CN105325244B - 一种联合应用amf与pgpr菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法 - Google Patents

一种联合应用amf与pgpr菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，该方法步骤包括制备AMF菌根接种体、制备PGPR菌剂、育苗土消毒、枳种子催芽、播种与接种。本发明设计的柑橘容器菌根苗栽培方法，其能够提高柑橘根系的菌根侵染率，更好的活化营养土矿质营养，促进柑橘容器苗对养分和水分的吸收利用，培育出抗逆性和成活率更高的菌根容器苗，有利于工厂化大批量容器苗的整齐快速的生长，缩短育苗期，并能使橘树终身受益菌根促生效应，减少化学肥料在容器育苗中的施用量。

Description

一种联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的 方法
技术领域
本发明涉及柑橘苗木栽培技术，具体涉及联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法。
背景技术
丛枝菌根真菌（AMF）几乎存在于所有生态类型土壤中，在自然界中分布极其广泛，其能侵染80%的陆生高等植物形成互惠共生体。经研究表明，AMF真菌能促进宿主植物对养分和水分的吸收，提高宿主植物对多种生物和非生物胁迫的抗性；另外，在生物修复退化土壤、改良土壤结构、减轻土壤污染、保护和利用资源等方面也具有不可替代的重要作用。
而根围促生细菌（PGPR）是根际土壤微生态中的一类重要的有益微生物成员。研究表明，巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）与胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginousus）作为微生物肥料中两类经常应用的PGPR，能够促进土壤难溶性磷、钾等矿物质元素的释放，近年来，通过其改善植物营养吸收，减少化学肥料施用的研究逐渐成为了发展可持续农业的热点。
在目前，柑橘砧木苗通常通过种子繁育，传统的露地育苗设施环境调控能力差，出苗率偏低、偏慢，容易受病虫害感染，而且在自然土壤中育苗，不同种类的大量微生物常与AMF竞争，从而抑制AMF对砧木苗根系的大量侵染。因此，露地繁育的柑橘砧木苗只带有自然的、较少的菌根，严重消弱了菌根共生体对柑橘吸收利用营养及抗病性的有益贡献。
而相比较露地育苗，柑橘容器育苗能够培育出高质量苗木，近年来在全国柑橘容器育苗中被大量采用。理论上来说，若在育苗伊始就对苗木根系接种上高效的AMF菌种，批量化生产优质柑橘容器菌根苗，可显著提高柑橘幼苗对基质养分的利用吸收，促进苗木快速整齐生长，缩短育苗周期，并提高苗木定植后的抗逆性和抗病性，缓解柑橘连作障碍，而且可使橘树终生受益。但经多年的研究表明，单一微生物的促生长作用效率普遍偏低，无法满足实际当中的大批量育苗需要。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其能够提高柑橘根系的菌根侵染率，更好的活化营养土矿质营养，促进柑橘容器苗对养分和水分的吸收利用，培育出抗逆性和成活率更高的菌根容器苗，有利于工厂化大批量容器苗的整齐快速的生长，缩短育苗期，并能使橘树终身受益菌根促生效应，减少化学肥料在容器育苗中的施用量。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：包括如下几个步骤：
a、制备AMF菌根接种体：选细河沙、橘园土、草炭按体积比2:1:1混匀，装布袋经121℃湿热灭菌2小时2次，中间间隔24小时，放置1~2周后作为AMF菌剂培养基质；将含有AMF孢子的菌剂加入上述培养基质中并播种三叶草，在塑料温室自然光照条件下培养，培养3~4个月后收获基质和根段，保证根段侵染率在70%以上，侵染强度在40%以上；且风干后测定AMF孢子密度，保证每克接种基质至少含25个成熟健康孢子，作为标准接种剂；
b、制备PGPR菌剂：将浓度为108 CFU/ml的PGPR 种子液1ml接种于液体培养基中，于30摄氏度下180转/分钟摇瓶培养36小时后稀释至108 CFU/ml，作为标准接种剂；
c、育苗土消毒：将育苗土装布袋湿热灭菌2小时2次，消毒除去杂菌，中间间隔24小时，放置1~2周后作为柑橘容器育苗土；所述育苗土为橘园普通土壤添加堆沤发酵、充分腐熟并以体积比7：3的比例添加菌糠；所述菌糠为金针菇、平菇、杏鲍菇菌糠中的一种或多种；
d. 枳种子催芽：选择上一年采集优质饱满枳种子，用10%双氧水表面消毒10分钟，蒸馏水冲洗数次后，置于底部铺有湿润棉层的托盘中，于27℃电热恒温隔水式培养箱中暗培养催芽；
