CN110178857B - 沙棘内生真菌菌株sj1发酵提取物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物的用途，包括诱导植物内源水杨酸的积累；增强植物RNA沉默的效率；提高植物对病毒的抗性。本发明提供的沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物使用浓度在150ng/mL和100ng/mL均具有较好的预防效果，平均预防效果分别为：77.45％、72.88％，均高于对照20％吗胍﹒乙酸铜5ug/ml的预防效果(71.98％)；综合分析，SJ1发酵提取物100～150ng/mL的使用浓度成本低于20％吗胍﹒乙酸铜，本发明提供的SJ1发酵提取物使用更经济。

Description

沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物的用途
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，具体为沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物的用途。
背景技术
病毒病是植物的三大病害之一，发生普遍，危害严重，并且其防治比较困难，俗称植物的“癌症”。目前，植物病毒病的防治主要是采用化学药物，它虽然对病毒病的发生发展起到了一定防控作用，但同时又带来了环境污染和农药残留等问题。生物源抗病毒剂是一种新的生物农药，具有无毒、不污染环境、无残留、不杀伤天敌、保护人畜安全等特点；并且具有用药量少、药的持效期长、成本低廉等优点，是实现产业化生物防治的关键。
水杨酸(Salicylic acid，SA)是植物受到生物胁迫和非生物胁迫时合成的一种主要信号分子，并且在植物启动自身免疫机制，抵御外界病原菌入侵过程中扮演着重要的角色。
但是关于SA如何在植物的防卫反应中起作用仍在不断研究中。
内生真菌(endophyticfungi)是指在至少生活史的一部分能生活在健康植物体内，但对寄主植物组织并不引起明显侵染的真菌(Wilson，1995)。植物内生真菌普遍存在于各种陆生和水生植物中，几乎所有生活的植物体内均有内生真菌的存在(Petrini，1986)。内生真菌代谢产物能够刺激寄主植物的生长发育，提高寄主植物的生物应激和非生物胁迫抗性能力，内源性菌株对植物病害的防治作用及生物开发应用已引起科学家的广泛关注。
RNA沉默是或称RNA干扰(RNA interference，RNAi)，是一种由双链RNA诱导、序列特异性的核酸降解和植物抵御病毒侵染的重要防卫机制。RNA沉默也是在植物生长发育、基因的表达调控以及对逆境和生物非生物胁迫的防御等方面发挥着重要的作用(周雪平等，2017)。
专利号为ZL201510059660.1的发明《一种宛氏拟青霉菌株SJ1及其应用》提供了一种真菌菌株，该菌株为沙棘内生真菌菌株(Paecilomyces variotii)SJ1，于2014年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号是CGMCCNO.10114。该真菌菌株发酵提取物的用途是：促进玉米、水稻等作物生长、根系发育、提高抗冻能力、增加产量。
发明内容
为避免化学药物污染环境及农药残留的问题，发掘无毒、无残留、保护人畜安全的生物源抗病毒剂，本发明提供了沙棘内生真菌菌株(Paecilomyces variotii)SJ1发酵提取物的新用途。
所述沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物的用途包括诱导植物内源水杨酸的积累；增强植物RNA沉默的效率；提高植物对病毒的抗性。
优选的，所述病毒为烟草花叶病毒。因SJ1发酵提取物诱导的是非特异性抗性，所以理论上可以包括所有植物病毒，包括黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、番茄黄化曲叶病毒、番茄退绿病毒等植物病毒。
进一步的，所述沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物提高植物对病毒的抗性的浓度为100ng/ml～150ng/ml。
与现有技术相比，本发明至少包括以下有益效果是：
1、本发明提供了沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物的以下新用途：诱导植物内源水杨酸的积累；增强植物RNA沉默的效率；提高植物对病毒的抗性的作用；
