CN114600897B - 2`-脱氧鸟苷、鸟苷及其组合物的制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了2`‑脱氧鸟苷、鸟苷及其组合物的制备方法与应用，属于防治病原微生物技术领域，具体为2`‑脱氧鸟苷和鸟苷在抑制海水鱼类养殖中副溶血性弧菌的应用，2`‑脱氧鸟苷、鸟苷在抗植物病毒中的应用，以及2`‑脱氧鸟苷、鸟苷在提高植物体内2'‑脱氧鸟苷、鸟苷、水杨酸含量中的应用；本发明提供了一种包含2'‑脱氧鸟苷和鸟苷的组合物，并且提供了一种在宛氏拟青霉SJ1菌体中提取2'‑脱氧鸟苷、鸟苷的方法；本发明发现2'‑脱氧鸟苷、鸟苷具有防治病原微生物的作用，尤其是具有明显的抗植物病毒的作用，并且能够提高植物体内2'‑脱氧鸟苷、鸟苷、水杨酸的含量。

Description

2`-脱氧鸟苷、鸟苷及其组合物的制备方法与应用

技术领域

本发明属于防治病原微生物技术领域，具体为2`-脱氧鸟苷、鸟苷及其组合物的制备方法与应用。

背景技术

植物病毒病素有“植物癌症”之称，可引起严重的植物病害，给农业生产造成巨大的经济损失。目前，植物病毒病防治方法主要有：农业防治，如种苗脱毒、合理轮作、选用抗病品种等；化学农药防治，常见防治农药有吗胍·乙酸铜、氨基寡糖素、香菇多糖、盐酸吗啉胍等。在实际的植物病毒病防治中，仍以化学防治为主，但目前尚无有效的化学农药可以控制植物病毒病，且随着病毒抗药性的增加及化学农药对生态环境的污染备受关注，化学源抗病毒药剂的发展受到极大限制。

核苷类物质是生物机体细胞维持生命活动的基本组成元素，是一种由嘌呤碱或嘧啶碱与核糖通过糖苷键连接而成的小分子化合物；现有技术中关于核苷类物质药理活性的研究，主要侧重于人体病毒病、肿瘤病的研究，而对植物体作用的影响报道较少。

现有技术中对2'-脱氧鸟苷、鸟苷的研究主要在医学领域方面。2'-脱氧鸟苷被用作合成寡脱氧核苷酸等多种抗病毒、抗肿瘤核酸药物的重要原料；鸟苷被用作核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等医药产品的中间体。

中国专利文献CN110178857A（申请号：201910575412.0）公开了一种沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物的用途，该专利文献仅公开了提取物具有抗病毒作用，但是由于宛氏拟青霉SJ1菌株提取物的成分组成复杂，由该专利文献公开的内容，无法确定菌株提取物中抗病毒成分是什么物质。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了2`-脱氧鸟苷、鸟苷及其组合物的制备方法与应用。

2`-脱氧鸟苷也称为2`-脱氧鸟嘌呤核苷；

鸟苷也称为鸟嘌呤核苷。

本发明的技术方案如下：

一种组合物在抑制海水鱼类养殖中副溶血性弧菌的应用，所述组合物的组分包括：鸟苷和2'-脱氧鸟苷。

一种化合物在抗植物病毒中的应用，所述化合物为鸟苷或2'-脱氧鸟苷。

根据本发明优选的，上述一种化合物在抗植物病毒中的应用，所述植物病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒。

根据本发明优选的，上述一种化合物在抗植物病毒中的应用，所述化合物的使用浓度为150 ng/mL以上。

进一步优选的，所述化合物的使用浓度为150 ng/mL～250 ng/mL。

一种组合物在抗植物病毒中的应用，所述组合物的组分包括：鸟苷和2'-脱氧鸟苷。

根据本发明优选的，上述一种组合物在抗植物病毒中的应用，所述2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为（1~2）：1。

进一步优选的，所述2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为1：1。

根据本发明优选的，上述一种组合物在抗植物病毒中的应用，所述植物病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒。