e. 播种与接种：先将萌发的枳种子在浓度为108 CFU/ml的PGPR 液体培养基中浸泡30分钟，在育苗钵中装入消毒育苗土至育苗钵的3/4处，浇透水压出孔穴，而后将AMF菌根接种体25-35克撒入孔穴，并以1株/钵将浸泡过的枳种子根系平直的播种于育苗钵孔穴中，并灌根移入5ml 的PGPR菌剂，再覆盖1-1.5 cm育苗土。
进一步的，上述AMF为根内球囊霉（Rhizophagus intraradices）或摩西球囊霉（Funneliforeis mosseae）。
进一步的，上述PGPR为巨大芽孢杆菌，所述液体培养基含有1.5%淀粉、0.5%酵母粉、0.05% K2HPO4·3H2O、0.05% NaCl、0.05% MgSO4·7H2O和0.01% CaCO3，液体培养基的pH为7.0。
进一步的，上述PGPR为胶质类芽孢杆菌，其液体培养基含有0.5% 牛肉浸膏、1% 蛋白胨、0.1% NaCl、0.1% MgSO4·7H2O、0.05% K2HPO4·3H2O和 0.01% CaCO3，液体培养基的pH为7.0。
进一步的，上述菌糠为粪肥菌糠，其通过清洁菌糠加入稀人畜粪尿充分混匀，用稀泥封顶，堆体温度达到50℃，自然发酵2个月左右，当堆肥温度低于32℃，达到黑、烂即可。
进一步的，上述育苗土中添加过磷酸钙肥料。
进一步的，上述育苗钵在播种前先清洗干净，用0.1%高锰酸钾溶液浸泡30分钟后晾干备用。
进一步的，上述播完种的育苗钵放置于温室培养架上培育柑橘砧木苗，每隔7天浇施200ml自来水/钵，温室搭建遮阳网，遮阳率70%，温室内温度为28-34℃，相对湿度80%以上，进行常规管理，注意日常检查，防范病虫害。
本发明的优点在于：
1.在容器育苗营养土中添加高效促生长的AMF菌根接种体，能够比未接种容器育苗培育出抗逆性和成活率更高的菌根容器苗，接种技术简单易行，有利于工厂化大批量容器苗的整齐快速的生长，缩短育苗期，并能使橘树终身受益菌根促生效应。
2.在柑橘容器苗根际联合接种AMF与PGPR能够提高柑橘根系的菌根侵染率，更好的活化营养土矿质营养，促进柑橘容器苗对养分和水分的吸收利用，最终减少化学肥料在容器育苗中的施用量。
具体实施方式
本发明所用的AMF为根内球囊霉（Rhizophagus intraradices）或摩西球囊霉（Funneliforeis mosseae），分别简称为Ri和Gm。
本发明所用的PGPR为胶质类芽孢杆菌（Paenibacillus mucilaginousus）或巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），分别简称为Pa和Bm。
一种联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，包括如下几个步骤：
1、制备AMF菌根接种体：选细河沙、橘园土、草炭按体积比2:1:1混匀，装布袋经121℃湿热灭菌2小时2次，中间间隔24小时，放置1~2周后作为AMF菌剂培养基质；将含有AMF孢子的菌剂加入上述培养基质中并播种三叶草，在塑料温室自然光照条件下培养，培养3~4个月后收获基质和根段，保证根段侵染率在70%以上，侵染强度在40%以上；且风干后测定AMF孢子密度，保证每克接种基质至少含25个成熟健康孢子。
2、制备PGPR菌剂：将浓度为108 CFU/ml的PGPR 种子液1ml接种于液体培养基中，于30摄氏度下180转/分钟摇瓶培养36小时后稀释至108 CFU/ml，作为标准接种剂。在此，当PGPR为巨大芽孢杆菌时，以上液体培养基含有1.5%淀粉、0.5%酵母粉、0.05% K2HPO4·3H2O、0.05% NaCl、0.05% MgSO4·7H2O和0.01% CaCO3，液体培养基的pH为7.0。当PGPR为胶质类芽孢杆菌时，所述液体培养基含有0.5% 牛肉浸膏、1% 蛋白胨、0.1% NaCl、0.1% MgSO4·7H2O、0.05% K2HPO4·3H2O和 0.01% CaCO3，液体培养基的pH为7.0。
3、育苗土消毒：将育苗土装布袋湿热灭菌2小时2次，消毒除去杂菌，中间间隔24小时，放置1~2周后作为柑橘容器育苗土；所述育苗土为橘园普通土壤添加堆沤发酵、充分腐熟并以体积比7：3的比例添加菌糠；所述菌糠为金针菇、平菇、杏鲍菇菌糠中的一种或多种。
以上菌糠为粪肥菌糠，其通过清洁菌糠加入稀人畜粪尿充分混匀，用稀泥封顶，堆体温度达到50℃，自然发酵2个月左右，当堆肥温度低于32℃，达到黑、烂即可。
以上育苗土中可添加适量的过磷酸钙。
4. 枳种子催芽：选择上一年4℃沙藏采集优质饱满枳种子，用10%双氧水表面消毒10分钟，蒸馏水冲洗数次后，置于底部铺有湿润棉层的托盘中，于27℃电热恒温隔水式培养箱中暗培养催芽，待种子萌发露根后备用。
