CN105754864B - 白及菌根真菌及其应用 - Google Patents

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    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom

Abstract

本发明公开了一种白及菌根真菌，白及菌根真菌为蜡壳菌目(Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY‑51，白及菌根真菌于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO.11104。本发明中白及菌根真菌菌丝体与白及种子制作成白及种子和白及菌根真菌的共生混合体后能够促进白及种子萌发，且萌发率能达到98％。

Description

白及菌根真菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一株白及菌根真菌及其应用。
背景技术
兰科是被子植物中较大的一个科，包含许多珍稀名贵的药用植物和花卉，如铁皮石斛、金线莲、白及等，还是植物界进化程度高且与真菌有着密切联系的特殊生态类群。无论是兰科植物的种子萌发、幼苗生长，还是植株形成都离不开菌根真菌，兰科菌根在兰科药用和观赏类植物的保护、引种驯化和人工栽培中显得尤为重要。但是，由于大多数兰科植物处于濒危状态，所有兰科植物的野生种都已被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》，是植物保护中的“旗舰”类群。因此，如何在生产中有效地利用菌根真菌，已成为兰科植物大规模人工栽培、引种驯化和资源再生及保护的关键限制性因子。
兰科植物种子细小如尘，也称为“灰尘种子”，其种子海量，每一颗成熟的果实包含数万粒以上可利用的种子，但在自然条件下，种子很难萌发，只有受到适宜的真菌侵染后才完成萌发。
白及为兰科多年生草本植物，其花色艳丽，极具观赏价值，还是目前我国濒危紧缺的中药材，其根茎中富含药用成分白及胶质，具有治疗肺结核咯血、支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等作用，疗效确切，经济价值很高。但由于自身特殊的生理特点及其生态环境受到严重破坏，其资源几近枯竭。因此，如何实现白及资源的保护与资源再生，是一个重要而急切的课题。
目前，白及的繁殖方法主要有根茎分株繁殖和组织培养。传统的根茎分株繁殖速度慢，生长周期长，效率低，种苗成本高，很难满足大面积的栽培需求；而组织培养生产的无菌试管苗生长缓慢、移栽成活率低、抗逆性差、易感染病原菌。从目前情况看，白及繁殖困难的状况还没有得到根本解决，导致野生白及资源几近枯竭，市场供不应求，严重限制了白及临床用药和工业生产的需求。。
现有技术中，尚未有关于真菌用于促进白及种子田间萌发的应用报道，因此，筛选并利用能够促进白及种子萌发的真菌，是实现兰科植物大田栽培行之有效的一条途径，对于白及的育苗及栽培生产，提高白及药材的质量和产量，保护白及资源具有重要的现实意义和应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一株白及菌根真菌，白及菌根真菌菌丝体与白及种子制作成共生混合体后能够促进白及种子萌发，且白及种子的萌发率能达到98％。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一株白及菌根真菌，所述白及菌根真菌为蜡壳菌目(Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY-51，所述白及菌根真菌于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO.11104。
所述的白及菌根真菌在促进白及种子萌发中的应用。
所述的白及菌根真菌在促进白及种子在田间萌发中的应用。
一种应用所述的白及菌根真菌促进白及种子萌发的方法，包括以下步骤：
