CN114717119B

CN114717119B - 一种草珊瑚内生真菌及其应用

Info

Publication number: CN114717119B
Application number: CN202210168345.2A
Authority: CN
Inventors: 邓业成; 蒙思妤; 邓志勇; 骆海玉; 韦坚芬
Original assignee: Guangxi Normal University
Current assignee: Guangxi Normal University
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2042-02-23
Also published as: CN114717119A

Abstract

本发明公开了一种草珊瑚内生真菌及其应用，所述内生真菌为假可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia pseudotheobromae)J‑10，保藏号为CGMCC No.40055，于2022年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述内生真菌对罗汉果白绢病菌和罗汉果根腐病菌具有良好的抑菌活性，可用于制备抗相关植物病原真菌的灭菌制剂；本发明还公开了内生真菌J‑10的发酵产物、发酵产物中活性物质及其制备方法，并进一步研究了内生真菌J‑10发酵产物及活性物质的抑菌活性，发现其具有广谱抗病性，对9种病原真菌均具有抑制效果，本发明以植物内生真菌为资源，可用于制备抗植物病原真菌病害的新型农用杀菌剂，对农作物真菌病害的绿色防控和生态环境保护具有极其重要的意义。

Description

一种草珊瑚内生真菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种草珊瑚内生真菌及其应用。

背景技术

内生真菌(endophytic fungi)是指那些在其生活史中某一时期生活在活的植物组织内、不引起植物组织产生明显病害症状的真菌。植物内生真菌是近三十年来在国内外迅速受到关注的微生物类群，自从产紫杉醇的红豆杉内生真菌被报道后，植物内生真菌研究在生理活性物质领域开始暴发式增长。植物内生菌具有很强的次级代谢产物合成能力，能产生很多在医药和农药领域有重要应用价值的活性物质，可用于开发成新药和新型生物源农药。植物内生真菌产生的抗菌活性物质主要包括抗生素类、抗菌肽类、生物碱类、大环内酯类、萜类、酚类、醌类、几丁质酶、葡聚糖酶、挥发性物质等，利用内生真菌产生的抗菌活性物质开发新型农用杀菌剂具有巨大潜力。植物内生真菌还可通过重寄生、空间或营养竞争以及诱导植物抗性等抑制病原微生物的致病性，因而可用于开发防治植物病害的微生物菌剂。内生真菌能够存在于宿主植物组织内，与宿主植物作为一个整体共同发挥生防作用。宿主为内生菌提供水分、营养物质和生存场所，使其基本不受外界环境的影响，对植物病害的控制效果稳定；内生菌能够在宿主组织内长期存在，对植物病害能产生持久的控制效果。因此，植物内生真菌在植物病害防治领域有重要的开发应用价值。

有研究证明，从具有独特药用价值的植物中发现可产生新型活性物质的内生真菌的可能性较高。草珊瑚(Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai)为金粟兰科草珊瑚属多年生常绿草本植物，具有极高的药用、食用及观赏价值。草珊瑚全株可供药用，具有清热解毒、祛风活血、消肿止痛、抗菌消炎等作用。主治流行性感冒、流行性乙型脑炎、肺炎、阑尾炎、盆腔炎、跌打损伤、风湿性关节痛、闭经、创口感染、菌痢等疾病。还可以治疗胰腺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食管癌等恶性肿瘤，有缓解、缩小肿块、延长寿命、改善自觉症状等功效，无副作用。目前对草珊瑚的研究主要集中在植物本身的药用价值和应用方面，而对其内生真菌的研究和报道甚少。

本发明从草珊瑚植株中分离出内生真菌，通过抗菌活性及活性物质研究，旨在利用草珊瑚内生真菌开发出新型灭菌制剂，用于农作物真菌病害的防治，对于农作物病害的绿色防控和生态环境保护具有极其重要的意义。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种草珊瑚内生真菌J-10，并研究其对植物病原真菌的抑菌作用，同时还提供了内生真菌J-10发酵产物、发酵产物中活性物质及其制备方法，并对其抗植物病原真菌活性进行了研究，发现其对罗汉果白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)、罗汉果根腐病菌(Fusarium oxysporum)、玉米大班病菌(Setosphaeriaturcica)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum Capsici)和茶轮斑病菌(Pestallozzia theae)等植物病原真菌有着较为明显的抑制作用。

