CN105519350B - 快速生产白及种苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速生产白及种苗的方法，将白及种子与白及菌根真菌进行液体共培养至白及种子萌发，以及将萌发的白及种子进行白及种苗培养，其中，所述白及菌根真菌为蜡壳菌目(Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY‑51，所述白及菌根真菌于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO.11104。本发明制作的白及人工种子或种苗，容易保藏和运输，避免了传统组织培养过程中的操作过程复杂、技术要求高、多次继代培养、移栽或定植过程需要大量人力和物力，生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种快速生产白及种苗的方法。
背景技术
兰科植物种子细小如尘，也称为“灰尘种子”，其种子海量，每一颗成熟的果实包含数万粒以上可利用的种子，但在自然条件下，种子很难萌发。兰科植物是植物界进化程度高，且与真菌有着密切联系的特殊生态类群。研究表明，无论是兰科植物的种子萌发，还是植物的生长，都离不开菌根真菌；菌根真菌在兰科药用和观赏类植物的保护、引种驯化和人工栽培中显得尤为重要。由于大多数兰科植物处于濒危状态，所有兰科植物的野生种都已被列入《濒危野生动植物国际贸易公约》，是植物保护中的“旗舰”类群。因此，如何在生产中有效地利用菌根真菌，已成为兰科植物大规模人工栽培、引种驯化和资源再生及保护的关键限制性因子。
白及为兰科多年生草本植物，其花色艳丽，极具观赏价值，还是目前我国濒危紧缺的中药材，其根茎中富含药用成分白及胶质，具有治疗肺结核咯血、支气管扩张咯血、胃溃疡吐血、尿血、便血等作用，疗效确切，经济价值很高。但由于自身特殊的生理特点及其生态环境受到严重破坏，其资源几近枯竭。因此，如何实现白及资源的保护与资源再生，是一个重要而急切的课题。
目前，白及的繁殖方法主要有根茎分株繁殖和组织培养。传统的根茎分株繁殖速度慢，生长周期长，效率低，种苗成本高，很难满足大面积的栽培需求；而组织培养生产的无菌试管苗生长缓慢、移栽成活率低、抗逆性差、易感染病原菌。从目前情况看，白及繁殖困难的状况还没有得到根本解决，导致野生白及资源几近枯竭，市场供不应求，严重限制了白及临床用药和工业生产的需求。
现有技术中，尚未有关于菌根真菌与兰科植物种子液体共生培养的报道。本技术应用于白及种苗的快速生产及提高种苗的移栽成活率，同时可大幅降低生产成本，对于推广白及规模化种植物，提高白及药材的质量和产量，保护白及资源具有重要的现实意义和应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种快速生产白及种苗的方法，通过将白及种子接种于白及菌根真菌菌丝的菌液中共生培养，然后通过对共生培养得到的共生混合体进行包埋处理，制作得到类似于人工种子的白及种苗，播种于育苗盘，接菌处理的种子在白及菌根真菌作用下萌发形成具有根茎叶的完整植株。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一株白及菌根真菌，所述白及菌根真菌为蜡壳菌目(Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY-51，所述白及菌根真菌于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO.11104。
本发明所述的快速生产白及种苗的方法，包括以下步骤：
步骤一、菌液的制备：采用PDA固体培养基培养白及菌根真菌，然后将白及菌根真菌接种至共生液体培养基中得到白及菌根真菌菌丝体的菌液；
步骤二、共生混合体的制备：将经过预处理的白及种子接种至步骤一中得到的菌液中，在摇床上进行共生培养，得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
步骤三、白及种的包埋：待步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后，将所述共生混合体过滤，得共生培养后的白及种，并用包埋剂进行包埋，在包埋物表面喷洒2.5～40g/L普鲁兰多糖溶液，即得白及种苗。
优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述步骤一中所述共生液体培养基为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养基；
其中所述燕麦培养基的制作方法为：按2～20g/L的用量称取燕麦，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.1～5.3，即得燕麦培养基；
