CN110150013A - 一种锥栗菌根化育苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种锥栗菌根化育苗的方法，所述方法包括如下步骤：S1、培育锥栗幼苗：将消毒后锥栗种子播种至河沙中培育，获得锥栗幼苗；S2、固体菌剂的制备：将外生菌根真菌于MMN培养基中培养，获得活化菌板；挑取经活化的菌块接种至MMN液体培养基中培养以得到液体菌剂；将所述液体菌剂接种至灭菌的固体培养基中培养得到固体菌剂；S3、接菌处理：对锥栗幼苗的根系进行部分截除，然后栽种至基质中，将所述固体菌剂埋于所述锥栗幼苗根系附近，进行接菌处理。本发明提供一种锥栗菌根化育苗的方法在锥栗截根之后接种固体菌剂，使得培育的苗木的根系更好的与根菌共生，解决了锥栗圃地育苗细根少，根系不发达的问题，大大提高了苗木移植后的成活率。

Description

一种锥栗菌根化育苗的方法

技术领域

本发明涉及栽培领域，更具体地，涉及一种锥栗菌根化育苗的方法。

背景技术

锥栗(Castanea herryi)属壳斗科栗属植物，是我国特有的重要木本粮食树种。坚果营养丰富，富含淀粉、维生素C、人体易吸收的微量元素等多种成分，被称为“森林食品”。果实可制成栗粉或罐头，壳斗木材和树皮含大量鞣质，可提制栲胶。锥栗材质坚实，耐水湿，是枕木、建筑、造船、家具的速生优质用材经济树种。锥栗在我国主要分布于长江流域以南，现有种植面积达100万hm²，年产值数十亿元。发展锥栗生产对于我国精准扶贫、绿色增长、建设美丽乡村具有重要的作用。锥栗多为圃地良种育苗，移栽苗木会造成根系损伤、细根少，造林缓苗期长，对锥栗丘陵山地造林成活率造成了一定的影响。同时在土壤肥力贫瘠的锥栗园，土壤养分含量很低，存在施肥困难的现象。因此，在丘陵山地进行锥栗良种造林，如何解决苗木栽植成活率低的问题，成为一个亟待研究解决的问题。

发明内容

基于此，本发明针对锥栗苗木栽植成活率低的技术问题，提供了一种锥栗菌根化育苗的方法，以提高锥栗苗木栽植的成活率。

一种锥栗菌根化育苗的方法，所述方法包括如下步骤：

S1、培育锥栗幼苗：将消毒后锥栗种子播种至河沙中培育，获得锥栗幼苗；

S2、固体菌剂的制备：将外生菌根真菌接种至MMN培养基中，获得活化菌板；挑取经活化的菌块接种至MMN液体培养基中培养以得到液体菌剂；将所述液体菌剂接种至灭菌的固体培养基中培养得到固体菌剂；

S3、接菌处理：对锥栗幼苗的根系进行部分截除，然后栽种至基质中，将所述固体菌剂埋于所述锥栗幼苗根系附近，进行接菌处理。

在一些实施方式中，所述S1步骤包括：

将河沙进行消毒处理并保持一定湿度，将挑选的锥栗种子消毒后播种至厚度为5-8cm的河沙中，在温室中培养3-4个月，获得生长一致的锥栗幼苗。

在一些实施方式中，所述MMN培养基包含如下成分：

(NH₄)₂HPO₄ 0.25g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，NaCl 0.025g/L，MgSO₄·7H₂O0.15g/L，CaCl₂0.05g/L，Thiamine HCl 0.1mg/L，FeCl₃·6H₂0 0.02g/L，Malt Extract 3g/L，Glucose10g/L；和/或所述MMN培养基的pH为5.5～5.7。