为达上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明第一个技术方案是提供一种草珊瑚内生真菌，分类命名为假可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia pseudotheobromae)J-10，已于2022年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.40055。

本发明第二个技术方案是提供本发明第一个方案所述的草珊瑚内生真菌在制备抗植物病原真菌制剂中的应用，其中，所述植物病原真菌为罗汉果白绢病菌(Sclerotiumrolfsii)和罗汉果根腐病菌(Fusarium oxysporum)。

本发明第三个技术方案是提供一种本发明第一个技术方案所述的草珊瑚内生真菌的发酵产物。

本发明的第四个技术方案是提供本发明第三个技术方案所述的发酵产物的制备方法，包括如下步骤：(1)扩大培养：将草珊瑚内生真菌菌种接种到PDA平板培养基上培养，待其生长旺盛时，用打孔器打孔内生真菌菌落取得直径为0.4cm的菌饼，挑取3个菌饼，将其接种于装有500mL灭菌马铃薯葡糖糖液体培养基的1000mL锥形瓶中，再将锥形瓶置于恒温箱中于28培养，每天摇晃2～3次，培养30天，得到草珊瑚内生真菌发酵液；(2)过滤：将步骤(1)中发酵液用2层纱布过滤，得到菌液和菌丝体；(3)萃取、提取：将菌液置于分液漏斗中，依次用等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂分别萃取3次，合并同一种萃取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状，得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物，备用；菌丝体用甲醇浸泡提取24h，期间搅拌2～3次，随后抽滤，重复3次并合并滤液，浓缩得到菌丝体甲醇提取物，存于4℃冰箱中备用。

本发明的第五个技术方案是提供本发明第三个技术方案所述的发酵产物在制备抗植物病原真菌制剂中的应用，其中，所述植物病原真菌为玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum Capsici)、茶轮斑病菌(Pestallozzia theae)、罗汉果白绢病菌(Sclerotium rolfsii)、罗汉果根腐病菌(Fusarium oxysporum)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystis paradoxa)、贡柑链格孢菌(Alternaria alternata)。

本发明的第六个技术方案是提供本发明第三个技术方案所述的发酵产物中的活性物质，其中，活性物质的获取方法为：将第四个技术方案步骤(3)中得到的菌液乙酸乙酯萃取物和菌丝体甲醇提取物合并，采用硅胶柱进行色谱分离纯化得到活性物质。

所述的活性物质的化学结构式如式(I):

本发明的第七个技术方案是提供本发明第六个技术方案所述的活性物质在制备抗植物病原真菌制剂中的应用，其中，所述病原真菌为玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum Capsici)、茶轮斑病菌(Pestallozzia theae)、罗汉果白绢病菌(Sclerotium rolfsii)、罗汉果根腐病菌(Fusarium oxysporum)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystis paradoxa)、贡柑链格孢菌(Alternaria alternata)、甘蓝黑斑病菌(Ahernaria oleracea)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。

与现有技术相比，本发明的有益效果是:

(1)本发明从药用植物草珊瑚中筛选分离得到草珊瑚内生真菌，并鉴定命名为假可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia pseudotheobromae)J-10，通过抗菌实验发现，其对罗汉果白绢病菌和罗汉果根腐病菌具有良好的抑菌活性，抑菌率分别高达78.35％和68.72％，可用于制备抗相关植物病原真菌的灭菌制剂；

(2)本发明还提供了草珊瑚内生真菌J-10的发酵产物及其制备方法，并进一步研究了内生真菌J-10发酵产物的抑菌活性，确定内生真菌发酵产物的抑菌活性物质主要存在于菌液乙酸乙酯萃取物和菌丝体甲醇提取物中；