步骤一、菌种制备：采用PDA固体培养基培养白及菌根真菌，然后将白及菌根真菌接种于液体培养基中培养得到白及菌根真菌菌丝体；
步骤二、菌丝体扩大培养：采用液体培养基摇床暗培养白及菌根真菌菌丝体7～15天，培养温度为26±2℃，获得更多的白及菌根真菌菌丝体；
步骤三、制作共生混合体：将白及种子和白及菌根真菌菌丝体放在包埋剂中，制作得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
步骤四、应用：将白及种子和白及菌根真菌的共生混合体播种在育苗盘中或田间，15～30℃下自然光照后萌发。
优选的是，所述步骤一中得到白及菌根真菌菌丝体具体方法为：先采用PDA固体培养基，培养温度为26±2℃，暗培养7～15天后，从形成的菌落边缘挑取小块，接种到液体培养基中进行摇床暗培养，摇床转速为100r/min～150r/min，培养温度为26℃±2℃，暗培养10～20天；
其中，所述液体培养基由葡萄糖、无机盐以及天然提取液组成，所述无机盐为MgSO4·7H2O和KH2PO4，所述天然提取液是土豆提取液、麦麸提取液或燕麦提取液中的一种。
优选的是，所述液体培养基中葡萄糖的加入量为15g/L～40g/L，所述无机盐中KH2PO4的加入量为1.5g/L～3.0g/L，MgSO4·7H2O的加入量为0.5g/L～2.5g/L。
优选的是，所述无机盐中KH2PO4的加入量为2.0g/L，MgSO4·7H2O的加入量为1.5g/L。
优选的是，所述天然提取液是麦麸提取液，则麦麸提取液的制备方法为：按照30g/L称量后，加入1L水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，即得到麦麸提取液；
所述天然提取液是土豆提取液，则土豆提取液的制备方法为：取市售的土豆按照150g/L～300g/L去皮称量后，切块，加入1L水，开水煮30min，4层纱布过滤后，即得到土豆提取液；
所述天然提取液是燕麦提取液，则燕麦提取液的制备方法为：燕麦按照20g/L～40g/L称量后，加入1L水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，即得到燕麦提取液。
优选的是，所述步骤三中，制作得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体的具体方法为：在超净工作台上，将白及种子和白及菌根真菌菌丝体放在包埋剂中后，加入10～30滴的吐温-80或吐温-20，得到悬浮液，用滴管吸取所述悬浮液，滴入已灭菌的质量分数为2％的氯化钙溶液中，10～15min后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
其中，所述包埋剂为用水或所述天然提取液作为溶剂，配置得到质量分数为3～4％的海藻酸钠溶液，加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后，在121℃高压灭菌20min，冷却后得到包埋剂。
优选的是，所述步骤四中，将白及种子和白及菌根真菌的共生混合体播种在育苗盘中的具体方法为：在育苗盘中装入基质，在所述基质上放置壳斗科碎树叶，将白及种子和白及菌根真菌的共生混合体播种在壳斗科碎树叶上，然后再覆盖厚度为0.2～0.5cm的基质，喷淋浇灌；
其中，所述基质的组成为以下四种之一：质量比为2∶0.5～1∶1～2的泥炭土、珍珠岩和木屑；质量比为1∶0.5～1∶1～2的菜园土、珍珠岩和木屑；质量比为1∶2～4的砂子和泥炭土或质量比为1∶2～4的砂子和腐殖土。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明以白及种子和白及菌根真菌菌丝体为材料，制作成类似于人工种子的白及种子和白及菌根真菌的共生混合体，播种于育苗盘或直接播种于田间，接菌处理的种子在白及菌根真菌作用下萌发形成具有根茎叶的完整植株，2个月后接菌处理的种子萌发率达到98％，且白及菌根真菌的处理增强了种苗的抗逆性，缩短了白及的生长周期，提高了白及药材的产量。
