CN103087927B - 一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用 - Google Patents

一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103087927B
CN103087927B CN201310021372.8A CN201310021372A CN103087927B CN 103087927 B CN103087927 B CN 103087927B CN 201310021372 A CN201310021372 A CN 201310021372A CN 103087927 B CN103087927 B CN 103087927B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seed
phi17
bacterial strain
blue
germination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201310021372.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103087927A (zh
Inventor
刘红霞
孙晓颖
毛益婷
罗毅波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN201310021372.8A priority Critical patent/CN103087927B/zh
Publication of CN103087927A publication Critical patent/CN103087927A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103087927B publication Critical patent/CN103087927B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)

Abstract

本发明公开了一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用。本发明提供的菌株PhI17,鉴定为瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.),保藏号为CGMCC No.6756。将所述菌株PhI17与带叶兜兰种子共培养可以成功促进带叶兜兰种子萌发,并进一步促进幼苗发育,长出能进行光合作用的叶片,将幼苗移栽至基质培育,幼苗均能存活且生长良好。采用本发明提供的方法促进带叶兜兰种子萌发或进行带叶兜兰育苗,操作简单、成本低廉。本发明对于带叶兜兰的人工繁育有重要的经济价值。

Description

一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用。
背景技术
兜兰属(Paphiopedilum)植物,花形奇特,花色艳丽,是人们最喜爱的兰科植物之一,人们常称兜兰为“拖鞋兰”、“仙履兰”。近十几年来,由于猖獗走私以及生境破坏等原因,野生兜兰的数量急剧减少,分布区逐渐萎缩,不少种类已经到了灭绝的边缘。
为了缓解对野生植株的采集压力,保护濒危物种,以及满足人们对兜兰属植物的需求,国内外学者对兜兰植物的人工繁殖进行了大量地研究。目前,部分兜兰种类的无菌播种和组织培养技术已获成功,但无菌苗栽培后生长缓慢,成活率低,制约着兜兰的人工繁育。在自然条件下,兰科植物种子需要有合适的菌根真菌侵染,为其提供营养才能正常萌发,并帮助植物度过脆弱的幼苗期长成植株。国内外学者利用兰科菌根真菌与其种子进行共生萌发的技术已用于多种兰科植物,但因为兜兰属植物菌根真菌分离培养困难,尚缺乏可以与兜兰种子共生萌发的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用。