所述麦麸培养基的制作方法为：按2～20g/L的用量称取麦麸，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.1～5.3，即得麦麸培养基；
所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法为：称取5～200g/L土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头，切成小块，开水煮30分钟，4层纱布过滤后，即得相应的培养基，然后置于高压121℃高温条件下灭菌20min，冷却后备用。
优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述步骤一中得到白及菌根真菌菌丝体具体方法为：先采用PDA固体培养基，培养温度为26～28℃，暗培养7～10天后，从形成的菌落边缘挑取小块，接种到共生液体培养基中进行摇床暗培养3～5天，摇床转速为100～150r/min，培养温度为26～28℃。
优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述白及种子的预处理的具体步骤为：
步骤a、取9～10月份的成熟的白及蒴果，用自来水洗净，然后依次用体积分数为75％的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5％氯酸钠溶液浸泡8～20min，取出白及蒴果用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，切开白及蒴果，取出白及种子；
步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于0.1～1.0％体积分数的双氧水溶液中浸泡5～30min，取出白及种子用无菌水冲洗3次，然后将白及种子按0.5g/袋的规格分装入网袋中，在所述网袋的外部套设布制的外袋，所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向，所述外袋与所述网袋之间的空间内填充有0.1～0.5g的粒径为0.1～0.2mm的细砂，所述网袋的网格孔径小于白及种子的粒径；
其中，所述外袋经过了预处理：将所述外袋在质量分数为1～3％的聚乙烯醇、1.2～1.8％的氯化钙、0.5～0.8％的硫酸镍和1.0～1.5％的氯化锌的混合溶液中浸泡10～20min后晾干，重复浸泡1～3次后晾干使用；
步骤c、将所述网袋放入30～45℃的热水中浸泡5～10min，然后取出放入所述外袋中封口后超声振荡5～10min，重复浸泡、超声振荡1～3次，取所述网袋中的白及种子，并用无菌滤纸吸干水分，即得所述预处理的白及种子。
优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述步骤二中所述的共生培养条件为：摇床转速为100～200r/min，光照强度为2500～4500lux，温度为26～28℃，先光培养10h，然后暗培养14h，光/暗交替培养。
优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述包埋剂的制作方法为：用水或天然提取液作为溶剂，配置质量分数为3～4％的为海藻酸钠溶液，加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后，在高压121℃下灭菌20min，冷却后即得所述包埋剂；
其中，所述天然提取液为土豆、麦麸或燕麦的提取液。
优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，所述步骤三中所述白及种的包埋的具体操作方法为：在无菌条件下，将所述步骤二中共生培养获得的共生混合体过滤，将过滤得到的白及种单独或与预培养的菌根真菌菌丝体一起悬浮于所述包埋剂中，获得种苗悬浮液；然后用滴管吸取悬浮液，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中，约10～15min后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可完成种苗的包埋。
优选的是，所述的快速生产白及种苗的方法，还包括：
步骤四、白及种苗的育苗：在育苗盘中装入基质，在所述基质上放置壳斗科碎树叶，将所述步骤三中得到的白及种苗播种在壳斗科碎树叶上，然后再覆盖厚度为0.2～0.5cm的基质，在所述基质上部喷洒一层体积比为1∶3∶5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混合溶液，喷淋浇灌；