2、本发明提供的沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物使用浓度在150ng/mL和100ng/mL均具有较好的预防效果，平均预防效果分别为：77.45％、72.88％，均高于对照20％吗胍﹒乙酸铜5ug/ml的预防效果(71.98％)；综合分析，SJ1发酵提取物100～150ng/mL的使用成本低于20％吗胍﹒乙酸铜，本发明提供的SJ1发酵提取物使用更经济。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明提供的沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物处理的样品检测HPLC色谱图。
图2为SA标准品HPLC色谱图。
图3为SJ1发酵提取物和去离子水处理后GFP荧光强度对比图；
图4为qRT-PCR检测GFP基因的相对表达量示意图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
实施例1：1、沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物的制备
将沙棘内生真菌分离得到的宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)菌株SJ1接到平板PDA培养基上，25℃培养6天，用打孔器琼脂挖块接种于装有50mL种子培养液(为PDA培养基不加琼脂做成)的250mL三角烧瓶，于28℃，120r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10％量接种入装有150mL发酵培养基(发酵培养基为：马铃薯提取液1.0L，酵母膏1.0g，蛋白胨3.0g，葡萄糖15.0g，琼脂17.0g。马铃薯提取液的制备：取去皮马铃薯200g，切成小块，加蒸馏水1000mL煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL)的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵。培养得到的菌丝体洗涤后60℃下烘干，称重，然后经高速粉碎机粉碎，用同体积乙醇浸提24h，浸提3次，用磁力搅拌器将其混匀，超声波震荡1h，真空抽滤，收集滤液备用，滤液即为宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)菌株SJ1的提取物。
实施例2：沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物诱导水杨酸的积累
先将含有蛭石与基质(体积比为1:2)的营养土搅拌均匀，放入一次性塑料小钵；在每个小钵中撒上3-4颗本生烟的种子，放于温室(24℃，14h光照，10h黑暗)中，盖上一层塑料薄膜培养。出苗后，将小苗移栽至塑料小钵中，每钵1株，放置于温室进行管理。待烟草生长至4周时，选取10株本生烟，分别喷施150ng/mL的SJ1发酵提取物和去离子水(CK)，每株10mL，每个处理3次重复。2h后，取喷施水和SJ1发酵提取物的本生烟叶片，用液相色谱法检测水杨酸(SA)的含量。
(1)提取方法：取10.0g叶片充分研磨后，置于50mL的离心管中，加5％的三氯乙酸4.0mL，加水至20mL后再加入30mL乙醚，充分摇匀，浸提12h，于1000g下离心5.0min，取出上部乙醚相，水相再经乙醚重复提取2次，合并乙醚相，真空旋转蒸干后，加入1.0mL50％甲醇+50％乙酸缓冲液(pH3.2)的混合液将其溶解，置于Eppendorf管中保存，即为游离态SA样品。水相加18.5％的HCl至终浓度为3.2％，于80℃水浴中加热1h，冷却后用乙醚提取3次，合并乙醚相，蒸干后加入1mL50％甲醇+50％乙酸缓冲液(pH3.2)的混合液溶解，置于Eppendorf管中保存，即为结合态SA样品。结合态SA样品经0.3μm的微孔过滤器过滤后，用高效液相色谱(HPLC)进行检测。
(2)测定含量
主要仪器：Beckman高效液相色谱仪(带化学工作站)，岛津荧光检测器，Heidolp旋转蒸发仪(德国)。
SA标准品，上海五联化工厂生产；甲醇为色谱纯，天津市四友生物医学技术有限公司生产；其余所用试剂均为分析纯；水(二次蒸馏水，自制)。
HPLC检测条件：C18柱，7.3mm×20cm；流动相:甲醇:乙酸缓冲液(pH3.2)＝50:50；岛津荧光检测器(激发波长为310nm，发射波长为415nm)；流速为1mL/min；进样量为20μL。