2、本发明的白及菌根真菌菌株具有与白及种子在室内和田间均能够共生萌发的生物活性，采用该项新技术，将有助于解决白及及其他兰科植物种子田间萌发困难的瓶颈问题，是解决兰科植物资源保护与再生及可持续利用的有效方法，具有重要的现实意义和巨大的应用价值。
3、本发明还对白及菌根真菌YY-51的液体培养条件进行了探索，获得了白及菌根真菌液体培养基中的最优无机物加入量和天然提取液种类等发酵培养条件，本发明的白及菌根真菌YY-51的液体培养基配料简单，都是实验室中非常容易获得的，培养效果显著，使促进白及种子萌发的成本大大降低，可应用于大规模生产。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明筛选的白及菌根真菌为蜡壳菌目(Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY-51，白及菌根真菌YY-51于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO.11104，白及菌根真菌YY-51的内转录间隔区核糖体DNA的多核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示的多核苷酸序列。
YY-51的生物学特性：白及菌根真菌菌株YY-51在PDA培养基上，生长的菌落为奶油色到淡黄色，边缘规则，呈蜡质，其菌丝匍匐在培养基表面，气生菌丝不发达，菌丝直径为0.7um～1.1um，多个直径为3.6um的球状或椭球状的念珠状细胞形成长链状的菌丝分支。
菌种的分子生物学鉴定：通过对菌株YY-51的ITS rDNA序列测定，将该菌ITS rDNA片段与Genbank中序列进行比对从而确定该菌的种属，得到该菌株是一株蜡壳菌目真菌。
实施例1
菌株的鉴定
一、真菌DNA的提取：
将用于分子鉴定的真菌接种到PDA培养基上，在暗室内25℃培养2周后，真菌菌落的直径在3～5cm时，菌落表面的菌丝就可以提取DNA。
DNA提取参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.ATM Fungal DNA Kit，Omega Bio-Tek，Doraville，Georgia，USA)的使用指南进行，具体步骤如下：
1)、刮取50-100mg菌丝放入灭菌的研钵中，加入液氮冰冻，立即研磨成粉末，将研磨好的菌丝刮到灭菌的1.5mL Eppendorf管中。
2)、在Eppendorf管中加入Buffer FG1缓冲液800μL，涡旋混匀后，65℃下水浴10min，水浴过程中颠倒混匀2次。
3)、然后加入140μL Buffer FG2，涡旋混匀后，在常温下以转速13300r/min离心10min。
4)、吸取600μL上清液到已灭菌的1.5mL离心管中。
5)、在离心管中加入420μL的在-20℃下预冷过的异丙醇，涡旋沉淀DNA。
6)、在常温下以转速10000r/min离心2min，弃去上清液。
7)、将离心管中的沉淀DNA倒置于滤纸上，干燥DNA至没有异丙醇的味道。
8)、干燥后的DNA中加入65℃预热的重蒸水300μL，涡旋溶解沉淀后，分别加入150μL的Buffer FG3和300μL的无水乙醇，涡旋混匀。
9)、用1000μL的移液枪将液体转移到结合柱子中，以转速10000r/min离心1min。
10)、倒掉收集管中的液体，将结合柱换到新的收集管上，往柱子中加入700μL的Washbuffer，洗涤DNA，以转速10000r/min离心1min。
11)、重复1次步骤10)，即倒掉收集管中的液体，往柱子中加入700μL的Washbuffer，洗涤DNA，以转速10000r/min离心1min。
12)、倒掉收集管中的液体，以转速13300r/min离心2min。
13)、将柱子换到新的1.5mL离心管上，加入100μL的65℃预热的重蒸水，洗脱DNA。
14)、盖好离心管的盖子，记号笔写上标签，保存于-20℃的冰箱中，备用。
二、PCR扩增
DNA提取后，通过设计的引物对特定区段进行PCR扩增，从而提高目的片段的浓度。PCR扩增反应在Eppendorf Mastercycler梯度PCR仪上进行。