其中，所述基质的组成为以下四种之一：质量比为1.5～2.5∶1.5～2.5∶1.0～2.0的黄土、炭渣和椰壳；质量比为1∶0.5～1∶1～2的腐叶土、珍珠岩和松树叶；质量比为1∶2～4的蕨根和素红土或质量比为1～2∶2～4的珍珠岩和泥炭土。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明通过将白及种子接种于白及菌根真菌菌丝的菌液中共生培养，然后通过对共生培养得到的共生混合体进行包埋处理，制作得到类似于人工种子的白及种苗，播种于育苗盘，接菌处理的种子在白及菌根真菌作用下萌发形成具有根茎叶的完整植株；本发明不需要加入任何激素和组培常用培养基如MS培养基、1/2MS培养基、N6培养基、B5培养基、Knudson培养基等，而且在育苗及种植过程中也不需要加入任务杀菌剂，对环境友好，且生产工艺简单，在菌根真菌培养和白及种子接种的过程中，需要无菌操作，其他流程则可以不需要；另外，制作白及人工种子或种苗，容易保藏和运输，避免了传统组织培养过程中的操作过程复杂、技术要求高、多次继代培养、移栽或定植过程需要大量人力和物力，生产成本低。
2、本发明种苗生产周期短，只需2周就可以获得白及原球茎，1个月即可获得白及种苗，而且，菌根真菌诱导萌发的白及种苗，发育正常，苗整体质量优，移栽成活率达到95％以上，对于推广白及大规模育苗栽培具有广阔的应用前景和经济价值。
3、本发明设计双层结构的网袋，在超声波的过程中，位于外袋与内袋之间的细砂会与容纳与内袋中白及种子接触，在白及种子表面摩擦并留下细小的微孔，摩擦能够将休眠的白及种子激活，细小的微孔使得白及种子在萌发之前和萌发过程中能够吸入更多的氧气，增强白及种子的活力，从而提高白及种子的萌发率，且在超声振荡完成后通过拉开拉链取出内袋，将白及种子和细砂分离，结构简单，方便实用。
4、白及种子在热水浸泡过程中，种子内部进行一系列的修复活动，能够增强种皮的透性，使得氧气可以顺利进入种子内，进而有利于呼吸作用的进行，同时还可以增加酶的活性，然而单独的热水浸泡的热击处理需要一定的时间才能达到增加酶活性的效果，因此本发明在热击处理后立即进行超声振荡，能够快速刺激代谢酶的合成和激活原有的酶，进而提高酶的活性，节约时间，提高工作效率。
5、聚乙烯醇能够提前启动或加强种子萌发的代谢过程和呼吸作用，提高储藏无水解酶的活性，为种子的胚芽的迅速生长提供了大量的物质和能量，钙、镍和锌等微量元素能够提高白及种子的活力，对白及种子后期的萌发有一定的促进作用，外袋经过了在含有聚乙烯醇和微量元素的混合溶液中浸泡过，在超声振荡的过程中，外袋上残留的聚乙烯醇和微量元素能够缓慢的浸入白及种子内部，进一步为白及种子提供更多的能量，使白及种子的活力更高。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明筛选的白及菌根真菌为蜡壳菌目(Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY-51，白及菌根真菌YY-51于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO.11104，白及菌根真菌YY-51的内转录间隔区核糖体DNA的多核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示的多核苷酸序列。
YY-51的生物学特性：白及菌根真菌菌株YY-51在PDA培养基上，生长的菌落为奶油色到淡黄色，边缘规则，呈蜡质，其菌丝匍匐在培养基表面，气生菌丝不发达，菌丝直径为0.7um～1.1um，多个大小约为3.0um×3.9um的球状或椭球状的念珠状细胞形成长链状的菌丝分支。
菌种的分子生物学鉴定：通过对菌株YY-51的ITS rDNA序列测定，将该菌ITS rDNA片段与Genbank中序列进行比对从而确定该菌的种属，得到该菌株是一株蜡壳菌目真菌。
实施例1
菌株的鉴定
一、真菌DNA的提取：
将用于分子鉴定的真菌接种到PDA培养基上，在暗室内25℃培养2周后，真菌菌落的直径在3～5cm时，菌落表面的菌丝就可以提取DNA。
DNA提取参照真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.ATM Fungal DNA Kit，Omega Bio-Tek，Doraville，Georgia，USA)的使用指南进行，具体步骤如下：
1)、刮取50～100mg菌丝放入灭菌的研钵中，加入液氮冰冻，立即研磨成粉末，将研磨好的菌丝刮到灭菌的1.5mL Eppendorf管中。
2)、在Eppendorf管中加入Buffer FG1缓冲液800μL，涡旋混匀后，65℃下水浴10min，水浴过程中颠倒混匀2次。
3)、然后加入140μL Buffer FG2，涡旋混匀后，在常温下以转速13300r/min离心10min。
4)、吸取600μL上清液到已灭菌的1.5mL离心管中。
5)、在离心管中加入420μL的在-20℃下预冷过的异丙醇，涡旋沉淀DNA。
6)、在常温下以转速10000r/min离心2min，弃去上清液。
7)、将离心管中的沉淀DNA倒置于滤纸上，干燥DNA至没有异丙醇的味道。