本发明提供的菌株PhI17,经形态学和分子生物学鉴定为担子菌亚门胶膜菌科的瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.),已于2012年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏号为CGMCC No.6756。
所述菌株PhI17可用于促进带叶兜兰种子萌发。
本发明还保护一种促进带叶兜兰种子萌发的方法,包括如下步骤:将所述菌株PhI17和带叶兜兰种子共培养。所述共培养具体可在燕麦培养基上进行。所述共培养的条件具体可为:23℃黑暗培养。
所述菌株PhI17可用于促进带叶兜兰幼苗生长。
本发明还保护一种带叶兜兰育苗方法,包括如下步骤:将所述菌株PhI17和带叶兜兰种子共培养,直至种子萌发并长出真根。所述共培养具体可在燕麦培养基上进行。所述共培养的条件具体可为:23℃黑暗培养。
所述育苗方法还可包括将长出真根的幼苗移栽至燕麦培养基进行23℃光照培养的步骤。
所述育苗方法还可包括如下步骤:进行所述光照培养直至幼苗叶片长度大于3cm,然后将所述幼苗移栽至混合基质中,25℃培养(每天12小时光照,12小时黑暗)。
所述燕麦培养基的具体制备方法如下:将8g燕麦片加入蒸馏水中,煮沸30分钟,纱布过滤后收集滤液,用蒸馏水定容至1000ml,再加入10g琼脂和0.05g氯霉素。
将所述菌株PhI17与带叶兜兰种子共培养可以成功促进带叶兜兰种子萌发,并进一步促进幼苗发育,长出能进行光合作用的叶片,将幼苗移栽至基质培育,幼苗均能存活且生长良好。采用本发明提供的方法促进带叶兜兰种子萌发或进行带叶兜兰育苗,操作简单、成本低廉。本发明对于带叶兜兰的人工繁育有重要的经济价值。
附图说明
图1为菌株PhI17的形态。
图2为菌株PhI17和带叶兜兰种子共生培养75天的照片。
图3为将长出真根的原球茎移至装有燕麦培养基的三角瓶,23℃培养过程中幼苗的照片。
图4为将幼苗移栽至混合基质,25℃培养过程中幼苗的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
带叶兜兰(P.hirsutissimum):参考文献:刘仲健,陈心启,陈利君等,中国兜兰属植物.2009,北京:科学出版社.pp93-100。
燕麦培养基的制备方法:将8g燕麦片加入蒸馏水中,煮沸30分钟,用纱布过滤并收集滤液,用蒸馏水定容至1000ml,再加入10g琼脂和0.05g氯霉素,加热搅拌至琼脂溶解,分装后121℃湿热灭菌20分钟。
混合基质的制备方法:将等体积的沙子和蛭石混合,表面覆盖一层苔藓。
实施例1、菌株的获得、鉴定与保藏
一、菌株PhI17的获得
取生长良好的野外采集的带叶兜兰(P.hirsutissimum)营养根段,将其根段绒毛状根被轻轻剥去,在自来水下冲洗干净。光学显微镜下镜检,选出形成丰富菌丝团的根段。在超净工作台上,用75%的酒精浸泡30s,再用1%的NaClO根表灭菌4min,无菌水清洗3-4次,用无菌滤纸吸干水分。用灭菌刀片将根段切成若干厚度约0.5mm的薄片,平铺于1∕5PDA分离培养基上,25℃培养箱培养。当菌丝从根片上长出后,转移至PDA培养基进行纯化培养,最后以POA培养基试管斜面4℃保存。
每升1∕5PDA分离培养基是由40g去皮马铃薯,4g葡萄糖,17g琼脂和1000ml蒸馏水组成。倒平板前,待培养基温度降到45℃左右加入硫酸链霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)。
每升POA培养基是由50g去皮马铃薯、8g燕麦片、17g琼脂、0.05g氯霉素、1000ml蒸馏水组成。
将分离得到的一株纯培养的菌株命名为菌株PhI17。
二、菌株的鉴定
1、形态鉴定
菌株PhI17的形态见图1。图1A显示菌株PhI17在PDA培养基上的菌落特征。图1B显示菌株PhI17在光学显微镜下的菌丝特征。菌株PhI17的菌落乳白色,菌丝较发达,生长后期菌落中间偶出现菌丝黏滑,菌丝直角分支,近分支处有隔膜,不产生孢子,为典型的Rhizoctonia-like真菌。
2、分子鉴定