本研究的引物是真菌通用引物ITS1/ITS4。ITS1的多核苷酸序列见SEQ ID No.1，ITS4的多核苷酸序列见SEQ ID No.2，具体反应体系及反应条件如下：
表1 50μL PCR扩增反应体系
PCR扩增反应条件：
预变性：94℃，3min；
变性：94℃，30s；
退火：55℃，25s；
延伸：72℃，30s；
共35个循环后，72℃再延伸7min，暂时4℃保存；如保存时间在2天以上，-20℃保存。
三、电泳检测PCR产物
1)、电泳缓冲液的配制
1L母液5×TBE的配制：三异丙基乙磺酰(Tris)54g，硼酸27.5g，0.5mol/L，pH值为8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)20mL，ddH2O定容至1L。
0.5mol/L，pH值为8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)的配制方法：称取186.1g Na2EDTA·2H2O，溶解于700mL的水中，调节pH值为8.0，水定容至1L。
2)、0.8％琼脂糖凝胶
用量筒取100mLTBE，加入0.8g琼脂糖，微波炉完全溶解后，室温下冷却至45℃，再加入2μL溴化乙锭(EB)，摇匀后，倒胶。
3)、电泳条件
每个胶孔，加入2μL的样品液，电压150V，电泳时间20～30min。
四、测序
电泳结束后，在紫外灯下观察，有条带的PCR产物送北京金唯智生物工程公司测序。测序所用引物与扩增反应的相同。
五、鉴定结果
菌株YY-51代表了一个新的真菌菌种，其代表了蜡壳菌目(Sebacinales sp.)的新种。
实施例2
一、先采用PDA固体培养基活化白及菌根真菌菌种，培养温度为26±2℃，暗培养7～15天，然后从形成的菌落边缘挑取若干小块，接种到液体培养基中进行摇床暗培养，摇床转速为100r/min～150r/min，培养温度为26℃±2℃，暗培养10～20天，培养结束后，得到的菌根真菌菌丝体可直接利用，也可以采用豆浆机打碎后使用。
二、液体培养基对菌根真菌菌丝体的影响
液体培养基由葡萄糖、无机盐以及天然提取液组成，其中，葡萄糖的加入量为15g/L～40g/L，无机盐为MgSO4·7H2O和KH2PO4，天然提取液是土豆提取液、麦麸提取液、燕麦提取液中的一种。
1)对液体培养基中MgSO4·7H2O的用量进行实验
设置五个实验组，分别编号为a～e组，其中，液体培养基中除MgSO4·7H2O用量不同以外，葡萄糖的加入量均为20g/L，KH2PO4的加入量均为2.0g/L，天然提取液是麦麸提取液，按照30g/L称量后，加入1L水，煮开后保持30分钟，4层纱布过滤后，即为麦麸提取液，在相同的发酵培养条件下培养后测得菌根真菌菌丝体干重如表2所示：
表2液体培养基中MgSO4·7H2O的用量对生物量的影响
由表2可以看出，MgSO4·7H2O的加入明显有助于白及菌根真菌菌丝体的生长，MgSO4·7H2O加入量为0.5g/L～2.5g/L，白及菌根真菌菌丝体都能较好的生长，在MgSO4·7H2O加入量为1.5g/L时，白及菌根真菌菌丝体干重最大，因此液体培养基中MgSO4·7H2O的用量为1.5g/L时最佳。
2)对液体培养基中KH2PO4的用量进行实验
设置五个实验组，分别编号为f～j组，其中，液体培养基中除KH2PO4用量不同以外，葡萄糖的加入量均为2.0g/L，MgSO4·7H2O的加入量均为1.5g/L，天然提取液是麦麸提取液，按照30g/L称量后，加入1L水，煮开后保持30分钟，4层纱布过滤后，即为麦麸提取液，在相同的发酵培养条件下培养后测得菌根真菌菌丝体干重如表3所示：
表3液体培养基中KH2PO4的用量对生物量的影响
由表3可以看出，KH2PO4的加入明显有助于白及菌根真菌菌丝体的生长，加入量为1.5g/L～3.0g/L，白及菌根真菌菌丝体都能较好的生长，在KH2PO4加入量为2.0g/L时，白及菌根真菌菌丝体干重最大，因此液体培养基中KH2PO4的用量为2.0g/L时最佳。
3)对液体培养基中不同天然提取液进行实验