在一些实施方式中，在步骤S2中，所述固体培养基包括草炭、蛭石和MMN营养液，其中草炭和蛭石的体积分数比为3～2:1。

在一些实施方式中，在步骤S2中，接种至MMN液体培养基中培养的条件为：温度为24.5-25.5℃，转速为180r/min，暗培养20-30天。

在一些实施方式中，在步骤S2中，接种至灭菌的固体培养基中培养的条件为：温度为24.5-25.5℃，暗培养30-45天。

在一些实施方式中，所述对锥栗幼苗的根系进行部分截除中，对锥栗幼苗的主根截去2-3cm。

在一些实施方式中，在步骤S3中，所述基质包括黄心土、草炭、珍珠岩和蛭石，其中黄心土、草炭、珍珠岩和蛭石的体积比为4～2:1:1:1。

在一些实施方式中，所述外生菌根真菌选自如下的至少一种：美味牛肝菌、彩色豆马勃和土生空团菌。

在一些实施方式中，所述方法还包括：

S4、菌根苗木管理，所述菌根苗木管理包括：

保持移栽基质含水量30％～45％，室温25～28℃，空气相对湿度60％～70％，保持空气流通；

每周用冷开水或蒸馏水浇灌1～2次；

肥力管理：根据叶色，视情况每月施入200mg/株缓释肥；

病虫害管理：视情况采取相应措施防治病虫害的发生，特别是白粉病，禁用高残农药；

杂草管理：视情况人工除草，防止杂草滋生；

接种后4～6个月，选择生长发育良好的菌根苗进行大田定植。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明提供一种锥栗菌根化育苗的方法在锥栗截根之后接种固体菌剂，使得培育的苗木的根系更好的与根菌共生，解决了锥栗圃地育苗细根少，根系不发达的问题，大大提高了苗木移植后的成活率。

2)接种外生菌根可活化土壤难溶性磷，提高苗木养分利用率，可减少肥料的施用量，缓解因过量施肥而导致的土壤污染和水体富营养化。

3)本发明可实现锥栗菌根化苗木的规模化、产业化生产，为南方丘陵山区精准扶贫、乡村振兴打开一扇致富之门，具有显著的社会效益、经济效益和生态效益。

4)采用本发明所述的外生菌根菌剂制作方法，能够缩短菌剂制备的时间，提高菌剂的生物活性。

5)采用本发明所述的接种方法，能够减少苗木移栽过程中的劳动量，减少菌根化育苗成本。

附图说明

图1为本发明公开的一种锥栗菌根化育苗的方法的流程示意图；

图2为外生菌根真菌菌板图；

图3为液体菌剂图；

图4为固体菌剂图；

图5为菌根外部形态图，其中，图A为盆栽接种菌根；B为盆栽未接种；C为接种菌根形态；D为未接种根系形态；

图6为菌根内部结构图，其中，图A为未接种根尖，可见根毛；B为接种根尖纵切，形成了菌套和哈氏网；

图7为接菌苗与未接菌苗根系比较图；

图8为接菌苗与未接菌苗植株生长比较图。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

正如本文中所使用的术语“MMN”培养基是一种营养培养基，营养培养基是在基础培养基中添加一些其它营养物质，如葡萄糖、血液、血清、酵母浸膏等，可供营养要求较高的细菌生长。

如本文中所使用的术语“黄心土”是土层以下的心土,为石灰岩发育的红壤,具一定粘性，pH值4～6。

培养基的制备

MMN培养基：(NH₄)₂HPO₄ 0.25g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，NaCl 0.025g/L，MgSO₄·7H₂O0.15g/L，CaCl₂ 0.05g/L，Thiamine HCl 0.1mg/L，FeCl₃·6H₂00.02g/L，Malt Extract 3g/L，Glucose10g/L，pH为5.5～5.7。

实施例1

参考图1，一种锥栗菌根化育苗的方法，包括如下步骤：

S1、培育锥栗幼苗

利用多菌灵对河沙进行杀菌消毒处理，并且河沙保持一定湿度，即捏起成团，松手后散开为好；水选除去空瘪、病虫害的锥栗种子，用0.5％多菌灵溶液浸泡消毒10～15分钟。将锥栗种子横向播种，覆河沙厚度为5～8cm左右，一层河沙一层种子，播种完成后，置于人工气候室中培育3～4个月，得到生长状况基本一致的锥栗幼苗。

S2、固体菌剂的制备

将美味牛肝菌菌种菌丝接种在MMN培养基中，在25℃下培养至菌丝长满平板，参见图2；挑取所述经活化的菌落边缘的菌块，菌块大小为直径0.40cm圆形，加入装有50ml MMN液体培养基的三角瓶中，每瓶接种2块；将三角瓶放置在摇床中振荡培养，温度设置为25℃±0.5℃下，转速为180r/min，暗培养30天，获得液体菌剂，参见图3；每瓶液体菌剂接种固体菌剂数量5瓶，接种至高温灭菌的固体培养基，培养基成分为草炭(Klasmann,德国)：蛭石＝2:1(v/v)，每瓶固体培养基为250g，并添加MMN营养液50ml，置于培养箱内暗培养45天，将培养温度设置为25℃±0.5℃，获得固体菌剂，参见图4。

S3、幼苗进行接菌处理及侵染率调查

待锥栗幼苗主根系长8～10cm，侧根发达后开始接种，接种前应对其根系进行部分截除，主根约截去2～3cm，侧根进行修剪；栽种于基质为黄心土、草炭(Klasmann,德国)、珍珠岩和蛭石按4:1:1:1的体积比混合，基质的pH在5.5～5.7，基质经太阳曝晒杀菌约7天后装盆；将固体菌剂埋于锥栗幼苗根系附近，每株15g固体菌剂，进行接菌处理。接种6个月后，调查苗木侵染率和生长量等，并采用体式显微镜和石蜡切片方式，观察菌根形态，参见图5和图6。

