CN116240114B

CN116240114B - 一株桑树桑黄菌yx2、提取物及其应用

Info

Publication number: CN116240114B
Application number: CN202310076836.9A
Authority: CN
Inventors: 张晓英; 靳雨婷; 王洪凤; 王庆彬; 陈大印; 石磊; 徐宇飞; 王胜; 安典路
Original assignee: Shandong Pengbo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Pengbo Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-01-31
Filing date: 2023-01-31
Publication date: 2023-11-03
Anticipated expiration: 2043-01-31
Also published as: CN116240114A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体公开了一株桑树桑黄菌YX2、提取物及其应用，所述桑树桑黄菌YX2已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.21078；所述桑树桑黄菌YX2或其提取物仅需纳克级别用量即可明显增强植物抗干旱胁迫，促进种子萌发和植物生长发育；本发明所述桑树桑黄菌YX2及其提取物可与肥料复配使用，复配后具有协同增效作用，进一步提升植物抗逆能力，可用于作物生产中，实现产业化生产。

Description

一株桑树桑黄菌YX2、提取物及其应用

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株桑树桑黄菌YX2、提取物及其应用。

【背景技术】

植物在自然环境中经常受到各种生物和非生物胁迫的影响，干旱胁迫是影响全球作物生长和农业生产的重要因素。

干旱胁迫下植物种子萌发率降低，植株生长迟缓，叶片失水萎蔫，产生一系列生理生化变化，严重影响植物的正常生长发育，如何在干旱条件下提高作物抗旱能力、增加作物产量已成为当前农业研究的重中之重。

桑黄是大型真菌，通常生长在桑树上，属担子菌门(Basidiomycota)、伞菌纲(Agaricomy-cetes)、锈革孔菌目(Hymenochaetales)、锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)、桑黄孔菌属(Sanghuangporus)真菌。桑黄含有各种氨基酸、多糖高分子化合物、多种酶类、多酚类、三萜类、脂肪酸类和多种微量元素等成分。现有技术中对桑黄菌的研究主要在医学领域方面，暂没有在农学农业方面的研究。

【发明内容】

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供一株桑树桑黄菌YX2、提取物及其应用。

为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面在于，提供一株桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2，所述菌株已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.21078。

本发明所述桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2采集于泰山森林野生桑树中，所述菌株菌落在PDA培养基上于25℃条件下培养一周，直径75～80mm，菌落平坦，菌丝棕黄色，平铺，绳状，边缘羊毛状，两周后菌丝变成棕褐色。生殖菌丝具简单分隔，无色至浅黄色，薄壁至稍厚壁，多分枝，频繁分隔，直径为2～3.5μm；骨架菌丝金黄色，厚壁，具宽或窄内腔，少分枝，多分隔，近规则排列，直径为3～4.5μm。该菌具有桑黄孔菌属的特征，初步判定为桑树桑黄菌。

本发明的第二方面在于，提供所述桑树桑黄菌YX2的提取物，所述提取物具体为桑树桑黄菌YX2发酵后菌丝体的乙醇提取物。

本发明的第三方面在于，提供所述桑树桑黄菌YX2提取物的制备方法，包括发酵所述桑树桑黄菌YX2制备菌丝体的步骤，及将菌丝体采用乙醇进行提取的步骤。

本发明的第四方面在于，提供所述桑树桑黄菌YX2或其提取物在提高作物抗干旱胁迫或促进作物生长中的应用。

本发明的第五方面在于，提供一种所述桑树桑黄菌YX2或其提取物作为种子萌发剂的应用。

本发明的第六方面在于，提供所述桑树桑黄菌YX2或其提取物作为肥料增效剂的应用。

本发明的第七方面在于，提供一种组合物包括所述桑树桑黄菌YX2或其提取物。

本发明的第八方面在于，提供所述组合物在提高作物抗干旱胁迫、促进作物生长中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.21078；

本发明所述桑树桑黄菌YX2及其提取物能够增强植物抗干旱胁迫，促进种子萌发和植物生长发育；具体表现在以下几个方面：

本发明所述桑树桑黄菌YX2及其提取物通过提高α-淀粉酶活性促进种子萌发，缓解干旱胁迫对种子萌发的抑制；

本发明所述桑树桑黄菌YX2及其提取物可通过提高抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT)活性，降低丙二醛(MDA)含量，减轻植物细胞氧化损伤，缓解干旱胁迫对植物细胞造成的损伤；