根据本发明优选的，上述一种组合物在抗植物病毒中的应用，所述组合物的使用浓度为150 ng/mL以上。

进一步优选的，所述组合物的使用浓度为150 ng/mL～250 ng/mL。

一种化合物在提高植物体内2'-脱氧鸟苷、鸟苷、水杨酸含量中的应用，所述化合物为鸟苷或2'-脱氧鸟苷。

一种组合物在提高植物体内2'-脱氧鸟苷、鸟苷、水杨酸含量中的应用，所述组合物的组分包括：鸟苷和2'-脱氧鸟苷。

根据本发明优选的，上述一种组合物在提高植物体内2'-脱氧鸟苷、鸟苷、水杨酸含量中的应用，所述2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为（1~2）：1。

进一步优选的，所述2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为1：1。

根据本发明优选的，上述一种组合物在提高植物体内2'-脱氧鸟苷、鸟苷、水杨酸含量中的应用，所述组合物的使用浓度为150 ng/mL以上。

进一步优选的，所述组合物的使用浓度为150 ng/mL～250 ng/mL。

一种抗植物病毒的组合物，所述组合物的组分包括2'-脱氧鸟苷和鸟苷，所述2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为（1~2）：1。

根据本发明优选的，所述组合物中，2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为1：1。

一种在宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii）菌株SJ1菌体中提取2'-脱氧鸟苷、鸟苷的方法，包括如下步骤：

（1）制备宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）菌株SJ1的菌体，并将菌体粉碎备用，所述宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）菌株SJ1的保藏编号为CGMCC No.10114；

（2）将步骤（1）粉碎的菌体与体积分数为10~50%乙醇溶液按质量体积比1:（1~10）g/mL混合，超声处理，然后固液分离，液体部分为宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）菌株SJ1菌体的提取物；

（3）取步骤（2）制备的提取物，经反相HPLC半制备色谱，分离制备2'-脱氧鸟苷、鸟苷。

根据本发明优选的，步骤（1）中菌丝体的粉碎目数为50-70目。

根据本发明优选的，步骤（2）中乙醇溶液的体积分数为20-35%；步骤（2）中菌体与乙醇溶液的质量体积比为1:（1~5）g/mL。

进一步优选的，步骤（2）中乙醇溶液的体积分数为28-32%。

根据本发明优选的，步骤（2）中的超声强度为1200-1600 W。

进一步优选的，步骤（2）中超声处理的时间为50-70 min。

有益效果

1、本发明在宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）菌株SJ1提取物中鉴定出2'-脱氧鸟苷、鸟苷两种物质，并发现相对于提取物中的其他物质组分，这两种物质具有明显的抗植物病毒的作用，而且这两种物质按一定配比组合使用，抗病毒的作用效果更优。便于后续新型农药开发登记，实现产业化生产。

2、本发明还发现向植物喷施含有2'-脱氧鸟苷、鸟苷的提取物，能够提高植物体内2'-脱氧鸟苷、鸟苷和水杨酸的积累，有利于增强植物的免疫作用。本发明还提供了一种有效提高宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii）菌株SJ1提取物中2'-脱氧鸟苷、鸟苷含量的提取方法。

附图说明

图1 为宛氏拟青霉SJ1菌体提取物液相色谱图；

图中：色谱峰的编号分别为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9、化合物10。

图2 为图1中化合物8，2`-脱氧鸟苷的质谱图。

图3 为图1中化合物10，鸟苷的质谱图。

图4 为图1中化合物8的核磁图；

图中：a是2`-脱氧鸟苷的1D 1H谱图，b是2`-脱氧鸟苷的1D 13C谱图。

图5为图1中化合物10的核磁图；

图中：a是鸟苷的1D 1H谱图，b是鸟苷的1D 13C谱图。

图6为2`-脱氧鸟苷和鸟苷的结构图；

图中：a是2`-脱氧鸟苷，b是鸟苷。

图7为2`-脱氧鸟苷10 μg/mL与鸟苷10 μg/mL标准品的液相色谱图。

图8为批次3菌体提取物中2`-脱氧鸟苷与鸟苷的液相色谱图。

图9为实施例7中对照组CK的水杨酸检测液相色谱图。

图10为实施例7中A组的水杨酸检测液相色谱图。

图11为实施例7中对照组CK的2`-脱氧鸟苷和鸟苷检测液相色谱图。

图12为实施例7中A组的2`-脱氧鸟苷和鸟苷检测液相色谱图。

图13为副溶血性弧菌平板图；

图中：a是不加2`-脱氧鸟苷和鸟苷的TCBS培养基平板；b是含1 mg/mL配

比为1:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷的TCBS培养基平板。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。