8)、干燥后的DNA中加入65℃预热的重蒸水300μL，涡旋溶解沉淀后，分别加入150μL的Buffer FG3和300μL的无水乙醇，涡旋混匀。
9)、用1000μL的移液枪将液体转移到结合柱子中，以转速10000r/min离心1min。
10)、倒掉收集管中的液体，将结合柱换到新的收集管上，往柱子中加入700μL的Washbuffer，洗涤DNA，以转速10000r/min离心1min。
11)、重复1次步骤10)，即倒掉收集管中的液体，往柱子中加入700μL的Washbuffer，洗涤DNA，以转速10000r/min离心1min。
12)、倒掉收集管中的液体，以转速13300r/min离心2min。
13)、将柱子换到新的1.5mL离心管上，加入100μL的65℃预热的重蒸水，洗脱DNA。
14)、盖好离心管的盖子，记号笔写上标签，保存于-20℃的冰箱中，备用。
二、PCR扩增
DNA提取后，通过设计的引物对特定区段进行PCR扩增，从而提高目的片段的浓度。PCR扩增反应在EppendorfMastercycler梯度PCR仪上进行。
本研究的引物是真菌通用引物ITS1/ITS4。ITS1的多核苷酸序列见SEQ ID No.1，ITS4的多核苷酸序列见SEQ ID No.2，具体反应体系及反应条件如下：
表1 50μL PCR扩增反应体系
PCR扩增反应条件：
预变性：94℃，3min；
变性：94℃，30s；
退火：55℃，25s；
延伸：72℃，30s；
共35个循环后，72℃再延伸7min，暂时4℃保存；如保存时间在2天以上，-20℃保存。
三、电泳检测PCR产物
1)、电泳缓冲液的配制
1L母液5×TBE的配制：三异丙基乙磺酰(Tris)54g，硼酸27.5g，0.5mol/L，pH值为8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)20mL，ddH2O定容至1L。
0.5mol/L，pH值为8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)的配制方法：称取186.1g Na2EDTA·2H2O，溶解于700mL的水中，调节pH值为8.0，水定容至1L。
2)、0.8％琼脂糖凝胶
用量筒取100mLTBE，加入0.8g琼脂糖，微波炉完全溶解后，室温下冷却至45℃，再加入2μL溴化乙锭(EB)，摇匀后，倒胶。
3)、电泳条件
每个胶孔，加入2μL的样品液，电压150V，电泳时间20～30min。
四、测序
电泳结束后，在紫外灯下观察，有条带的PCR产物送北京金唯智生物工程公司测序。测序所用引物与扩增反应的相同。
五、鉴定结果
菌株YY-51代表了一个潜在的新的真菌菌种，其代表了蜡壳菌目(Sebacinalessp.)的新种。
实施例2
本发明所述的快速生产白及种苗的方法，包括以下步骤：
步骤一、菌液的制备：白及菌根真菌接种至PDA固体培养基中，控制培养温度为28℃，暗培养10天，然后从形成的菌落边缘挑取小块，接种到共生液体培养基中进行摇床暗培养5天，摇床转速为150r/min，培养温度为28℃，得到白及菌根真菌菌丝体的菌液；
其中，所述共生液体培养基为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养基；
其中所述燕麦培养基的制作方法为：按20g/L的用量称取燕麦，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.3，即得燕麦培养基；
所述麦麸培养基的制作方法为：按20g/L的用量称取麦麸，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.3，即得麦麸培养基；
所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法为：称取200g/L土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头，切成小块，开水煮30分钟，4层纱布过滤后，即得相应的培养基，然后置于高压121℃高温条件下灭菌20min，冷却后备用。
步骤二、共生混合体的制备：将经过预处理的白及种子接种至步骤一中得到的菌液中，在摇床上进行共生培养，所述共生培养的条件为：摇床转速为200r/min，光照强度为4500lux，温度为28℃，先光培养10h，然后暗培养14h，光/暗交替培养，得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
其中，所述白及种子的预处理的具体操作步骤为：
步骤a、取9～10月份的成熟的白及蒴果，用自来水洗净，然后依次用体积分数为75％的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5％氯酸钠溶液浸泡20min，取出白及蒴果用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，切开白及蒴果，取出白及种子；