S4、菌根苗木管理

保持移栽基质含水量30％～45％，室温25～28℃，空气相对湿度60％～70％，保持空气流通；菌根苗木视情况，每周定期用冷开水或蒸馏水浇灌1～2次；根据叶色，视情况每月施入200mg/株缓释肥；视情况采取相应措施，特别是白粉病；禁用高残农药；视情况人工除草，防止杂草滋生。接种后6个月，选择生长发育良好的菌根苗进行大田定植，以不接菌的苗木作为对照，参见图7和图8。

实施例2

一种锥栗菌根化育苗的方法，包括如下步骤：

S1、培育锥栗苗木

利用多菌灵对河沙进行杀菌消毒处理，并且河沙保持一定湿度，即捏起成团，松手后散开为好；水选除去空瘪、病虫害的锥栗种子，用0.5％多菌灵溶液浸泡消毒10～15分钟。将锥栗种子横向播种，覆河沙厚度为5～8cm左右，一层河沙一层种子，播种完成后，置于人工温室中培育3～4个月，得到生长状况基本一致的锥栗幼苗。

S2、固体菌剂的制备

将彩色豆马勃菌种菌丝接种在MMN培养基中，在25℃下培养至菌丝长满平板，参见图2；挑取所述经活化的菌落边缘的菌块，菌块大小为直径0.40cm圆形，加入装有50mlMMN液体培养基的三角瓶中，每瓶接种2块；将三角瓶放置在摇床中振荡培养，温度设置为25℃±0.5℃下，转速为180r/min，暗培养21天，获得液体菌剂，参见图3；每瓶液体菌剂接种固体菌剂数量5瓶，接种至高温灭菌的固体培养基，培养基成分为草炭(Klasmann,德国)：蛭石＝3:1(v/v)，每瓶固体培养基为250g，并添加MMN营养液50ml，放入培养箱内暗培养30天，将培养温度设置为25℃±0.5℃，获得固体菌剂，参见图4。

S3、幼苗进行接菌处理及侵染率调查

待锥栗幼苗主根系长8～10cm，侧根发达后开始接种，接种前应对其根系进行部分截除，主根约截去2～3cm，侧根进行修剪；栽种于基质为黄心土、草炭(Klasmann,德国)、珍珠岩和蛭石按3:1:1:1的体积比混合，基质的pH在5.5～5.7，基质经太阳曝晒杀菌约7天后装盆；将固体菌剂埋于锥栗幼苗根系附近，每株10g固体菌剂，进行接菌处理。接种5～6个月后，调查苗木侵染率和生长量等，并采用体式显微镜和石蜡切片等方式，观察菌根形态，参见图5和6。

S4、菌根苗木管理

保持移栽基质含水量30％～45％，室温25～28℃，空气相对湿度60％～70％，保持空气流通；菌根苗木视情况，每周定期用冷开水或蒸馏水浇灌1～2次；根据叶色，视情况每月施入200mg/株缓释肥；视情况采取相应措施防治病虫害的发生，特别是白粉病；禁用高残农药；视情况人工除草，防止杂草滋生。接种后5～6个月，选择生长发育良好的菌根苗进行大田定植，以不接菌的苗木作为对照，参见图7和图8。

实施例3

一种锥栗菌根化育苗的方法，包括如下步骤：

S1、培育锥栗幼苗

利用多菌灵对河沙进行杀菌消毒处理，并且河沙保持一定湿度，即捏起成团，松手后散开为好；水选除去空瘪、病虫害的锥栗种子，用0.5％多菌灵溶液浸泡消毒10～15分钟。将锥栗种子横向播种，覆河沙厚度为5～8cm左右，一层河沙一层种子，播种完成后，置于人工气候室中培育3～4个月，得到生长状况基本一致的锥栗幼苗。

S2、固体菌剂的制备

将土生空团菌种菌丝接种在MMN培养基中，在25℃下培养至菌丝长满平板，参见图2，获得纯化菌丝；挑取所述经活化的菌落边缘的菌块，菌块大小为直径0.50cm圆形，加入装有50mlMMN液体培养基的三角瓶中，每瓶接种2块；将三角瓶放置在摇床中振荡培养，温度设置为25℃±0.5℃下，转速为180r/min，暗培养20天，获得液体菌剂，参见图3；每瓶液体菌剂接种固体菌剂数量5瓶，接种至高温灭菌的固体培养基，培养基成分为草炭(Klasmann,德国)：蛭石＝2:1(v/v)，每瓶固体培养基为250g，并添加MMN营养液50ml，放入培养箱内暗培养30天，将培养温度设置为25℃±0.5℃，获得固体菌剂，参见图4。