主要材料来源

氨基寡糖素购于山东滨海瀚生生物科技有限公司。

2`-脱氧鸟苷和鸟苷均购于上海源叶生物科技有限公司。

宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii）菌株SJ1的保藏编号为CGMCC No.10114，该菌保藏信息已在专利文献CN201510059660.1 中公开。保藏日期为2014年12月08日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

TCBS培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。

宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii）菌株SJ1，以下简称“宛氏拟青霉SJ1”。

实施例1

宛氏拟青霉SJ1菌体提取物的制备

将宛氏拟青霉SJ1菌株接到平板PDA培养基上，25 ℃培养6天，用打孔器取长有菌体的琼脂块接种于装有50 mLPDA培养基的250 mL三角烧瓶，于28 ℃，120 r/min下旋转摇床上培养3天作为种子液，将种子液以10%的体积量接种入装有150 mLPDA培养基的500 mL三角瓶中，于28 ℃，120 r/min下旋转摇床上培养5天，终止发酵。将培养得到的菌丝体洗涤后60 ℃下烘干，称重，然后经高速粉碎机粉碎，过60目筛，粉碎后的菌粉与体积分数为20%乙醇溶液按质量体积比1:1g/mL混合后，1200 W超声处理60 min，真空抽滤，收集滤液备用，滤液即为宛氏拟青霉SJ1菌株的提取物。

实施例2

取实施例1制备的宛氏拟青霉SJ1菌株的提取物1 mL至1.5 mL离心管中，12000 r/min离心10 min，得到的上清液经0.22 µm滤膜过滤，滤液经反相HPLC半制备色谱梯度洗脱分离得到10个化合物，分别接取10个化合物样品，液相色谱图及化合物编号见图1。

实施例3

实施例2在提取物中分离的10个化合物的抗病毒实验

（1）烟草育苗：按常规的育苗方法进行烟草育苗。

（2）接种及施药方法：待烟草长至4-8片叶后，得到烟草幼苗，选取长势一致的烟草分别用浓度为200 ng/mL，用量为10 mL的实施例2中分离的10个化合物样品喷施于烟草叶片上，每个处理喷施五棵烟草，用清水喷施作为对照，每种处理重复3次，注意每个叶片均匀喷施，处理两小时后用摩擦接种的方法接种烟草系统叶下方的三片真叶，取50 μL病毒溶液用600目石英砂于每片真叶正面轻柔摩擦接种，接种的病毒分别是烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯X病毒（PVX）、黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY），接种后放至人工气候室内培养5 d。

（3）病毒含量计算：接种5 d后，取步骤（2）中处理的叶片放于紫外灯下观察不同药剂处理组的病毒蛋白荧光情况，并将带有荧光标记的发病系统叶片取下，用锡纸做好标记迅速放入液氮中，待全部处理取完样后放入-80 ℃冰箱长期保存待用，采用酶联免疫吸附测定带毒系统叶片的病毒含量。

抗病毒实验方法的参考文献《Ultrahigh-activity immune inducer fromEndophytic Fungi induces tobacco resistance to virus by SA pathway and RNAsilencing》PengC,ZhangA,WangQ,etal.Ultrahigh-activity immune inducer fromEndophytic Fungi induces tobacco resistance to virus by SA pathway and RNAsilencing[J].BMC Plant Biology,2020,20(1).

（4）具体病毒含量的检测结果见表1。

表1

通过分析表1的实验数据得出，10个化合物处理烟草叶片后，不同处理组对4种病毒均存在一定的抗性，其病毒含量均低于对照组。其中，8号化合物中4种病毒的含量均为最低，发病最轻，为对照组的0.4倍左右，10号化合物次之，病毒含量为对照的0.5倍左右，其余化合物与对照比相比差异不显著，因此，本发明确定8号和10号化合物为宛氏拟青霉SJ1菌株的提取物主要抗病毒物质。

实施例4

抗病毒物质鉴定

对实施例3中对病毒具有明显抗性的2个化合物，分别使用液相色谱串联质谱仪和核磁共振仪进行检测，通过波谱数据分析，确定具有抗病毒作用的2个化合物的结构。液质图和核磁图分别见图2、图3和图4、图5。