5. 播种与接种：在播种前先首先将育苗钵清洗干净，用0.1%高锰酸钾溶液浸泡30分钟后晾干备用。将萌发的枳种子在浓度为108 CFU/ml的PGPR 液体培养基中浸泡30分钟，而后在育苗钵中装入消毒育苗土至育苗钵的3/4处，浇透水压出孔穴，接着将AMF菌根接种体25-35克撒入孔穴，并以1株/钵将浸泡过的枳种子根系平直的播种于育苗钵孔穴中，并灌根移入5ml 的PGPR菌剂，再覆盖1-1.5 cm育苗土。
播完种的育苗钵放置于温室培养架上培育柑橘砧木苗，每隔7天浇施200ml自来水/钵，温室搭建遮阳网，遮阳率70%，温室内温度为28-34℃，相对湿度80%以上，进行常规管理，注意日常检查，防范病虫害。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
AMF菌根接种体采用摩西球囊霉菌剂配置而成，每克基质含25个成熟健康孢子。
PGPR菌剂为胶质类芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的液体菌剂，浓度为108 CFU/ml。
所述的育苗土中未添加过磷酸钙。
未接种、单独接种AMF和联合接种AMF、PGPR枳实生苗5个月生长情况对比（差异显著性P < 0.05）。
注：表格中数值后面的不同字母表示差异显著（LSD分析），下同。
实施例2：
AMF菌根接种体采用根内球囊霉菌剂配置而成，每克基质含25个成熟健康孢子。
PGPR菌剂为胶质类芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的液体菌剂，浓度为108 CFU/ml。
所述的育苗土中未添加过磷酸钙。
未接种、单独接种AMF和联合接种AMF、PGPR枳实生苗5个月生长情况对比（差异显著性P < 0.05）。
实施例3：
AMF菌根接种体采用摩西球囊霉菌剂配置而成，每克基质含25个成熟健康孢子。
PGPR菌剂为胶质类芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的液体菌剂，浓度为108 CFU/ml。
所述的育苗土中添加0.75%的过磷酸钙。
未接种、单独接种AMF和联合接种AMF、PGPR枳实生苗5个月生长情况对比（差异显著性P < 0.05）。
实施例4：
AMF菌根接种体采用根内球囊霉菌剂配置而成，每克基质含25个成熟健康孢子。
PGPR菌剂为胶质类芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的液体菌剂，浓度为108 CFU/ml。
所述的育苗土中添加0.75%的过磷酸钙。
未接种、单独接种AMF和联合接种AMF、PGPR枳实生苗5个月生长情况对比（差异显著性P < 0.05）。
实施例5：
AMF菌根接种体采用摩西球囊霉菌剂配置而成，每克基质含25个成熟健康孢子。
PGPR菌剂为胶质类芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的液体菌剂，浓度为108 CFU/ml。
所述的育苗土中添加1.5%的过磷酸钙。
未接种、单独接种AMF和联合接种AMF、PGPR枳实生苗5个月生长情况对比（差异显著性P < 0.05）。
实施例6：
AMF菌根接种体采用根内球囊霉菌剂配置而成，每克基质含25个成熟健康孢子。
PGPR菌剂为胶质类芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的液体菌剂，浓度为108 CFU/ml。
所述的育苗土中添加1.5%的过磷酸钙。
未接种、单独接种AMF和联合接种AMF、PGPR枳实生苗5个月生长情况对比（差异显著性P < 0.05）。
对比以上六张表格的数据，容器苗生长5个月后，相同基质中单接种菌根的枳实生苗的株高、茎粗、叶片数和生物量均明显高于未接种枳苗，说明容器苗中接种菌根能够促进柑橘的生长，并以接种根内球囊霉（Rhizophagus intraradices）菌剂效果最好；双接种情况下，相同基质中联合接种根内球囊霉（Rhizophagus intraradices）和巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）菌剂的枳实生苗的株高、茎粗、叶片数和生物量均明显高于未接种、单接种和其他联合接种处理，促进枳苗生长的效果最好。
此外，虽然添加过磷酸钙肥料能够促进枳苗的生长，但在联合接种AMF和PGPR菌剂的情况下，添加1.5%过磷酸钙肥料枳苗的生长状况并不优于添加0.75%过磷酸钙肥料枳苗的生长情况，说明联合接种AMF和PGPR能在保证育苗质量的情况下减少化学肥料的施用。