设置四个实验组，分别编号为k～n组，其中，液体培养基中除天然提取液的种类外，葡萄糖的加入量均为20g/L，MgSO4·7H2O的加入量均为1.5g/L，KH2PO4的加入量均为2.0g/L，天然提取液分别是未添加对照组、麦麸提取液、土豆提取液以及燕麦提取液中的一种，天然提取液是麦麸提取液，则麦麸提取液的制备方法为：按照30g/L称量后，加入1L水，煮开后保持30分钟，4层纱布过滤后，即为麦麸提取液；天然提取液是土豆提取液，则土豆提取液的制备方法为：市售的土豆取150g/L～300g/L去皮称量后，切成小块，加入1L水，开水煮30分钟，4层纱布过滤后，即为土豆提取液；天然提取液是燕麦提取液，则燕麦提取液的制备方法为：燕麦按照20g/L～40g/L称量后，加入1L水，煮开后保持30分钟，4层纱布过滤后，即为燕麦提取液，在相同的发酵培养条件下培养后测得菌根真菌菌丝体干重如表4所示：
表4液体培养基中不同天然提取液对生物量的影响
由表4可以看出，麦麸提取液、土豆提取液以及燕麦提取液的加入均明显有助于白及菌根真菌菌丝体的生长，加入麦麸提取液时，白及菌根真菌菌丝体干重最大，因此液体培养基中采用麦麸提取液最佳。
三、制作白及种子和白及菌根真菌的共生混合体
采用上述c组中发酵培养得到的白及菌根真菌菌丝体，液体培养基中摇床暗培养，培养温度为26±2℃，暗培养7～15天，获得更多的白及菌根真菌菌丝体。
在9～10月，采集成熟的白及蒴果，在自来水下冲洗干净白及蒴果表面的杂物，用无菌滤纸吸干水分后，将白及蒴果切开后得到白及种子备用。
用水或上述的天然提取液作为溶剂，配置质量分数为3～4％的海藻酸钠溶液，加热使海藻酸钠溶液成溶胶状态后在121℃高压灭菌20min，冷却后即得到包埋剂备用。
在超净工作台上，将菌根真菌菌丝体和白及种子放在包埋剂中，并加10～30滴吐温-80或吐温-20，即得真菌和种子的悬浮液；然后，用滴管吸取悬浮液，滴入已灭菌的质量分数为2％氯化钙溶液中，10～15min后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体，干燥后放入无菌的三角瓶中，用封口膜封好，置于4℃下的冰箱中贮藏。
四、育苗
在简易温室大棚中，在育苗盘中装入基质，在基质上放置适量壳斗科碎树叶，再将白及种子和菌根真菌共生混合体直接播种在树叶上，覆盖0.2cm～0.5cm的基质，喷雾淋透，在15℃～30℃下自然光照，待白及种子萌发形成完整植株后，适量喷淋叶面肥，白及种苗长到5cm以上时，移栽大田。
其中，上述育苗盘中的基质为以下四种组成其中之一：质量比为2∶0.5～1∶1～2的泥炭土、珍珠岩和木屑；质量比为1∶0.5～1∶1～2的菜园土、珍珠岩和木屑；质量比为1∶2～4的砂子和泥炭土或质量比为1∶2～4的砂子和腐殖土。
实施例3
发明人取200颗白及种子平均分为两组，1组中按照实施例2中的方法以白及种子和白及菌根真菌菌丝体为材料，制作得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体后，直接播种于田间，2组中直接以白及种子播种于田间，播种后第5周，1组中开始有种子萌发，测定5～12周种子萌发情况如表5所示：
表5白及种子萌发率测定
从表5中可以看出，接菌处理的种子，从第5周开始，白及种子在白及菌根真菌作用下，在大田中萌发形成具有根茎叶的完整植株，经过2个月后萌发率达到98％以上，不接菌处理的对照组，萌发率为0，证明白及菌根真菌能促进白及种子在田间萌发，且效果显著。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (8)

1.一种白及菌根真菌促进白及种子萌发的方法，其特征在于，所述白及菌根真菌为蜡壳菌目(Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY-51，所述白及菌根真菌于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO.11104；其中，所述的白及菌根真菌促进白及种子萌发的方法，包括以下步骤：