首先，提取物经半制备高效液相色谱仪分离纯化，该过程得到的组分中会存在微量杂质。其次，使用液质联用仪进行全扫描时，液质联用仪系统本身也会存在微量干扰离子。所以图2、图3质谱图中除2’-脱氧鸟苷和鸟苷外，还存在微量其他化合物。图2中相对丰度较强的两个离子m/z为268.13和152.11，根据数据库检索，推断其分别为2’-脱氧鸟苷的母离子和子离子。图3中相对丰度较强的两个离子m/z为284.13和152.16，根据数据库检索，推断其分别为鸟苷的母离子和子离子。

通过分析得出8号化合物的分子式是C₁₀H₁₃N₅O₄，相对分子质量267.24，ESI-MS m/z268.1[M-H]+。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:7.93(1H，s，H-8)，6.49(2H，s，NH2)，5.69(1H，d，J=6.0Hz，H-1')，4.39(1H，m，H-2')，4.08(1H，m，H-3')，3.86(1H，d，J=2.96Hz，H-4')，3.52～3.61(2H，m，Ha-5'，Hb-5');13C-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:159.70(C-6)，154.59(C-2)，152.04(C-4)，138.54(C-8)，117.41(C-5)，87.98(C-1')，84.80(C-4')，72.03(C-3')，62.50(C-2')，39.57(C-5')。

通过分析得出10号化合物的分子式是C₁₀H₁₃N₅O₅，相对分子质量283.2，ESI-MS m/z284.1[M-H]+。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:7.93(1H，s，H-8)，6.49(2H，s，NH2)，5.69(1H，d，J=6.0Hz，H-1')，4.39(1H，m，H-2')，4.08(1H，m，H-3')，3.86(1H，d，J=2.96Hz，H-4')，3.52～3.61(2H，m，Ha-5'，Hb-5')；13C-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ:157.21(C-6)，154.15(C-2)，151.77(C-4)，135.98(C-8)，117.18(C-5)，86.81(C-1')，85.65(C-4')，74.15(C-3')，70.83(C-2')，61.86(C-5')。

由于2`-脱氧鸟苷和鸟苷为已知物，其结构也有相关文献报道，根据图2中相对丰度较强的两个离子m/z为268.13和152.11、图3中相对丰度较强的两个离子m/z为284.13和152.16，通过数据库检索推断该离子分别为2`-脱氧鸟苷和鸟苷的母离子和子离子。同时图4和图5核磁共振中氢谱和碳谱数据与参考文献中2`-脱氧鸟苷和鸟苷中数据一致，故鉴定8号化合物为2`-脱氧鸟苷(2`-deoxyguanosine)，结构图见图6中的a；10号化合物为鸟苷(guanosine)，结构图见图6中的b。

参考文献如下：

焦森, 毛淑杰, 梁曜华,等. 石菖蒲中核苷类成分的分离鉴定及转化途径分析[J]. 中国实验方剂学杂志, 2020, 26(12):9.

徐小博. 高节竹(Phyllostachys prominens)竹叶、竹笋化学成分研究[D]. 中国林业科学研究院, 2015.

实施例5

宛氏拟青霉SJ1菌体提取物中2`-脱氧鸟苷和鸟苷含量测定

分别取10批宛氏拟青霉SJ1菌体的提取物1mL至1.5 mL离心管中，12000 r/min离心10 min，离心得到的上清液经0.22 µm滤膜过滤，供分析型液相检测。10批次宛氏拟青霉SJ1菌体的培养方法与实施例1相同。

标准品溶液的配制：分别称取干燥至恒重的2`-脱氧鸟苷、鸟苷标准品各1 mg，使用水溶解并定容至100 mL，配制成10 μg/mL的标准品母液。

标准曲线的绘制：分别吸取标准品母液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL定容至1 mL，配制标准工作液。

根据标准品出峰时间为参照，对样品进行积分，通过公式（1）计算宛氏拟青霉SJ1菌株提取物中2`-脱氧鸟苷和鸟苷的含量。

（1）

式中：

X-试样中待测组分含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

C-由标准曲线得出的试样液中待测物的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；

V-试样定容体积，单位为毫升（mL）；

m-试样质量，单位为克（g）。

结果见表2：

表2

通过分析得出，宛氏拟青霉SJ1菌株提取物中2`-脱氧鸟苷和鸟苷的含量分别为5.44~10.3mg/kg和4.22~7.31 mg/kg，2`-脱氧鸟苷与鸟苷在宛氏拟青霉SJ1菌株提取物的含量配比为（1~2）:1之间。