(3)本发明还通过对内生真菌J-10发酵产物中活性物质分离提纯，鉴定结构，确定其为毛色二孢素，同时通过抗菌实验研究，发现其具有广谱抗病性，对包括玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum Capsici)、茶轮斑病菌(Pestallozzia theae)、罗汉果白绢病菌(Sclerotium rolfsii)、罗汉果根腐病菌(Fusarium oxysporum)、甘蔗凤梨病菌(Ceratocystis paradoxa)、贡柑链格孢菌(Alternaria alternata)、甘蓝黑斑病菌(Ahernaria oleracea)和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)在内的9种病原真菌均具有抑制效果；

(4)本发明以植物内生真菌为资源，可用于制备抗植物病原真菌病害的新型农用杀菌剂，对农作物真菌病害的绿色防控和生态环境保护具有极其重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了草珊瑚内生真菌假可可毛色二孢菌J-10在PDA培养基上生长不同时间的菌落形态图(A：24h，B：36h，C：5d，D：20d正面，E：20d背面)；

图2示出了草珊瑚内生真菌假可可毛色二孢菌J-10的系统发育树；

图3示出了实施例中草珊瑚内生真菌假可可毛色二孢菌J-10发酵产物中活性物质毛色二孢素的MS图谱；

图4示出了实施例中草珊瑚内生真菌假可可毛色二孢菌J-10发酵产物中活性物质毛色二孢素的¹H NMR图谱；

图5示出了实施例中草珊瑚内生真菌假可可毛色二孢菌J-10发酵产物中活性物质毛色二孢素的¹³C NMR图谱。

具体实施方式

实施例1草珊瑚内生真菌的分离

1.1培养基准备

在超净工作台中，将链霉素粉末加入至融化好的温度55～65℃左右的PDA培养基中，摇晃使其充分混合，制备成含链霉素的PDA平板培养基，待其冷却凝固后备用。

1.2生物样本采集

新鲜健康的草珊瑚植株采集于广西贺州市富川瑶族自治县，将新鲜健康的整株草珊瑚植株放在自来水下活水冲洗10分钟，洗净表面尘土，随后移至超净工作台中，用无菌水冲洗1次，置于体积浓度75％乙醇水溶液浸泡消毒2分钟，用无菌水冲洗3次，再用质量浓度2.5％次氯酸钠溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗3次(最后一次冲洗的无菌水接入PDA平板培养基上，培养箱中培养30d，若无菌落生长，则说明植株表面彻底消毒。)，得到表面彻底消毒的草珊瑚植株。

1.3菌株分离

将上述步骤中得到的表面彻底消毒的草珊瑚植株根、茎、叶用无菌滤纸吸干水分后，剪去边缘，切成5mm×5mm小块，接入PDA平板培养基上。待组织块表面长出菌丝后挑取其尖端部分移至新鲜PDA培养基上，经过3～5次纯化得到内生菌种，纯化好的菌种保存在4℃冰箱。从根部分离得到10株内生真菌(记做G-1～G-10)，茎部分离得到36株内生真菌菌株(记做J-1～J-36)，叶部分离得到15株内生真菌(记做Y-1～Y-15)，共计61株内生真菌。

实施例2草珊瑚内生真菌抑菌活性初筛

2.1初筛样本

利用草珊瑚茎部分分离的36株内生真菌(J-1～J-36)，采用平板对峙法对2种植物病原真菌(罗汉果白绢病菌(BJB)和罗汉果根腐病菌(GFB))进行对峙培养，筛选出对植物病原真菌具有抑菌作用的内生真菌。

2.2平板对峙法

预先在培养皿底面用记号笔做记号，记号点以培养皿中心轴对称，两点间距3cm。用直径为0.4cm的灭菌打孔器在培养5d的内生真菌和植物病原真菌的菌落边缘打出菌饼，然后在无菌条件下取菌饼接种在平板培养基的标记点上，以单独接种植物病原真菌为对照组，随后将平板置于28℃恒温箱中培养3d后观察，且每组设置3个重复。依据平板对峙菌落之间有无抑菌带来确定两者之间是否具有抑制作用，若存在抑菌带，则在处理组平板中两菌落中心点之间划一条直线，用刻度尺测量处理组病原真菌菌落生长短半径，记为r1，测量对照组病原真菌生长半径，记为ro。按照如下公式计算各组抑菌率，并将结果记录于表1。