步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于1.0％体积分数的双氧水溶液中浸泡30min，取出白及种子用无菌水冲洗3次，然后将白及种子按0.5g/袋的规格分装入网袋中，在所述网袋的外部套设布制的外袋，所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向，所述外袋与所述网袋之间的空间内填充有0.5g的粒径为0.2mm的细砂，所述网袋的网格孔径小于白及种子的粒径；
其中，所述外袋经过了预处理：将所述外袋在质量分数为3％的聚乙烯醇、1.8％的氯化钙、0.8％的硫酸镍和1.5％的氯化锌的混合溶液中浸泡20min后晾干，重复浸泡1～3次后晾干使用；
步骤c、将所述网袋放入45℃的热水中浸泡10min，然后取出放入所述外袋中封口后超声振荡10min，重复浸泡、超声振荡1～3次，取出所述网袋中的白及种了，并用无菌滤纸吸干水分，即得所述预处理的白及种子；
步骤三、白及种的包埋：待步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后，将所述共生混合体过滤，得共生培养后的白及种，将过滤得到的白及种单独或与预培养的菌根真菌菌丝体一起悬浮于所述包埋剂中，获得种苗悬浮液；然后用滴管吸取悬浮液，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中，约15min后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可完成种苗的包埋，在包埋物表面喷洒40g/L普鲁兰多糖溶液，即得白及种苗；
其中所述包埋剂的制作方法为：用水或天然提取液作为溶剂，配置质量分数为4％的为海藻酸钠溶液，加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后，在高压121℃下灭菌20min，冷却后即得所述包埋剂；
其中，所述天然提取液为土豆、麦麸或燕麦的提取液；
步骤四、白及种苗的育苗：在育苗盘中装入基质，在所述基质上放置壳斗科碎树叶，将所述步骤三中得到的白及种苗播种在壳斗科碎树叶上，然后再覆盖厚度为0.5cm的基质，在所述基质上部喷洒一层体积比为1∶3∶5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混合溶液，喷淋浇灌；
其中，所述基质的组成为以下四种之一：质量比为2.5∶2.5∶2.0的黄土、炭渣和椰壳；质量比为1∶1∶2的腐叶土、珍珠岩和松树叶；质量比为1∶4的蕨根和素红土或质量比为2∶4的珍珠岩和泥炭土。
实施例3
本发明所述的快速生产白及种苗的方法，包括以下步骤：
步骤一、菌液的制备：白及菌根真菌接种至PDA固体培养基中，控制培养温度为26℃，暗培养7天，然后从形成的菌落边缘挑取小块，接种到共生液体培养基中进行摇床暗培养3天，摇床转速为100r/min，培养温度为26℃，得到白及菌根真菌菌丝体的菌液；
其中，所述共生液体培养基为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养基；
其中所述燕麦培养基的制作方法为：按2g/L的用量称取燕麦，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.1，即得燕麦培养基；
所述麦麸培养基的制作方法为：按2g/L的用量称取麦麸，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.1，即得麦麸培养基；
所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法为：称取5g/L土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头，切成小块，开水煮30分钟，4层纱布过滤后，即得相应的培养基，然后置于高压121℃高温条件下灭菌20min，冷却后备用。
步骤二、共生混合体的制备：将经过预处理的白及种子接种至步骤一中得到的菌液中，在摇床上进行共生培养，所述共生培养的条件为：摇床转速为100r/min，光照强度为2500lux，温度为26℃，先光培养10h，然后暗培养14h，光/暗交替培养，得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
其中，所述白及种子的预处理的具体操作步骤为：
步骤a、取9～10月份的成熟的白及蒴果，用自来水洗净，然后依次用体积分数为75％的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5％氯酸钠溶液浸泡8min，取出白及蒴果用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，切开白及蒴果，取出白及种子；