挑取燕麦液体培养基培养的菌株PhI17的菌丝球,无菌滤纸吸干多余水分,使用普通植物基因提取试剂盒(TIANGEN,China)提取rDNA。利用ITS1/ITS4对真菌rDNA上的ITS区域进行PCR扩增。扩增反应体系(25μl)包括:16.25μl ddH2O,2.5μl10×PCR buffer,2.5μl dNTP(2.5mM),1μl ITS1(10mM),1μl ITS4(10mM),0.25μlTaq polymerase,1.5μl DNA。PCR扩增反应程序为:95℃预变性5min后进入30个循环(即95℃30s,50℃30s,72℃30s),循环完成后,72℃延伸10min。取4μl扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,有明亮单一条带的扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。测序结果如序列表中序列1所示。将测序结果在GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行在线比对,该菌株与JQ713581(Tulasnella sp.)的相似性较高,为97%。
根据以上形态和分子特征,菌株PhI17属于瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.)。菌株PhI17已于2012年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编100101),保藏编号为CGMCC No.6756。
实施例2、菌株PhI17与带叶兜兰种子的共生萌发
一、带叶兜兰种子的获得
采集野外自然结实,生长发育良好,果实饱满,七八成熟且未开裂的带叶兜兰蒴果,用75%酒精棉反复擦拭蒴果表面除去果皮绒毛,在超净工作台上,用75%的酒精浸泡30s,再用4.5%的NaClO灭菌8min,无菌水清洗3-4次。将蒴果置于事先放置无菌滤纸的培养皿内,一只手用镊子夹住蒴果,另一只手用解剖刀纵切果实,取出种子。取少量种子观察有胚率,确保用于试验的种子有胚率大于80%。
二、菌株PhI17的琼脂块的获得
挑取PhI17菌落接种至PDA培养基平板上,25℃培养箱培养8天,用灭菌后的打孔器打孔,得到直径约0.5cm、表面覆盖菌株PhI17的菌丝的琼脂块。
三、菌株PhI17与带叶兜兰种子的共生萌发
1、无菌条件下,在燕麦培养基平板上放射状排列放置1×3.5cm的滤纸条(Shuangquanpai102,China)5片,用小药勺将带叶兜兰种子均匀洒在滤纸条上,每片滤纸条上40-80粒种子。
2、分组处理
实验组:在燕麦培养基平板中心接种一个步骤二得到的琼脂块,用封口膜密封后23℃黑暗培养。
对照组:在燕麦培养基平板中心接种直径约0.5cm的无菌PDA琼脂块,用封口膜密封后23℃黑暗培养。
进行三次重复实验,每次重复实验中每个处理包括三个燕麦培养基平板。
共生培养过程中,持续观察带叶兜兰种子的萌发情况并拍照。
共生培养75天的照片见图2。图2中的阿拉伯数字表示带叶兜兰种子和原球茎所处的发育阶段;0代表阶段0,即种皮完好,未萌发;1代表阶段1,即种胚膨大,种皮破裂;2代表阶段2,即种胚继续膨大,假根毛出现;3代阶段3,即表叶原基出现;4代表阶段4,即第一片叶出现;5代表阶段5,即真根出现。共生培养35天时,带叶兜兰种子明显膨大,突破种皮。共生培养55天时,第3阶段的原球茎出现。共生培养75天时,第5阶段的原球茎出现。
共生培养75天后在超净工作台上用体视显微镜统计所有种子中处于不同萌发阶段的种子的比率。进行三次重复实验,结果取平均值。结果见表1。
表1共生培养75天后处于不同萌发阶段的种子的比率
Figure BDA00002756130200041
3、萌发种子的移栽
(1)将长出真根的原球茎移至装有燕麦培养基的三角瓶内,23℃培养(每天24小时光照),每3个月将幼苗移至新的装有燕麦培养基的三角瓶内。培养37天时的照片见图3A,培养144天时的照片见图3B。
(2)步骤(1)中的幼苗叶片长度大于3cm后,移栽至混合基质中,25℃培养(每天12小时光照,12小时黑暗,两天浇一次水)。移栽至混合基质3个月后,所有移栽的幼苗均存活,生长良好,叶片翠绿平展。刚移栽至混合基质的幼苗见图4A,移栽98天后的幼苗见图4B。
Figure IDA00002756131300011