综上，本发明设计的一种联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其能够提高柑橘根系的菌根侵染率，更好的活化营养土矿质营养，促进柑橘容器苗对养分和水分的吸收利用，培育出抗逆性和成活率更高的菌根容器苗，有利于工厂化大批量容器苗的整齐快速的生长，缩短育苗期，并能使橘树终身受益菌根促生效应，减少化学肥料在容器育苗中的施用量。
以上所述，仅是本发明的较佳实施方式，并非对发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术原理对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化或修饰，仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (8)

1.一种联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：包括如下几个步骤：
a、制备AMF菌根接种体：选细河沙、橘园土、草炭按体积比2:1:1混匀，装布袋经121℃湿热灭菌2小时2次，中间间隔24小时，放置1~2周后作为AMF菌剂培养基质；将含有AMF孢子的菌剂加入上述培养基质中并播种三叶草，在塑料温室自然光照条件下培养，培养3~4个月后收获基质和根段，保证根段侵染率在70%以上，侵染强度在40%以上；且风干后测定AMF孢子密度，保证每克接种基质至少含25个成熟健康孢子；
b、制备PGPR菌剂：将浓度为108 CFU/ml的PGPR 种子液1ml接种于液体培养基中，于30摄氏度下180转/分钟摇瓶培养36小时后稀释至108 CFU/ml，作为标准接种剂；
c、育苗土消毒：将育苗土装布袋湿热灭菌2小时2次，消毒除去杂菌，中间间隔24小时，放置1~2周后作为柑橘容器育苗土；所述育苗土为橘园普通土壤添加堆沤发酵、充分腐熟并以体积比7：3的比例添加菌糠；所述菌糠为金针菇、平菇、杏鲍菇菌糠中的一种或多种；
d. 枳种子催芽：选择上一年采集优质饱满枳种子，用10%双氧水表面消毒10分钟，蒸馏水冲洗数次后，置于底部铺有湿润棉层的托盘中，于27℃电热恒温隔水式培养箱中暗培养催芽；
e. 播种与接种：先将萌发的枳种子在浓度为108 CFU/ml的PGPR 液体培养基中浸泡30分钟，在育苗钵中装入消毒育苗土至育苗钵的3/4处，浇透水压出孔穴，而后将AMF菌根接种体25-35克撒入孔穴，并以1株/钵将浸泡过的枳种子根系平直的播种于育苗钵孔穴中，并灌根移入5ml 的PGPR菌剂，再覆盖1-1.5 cm育苗土。
2.如权利要求1所述的联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：所述AMF为根内球囊霉（Rhizophagus intraradices）或摩西球囊霉（Funneliforeis mosseae）。
3.如权利要求1或2所述的联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：所述PGPR为巨大芽孢杆菌，所述液体培养基含有1.5%淀粉、0.5%酵母粉、0.05%K2HPO4·3H2O、0.05% NaCl、0.05% MgSO4·7H2O和0.01% CaCO3，液体培养基的pH为7.0。
4.如权利要求1或2所述的联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：所述PGPR为胶质类芽孢杆菌，其液体培养基含有0.5% 牛肉浸膏、1% 蛋白胨、0.1% NaCl、0.1% MgSO4·7H2O、0.05% K2HPO4·3H2O和 0.01% CaCO3，液体培养基的pH为7.0。
5.如权利要求1所述的联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：所述菌糠为粪肥菌糠，其通过清洁菌糠加入稀人畜粪尿充分混匀，用稀泥封顶，堆体温度达到50℃，自然发酵2个月左右，当堆肥温度低于32℃，达到黑、烂即可。
6.如权利要求1或5所述的联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：所述育苗土中添加过磷酸钙肥料。
7.如权利要求1所述的联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：所述育苗钵在播种前先清洗干净，用0.1%高锰酸钾溶液浸泡30分钟后晾干备用。
8.如权利要求1或7所述的联合应用AMF与PGPR菌剂进行柑橘容器菌根苗栽培的方法，其特征在于：所述播完种的育苗钵放置于温室培养架上培育柑橘砧木苗，每隔7天浇施200ml自来水/钵，温室搭建遮阳网，遮阳率70%，温室内温度为28-34℃，相对湿度80%以上，进行常规管理，注意日常检查，防范病虫害。
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