S3、幼苗进行接菌处理及侵染率调查

待锥栗幼苗主根系长8～10cm，侧根发达后开始接种，接种前应对其根系进行部分截除，主根约截去2～3cm，侧根进行修剪；栽种于基质为黄心土、草炭(Klasmann,德国)、珍珠岩和蛭石按2:1:1:1的体积比混合，基质的pH在5.5～5.7，基质经太阳曝晒杀菌约7天后装盆；将固体菌剂埋于锥栗幼苗根系附近，每株12g固体菌剂，进行接菌处理。接种4～6个月后，调查苗木侵染率和生长量等，并采用体式显微镜、石蜡切片等方式，观察菌根形态，参见图5和图6。

S4、菌根苗木管理

保持移栽基质含水量30％～45％，室温25～28℃，空气相对湿度60％～70％，保持空气流通；菌根苗木视情况，每周定期用冷开水或蒸馏水浇灌1～2次；根据叶色，视情况每月施入200mg/株缓释肥；视情况采取相应措施防治病虫害的发生，特别是白粉病；禁用高残农药；视情况人工除草，防止杂草滋生。接种后4～6个月，选择生长发育良好的菌根苗进行大田定植，以不接菌的苗木作为对照，参见图7和图8。

结果分析

接种锥栗幼苗后，其侵染率达到83％以上，优于中国申请号为2013101725899的一种板栗菌根菌人工培养方法、中国申请号为2017108086625的一种板栗菌根菌人工培养方法和中国申请号为2015105888790一种锥栗优势共生菌根菌的人工培养方法，可见本发明的方法侵染锥栗幼苗的能力强，接种效果好。

表1不同接种对侵染率、苗高、植株养分含量以及成活率的影响

综上所述可知，本发明的固体菌剂接种锥栗幼苗后，可以显著的提高苗木的苗高、地径、生物量和矿质元素N、P的含量，与常见的菌根菌(绵毛丝膜菌、红绒盖牛肝菌和正红菇等)相比较，其侵染效果和上述各指标均超过常见菌种，因此可以认为本发明利用制成的固体菌剂，应用于锥栗苗木菌根化，实际效果好于其他常见菌剂以及对照，造林成活率达95％以上，可进一步大规模应用于南方丘陵山地锥栗苗木菌根化培育的生产实践。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种锥栗菌根化育苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、培育锥栗幼苗：将消毒后锥栗种子播种至河沙中培育，获得锥栗幼苗；

S2、固体菌剂的制备：将外生菌根真菌于MMN培养基中培养，获得活化菌板；挑取经活化的菌块接种至MMN液体培养基中培养以得到液体菌剂；将所述液体菌剂接种至灭菌的固体培养基中培养得到固体菌剂；

S3、接菌处理：对锥栗幼苗的根系进行部分截除，然后栽种至基质中，将所述固体菌剂埋于所述锥栗幼苗根系附近，进行接菌处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1步骤包括：

将河沙进行消毒处理并保持一定湿度，将挑选的锥栗种子消毒后播种至厚度为5-8cm的河沙中，在温室中培养3-4个月，获得生长一致的锥栗幼苗。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MMN培养基包含如下成分：

(NH₄)₂HPO₄ 0.25g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，NaCl 0.025g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，CaCl₂0.05g/L，Thiamine HCl 0.1mg/L，FeCl₃·6H₂0 0.02g/L，Malt Extract 3g/L，Glucose10g/L；和/或所述MMN培养基的pH为5.5～5.7。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，所述固体培养基包括草炭、蛭石和MMN营养液，其中草炭和蛭石的体积分数比为3～2:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，接种至MMN液体培养基中培养的条件为：温度为24.5-25.5℃，转速为180r/min，暗培养20-30天。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，接种至灭菌的固体培养基中培养的条件为：温度为24.5-25.5℃，暗培养30-45天。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对锥栗幼苗的根系进行部分截除中，对锥栗幼苗的主根截去2-3cm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述基质包括黄心土、草炭、珍珠岩和蛭石，其中黄心土、草炭、珍珠岩和蛭石的体积比为4～2:1:1:1。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外生菌根真菌选自如下的至少一种：美味牛肝菌、彩色豆马勃和土生空团菌。

10.根据权利要求1～9任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

S4、菌根苗木管理，所述菌根苗木管理包括：

保持移栽基质含水量30％～45％，室温25～28℃，空气相对湿度60％～70％，保持空气流通；

每周用冷开水或蒸馏水浇灌1～2次；

肥力管理：根据叶色，视情况每月施入200mg/株缓释肥；

病虫害管理：视情况采取相应措施防治病虫害的发生，特别是白粉病，禁用高残农药；

杂草管理：视情况人工除草，防止杂草滋生；

接种后4～6个月，选择生长发育良好的菌根苗进行大田定植。