本发明所述桑树桑黄菌YX2及其提取物通过积累可溶性糖等渗透调节物质，增加细胞渗透势，促进植物吸水，提高植物抗旱能力，提高作物品质；

本发明所述桑树桑黄菌YX2提取物仅需纳克级别用量即可明显增强植物抗干旱胁迫能力，促进植株生长；

本发明所述桑树桑黄菌YX2及其提取物与肥料复配具有协同增效作用，进一步提升植物抗逆能力，可用于作物生产中，实现产业化生产。

【附图说明】

图1为所述桑树桑黄菌YX2的菌落形态；

图2为所述桑树桑黄菌YX2于显微镜下观察的菌丝形态(左侧放大倍数为40×0.65，右侧放大倍数为100×1.4)；

图3为所述桑树桑黄菌YX2通过ITS序列分析建立的系统发育进化树；

图4为不同处理组小麦种子的萌发情况；

图5为不同处理组小麦种子的生理生化指标情况；

图6为不同处理组生菜的生长情况；

图7为不同处理组生菜叶片的生理生化指标情况；

图8为不同处理组小麦的生长情况；

图9为不同处理组水稻的株高、鲜重、含水量指标。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1菌株的分离与鉴定

1、菌株的分离：

本发明所述球桑树桑黄菌YX2从泰山森林中野生桑树上分离分离得到；

(1)取新鲜桑黄子实体，用干净刷子刷去子实体表面的杂质，用75％乙醇进行表面消毒，然后置于无菌烧杯中备用；

(2)将已消毒的子实体在无菌超净工作台上切开，用已灭菌的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织块，接入无菌的PDA培养基表面，倒置于25℃恒温箱中培养；

(3)待长出菌丝后，取生长快的菌丝，移入另一无菌PDA平板培养皿表面培养，待长出菌丝后，取生长快、无杂菌污染的菌丝块，移入PDA平板培养基表面培养，如此反复几次分离、纯化；直至每个平板上只含有统一特征的单一菌落，最后得到一株菌，编号为YX2。

2、菌株的鉴定

(1)菌株的形态特征

将所述菌株YX2在PDA培养基上，25℃培养一周，直径75～80mm，菌落平坦，菌丝棕黄色，平铺，绳状，边缘羊毛状，两周后菌丝变成棕褐色，如图1所示；

在显微镜下可见生殖菌丝具简单分隔，无色至浅黄色，薄壁至稍厚壁，多分枝，频繁分隔，直径为2～3.5μm；骨架菌丝金黄色，厚壁，具宽或窄内腔，少分枝，多分隔，近规则排列，直径为3～4.5μm，如图2所示(左图放大倍率为40×0.65，右图放大倍率为100×1.4)。

(2)菌株的分子生物学鉴定

以ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC为引物，对所述菌株YX2进行扩增，并对扩增产物进行测序分析，具体序列见序列表；

基于blast搜索，选取与研究菌株序列最接近的种或最靠近的进化分支代表菌株的序列进行比对，利用Mega6.0软件通过ML算法，利用bootstrap 1000次建树结果建立进化树如图3所示；NCBI数据库对比分析，发现其与桑树桑黄菌的同源相似性达98％。

最终通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，确定该菌株为桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)。

实施例2桑树桑黄菌YX2提取物的制备

所述桑树桑黄菌YX2提取物具体为其发酵后菌丝体的乙醇提取物，具体制备过程如下：

1.发酵培养：

将实施例1分离、纯化得到的桑树桑黄菌(Sanghuangporus sanghuang)YX2的菌种接到PDA培养基上，25℃培养一周，琼脂挖块接种于装有50mL PDA培养液的250mL三角烧瓶，于25℃，160-180r/min下旋转摇床上培养3天作为种子，以10％量接种于装有150mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同样条件下培养5天，终止发酵，得发酵液。

2.乙醇提取：

将发酵液离心过滤，得菌丝体，将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液，即得所述桑树桑黄菌YX3提取物。所述乙醇的加入量为菌丝体干燥后重量的20％；每次提取加入乙醇的量相同。