Claims (5)

1.菌株(Epulorhiza sp.)PhI17,它的保藏编号为CGMCC No.6756。
2.权利要求1所述的菌株在促进带叶兜兰种子萌发中的应用。
3.权利要求1所述的菌株在促进带叶兜兰幼苗生长中的应用。
4.一种促进带叶兜兰种子萌发的方法,包括如下步骤:将权利要求1所述的菌株和带叶兜兰种子共培养。
5.一种带叶兜兰育苗方法,包括如下步骤:将权利要求1所述的菌株和带叶兜兰种子共培养,直至种子萌发并长出真根。
CN201310021372.8A 2013-01-21 2013-01-21 一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用 Expired - Fee Related CN103087927B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310021372.8A CN103087927B (zh) 2013-01-21 2013-01-21 一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310021372.8A CN103087927B (zh) 2013-01-21 2013-01-21 一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103087927A CN103087927A (zh) 2013-05-08
CN103087927B true CN103087927B (zh) 2014-05-07

Family

ID=48201068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310021372.8A Expired - Fee Related CN103087927B (zh) 2013-01-21 2013-01-21 一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103087927B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105861332B (zh) * 2016-06-02 2019-04-23 广西壮族自治区农业科学院花卉研究所 一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用
CN105861330B (zh) * 2016-06-02 2019-04-23 广西壮族自治区农业科学院花卉研究所 一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用
CN107125005B (zh) * 2017-06-12 2020-03-13 贵州省林业科学研究院 硬叶兜兰菌根化育苗方法
CN109536391B (zh) * 2018-12-20 2022-02-22 沈阳农业大学 一种用于促进蝴蝶兰原球茎生长的真菌及其应用
CN110881478B (zh) * 2019-11-07 2021-04-13 中国林业科学研究院林业研究所 蜡壳属真菌促进树兰属植物和兜兰属植物种子萌发的方法
CN111876336B (zh) * 2020-08-11 2022-03-08 云南大学 胶膜菌属真菌及其促进白旗兜兰种子萌发形成幼苗的应用
CN112760239B (zh) * 2021-03-19 2022-05-13 中国林业科学研究院林业研究所 一株促进带叶兜兰种子萌发形成幼苗的胶膜菌及其培养方法和应用
CN113528390B (zh) * 2021-07-26 2022-09-09 广西中医药大学 瘤菌根菌菌株1219及其应用
CN114058520B (zh) * 2021-12-03 2023-05-16 贵州省林业科学研究院 一种小叶兜兰菌根真菌及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4922697B2 (ja) * 2005-09-26 2012-04-25 住化農業資材株式会社 植物育苗用資材及びその利用
CN101338290B (zh) * 2008-08-12 2010-09-01 金辉 一种培养兰花的方法及其专用菌株

Also Published As

Publication number Publication date
CN103087927A (zh) 2013-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103087927B (zh) 一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用
CN101595803B (zh) 一种菌根食用菌菌根苗的生产方法
CN104745483B (zh) 一种宛氏拟青霉菌株sj1及其应用
CN102612965B (zh) 一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法
CN105861330B (zh) 一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用
CN106399132B (zh) 一株白囊耙齿菌及其应用
CN112725191B (zh) 一株促进兰科种子萌发的膨大革孔菌菌株及其应用
CN107460133A (zh) 深色有隔内生真菌hs40及其在铁皮石斛生产上的应用
CN105754864B (zh) 白及菌根真菌及其应用
CN114381379B (zh) 一株具有提高石斛幼苗萌蘖能力的胶膜菌菌株tp-8及其应用
CN115537346A (zh) 促进西藏虎头兰生长分化的胶膜菌及其应用
CN107746811A (zh) 一种促进带叶兜兰植株生长的菌株及其应用
CN107629966A (zh) 真菌诱导子、其制备方法及利用该真菌诱导子进行白芨种苗快繁的方法
CN105103947B (zh) 一种天然林下外生菌根合成的专用菌源的使用方法
CN117568190A (zh) 一种促进山慈菇种子萌发的菌株及快速繁育种苗的方法
CN114395486B (zh) 一株具有促进石斛株高生长能力的胶膜菌菌株tp-3及其应用
CN114395485B (zh) 一种具有促进石斛茎粗的胶膜菌菌株tp-2和应用
CN110229757A (zh) 一株有效促进作物生长的桔绿木霉js84及其研制的生物有机肥
CN107090410B (zh) 一株产植物激素的菌根真菌及其在促进植物生长中的应用
CN102492628B (zh) 一种促进大花杓兰种子共生萌发的真菌及其应用
CN114766285A (zh) 一种白肉灵芝菌株l4495及其栽培方法与应用
CN102876580B (zh) 能促进文山红柱兰组培苗生长的丛赤壳科属真菌的分离与应用
CN114717139B (zh) 一株具有促进石斛新根生长能力的瘤菌根菌菌株tp-13及其应用
CN114868617B (zh) 一种利用共生菌进行独蒜兰直播育苗的方法
CN114456951B (zh) 促进手参生长的角担菌属真菌菌株及其方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140507

Termination date: 20220121