでは活性が確認されなかった。

Claims (11)

  1. リジンを含むコーヒーノキの病害抵抗性増強剤。
  2. 病害がさび病である請求項１に記載の病害抵抗性増強剤。
  3. リジンの濃度が０．２ｍＭ〜１００ｍＭとなるようにコーヒーノキに施用される、請求項１又は２に記載の病害抵抗性増強剤。
  4. リジンがＬ−リジンである請求項１〜３のいずれか一項に記載の病害抵抗性増強剤。
  5. コーヒーノキが、アラビカコーヒーノキ、ロブスタコーヒーノキ、及びリベリカコーヒーノキからなる群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の病害抵抗性増強剤。
  6. リジンをコーヒーノキに施用する、コーヒーノキの病害を防除する方法。
  7. 病害がさび病である請求項６に記載の方法。
  8. 施用時のリジンの濃度が０．２ｍＭ〜１００ｍＭである、請求項６又は７に記載の方法。
  9. リジンの量として、５０ｇ〜２００ｋｇ／ヘクタールの量で施用する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. リジンがＬ−リジンである請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. コーヒーノキに対して病害抵抗性増強作用を有する、リジンを含む農業用組成物。
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