实施例3桑树桑黄菌YX2提取物对干旱胁迫下种子萌发的影响

1、试验设计：

(1)PEG6000干旱胁迫浓度筛选：

设置PEG6000七个浓度梯度，分别为0、5％、10％、15％、20％、25％、30％。分别选取大小均匀一致饱满的小麦种子(济麦22)，浸种24h后置于培养皿中，种子下铺1层滤纸，种子上覆1层滤纸，向培养皿中加入6mL不同浓度梯度的PEG6000溶液，放在25℃恒温培养箱中暗处培养，3d后统计萌发数，查看滤纸湿润情况，若湿润度不足每皿补充对应溶液；自种子发芽当日起，每天定时统计种子发芽总数及每日新萌发种子的数量，培养至第7d，测定各项指标，最终确定PEG6000溶液的试验浓度为20％。

(2)不同处理对干旱胁迫下种子萌发的影响

分别设正常水分处理(CK0)、20％ PEG6000干旱处理(CK1)、20％ PEG6000干旱+33ng/mL 24-表芸苔素内酯(BR)和20％ PEG6000干旱+20ng/mL桑树桑黄菌YX2提取物(YX2)。浸种24h，方法同上，每皿50粒种子，重复三次。每天定时统计发芽种子总数及每日新萌发种子的数量，7d后，每皿取6颗幼苗测定根长、芽长，并按照下式分别计算各指标：

发芽率＝7d内萌发的种子数/种子总数

发芽势＝3d内萌发的种子数/种子总数

发芽指数＝∑逐日萌发数/相应的发芽天数

幼苗活性指数＝发芽指数×7d时芽长

萌发抗旱指数＝处理的萌发指数/对照萌发指数；

活力抗旱指数＝处理的活力指数/对照的活力指数；

(3)不同处理对种子生理指标的影响

取上述各处理组处理后的种子，剥取完整的种胚进行后续的生理指标测定，具体生理指标测定参照如下方法进行，测定结果如图5所示；

可溶性糖含量参照蒽酮比色法测定(方法参照张志良,瞿伟菁.植物生理学试验指导[M].第三版.北京:高等教育出版社,2003.)；

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定(方法参照蔡永萍.植物生理学实验指导[M].北京：中国农业大学出版社，2014.)；

过氧化氢(H₂O₂)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、ɑ-淀粉酶活性使用北京索莱宝科技有限公司的试剂盒检测。

2、试验结果

(1)不同处理组小麦种子萌发情况：

不同处理组小麦种子萌发情况如表1和图4所示：

表1不同处理组小麦种子萌发情况

注：不同小写字母表示在0.05水平差异显著。

由表1和图4可以看出，YX2提取物与BR溶液浸种处理均能缓解PEG6000模拟的干旱胁迫对小麦种子萌发及生长的影响，YX2提取物浸种后小麦抗干旱胁迫能力更加显著；且由表1可知YX2提取物处理后小麦胚芽长较CK1增加84.8％，胚根长较CK1增加28.6％，发芽率较CK1增加7.3％。

(2)不同处理组小麦种子的理化指标：

由图5可知，YX2提取物与BR浸种处理后小麦种子会发生一系列生理生化变化，具体如下：

在干旱胁迫下小麦种子内的可溶性糖含量和脯氨酸含量会降低，YX2提取物和BR浸种处理后小麦种子中的可溶性糖含量和脯氨酸含量与CK1处理组相比均有所提高，尤其是YX2提取物处理组小麦种子中的可溶性糖含量和脯氨酸含量分别较CK1处理组增加了56.02％和3.85％，有利于降低植株水势，促进小麦吸水；

干旱胁迫下小麦种子内的丙二醛和过氧化氢含量升高，过氧化物酶活性降低，从而造成细胞氧化损伤，严重影响植物正常代谢；YX2提取物与BR浸种均能缓解小麦的氧化损伤，YX2提取物浸种后小麦体内丙二醛和过氧化氢含量明显降低，分别较CK1处理组减少了56.34％和31.78％；超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和α-淀粉酶活性显著升高，分别较CK1处理组增加62.28％、42.86％和13.5％，说明YX2提取物可以通过降低膜脂过氧化产物和活性氧积累、提高过氧化物酶活性来缓解细胞损伤，提高植物抗干旱胁迫能力，通过提高α-淀粉酶活性促进种子萌发，缓解干旱胁迫对种子萌发的抑制。

实施例4桑树桑黄菌YX2提取物对干旱胁迫下生菜生长的影响

1、试验过程：

将营养基质与珍珠岩充分混匀，加水湿润后装入育苗盘，表面铺平，点入生菜种子，播种深度0.5cm；于温度23℃，湿度50％-60％，光照6000-7000lux培养室内培养，长至两叶一心期，选择长势均匀一致的幼苗进行移栽。