2`-脱氧鸟苷10 μg/mL与鸟苷10 μg/mL标准品的液相色谱图见图7；

表2中批次3菌体提取物中2`-脱氧鸟苷与鸟苷的液相色谱图见图8。

实施例6

2`-脱氧鸟苷、鸟苷抗病毒效果验证实验

按照实施例3育苗、接种及施药方法处理，浓度为150 ng/mL，质量配比为1:2的2`-脱氧鸟苷和鸟苷溶液为A组、浓度为150 ng/mL，质量配比为1:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷溶液为B组、浓度为150 ng/mL，质量配比为2:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷溶液为C组、浓度为150 ng/mL，质量配比为3:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷溶液为D组、浓度为150 ng/mL，质量配比为4:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷溶液为E组、浓度为150 ng/mL2`-脱氧鸟苷为F组、浓度为150 ng/mL鸟苷溶液为G组、质量分数为5%的氨基寡糖素溶液为H组、清水作为对照组CK，研究不同配比的2`-脱氧鸟苷和鸟苷对烟草花叶病毒的抗性，结果见表3。

表3

处理组	CK	A组	B组	C组	D组	E组	F组	G组	H组
										病毒含量	0.641	0.311	0.279	0.281	0.294	0.301	0.343	0.378	0.422

由表3可知，2`-脱氧鸟苷、鸟苷对烟草花叶病毒均具有防治效果，且效果大于对照药品质量分数为5%的氨基寡糖素溶液；在相同浓度条件下，2`-脱氧鸟苷标准品与鸟苷标准品配比组合的作用效果优于单一的2`-脱氧鸟苷、鸟苷抗植物病毒的作用效果，证明了2`-脱氧鸟苷与鸟苷两者产生了一定的协同作用。

由表3还可以看出，2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比按质量计为（1~2）：1时，抗植物病毒的作用效果明显，优于2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比按质量计为4：1时，抗植物病毒的作用效果；也优于2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比按质量计为1：2时，抗植物病毒的作用效果。尤其是2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为1：1时，抗植物病毒的作用效果最优。

由表3还可以看出，虽然相同浓度条件下，单独施用2`-脱氧鸟苷的抗植物病毒的作用效果，优于单独施用鸟苷的抗植物病毒的作用效果；但是二者配比组合施用时，并不是组合物中2`-脱氧鸟苷的配比越高，作用效果越好，如表3中C组、E组的实验数据，也进一步证明了2`-脱氧鸟苷与鸟苷两者产生了一定的协同作用。

实施例7

宛氏拟青霉SJ1菌体提取物诱导植物内源核苷类物质及水杨酸变化

按照常规的育苗方法进行烟草育苗，待烟草生长至4周时，选取10株烟草，分别喷施浓度为150 ng/mL，质量配比为1:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷溶液为A组、清水作为对照组CK；每株施用量为10mL，每个处理3次重复。2h后，取A组和对照组CK的本生烟叶片，用液相色谱法检测2`-脱氧鸟苷、鸟苷、水杨酸的含量。

（1）核苷类物质提取方法：取0.50 g烟草叶片置于液氮条件下研磨成粉末，准确称取0.10 g烟草叶片粉末于10 mL离心管中，加入3 mL纯水，于室温250 W功率下超声30 min，将超声后的样品以8000 r/min离心10 min，取上清液，加入上清液1/2体积三氯甲烷，震荡30 min，吸取水相，重复上述操作，合并2次提取的水相溶液，加入15 mg不溶性的聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），上下震荡，8000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，供液相检测。