步骤一、菌种制备：采用PDA固体培养基培养白及菌根真菌，然后将白及菌根真菌接种于液体培养基中培养得到白及菌根真菌菌丝体；
步骤二、菌丝体扩大培养：采用液体培养基摇床暗培养白及菌根真菌菌丝体7～15天，培养温度为26±2℃，获得更多的白及菌根真菌菌丝体；
步骤三、制作共生混合体：将白及种子和白及菌根真菌菌丝体放在包埋剂中，制作得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
步骤四、应用：将白及种子和白及菌根真菌的共生混合体播种在育苗盘中或田间，15～30℃下自然光照后萌发；其中，将白及种子和白及菌根真菌的共生混合体播种在育苗盘中的具体方法为：在育苗盘中装入基质，在所述基质上放置壳斗科碎树叶，将白及种子和白及菌根真菌的共生混合体播种在壳斗科碎树叶上，然后再覆盖厚度为0.2～0.5cm的基质，喷淋浇灌；
其中，所述基质的组成为以下四种之一：质量比为2:0.5～1:1～2的泥炭土、珍珠岩和木屑；质量比为1:0.5～1:1～2的菜园土、珍珠岩和木屑；质量比为1:2～4的砂子和泥炭土或质量比为1:2～4的砂子和腐殖土；所述白及菌根真菌的保藏号为GCMCC NO.11104。
2.如权利要求1所述的白及菌根真菌在促进白及种子萌发中的应用。
3.如权利要求1所述的白及菌根真菌在促进白及种子在田间萌发中的应用。
4.如权利要求1所述的白及菌根真菌促进白及种子萌发的方法，其特征在于，所述步骤一中得到白及菌根真菌菌丝体具体方法为：先采用PDA固体培养基，培养温度为26±2℃，暗培养7～15天后，从形成的菌落边缘挑取小块，接种到液体培养基中进行摇床暗培养，摇床转速为100r/min～150r/min，培养温度为26℃±2℃，暗培养10～20天；
其中，所述液体培养基由葡萄糖、无机盐以及天然提取液组成，所述无机盐为MgSO4·7H2O和KH2PO4，所述天然提取液是土豆提取液、麦麸提取液或燕麦提取液中的一种。
5.如权利要求4所述的白及菌根真菌促进白及种子萌发的方法，其特征在于，所述液体培养基中葡萄糖的加入量为15g/L～40g/L，所述无机盐中KH2PO4的加入量为1.5g/L～3.0g/L，MgSO4·7H2O的加入量为0.5g/L～2.5g/L。
6.如权利要求5所述的白及菌根真菌促进白及种子萌发的方法，其特征在于，所述无机盐中KH2PO4的加入量为2.0g/L，MgSO4·7H2O的加入量为1.5g/L。
7.如权利要求4所述的白及菌根真菌促进白及种子萌发的方法，其特征在于，所述麦麸提取液的制备方法为：按照30g/L称量后，加入1L水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，即得到麦麸提取液；
所述土豆提取液的制备方法为：取市售的土豆按照150g/L～300g/L去皮称量后，切块，加入1L水，开水煮30min，4层纱布过滤后，即得到土豆提取液；
所述燕麦提取液的制备方法为：燕麦按照20g/L～40g/L称量后，加入1L水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，即得到燕麦提取液。
8.如权利要求4所述的白及菌根真菌促进白及种子萌发的方法，其特征在于，所述步骤三中，制作得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体的具体方法为：在超净工作台上，将白及种子和白及菌根真菌菌丝体放在包埋剂中后，加入10～30滴的吐温-80或吐温-20，得到悬浮液，用滴管吸取所述悬浮液，滴入已灭菌的质量分数为2％的氯化钙溶液中，10～15min后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
其中，所述包埋剂为用水或所述天然提取液作为溶剂，配置得到质量分数为3～4％的海藻酸钠溶液，加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后，在121℃高压灭菌20min，冷却后得到包埋剂。
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