土壤过筛，150℃干热灭菌2h，将营养基质与土壤按1:3充分混匀，移栽生菜(花盆尺寸：10*10*8cm，托盘尺寸42*31*2.5cm)。7天后进行试验处理，分别设正常水分处理(CK0)、干旱处理(CK1)、干旱+10ng/mL YX2提取物处理(YX2-10)、干旱+20ng/mL YX2提取物处理(YX2-20)，每处理重复6盆，正常处理组每托盘浇灌600mL，干旱处理组每托盘浇灌400mL。过程中根据土壤水分速测仪测定的土壤含水率，定期补充水分，正常水分处理土壤含水量18-20％(饱墒)；干旱处理含水量12-15％(黄墒)，培养期间定期观察、记录试验结果，效果明显时进行拍照。

处理后15天测定植株株高、基部茎粗、地上/地下部分鲜重、叶片数、根长、地上/地下部分干重，计算植株含水量，并取生菜叶片测定理化指标。

2、试验结果

(1)不同处理组生菜的生长指标：

表2不同处理对干旱胁迫下生菜生长指标的影响

由表2和图6可知，干旱处理组(CK1)的生菜植株矮小，叶片萎蔫，叶面积、根长、植株鲜重，含水量等生长指标降低，严重影响了生菜的生长；YX2-10、YX2-20处理组与CK1组相比，生菜各项生长指标均有不同程度的提高，浇灌浓度为10ng/mL即有显著功效，20ng/mL处理组生菜地上部鲜重最高；YX2-10处理组和YX2-20处理组生菜的地上部鲜重分别较CK1处理组增加42.60％和55.23％，植株含水量较CK1处理组增加18.80％和29.69％。可见，浇灌一定浓度YX2提取物可以缓解干旱胁迫对生菜的伤害，提高生菜叶片含水量，促进生菜地上部生长及产量增加。

(2)不同处理组生菜叶片的理化指标：

可溶性糖对生菜的口感及营养起关键性作用，由图7可知，YX2提取物可促进干旱胁迫下生菜可溶性糖含量增加，降低生菜细胞水势的同时提升生菜的口感及品质。YX2提取物还能显著提高抗氧化酶活性，减轻生菜细胞过氧化损伤。在10ng/mL和20ng/mL浓度下，生菜可溶性糖含量分别较CK1增加94.41％和95.24％；超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性显著升高，分别较CK1增加8.17％、242.86％和17.06％、380.00％，有效缓解干旱胁迫对生菜的损伤，提高生菜抗干旱胁迫的能力。

实施例5桑树桑黄菌YX2提取物与聚谷氨酸复配对干旱胁迫下小麦的影响

(1)试验过程：小麦种子消毒，在培养皿中进行催芽萌发；土壤过筛，150℃干热灭菌2h，土壤与基质3:1混合，选择长势一致的小麦幼苗移栽。

试验设四个处理，CK0：正常水分处理；CK1：干旱处理；PGA：干旱胁迫+5g/L聚谷氨酸(武汉光华时代生物科技有限公司提供)；YX2：干旱胁迫+500ng/mL YX2提取物；PGA+YX2：干旱胁迫+500ng/mL YX2提取物+5g/L聚谷氨酸，每处理重复5盆，每盆4棵小麦，每盆浇灌100mL处理液。7天后干旱胁迫组停止浇水，模拟土壤自然干旱；培养期间定期观察，20天后测定小麦株高、根长、鲜重、干重，计算植株含水量及抗旱系数，结果如表3所示；

从断水后开始每天观察小麦的生长状况根据小麦植株表现出的萎蔫程度，按照以下分级标准对各重复分株进行调查统计：

0级：植株生长正常，无萎蔫现象；

1级：植株生长基本正常，只有1片叶表现轻微萎蔫；

2级：植株萎蔫加重，2片叶出现萎蔫；

3级：植株明显萎蔫，3片叶以上均萎蔫；叶片萎蔫下垂，恢复困难。

抗旱系数＝[1-∑(各级株数×相应级数)/(总株数×3)]×100％；

植株含水量＝(植株鲜重-植株干重)/(植株饱和鲜重-植株干重)×100％。

表3不同处理对干旱胁迫下小麦生长指标的影响

由表3和图8可知，干旱胁迫会导致小麦植株萎蔫，株高、鲜重、含水量等生长指标降低，严重影响小麦生长发育；聚谷氨酸和YX2提取液均能促进小麦生长发育，提高小麦抗旱性，聚谷氨酸复配YX2提取物后促生抗旱效果更佳，叶片鲜重及抗旱系数分别较CK1增加33.90％和177.54％，较单施聚谷氨酸增加12.86％和50.89％，较单施YX2提取物增加9.72％和32.30％，说明本发明所述YX2提取物与聚谷氨酸复配使用在促生抗旱方面具有增效作用。