步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于0.1％体积分数的双氧水溶液中浸泡5min，取出白及种子用无菌水冲洗3次，然后将白及种子按0.5g/袋的规格分装入网袋中，在所述网袋的外部套设布制的外袋，所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向，所述外袋与所述网袋之间的空间内填充有0.1g的粒径为0.1mm的细砂，所述网袋的网格孔径小于白及种子的粒径；
其中，所述外袋经过了预处理：将所述外袋在质量分数为1％的聚乙烯醇、1.2％的氯化钙、0.5％的硫酸镍和1.0％的氯化锌的混合溶液中浸泡10min后晾干，重复浸泡1次后晾干使用；
步骤c、将所述网袋放入30℃的热水中浸泡5min，然后取出放入所述外袋中封口后超声振荡5min，重复浸泡、超声振荡1～3次，取出所述网袋中的白及种子，并用无菌滤纸吸干水分，即得所述预处理的白及种子；
步骤三、白及种的包埋：待步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后，将所述共生混合体过滤，得共生培养后的白及种，将过滤得到的白及种单独或与预培养的菌根真菌菌丝体一起悬浮于所述包埋剂中，获得种苗悬浮液；然后用滴管吸取悬浮液，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中，约10min后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可完成种苗的包埋，在包埋物表面喷洒2.5g/L普鲁兰多糖溶液，即得白及种苗；
其中所述包埋剂的制作方法为：用水或天然提取液作为溶剂，配置质量分数为3％的为海藻酸钠溶液，加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后，在高压121℃下灭菌20min，冷却后即得所述包埋剂；
其中，所述天然提取液为土豆、麦麸或燕麦的提取液；
步骤四、白及种苗的育苗：在育苗盘中装入基质，在所述基质上放置壳斗科碎树叶，将所述步骤三中得到的白及种苗播种在壳斗科碎树叶上，然后再覆盖厚度为0.2cm的基质，在所述基质上部喷洒一层体积比为1∶3∶5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混合溶液，喷淋浇灌；
其中，所述基质的组成为以下四种之一：质量比为1.5∶1.5∶1.0的黄土、炭渣和椰壳；质量比为1∶0.5∶1的腐叶土、珍珠岩和松树叶；质量比为1∶2的蕨根和素红土或质量比为1∶2的珍珠岩和泥炭土。
实施例4
本发明所述的快速生产白及种苗的方法，包括以下步骤：
步骤一、菌液的制备：白及菌根真菌接种至PDA固体培养基中，控制培养温度为27℃，暗培养9天，然后从形成的菌落边缘挑取小块，接种到共生液体培养基中进行摇床暗培养4天，摇床转速为130r/min，培养温度为27℃，得到白及菌根真菌菌丝体的菌液；
其中，所述共生液体培养基为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养基；
其中所述燕麦培养基的制作方法为：按11g/L的用量称取燕麦，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.2，即得燕麦培养基；
所述麦麸培养基的制作方法为：按11g/L的用量称取麦麸，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.2，即得麦麸培养基；
所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法为：称取102g/L土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头，切成小块，开水煮30分钟，4层纱布过滤后，即得相应的培养基，然后置于高压121℃高温条件下灭菌20min，冷却后备用。
步骤二、共生混合体的制备：将经过预处理的白及种子接种至步骤一中得到的菌液中，在摇床上进行共生培养，所述共生培养的条件为：摇床转速为150r/min，光照强度为3500lux，温度为27℃，先光培养10h，然后暗培养14h，光/暗交替培养，得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
其中，所述白及种子的预处理的具体操作步骤为：
步骤a、取9～10月份的成熟的白及蒴果，用自来水洗净，然后依次用体积分数为75％的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5％氯酸钠溶液浸泡14min，取出白及蒴果用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，切开白及蒴果，取出白及种子；