抑菌率(％)＝(r0-r1)/r0*100

表1草珊瑚茎内生真菌对罗汉果白绢病菌(BJB)和罗汉果根腐病菌(GFB)的抑菌作用

由表1数据可以看出，菌株编号为J-9和J-10的内生真菌的抑菌效果最为显著，J-9对罗汉果白绢病菌和根腐病菌的抑菌率分别为92.01％和76.32％，J-10对罗汉果白绢病菌和根腐病菌的抑菌率分别为78.35％和68.72％，通过进一步的活性研究，最终筛选出内生真菌J-10作为活性菌株。

实施例3草珊瑚内生真菌J-10的形态特征观察

参见附图1，内生真菌J-10在PDA培养基上培养，菌落最初呈白色圆形，菌丝蓬松，生长速度快。在28℃的自然光条件下，24h后测量菌落直径为49mm(图1A)，36h后可长满培养基，菌落直径为90mm(图1B)，继续生长5d后表面颜色变为浅灰色，圆心有一圈灰褐色菌丝(图1C)，20d后整个菌落呈现灰褐色绒状(图1D)，背面变为炭黑色(图1E)。

实施例4草珊瑚内生真菌J-10的鉴定

通过对菌株J-10的ITS进行扩增和测序，将菌株的18S rDNA序列与Gen Bank中已有的相关DNA序列进行BLAST比对，采用MEGA 6.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树(见附图2)。通过ITS序列比对，发现菌株J-10的序列在NCBI数据库中与对应的Lasiodiplodia pseudotheobromae 5株菌株(登录号分别为OK427342.1，MZ208811.1，MZ182298.1，MW157267.1，MT913570.1)的序列完全一致。在系统发育树中，菌株J-10与Lasiodiplodia pseudotheobromae OK427342.1聚为一支。结合菌株的菌落形态特征和18SrDNA序列分析，将J-10菌株鉴定为假可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiapseudotheobromae)。

实施例5草珊瑚内生真菌J-10发酵产物

5.1扩大培养

将内生真菌J-10菌种接种到PDA平板培养基上培养，待其生长旺盛时，用打孔器打孔内生真菌J-10菌落取得直径为0.4cm的菌饼，挑取3个菌饼，将其接种于装有500mL灭菌马铃薯葡糖糖液体培养基的1000mL锥形瓶中，再将锥形瓶置于恒温箱中于28培养，每天摇晃2～3次，培养30天，得到草珊瑚内生真菌发酵液。

5.2过滤

将草珊瑚内生真菌发酵液用2层纱布过滤，得到菌液和菌丝体。

5.3萃取、提取

将菌液置于分液漏斗中，依次用等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取，每种溶剂分别萃取3次，合并同一种萃取液，用旋转蒸发仪减压浓缩至膏状，得到乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物，备用；菌丝体用甲醇浸泡提取24h，期间搅拌2～3次，随后抽滤，重复3次并合并滤液，浓缩得到菌丝体甲醇提取物，存于4℃冰箱中备用。

实施例6草珊瑚内生真菌J-10发酵产物抑菌活性测定

6.1配制活性供试样品

取本发明实施例5中得到的乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、萃余物和菌丝体甲醇提取物分别用丙酮和水的混合液(丙酮：水＝1:1(v:v))作为溶剂溶解，配制成20mg/mL的供试样品溶液。

6.2抑菌实验

采用抑制菌丝生长速率法测定草珊瑚内生真菌发酵产物对植物病原真菌的抑菌活性：将1mL供试样品液与9mL温度为55℃～65℃的PDA培养基混合均匀，倒入直径为9cm的培养皿中制成厚薄均匀的带药培养基，对照组用等体积丙酮和水混合液(丙酮：水＝1:1(v:v))代替供试样品液；再在已活化的供试病原真菌菌落边缘，用直径为0.4cm的无菌打孔器切取菌饼，并使菌丝面朝下将菌饼接种于带药培养基表面；每个培养皿接种3个菌饼，使其呈“品”字形均匀分布，每个处理设3个重复，置于28±1℃培养箱中培养3d，用十字交叉法测量菌落直径，根据下列公式计算抑菌率，并将结果记录于表2。