实施例6桑树桑黄菌YX2提取物与硅酸钠(Na₂SiO₃·9H₂O)复配对干旱胁迫下水稻的影响

试验前进行PEG6000胁迫浓度筛选，确定PEG6000试验浓度为15％；

水稻育苗，两叶一心后选择长势均匀一致的幼苗移至装有蛭石的花盆中，并将花盆放入托盘中(花盆尺寸：7*7*7.5cm，托盘尺寸32.5*25*12cm)，每托盘10放置10盆花盆，置于25℃温室内培养(16h/8h)；

试验设4个处理，CK0：正常水分处理；CK1：干旱胁迫处理；Si：干旱胁迫+0.25mM硅酸钠；YX2：干旱胁迫+10ng/mLYX2提取物；Si+YX2：干旱胁迫+0.25mM硅酸钠+10ng/mLYX2提取物，每处理重复10盆；干旱胁迫处理的水稻分别浇灌15％ PEG6000及营养液(营养液采用国际水稻所营养液配方)，正常水分处理的水稻浇灌清水及营养液，各处理初次浇灌1L/托盘，之后每周浇灌500mL/托盘。待效果明显时测定株高、根长、叶片数、鲜重等指标，结果如图9所示；

由图9可知，桑树桑黄菌YX2提取物与硅酸钠复配使用可显著提高水稻生长及抗旱能力，水稻株高、鲜重及含水量分别较CK1处理组提高29.36％、41.76％、23.53％；较仅使用硅处理提高15.58％、17.16、14.67％；较仅使用YX2提取物处理增加9.07％、13.77％、11.16％。试验证明桑树桑黄菌YX2提取物与硅元素复配具有协同增效作用，可显著提高作物的抗干旱胁迫能力。

通过以上实施案例看出，本发明公开的所述桑树桑黄菌(Sanghuangporussanghuang)YX2及其提取物，能够提高植物抗氧化酶活性、降低脂质过氧化物的含量，从而减轻干旱胁迫对植物的伤害；同时有利于植物积累渗透调节物质，促进植株吸水，缓解植物生理干旱；本发明的桑树桑黄菌YX2提取物生产过程安全环保、成本低效益高，用量极低，10ng/mL即能促进干旱胁迫下植物生长，作为肥料增效剂、种子萌发助剂等与肥料复配施用具有协同增效作用，对干旱胁迫下的农作物生长和农产品的无公害生产具有重要意义。

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims

1.一株桑树桑黄菌YX2，其特征在于，所述菌株已于2020年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.21078。

2.权利要求1所述桑树桑黄菌YX2的提取物，其特征在于，所述提取物具体为桑树桑黄菌YX2发酵后菌丝体的乙醇提取物；其制备方法具体包括发酵所述桑树桑黄菌YX2制备菌丝体的步骤，及将菌丝体采用乙醇进行提取的步骤；其中，乙醇提取的步骤具体为：将菌丝体在50℃下干燥、粉碎，加入乙醇冷浸24小时，然后超声提取2h；重复提取2次，合并滤液，即得所述桑树桑黄菌YX2提取物；所述乙醇的加入量为菌丝体干燥后重量的20％，每次提取加入乙醇的量相同。

3.权利要求1所述的桑树桑黄菌YX2或权利要求2所述的桑树桑黄菌YX2的提取物在提高作物抗干旱胁迫、在干旱胁迫条件下促进作物生长中的应用。

4.权利要求1所述的桑树桑黄菌YX2或权利要求2所述的桑树桑黄菌YX2的提取物在干旱胁迫条件下作为种子萌发剂的应用。

5.权利要求1所述的桑树桑黄菌YX2或权利要求2所述的桑树桑黄菌YX2的提取物在干旱胁迫条件下作为肥料增效剂的应用。

6.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的桑树桑黄菌YX2或权利要求2所述的桑树桑黄菌YX2的提取物。

7.权利要求6所述的组合物在提高作物抗干旱胁迫、在干旱胁迫条件下促进作物生长中的应用。