结果如图1、图2和表1所示。
表1不同处理植株中SA的含量
样品 质量(g) 峰面积(mv·min) SA含量(μg/g FW)
SJ1 0.106 2.639 0.656±0.04
CK 0.1012 1.363 0.4015±0.025
由表1可以看出，用SJ1发酵提取物处理的本生烟株系中，SA含量是对照的1.5倍。
实施例3：沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物增强植物RNA沉默效率
选取10株4周苗龄的本生烟，分成两组，分别喷施150ng/mL浓度的SJ1发酵提取物和去离子水，每株10mL，每个处理3次重复。2h后瞬时侵染含有pBI121-GFP的农杆菌菌液(OD600＝1.0)，在长波紫外灯下观察并拍照记录荧光强度变化，连续观察7d。结果如图3和图4所示。
由图3可见，发现SJ1发酵提取物处理的侵染区在侵染后第3d GFP荧光强度最强，但明显弱于去离子水处理的侵染区。收集3dpi(接种后3天)不同处理的15株本生烟叶片的GFP侵染区域，提取总RNA，qRT-PCR检测GFP的相对表达量，如图4结果显示，3dpi SJ1发酵提取物处理的本生烟叶片中GFP的相对表达量低于对照，与表型相一致。表明SJ1发酵提取物可增强植物的RNA沉默效率。
实施例4：沙棘内生真菌菌株SJ1发酵提取物可提高植物对病毒的抗性
于2018年5月6号进行预防试验。当番茄苗第1片真叶出现(破心)，喷施药剂，每个处理喷施100株，每株10mL。药剂处理为SJ1发酵提取物(实施例1所得产品)50ng/mL、SJ1发酵提取物100ng/mL、SJ1发酵提取物150ng/mL、20％吗胍﹒乙酸铜(东莞市瑞德丰生物科技有限公司)5ug/mL、清水对照等共5个处理，每个处理3次重复，随机排列。药剂喷施后2小时，接种病毒。以后间隔5天喷一次，连喷3次。病毒的制备方法是：采集感染烟草花叶病毒(Tomatomosaic virus，TMV)的番茄鲜叶，按鲜病叶：缓冲液＝1:5的重量体积比加缓冲液，缓冲液种类为0PBS，缓冲液的酸碱度pH7.0。然后用石英砂将混合体碾磨成匀浆后，用纱布过滤，取滤液摩擦接种，每株接种2个叶片，每个叶片500μL。接种15天后调查病情。计算病情指数及预防效果。结果见表2。
表2 SJ1发酵提取物对番茄病毒病的预防效果
药剂 用量 病情指数 预防效果(％)
SJ1发酵提取物 50ng/mL 23.13 66.17
SJ1发酵提取物 100ng/mL 18.54 72.88
SJ1发酵提取物 150ng/mL 15.42 77.45
20％吗胍﹒乙酸铜 5ug/mL 19.16 71.98
清水对照 — 68.37 —
注：病毒病分级标准：0级：无病症；1级：叶片明显呈花叶或黄化，有疮斑；3级：叶片凹凸不平，变小且畸形；5级：植株形成丛枝，大量落花落蕾；7级：整个植株矮化、果小质劣，果实花脸。
病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级数)×100；
预防效果＝(CK0病情指数-药剂处理后病情指数)/CK0病情指数×100。
式中：CK0—对照区用药前；CK1—对照区用药后；CL0—处理区用药前；CL1—处理区用药后。
由表2可以看出，SJ1发酵提取物使用浓度从150ng/mL和100ng/mL均具有较好的预防效果，平均预防效果分别为：77.45％、72.88％，均高于对照20％吗胍﹒乙酸铜5ug/ml的预防效果(71.98％)；SJ1发酵提取物使用浓度50ng/mL的预防效果相对较差。综合分析，SJ1发酵提取物使用浓度100～150ng/mL时与20％吗胍﹒乙酸铜均具有较好的预防效果，但SJ1发酵提取物成本(3元/亩)低于20％吗胍﹒乙酸铜，更经济。
其作用原理可能是诱导SA的积累，增强RNA沉默效率，提高植物对病毒的抗性。由于SJ1发酵提取物诱导的是非特异性抗性，所以理论上可以包括所有植物病毒。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.沙棘内生真菌宛氏拟青霉菌株SJ1发酵提取物的用途，其特征在于，提高植物对病毒的抗性，所述植物为番茄，所述病毒为烟草花叶病毒；所述沙棘内生真菌宛氏拟青霉菌株SJ1发酵提取物提高植物对病毒的抗性的浓度范围为100ng/ml～150ng/ml。
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