步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于0.5％体积分数的双氧水溶液中浸泡18min，取出白及种子用无菌水冲洗3次，然后将白及种子按0.5g/袋的规格分装入网袋中，在所述网袋的外部套设布制的外袋，所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向，所述外袋与所述网袋之间的空间内填充有0.3g的粒径为0.15mm的细砂，所述网袋的网格孔径小于白及种子的粒径；
其中，所述外袋经过了预处理：将所述外袋在质量分数为2％的聚乙烯醇、1.5％的氯化钙、0.7％的硫酸镍和1.3％的氯化锌的混合溶液中浸泡15min后晾干，重复浸泡2次后晾干使用；
步骤c、将所述网袋放入38℃的热水中浸泡8min，然后取出放入所述外袋中封口后超声振荡8min，重复浸泡、超声振荡2次，取出所述网袋中的白及种子，并用无菌滤纸吸干水分，即得所述预处理的白及种子；
步骤三、白及种的包埋：待步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后，将所述共生混合体过滤，得共生培养后的白及种，将过滤得到的白及种单独或与预培养的菌根真菌菌丝体一起悬浮于所述包埋剂中，获得种苗悬浮液；然后用滴管吸取悬浮液，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中，约13min后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可完成种苗的包埋，在包埋物表面喷洒3.3g/L普鲁兰多糖溶液，即得白及种苗；
其中所述包埋剂的制作方法为：用水或天然提取液作为溶剂，配置质量分数为3.5％的为海藻酸钠溶液，加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后，在高压121℃下灭菌20min，冷却后即得所述包埋剂；
其中，所述天然提取液为土豆、麦麸或燕麦的提取液；
步骤四、白及种苗的育苗：在育苗盘中装入基质，在所述基质上放置壳斗科碎树叶，将所述步骤三中得到的白及种苗播种在壳斗科碎树叶上，然后再覆盖厚度为0.4cm的基质，在所述基质上部喷洒一层体积比为1∶3∶5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混合溶液，喷淋浇灌；
其中，所述基质的组成为以下四种之一：质量比为2∶2∶1.5的黄土、炭渣和椰壳；质量比为1∶0.8∶1.5的腐叶土、珍珠岩和松树叶；质量比为1∶3的蕨根和素红土或质量比为1.5∶3的珍珠岩和泥炭土。
实施例5
发明人取300颗白及种子平均分为三组，1组中按照实施例4中的方法将预处理后的白及种子接种于白及菌根真菌菌丝的菌液中共生培养，然后通过对共生培养得到的共生混合体进行包埋处理，制作得到类似于人工种子的白及种苗，播种于育苗盘培养3个月后移栽至田间；2组中直接将白及种子接种于白及菌根真菌菌丝的菌液中共生培养，然后通过对共生培养得到的共生混合体进行包埋处理，制作得到类似于人工种子的白及种苗，播种于育苗盘培养3个月后移栽至田间；3组中直接将白及种子播种于育苗盘培养3个月后移栽至田间，播种后第5周，1组和2组中开始有种子萌发，12周后将白及种苗移栽至田间，1～2组白及种苗的移栽成活率分别为95％和88％；测定5～12周1～3组中的白及种子萌发情况如表2所示：
表2白及种子萌发率测定
从表2中可以看出，接菌处理的种子，从第5周开始，白及种子在白及菌根真菌作用下，1组和2组中的白及种子在育苗盘中萌发形成具有根茎叶的完整植株，不接菌处理的3组，萌发率为0，证明白及菌根真菌能促进白及种子在田间萌发，且效果显著，1组白及种子的萌发率始终比2组白及种子的萌发率要高，且移栽成活率也要高7％，说明白及种子经过了浸泡、与细砂一起超声处理，增强了白及种子表皮的通透性、激活了种子内部休眠的胚芽、提前启动白及种子的萌发代谢过程，使得白及菌种的菌丝更容易的进入白及种子内部，从而大大提高白及种子的萌发率。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (7)
1.一种快速生产白及种苗的方法，其特征在于，将白及种子与白及菌根真菌进行液体共培养至白及种子萌发，以及将萌发的白及种子进行白及种苗培养，其中，所述白及菌根真菌为蜡壳菌目(Sebacinales sp.)菌根真菌菌株YY-51，所述白及菌根真菌于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为GCMCC NO.11104；
所述的快速生产白及种苗的方法，包括以下步骤：
步骤一、菌液的制备：采用PDA固体培养基培养白及菌根真菌，然后将白及菌根真菌接种至共生液体培养基中得到白及菌根真菌菌丝体的菌液；
步骤二、共生混合体的制备：将经过预处理的白及种子接种至所述步骤一中得到的菌液中，在摇床上进行共生培养，得到白及种子和白及菌根真菌的共生混合体；