抑菌率(％)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)÷(对照菌落直径－0.4)×100

表2草珊瑚内生真菌J-10发酵产物对植物病原真菌的抑菌活性

由表2数据可以看出，草珊瑚内生真菌发酵产物中菌液乙酸乙酯萃取物和菌丝体甲醇提取物具有更强的抑菌活性，菌液乙酸乙酯萃取物对7种供试病原真菌的抑菌率在给药浓度2mg/mL时为75.75％-100％，菌丝体甲醇提取物对7种供试病原真菌的抑菌率在给药浓度2mg/mL时为75.87％-100％，表明草珊瑚内生真菌发酵产物的抑菌活性物质主要存在于菌液乙酸乙酯萃取物和菌丝体甲醇提取物中。

实施例7草珊瑚内生真菌J-10的发酵产物中活性物质的分离、鉴定

7.1活性物质分离

将实施例5中菌液乙酸乙酯萃取物与菌丝体甲醇提取物合并，采用硅胶柱色谱分离技术，并结合活性跟踪，分离纯化出抑菌活性物质单体。

7.2活性物质鉴定

对活性物质单体采用核磁共振谱和质谱技术进行结构鉴定，确定其为毛色二孢素，化学结构式如下式(I)，相关MS谱图及核磁谱图见附图3-5。

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具体波普数据如下：

HRESIMS:m/z 291.1599[M–H]^–.分子式为C₁₇H₂₄O₄，分子量为292.1599。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.67(s,1H),6.25(d,J＝2.1Hz,1H),6.20(d,J＝2.1Hz,1H),5.04(m,1H),3.67(s,3H),2.48(m,2H),2.39(m,1H),1.82(m,1H),1.66–1.51(overlapped,4H),1.43–1.29(overlapped,4H),1.21(d,J＝6.8Hz,3H),1.18–1.09(overlapped,2H).

¹H NMR(400MHz,acetone-d₆)δ6.35(d,J＝2.1Hz,1H),6.33(d,J＝2.1Hz,1H),5.15(td,J＝6.6,3.2Hz,1H),3.76(s,3H),2.70(m,1H),2.46(dt,J＝13.1,6.2Hz,1H),2.12–2.07(overlapped,1H),1.92(m,1H),1.71–1.57(overlapped,4H),1.49–1.40(overlapped,4H),1.29(d,J＝6.8Hz,3H),1.23–1.17(overlapped,2H).

¹³C NMR(100MHz,acetone-d₆)δ167.83,159.07,157.98,142.31,117.17,107.92,96.83,71.07,55.20,32.32,30.05,29.69,26.56,24.98,24.40,20.78,18.95.

实施例8活性物质毛色二孢素的抑菌活性测定

制作带药培养基，培养、测量和记录等操作同实施例6，配制供试样品部分：将实施例7中纯化得到的活性物质毛色二孢素配制成梯度浓度的供试样品溶液。采用抑制菌丝生长速率法测试了活性物质毛色二孢素在梯度浓度下对9中植物病原真菌的抑菌活性，并根据抑菌结果计算出EC₅₀值和95％置信限，结果如表3所示。

表3毛色二孢素对植物病原真菌的抑菌活性

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由表3数据可以看出，活性物质毛色二孢素对9种植物病原真菌均有抑菌活性，有效中浓度(EC₅₀)为0.0155mg/mL～0.2491mg/mL，表明其具有广谱抗病性，有用于制备农用广谱杀菌剂的潜力。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种草珊瑚内生真菌，其特征在于，所述草珊瑚内生真菌的分类命名为假可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia pseudotheobromae）J-10，已于2022年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 40055。

2.一种根据权利要求1所述的草珊瑚内生真菌在制备抗植物病原真菌制剂中的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为罗汉果白绢病菌（Sclerotium rolfsii）和罗汉果根腐病菌（Fusarium oxysporum）。