（2）水杨酸提取方法：取10.0g叶片充分研磨后，置于100 mL的离心管中，加5%的三氯乙酸4 mL，加水至20 mL后再加入30 mL乙醚，充分摇匀，浸提12 h，8000 r/min离心5min，取出上部乙醚相，水相再经乙醚重复提取2次，合并乙醚相，真空旋转蒸干后，加入1mL50%甲醇+50%乙酸缓冲液（pH=3.2）的混合液将其溶解，置于Eppendorf管中保存，即为游离态水杨酸样品。水相加18.5%的HCl至终pH为3.2，于80 ℃水浴中加热1 h，冷却后用乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入1 mL50%甲醇+50%乙酸缓冲液(pH=3.2)的混合液溶解，置于Eppendorf管中保存，即为结合态水杨酸样品。结合态水杨酸样品经0.22 μm的微孔滤膜过滤后，供液相检测。

（3）结果见表4

表4

由表4得出，喷施1:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷溶液，烟草叶片中2`-脱氧鸟苷、鸟苷和水杨酸的含量较对照组提高了20~35%，说明对植物喷施含一定配比的2`-脱氧鸟苷和鸟苷溶液，会引起植物体内2`-脱氧鸟苷、鸟苷和水杨酸积累。

对照组CK：水杨酸检测液相色谱图，见图9；

A组：水杨酸检测液相色谱图，见图10；

对照组CK：2`-脱氧鸟苷和鸟苷检测液相色谱图，见图11；

A组：2`-脱氧鸟苷和鸟苷检测液相色谱图，见图12。

实施例8

因素选取及响应面优化

选取料液比、超声时间、超声功率及溶剂浓度等4个因素来设计响应面试验，以核苷类物质提取量为响应值，得到最佳提取条件，并验证，试验设计因素与结果如表5所示。

表5

组别	料液比（g/mL）	乙醇浓度%	超声时间min	超声功率W	核苷类物质含量（mg/kg)
						1	1:5	0	60	1200	115.0
2	1:5	40	60	1200	145.4
						3	1:5	20	60	1200	141.2
4	1:5	20	0	1200	77.2
						5	1:10	10	90	1600	48.4
6	1:3	10	90	800	178.6
						7	1:5	20	60	1200	139.6
8	1:3	10	30	1600	160.4
						9	1:5	20	60	1200	119.0
10	1:5	20	60	400	144.0
						11	1:2	20	60	1200	255.6
12	1:5	20	60	1200	144.0
						13	1:10	30	30	800	56.8
14	1:3	30	90	800	193.6
						15	1:10	30	30	1600	66.8
16	1:3	30	90	1600	217.4
						17	1:10	10	90	800	49.6
18	1:3	10	30	800	180.8
						19	1:5	20	120	1200	117.2
20	1:3	30	30	1600	228.6
						21	1:3	30	30	800	193.6
22	1:10	10	30	800	43.8
						23	1:10	30	90	800	67.2
24	1:10	30	90	1600	90.8
						25	1:5	20	60	1200	120.0
26	1:5	20	60	2000	129.4
						27	1:1	20	60	1200	67.8
28	1:10	10	30	1600	46.0
						29	1:5	20	60	1200	120.8
30	1:3	10	90	1600	155.8

表6

方差来源	偏差平方和	自由度	方差	F比	P值
						Model	111900	14	7990.59	57.23	< 0.0001
A-料液比	104100	1	104100	745.91	< 0.0001
						B-乙醇浓度	3513.84	1	3513.84	25.17	0.0002
C-超声时间	229.4	1	229.4	1.64	0.2194
						D-超声功率	16.34	1	16.34	0.117	0.7371
AB	554.6	1	554.6	3.97	0.0648
						AC	91.2	1	91.2	0.6532	0.4316
AD	0.7225	1	0.7225	0.0052	0.9436
						BC	4.62	1	4.62	0.0331	0.8581
BD	678.6	1	678.6	4.86	0.0435
						CD	41.6	1	41.6	0.298	0.5932
A²	30.72	1	30.72	0.22	0.6458
						B²	4.86	1	4.86	0.0348	0.8545
C²	2080.05	1	2080.05	14.9	0.0015
						D²	245.49	1	245.49	1.76	0.2047
残差	2094.39	15	139.63
						失拟项	1446.25	10	144.62	1.12	0.4808
净误差	648.14	5	129.63
						总离差	114000	29

模型的建立和统计分析

根据所得数据进行多元回归分析，得到相应变量料液比、超声时间、超声功率及溶剂浓度与核苷提取含量之间的多元二次回归方程。

Y=130.30+65.87*A+12.10*B+3.09*C+0.8250*D+5.89*A*B-2.39*A*C+0.2125*A*D-0.5375*B*C+6.51*B*D-1.61*C*D-1.06*A²-0.4208*B²-8.71*C²+2.99* D²