所述白及种子的预处理的具体步骤为：
步骤a、取9～10月份的成熟的白及蒴果，用自来水洗净，然后依次用体积分数为75％的酒精溶液浸泡30s和质量分数为2.5％氯酸钠溶液浸泡8～20min，取出白及蒴果用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干水分，切开白及蒴果，取出白及种子；
步骤b、将所述步骤a中得到的白及种子置于0.1～1.0％体积分数的双氧水溶液中浸泡5～30min，取出白及种子用无菌水冲洗3次，然后将白及种子按0.5g/袋的规格分装入网袋中，在所述网袋的外部套设布制的外袋，所述网袋与所述外袋的开口朝向同一方向，所述外袋与所述网袋之间的空间内填充有0.1～0.5g的粒径为0.1～0.2mm的细砂，所述网袋的网格孔径小于白及种子的粒径；
其中，所述外袋经过了预处理：将所述外袋在质量分数为1～3％的聚乙烯醇、1.2～1.8％的氯化钙、0.5～0.8％的硫酸镍和1.0～1.5％的氯化锌的混合溶液中浸泡10～20min后晾干，重复浸泡1～3次后晾干使用；
步骤c、将所述网袋放入30～45℃的热水中浸泡5～10min，然后取出放入所述外袋中封口后超声振荡5～10min，重复浸泡、超声振荡1～3次，取所述网袋中白及种子，并用无菌滤纸吸干水分，即得所述预处理的白及种子；
步骤三、白及种的包埋：待所述步骤二中所述白及种子萌发并形成原球茎和叶片后，将所述共生混合体过滤，得共生培养后的白及种，并用包埋剂进行包埋，在包埋物表面喷洒2.5～40g/L普鲁兰多糖溶液，即得白及种苗。
2.如权利要求1所述的快速生产白及种苗的方法，其特征在于，所述步骤一中所述共生液体培养基为燕麦培养基、麦麸培养基、土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基、或芋头培养基；
其中所述燕麦培养基的制作方法为：按2～20g/L的用量称取燕麦，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.1～5.3，即得燕麦培养基；
所述麦麸培养基的制作方法为：按2～20g/L的用量称取麦麸，加入500mL的水，煮开后保持30min，4层纱布过滤后，定容至1L，调节pH值为5.1～5.3，即得麦麸培养基；
所述土豆培养基、苹果培养基、萝卜培养基、番薯培养基或芋头培养基的制作方法为：称取5～200g/L土豆、苹果、萝卜、番薯或芋头，切成小块，开水煮30分钟，4层纱布过滤后，即得相应的培养基，然后置于高压121℃高温条件下灭菌20min，冷却后备用。
3.如权利要求1所述的快速生产白及种苗的方法，其特征在于，所述步骤一中得到白及菌根真菌菌丝体具体方法为：先采用PDA固体培养基，培养温度为26～28℃，暗培养7～10天后，从形成的菌落边缘挑取小块，接种到共生液体培养基中进行摇床暗培养3～5天，摇床转速为100～150r/min，培养温度为26～28℃。
4.如权利要求1所述的快速生产白及种苗的方法，其特征在于，所述步骤二中所述的共生培养条件为：摇床转速为100～200r/min，光照强度为2500～4500lux，温度为26～28℃，先光培养10h，然后暗培养14h，光/暗交替培养。
5.如权利要求1所述的快速生产白及种苗的方法，其特征在于，所述包埋剂的制作方法为：用水或天然提取液作为溶剂，配置质量分数为3～4％的为海藻酸钠溶液，加热使所述海藻酸钠溶液成溶胶状态后，在高压121℃下灭菌20min，冷却后即得所述包埋剂；
其中，所述天然提取液为土豆、麦麸或燕麦的提取液。
6.如权利要求1所述的快速生产白及种苗的方法，其特征在于，所述步骤三中所述白及种的包埋的具体操作方法为：在无菌条件下，将所述步骤二中共生培养获得的共生混合体过滤，将过滤得到的白及种单独或与预培养的菌根真菌菌丝体一起悬浮于所述包埋剂中，获得种苗悬浮液；然后用滴管吸取悬浮液，滴入已灭菌的2％氯化钙溶液中，10～15min后，倒去氯化钙溶液，用无菌水冲洗20min，即可完成种苗的包埋。
7.如权利要求1所述的快速生产白及种苗的方法，其特征在于，还包括：
步骤四、白及种苗的育苗：在育苗盘中装入基质，在所述基质上放置壳斗科碎树叶，将所述步骤三中得到的白及种苗播种在壳斗科碎树叶上，然后再覆盖厚度为0.2～0.5cm的基质，在所述基质上部喷洒一层体积比为1:3:5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混合溶液，喷淋浇灌；
其中，所述基质的组成为以下四种之一：质量比为1.5～2.5:1.5～2.5:1.0～2.0的黄土、炭渣和椰壳；质量比为1:0.5～1:1～2的腐叶土、珍珠岩和松树叶；质量比为1:2～4的蕨根和素红土或质量比为1～2:2～4的珍珠岩和泥炭土。
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