该回归方程R2=0.9809，Adj R2=0.9630，说明该方程预测值与实际值之间的相关性良好。

方差结果分析：由表6分析得出，模型F值为54.89，表明该模型显著，P值小于0.0001，只有0.01%的概率该F值是由噪声引起的。P值小于0.05说明模型项目显著，本次实验中A，B，BD，C2为显著项，显著水平大小顺序为A＞B＞C2＞BD，其余项不显著。失拟项的F值为1表明失拟项相对于绝对误差不显著，有53.54%的几率失拟项F值是由噪声引起的，失拟项不显著说明该模型较好。各项F值表明，A（料液比）和B（乙醇浓度）对提取液浓度有显著影响，A的影响远大于B。

利用Design-Expert软件得出最佳参数组合为：物料比为1:3（g/mL），乙醇体积浓度为30%，提取时间为63.3 min，超声功率为1600 W。

实施例9

最佳提取条件验证试验

将粉碎后的宛氏拟青霉SJ1菌株菌粉，与一定浓度的乙醇溶液按一定的质量体积比混合后，按照一定功率超声波处理一段时间，真空抽滤，收集滤液备用，滤液即为宛氏拟青霉SJ1菌株的提取物，具体条件如下，其他条件同实施例1中的提取方法：

A组的料液比为1:3（g/mL），乙醇体积浓度为30%，超声功率为1600W，提取时间为63.3min；

B组的料液比为1:5（g/mL），乙醇体积浓度为30%，超声功率为1600W，提取时间为63.3min；

C组的料液比为1:3（g/mL），乙醇体积浓度为20%，超声功率为1600W，提取时间为63.3min；

D组的料液比为1:1（g/mL），乙醇体积浓度为20%，超声功率为1600W，提取时间为63.3min。

按照实施例5的步骤测定提取物中2`-脱氧鸟苷和鸟苷含量，结果如表7。

表7

由表7中的实验数据可以得出，本发明提供的提取方法，提取物中2`-脱氧鸟苷和鸟苷含量高，尤其是提取条件：料液比为1:3（g/mL），乙醇体积浓度为30%时，菌体提取物中2`-脱氧鸟苷和鸟苷含量最高，2`-脱氧鸟苷含量为10.93mg/kg，鸟苷含量为8.54mg/kg，本发明提供的提取方法，有利于后期2`-脱氧鸟苷、鸟苷的生产、利用等研究的开展。

实施例10

2`-脱氧鸟苷和鸟苷对副溶血性弧菌的影响实验

副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus，VP）广泛存在于海水和海产品中，是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。

将副溶血性弧菌在37℃培养12 h至对数期，用0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液中稀释至10⁶CFU/mL。分别接种到含1 mg/mL质量配比为1:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷的TCBS培养基上和不含2`-脱氧鸟苷和鸟苷的TCBS培养基上，37℃孵育过夜后，观察培养基上副溶血性弧菌生长情况。如图13所示，与不含2`-脱氧鸟苷和鸟苷的对照相比，1:1的2`-脱氧鸟苷和鸟苷对副溶血性弧菌有一定抑制作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种组合物在抑制海水鱼类养殖中副溶血性弧菌的应用，其特征在于，所述组合物的组分包括：鸟苷和2'-脱氧鸟苷。

2.一种化合物在抗植物病毒中的应用，其特征在于，所述化合物为鸟苷或2'-脱氧鸟苷，所述植物病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒。

3.一种组合物在抗植物病毒中的应用，其特征在于，所述组合物的组分包括：鸟苷和2'-脱氧鸟苷，所述植物病毒为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为（1~2）：1。

5.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述组合物的使用浓度为150 ng/mL以上。

6.一种组合物在提高植物体内2'-脱氧鸟苷、鸟苷、水杨酸含量中的应用，其特征在于，所述组合物的组分包括：鸟苷和2'-脱氧鸟苷。

7.一种抗植物病毒的组合物，其特征在于，所述组合物的组分包括2'-脱氧鸟苷和鸟苷，所述2'-脱氧鸟苷与鸟苷的配比，按质量计为（1~2）：1。

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